골격근 질환에 대한 열기 필드 활동 모니터링 시스템을 사용하여 행동 및 운동력 측정

Behavior
 

Summary

오픈 필드 활동 수준이 기관차 및 행동 활동 수준을 평가하기 위해 사용된다. 이 프로토콜은 신경 근육 질환에 대한 임상 시험에서 사용하는 잘 설계된 표준화 된 프로토콜을 제공합니다.

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Tatem, K. S., Quinn, J. L., Phadke, A., Yu, Q., Gordish-Dressman, H., Nagaraju, K. Behavioral and Locomotor Measurements Using an Open Field Activity Monitoring System for Skeletal Muscle Diseases. J. Vis. Exp. (91), e51785, doi:10.3791/51785 (2014).

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Abstract

열린 필드 액티비티 모니터링 시스템은 종합적 전위와 마우스의 행동 활동 수준을 평가한다. 그것은 신경 근육 질환과 운동 및 / 또는 근육 기능을 향상시킬 수 있습니다 치료 약물의 효능을 동물 모델에서 기관차 손상을 측정하기위한 유용한 도구입니다. 열린 필드 활성 측정은 일반적으로 그립 세기 측정에 의해 평가되는 근력,보다 다른 측정 값을 제공한다. 또한 추가 결과 측정과 함께 사용했을 때 약물뿐만 아니라 다른 신체 시스템에 영향을 미칠 수있는 방법을 표시 할 수 있습니다. 또한, 같은 여행 총 거리 등의 조치 도보 6 분 시험, 임상 시험 결과 측정을 반영. 그러나, 오픈 필드 활동 모니터링도 중요한 과제와 관련된 : 오픈 필드 활동 측정은 동물의 피로, 나이, 성별, 생체 리듬에 따라 다릅니다. 또, 실내 온도, 습도, 조명, 잡음, 심지어 냄새 평가 결과에 영향을 미칠 수있다. 전반적으로,이 manuscript는 신경 근육 질환의 동물 모델에서 전임상 시험을위한 잘 테스트 및 표준화 된 오픈 필드 활동 SOP를 제공합니다. 우리는 중요한 고려 사항, 일반적인 결과, 데이터 분석, 상세 설계의 장점과 오픈 필드 테스트의 약점에 대한 설명을 제공한다. 전임상 시험에서 열려 필드 활동을 사용하는 경우 또한, 우리는 최적의 연구 설계를위한 추천 정보를 제공한다.

Introduction

동물 모델은 질병 메커니즘에 대한 학습에 유용 있었지만, 임상 시험에서 치료 효과를 예측하는 자신의 유틸리티는 자주 1-3에 도전하고있다. 수많은 "유망"임상 시험은 매년 출판; 임상 시험에 왔을 때 그러나, 제안 된 개입의 거의는 긍정적 인 결과를 보여줍니다. 이러한 불일치는 종종 출판 바이어스, 낙관적으로 결론에 기인하고, 잘못 설계 및 재현성없는 결과 1-3로 이어질 전임상 연구를 실행됩니다.

신경 근육 질환 용 약물 개발에서의 현재의 진보와 함께, 잘 설계된 전임상 실험에 대한 필요성이 증가하고있다. 특히, 검증, 재현성 및 병진 결과 측정하여, 표준화 맹검 방식으로 수행 될 수있다 엄격한 방법론에 대한 필요성이 존재한다. 선천성 근육 질환 컨소시엄 부재와 마찬가지로보다 엄격한 임상 연구를 수행하는 욕망, 우리는 여기에 주 우리의 표준 운영 절차 열기 필드 활동에 대한 (SOP). 이 SOP는 이전에 4를 검증하고 뒤 시엔 느 근이영양증 (DMD) 동물 모델 5 TREAT-NMD의 표준 운영 절차의 일환으로 출판되었다. 우리는 6,7 표현형 Lama2의 DY-2J / J (Dy2J) 마우스, 선천성 근이영양증 (CMD)에 대한 동물 모델을 포함하여, 신경 근육 질환의 동물 모델의 수많은 약물의 치료 효능을 테스트하기 위해이 방법을 사용한 . 차례로,이 문서는 우리의 이전에 발행 된 TREAT-NMD SOP 5에서 구성된다.

열린 필드 액티비티 모니터링 시스템은 종합적 및 전위 기관차 기능과 상관 될 수 생쥐 행동 활동 수준을 평가한다. 시험은 널리 불안과 같은 탐색 동작 8-10을 평가하는 데 사용된다. 특히, 오픈 필드는 엉덩이를위한 유용한 도구입니다기관차 신경 근육 질환 (11, 12)의 동물 모델에서의 장애 및 운동 및 / 또는 모터의 기능을 향상시킬 수 6,7,13,14 치료제의 효능을 에싱. 열린 필드 활성 평가는 일반적으로 악력으로 측정 근력,보다 다른 측정 값을 제공하며, 약물뿐만 아니라 5 (중추 신경계 즉) 다른 신체 시스템에 영향을 미칠 수있는 방법을 보여준다. 또한, 오픈 필드 활성 측정은 총 이동 거리, 최대 하 운동 성능과 수명 (15, 16)의 질에 초점을 맞추고 도보 6 분 시험, 임상 시험 결과 측정을 미러링합니다. 전반적으로이 열기 필드 활동이 전임상 시험에서 사용할 수있는 유익한 2 차 또는 보조 결과 변수를 테스트 할 수 있습니다. 그러나, 오픈 필드 액티비티 모니터링 시스템은 그것과 관련된 상당한 어려움이있다. 이 테스트는 행동이며 외부의 다수에 의해 영향으로 상당히 변수가 될 수 있습니다요인. 예를 들어,이 동작은 모터 출력 (10)에 더하여, 탐색 드라이브 (즉,인지), 불안, 질병, 일주기 리듬, 환경 적 요인, 유전 적 배경에 의해 영향을받을 수있다. 그 결과는 통제 된 환경으로 표준화 된 방식으로이 측정을 실시하는 것이 필수적이다. 여기에 제시된 프로토콜은 구체적으로 오픈 필드 활동 SOP에 대해 설명합니다. 그것은 단계별 절차 및 환경 조건을 제어하고 자세한 세부 사항에서 변화, 일반적인 결과, 데이터 분석 및 평가의 강점과 약점을 줄이는 데 도움이 중요한 고려 사항에 대한 자세한 설명을 제공한다.

Protocol

NOTE : 오픈 필드 활동 모니터링 시스템은 광전지 방출기 및 수용체와 플렉시 유리 챔버 동등 챔버의 둘레를 따라 이격 된 오픈 필드 (도 1)를 사용한다. 이 광전지 방출 및 수용체는 보이지 않는 적외선 빔의 XY 그리드를 만들 수 있습니다. 동물이 챔버 내에 배치 될 때, 빔 나누기 원인에 대해 이동한다. 수직 센서는 또한뿐만 아니라 수직 활동 수준 (즉, 양육 행동을) 평가할 존재한다. 분석기는 빔 휴식의 정보를 기록하고 급속를 분석합니다. 컴퓨터 소프트웨어는 미리 설정된 시간 기간에 걸쳐 다수의 활성 측정을 계산한다. 이러한 조치는 다음과 같습니다 가로 활동 (단위), 수직 활동 (단위), 총 거리 (cm)를 여행, 이동 시간 (초), 휴식 시간 (초) 5.

참고 : 일반적으로 시험장도 조명으로, 온도 - 습도 조절해야한다. 테스트 챔버 균등 혐오해야방에 대한 tributed 직접 빛, 어두운 구석 또는 음영 지역에 배치 할 수 없습니다. 모든 악기 순응 테스트는 (아침, 예)와 같은 개인이 매일 같은 시간에 수행되어야한다. 이러한 개인 동물 처리 군 멀게하고, 가능하면 유전자형한다.

다음 프로토콜은지도와 아동 국립 의료 센터 IACUC의 승인하에 수행하고있다.

1 악기 적응도

  1. 적응하기 위해 약 10 분 동안 자신의 집 새장에있는 테스트 룸에서 마우스를 놓습니다. 순응 기간 동안 방을 둡니다.
  2. 시험장으로 돌아가 활동 실의 전원을 켭니다. 데이터는이 시점에서 수집되지 않는 경우에도, 이는 상기 테스트 환경을 모방 한 것이다.
  3. 조심스럽게 자신의 홈 케이지에서 각 마우스를 제거하고 즉시 시험 챔버에 배치합니다. 활동하는 경우챔버는 사분면에 챔버 (그림 1)을 분할하는 중앙 분배기를 포함, 각 빈 사분면으로 한 마우스를 놓습니다.
  4. 모든 동물을 시험 챔버에로드되면, 각 테스트 챔버의 상부에 덮개를 배치했다. 이 순응 기간 동안 방을 둡니다.
  5. 60 분 후, 방으로 돌아갑니다. 각 시험 챔버에서 뚜껑을 제거하고 부드럽게 자신의 각각의 홈 케이지에 각각 마우스를 반환합니다.
  6. 소독제 및 종이 타월로 각 챔버를 청소합니다. 입자가 챔버에 남아있는 오물을 확인하지 않습니다.
    참고 : 여러 세션이 매일 실행되는 경우, 철저하게 각 세션 사이에 각 시험 챔버를 청소합니다.
  7. 4 일 연속 1-6 단계를 반복합니다.
    참고 : 수행 순응 일주 초기 데이터 수집 이전에. 동물 연구를 통해 여러 번 테스트하는 경우에만 이전 습관화을 방지하기 위해 테스트의 첫 번째 라운드에 순응을 수행합니다. 또한, 무작위로 새에 동물을 할당각 세션 상자. 연구의 기간에 걸쳐 상자 할당을 추적 할 수 있습니다.

2 데이터 수집

  1. 적응하기 위해 10 ~ 30 분 동안 자신의 집 새장에있는 테스트 룸에서 마우스를 놓습니다. 이 시간 동안 방을 둡니다.
  2. 10 ~ 30 분 후, 테스트 룸으로 돌아갑니다. 활동 실을 켜고 챔버에 연결된 컴퓨터에 첨부 된 컴퓨터 소프트웨어를 엽니 다. 챔버는 사분면 디바이더가 포함되어있는 경우,이 시점에서 파티션을 삽입합니다.
    참고 : 테스트 챔버는 사분면 분배기를 포함하는 경우,이 동물이 데이터를 수집하는 동안 시험 챔버에 배치 할 수 있습니다. 하나의 동물은 전면 좌측 사분면과 후면 오른쪽 사분면에서 하나 (도 1)에 배치 될 수있다.
    참고 : 데이터를 수집하는 동안 또는 같은 행이나 열에서 네 개의 사분면에서 동물을 올려 놓지 마십시오. 이러한 방향에 동물을 배치하면 될 것입니다 적외선 빔의 XY 그리드 및 동물의 움직임을 방해부정확하게 측정했다.
  3. prebeam 검사를 수행하기 위해 컴퓨터 소프트웨어를 구성합니다. 이 구성은 하나의 시험 챔버에 실험 장치 전에 동물의 삽입에 (아래 참조) 다음과 같은 사전 빔 검사를 실행 할 수 있습니다.
    NOTE : prebeam 검사가 실행되는 경우, 컴퓨터 소프트웨어는 XY 적외선 빔의 기능을 평가한다. 광전지 방출 및 수용체가 차단 적절 챔버 내에서 움직임을 감지 할 수없는 경우 예를 들어, 확인할 수 있습니다.
  4. (즉, 60 분의 전체에 대한 데이터를 수집하는) 데이터의 여섯 10 분 블록들을 수집하기 위해 컴퓨터 소프트웨어의 기본 데이터 수집 매개 변수를 설정하고 적절한 날짜, 파일명, 및 마우스의 ID 번호를 입력한다.
  5. 모든 매개 변수가 설정되면, prebeam 검사를 실행합니다. 실이 통과하지 않는 경우는이 때문에 중앙 사분면 분할 또는 테스트 챔버의 가난한 정렬에 가장 가능성이 확인 prebeam. 이 경우, 중앙 사분면 디비 재정렬센서가 더 이상 차단되지 않으며 시스템이 테스트 챔버가 준비 될 때까지 없다는 데르와 테스트 챔버. 이 문제가 해결되지 않을 경우, 기기의 사용 설명서를 참조합니다.
  6. 모든 테스트 실 준비가되면, 조심스럽게 자신의 홈 케이지에서 마우스를 제거하고 즉시 시험 챔버에 그 사람이나 그 여자를 배치합니다. 마우스의 ID를 참고하고 컴퓨터에 입력 한 것과 일치해야합니다.
  7. 모든 동물이 적절하게 테스트 챔버에로드되면, 각 챔버의 상부에 뚜껑을 배치합니다. 그런 데이터 수집을 시작하기 위해 컴퓨터 소프트웨어에 적절한 명령을 선택한다. 이 때, 분석기 및 컴퓨터 소프트웨어는 데이터 수집 매개 변수에 따라, 기록 활동 수준을 시작할 것이다.
  8. 시험 기간의 나머지 부분에 대한 시험 공간을 둡니다.
  9. (즉, 60 분 이상) 시험 기간 종료 후, 즉시 검사실로 복귀. 데이터를 저장하고 그들의 존경에 각 동물을 반환필자 홈 케이지.
  10. 살균제 및 종이 타월로 모든 유닛을 청소합니다.
    참고 : 여러 세션이 매일 실행되는 경우, 철저하게 각 세션 사이에 각 시험 챔버를 청소합니다.
  11. 수출 스프레드 시트에 데이터를 입력 한 다음 소프트웨어 프로그램을 종료합니다.
  12. 그들이 기록 된 보장하기 위해 데이터를 확인합니다. 데이터가 기록되지 않은, 또는 동물이 데이터 수집 시간주기의 전체에 걸쳐 잤다 경우, 데이터 수집의 여분의 일을 수행한다.
    주 : 동물은 그것이 전체 60 분의 시험 기간에 걸쳐 이동하지 않으면 "수면"으로 간주된다.
  13. 반복은 4 일 연속 2.1-2.12 단계를 반복합니다.
    주 : 동물 연구의 기간에 걸쳐 여러 시점에서 시험하는 경우, 습관화을 방지하기 위해 한 달에 한 번 이상 열기 필드 활동 측정을 수행하지 않습니다. 또한, 무작위로 새로운 상자로 각 세션을 동물을 할당합니다. 연구의 기간에 걸쳐 상자 할당을 추적 할 수 있습니다.

3 데이터 분석

  1. 평균 수평 활동 (단위), 수직 활동 (단위)를 계산, 총 거리 (cm) 이동 시간 (초), 마우스 및 그룹 별 휴식 시간 (초)을 여행했다. 컴퓨터 소프트웨어는 계산하고 데이터 수집 기간 (예 : 60 분)에 대한 이상 총 수평 활동 (단위), 수직 활동 (단위), 총 주행 거리 (cm), 이동 시간 (초), 휴식 시간 (초)을보고 각 마우스입니다. 데이터 수집의 사일에서 상기 각 매개 변수에 대한 평균을 계산합니다.
  2. 모든 통계 분석을 수행하기에 앞서, 사피 빌크-테스트를​​ 이용하여 상기 데이터의 정상 성을 평가하고, 그루브의 테스트를 이용하여 특이점을 확인. 의미있는 아웃 라이어 (P <0.05)를 제거합니다.
  3. 정규 분포 데이터의 경우, 다중 비교를 위해 조정 P-값 의존과 독립 샘플 t-테스트 또는 편도 ANOVA 및 사후 시험을 사용하여 그룹 간의 비교 수단처리 군의 전체 수에 보내고.
  4. 비 - 정규 분포 데이터의 경우, 윌 콕슨 순위 합 시험 또는 처리 군의 전체 수에 따라 다중 비교를 위해 조정 P-값을 생성 가진 이상 Kruskal-월리스 시험 및 순위 합 시험을 사용하여 그룹 간의 중간 값을 비교한다.

Representative Results

열기 필드 활동 데이터를 분석 할 때, 우리는 일반적으로 기관차 기능을 반영하는 활동 수준에 대한 평가를 제공하는 몇 가지 선택 측정에 초점을 맞 춥니 다. 이러한 매개 변수는 다음과 같습니다 가로 활동, 수직 활동, 이동 시간, 휴식 시간, 여행 총 거리. 일반적으로, 감소 된 근육 기능을 가진 동물은 덜 활성 및 하부 외래 활성을 갖는 것이다. 이것은 일반적으로 수평 활성, 활성 수직, 전체 이동 거리와 이동 시간의 감소와 연관되며, 나머지 시간을 5,6,12,17 증가된다. 반대로, 손상되지 않은 근육 기능 또는 근육 병리 열화의 진행을 저하 치료제로 처리 된 것과 동물은 높은 활성 수준 6,7,14,17을 표시 할 가능성이 높다.

신경 근육 질환의 동물 모델에서이 프로토콜을 이용하여 얻어진 결과의 전형적인 예를 도시하기 위해, 우리는 길이 w 연구로부터의 데이터를 구비전자 이전에 Dy2J 선천성 근이영양증 (CMD) 동물 모델 6에서 실시했다. 즉, Dy2J 모델은 뒷다리 마비, 탈수 초화, 그리고 이영 골격 근육의 변화를 초래 LAMA2 유전자의 절단 된 형태로 포함되어 있습니다. 활동 수준에서이 근육 병리의 영향이 마우스에서 관찰된다. 예를 들어, 연구 Dy2J 마우스는 하부 수평 활동 수준을 보이는 경향이 덜 거리는 연구 기간에 걸쳐 그들의 연령 및 성별 - 매치 BL / 6 야생형 콘트롤 (도 2)에 비해, 이동; 그러나 이러한 차이가 항상 유의하지 않았다. 의미의 부족으로 인해 BL6 데이터의 작은 샘플 크기 및 높은 인트라 그룹 변동 때문일 수있다. 변화가 열려 현장 활동 자료의 전형이다; 이 그룹은 서로 통계적으로 다른 경우 그러나, 특정 부족 충분한 전력에서 이러한 데이터를 확인합니다. 일반적으로 N = 10-12는 S를 검출하는 데 사용되어야tatistically 유의 한 차이 5,17입니다. SJL 연구에서 수행되었을 때 더 큰 샘플 크기가 사용되는 예를 들어 군 사이에 유의 한 차이가 관찰 될 수있다 (그림 3B, 3D 및 3E의 두 번째 BL6 바 참조). Dy2J 동물들도 뒷다리 마비 미러 수직 활동 수준의 완전한 손실을 보였으며, 차례, 뒷면에 무능력 (그림 2B) 6. 마지막으로, 상기 활동 수준에서 성별 차이를 주목하는 것이 중요하다. 예를 들어, 암컷 수평 활동, 세로 높은 수준의 활동을 표시하는, 남성보다 더 활성 경향, 총 거리 (도 2)를 이동; 그러나 이러한 차이는 통계적으로 유의하지 않았다.

우리는 또한 행동에 영향을주는 여러 가지 추가 요소를 강조 할뿐만 아니라, 신경 근육 질환의 다른 동물 모델에서 실시 이전의 여러 연구에서 데이터를 제공하고 있습니다의 ivity 수준 (그림 3). 예를 들어, 활동 수준은 유전 적 배경 (10)에 따라 다릅니다. BL10 야생형 마우스는 큰 활성 수평, 수직 활성, 연령 및 성별 및 비교가 BL6 야생형 마우스 (그림 3)와 일치 전체 이동 거리를 나타낸다. 이 사용할 수없는 데이터를 렌더링 할 수있는 연구에 잘못된 제어 계통을 활용으로, 주목해야 할 중요한 관측이다. 둘째, 활동 수준은 질병 모델 및 표현형 (그림 3)에 따라 다릅니다. 예를 들어, SJL 마우스, 사지 거들위한 동물 모델은 근이영양증-2B (LGMD-2B)는, Dy2J 마우스 및 MDX 마우스, 뒤 시엔 느위한 동물 모델에 이어 수평 활성 및 여행 총 거리의 낮은 수준을 나타낸다 근이영양증 (그림 3A, 3C). 그러나 Dy2J 마우스는, 때문에 뒷다리 마비의 수직 활동 (그림 3B)의 가장 낮은 수준을 표시합니다. 그것은의 높은 수준의주의하는 것도 중요하다MDX 표현형의 활동은 대부분 BL10 배경 균주의 증가 된 활동 수준에 기인한다. 마지막으로,이 도면은 테스트시 동물 나이 / 질환 병리의 중요성을 강조한다. 예를 들어, 30 세 주에, 차이는 MDX 마우스와 자신의 나이와 성별이 일치 BL10 야생형 컨트롤 (그림 3) 사이의 활동 수준에서 감지 할 수 없습니다. 그러나 생후 6 주에, MDX 마우스 모델에서 피크 괴사 상 주위 MDX 마우스는 수직 활동에서 유의 한 감소, 수평 활동을 표시합니다. 감소는 여행 총 거리에서 관찰됩니다 만, 그러한 차이가 큰 (그림 3) 아니다 4.

그림 1
그림 1 열기 필드 활동 장치.을 열고 두 필드 센터 사중와 장치들NT를 분할, 그리고 정상. 이동식 중심 사분면 분배기가 있으면, 동물은 (4 2) 각 박스의 유효한 수치를 얻기 위해 시험 중에 전방 좌측 (1, 3) 및 후면 우측 방에 배치해야한다.

그림이
그림 2 열기 필드에 활동 자료. Dy2J에 대한 일반적인 오픈 현장 활동 자료 (회색 선, N = 3) 및 나이와 성별에 일치 BL6 제어 변형 (검은 선, N = 3) 마우스 (14)에서, 19, 23, 25, 나이의 30주 (A - F)) 수평 활동 (임의 단위) 남성, B) 수평 활동 (임의 단위) 여성, C) 수직 활동 (임의 단위) 남성, D) 수직 활동 (임의 단위) 여성. E) 총 거리 trave주도 (cm) 남성, E) 총 거리 (cm) 여성을 여행했다. 데이터는 4 일 연속 동안 수집 및 마우스와 그룹별로 평균 하였다. 동일한 마우스는 각 시점에서 시험 하였다. 데이터는 ± SEM을 의미 나타냅니다. 데이터는 이전에 6을 발표했다. Dy2J 및 BL6 마우스는 각 시간 지점에서의 독립 샘플 T-test로 비교 하​​였다. P-값 <0.05으로 유의하다고 하였다. * p <0.05, ** p <0.01, *** p <0.001.

그림 3
그림 3 열기 필드에 활동 자료 여러 변종 남성 BL10에서 일반적인 행동 활동 자료 (6 세의 주, 8 명, 연령 25 ~ 30 주 N = 10)., MDX (6 세의 주, N = 9; 25 ~ 30 세의 주, N = 15) Dy2J 마우스에 대한, BL6이 (대조군, n = 3, 제어 SJL 마우스에 대한 그룹 N = 13), Dy2J (N = 3), 및 SJL (N = 13) 마우스 버지니아의.) 수평 활동 (임의 단위) 6에서 BL10 및 MDX 마우스의 데이터와 시대의 25~30주 나이를 rying, B) 수평 활동 (임의의 단위)의 25~30주에서 BL6, Dy2J 및 SJL 마우스 데이터 나이, C) 수직 활동 (임의 단위) 6에서 BL10 및 MDX 마우스의 데이터와 연령 25 ~ 30 주 D) 수직 활동 (임의 단위) 시대의 25~30주에서 BL6, Dy2J 및 SJL 마우스 데이터 , E)은 총 이동 거리 (cm) 총 주행 거리 BL10 및 6에서 MDX 마우스와 연령 25 ~ 30 주 및 F)의 데이터 (cm) 시대의 25-30주에서 BL6, Dy2J 및 SJL 마우스 데이터 . Dy2J, BL6 배경에 라미닌의 α2 유전자 변이 CMD에 대한 동물 모델; SJL, 사지 띠 근 위축증-2B (LGMD-2B)에 대한 동물 모델; MDX, BL10 배경에 DMD를위한 동물 모델. 더 dysferlin 자족 SJL 컨트롤이 없습니다. 데이터는 SEM ± 수단이다. B, C, 및 D 데이터는 이전 PUBLI 포함6,17을 흘렸다. 데이터는 일반적으로 분산되지 않았다; 따라서, 데이터는 윌 콕슨 순위 합 시험을 이용하여 비교 하​​였다. P <0.05의 P-값은 유의 한 것으로 간주 하였다. 다음 비교는 각 매개 변수에 만들어진 :) 시대의 육주에서 BL10 및 MDX 마우스, P <0.05; b)는 나이 25 ~ 30 주 후에 BL10 및 MDX 마우스, 중요하지; C) Dy2J 및 BL6 나이, p <0.05 25 ~ 30 주에 제어 변형 쥐를 일치; 라) SJL 및 BL6 나이, P <0.001 25 ~ 30 주에 컨트롤의 피로를 일치; 나이 25주 연령 및 BL6 (Dy2J 마우스에 대한 대조군) 마우스의 25-30주에서 전자) BL10 마우스, P <0.01; 나이 25~30주, P <0.001에서 나이와 BL6 SJL 마우스에 대한 (대조군)의 25~30주에서 F) BL10.

Discussion

오픈 필드 활성 측정은 신경 근육 질환 6,7,11-14의 동물 모델에서 질병의 진행 및 약물의 효능을 평가하기위한 도움이 될 수있는 생체 내 분석이다. 도 2에 도시 된 바와 같이, 일반적 기관차 기능을 반영하는 활동 수준의 평가를 제공한다. 이것은 임상 약물 연구에서 수행 할 수있는 이상적인 2 차 또는 보조 결과를 측정하고 근육의 강도와 다른 측정입니다. 또한,이 연구 기간 전반에 걸쳐 여러 번 수행 될 수있다 (15) 임상 적, 비 침습적 측정 값이다. 그러나, 행동 및 기관차 활성은 또한 오픈 필드 활동 데이터의 변동을 만드는 (즉, 실험자 처리, 환경 조건, 및인지)뿐만 아니라 부가적인 요인에 의해 영향을 받는다. 본 논문의 목적은 변화를 줄이고 결과 다 할 수있는 잘 테스트 및 표준화 된 프로토콜을 제공하는 것입니다우리의 분야에서 번역을 강화 희망, 여러 실험실에서 ompared.

이 법안의 가장 큰 단점은 매우 다양하고 많은 외부 요인에 의해 영향을 것입니다. 프로토콜을 개발할 때 그러나, 우리는 고려 사항으로이했다. 우리는 데이터 수집의 1~5일 기간에 이르기까지 테스트 다양한 프로토콜을 평가 하였다. 결국, 우리는 이전 데이터 수집에 악기 순응을 수행하는 시험 챔버 환경에 동물을 숙지하고 데이터 수집을 수행 사일 크게 결과 데이터 (5)에 변형의 양을 감소하는 것으로 판단. 이 프로토콜은 원래 MDX 마우스 모델에서의 행동 및 기관차 활동 수준을 평가하기 위해 디자인되었다; 그러나이 프로토콜은도 6과 같은 최근 Dy2J 동물 모델에서 검증되었다. 이 프로토콜은 임상 시험에서 사용하기에 앞서 각각의 동물 모델에 대한 실험실 내에서 표준화 될 것을 제안한다.

열기 필드의 활동은 유전 적 배경 (17), 성별 18 ~ 20, 18 세, 그리고 생체 리듬 (21)에 따라 다릅니다. 이것은 동시에 평가되는 같은 연령, 성별, 유전 적 배경의 동물을 필요로한다. 계획 단계 동안,주의 생각이 부과됩니다 오픈 몇 살이나 나이 필드 활동 수준 결정에 투입해야한다. 각각의 동물 모델은 심각도에 나이 6,15 (그림 2와 그림 3)에 따라 다릅니다 만의 독특한 질병의 진행 및 기관차 및 행동 표현형을 가지고 있습니다. 따라서, 오픈 필드 활성 측정을 평가하기 위해 임상 적 및 조직 학적으로 중요한 시점을 결정하는 것이 중요하다. 통계적으로 유의 한 차이를 검출하기 위해 각각의 처리 군에 필요한 동물의 총 개수뿐만 아니라 동물 모델, 연령, 성별에 의해 변화한다. 결과적으로, 관련 샘플 크기 계산하여 결정하는 데 또한 계획 단계 동안 수행되어야각 처리 군에 필요한 동물의 총 개수 중첩에 통계적으로 유의 한 차이를 검출한다. 이러한 계산은 또한 연구에 사용 고려 추가적인 결과 측정 (예를 들면, 악력 측정 또는 조직 학적 분석)을 고려한다. 우리의 힘의 계산에 기초하여, 우리는 일반적으로 치료 그룹 당 10 ~ 12 동물을 사용합니다. 또한, 특별한주의 연구에 사용되는 것을 제어 변형에 지불해야한다. 전임상 연구에서 사용될 부적절한 제어 균주 경향이있다. 예를 들어, BL6 마우스는 종종 MDX 쥐 대조 균주로 사용된다; 그러나, MDX 마우스 BL10 배경에 있습니다. 도 3에 도시 된 바와 같이, BL10 마우스는 훨씬 활성이 불가능 MDX 및 BL6 데이터를 비교할 수 있도록 BL6 마우스,보다하다. MDX 쥐 임상 시험을 수행 할 때, BL10 마우스는 대조 균주로 사용되어야한다. 연구 Dy2J 마우스 실시되는 경우 또한, BL6 마우스는 CONTR으로 사용되어야한다올 변형.

작은 환경의 변화도 크게 활동 수준에 영향을 미칠 수있다. 이들은 조명, 온도, 습도, 냄새, 소음, 인간 활동 4,15을 포함한다. 따라서, 테스트를 동시에 매일 5에 비 직접 조명 및 온도 - 습도가 제어 된 실내에서 수행하는 것이 매우 중요하다. 시험 챔버는 균일하게 방 전체에 간격 및 직접 조명 아래 또는 그림자 또는 어두운 구석 오에 배치되지해야합니다. 동물 무작위 공간에 걸쳐 환경 조건 변화의 영향을 줄이기 위해 매일 그들의 시험 챔버에 할당되어야하고, 이들은 종래의 데이터 수집을 10-30 분 동안 시험장에 적응하도록 허용한다. 상자 / 환경에의 영향을 동일하게 다른 치료 그룹 사이에 분산 될 수 있도록 연구의 기간에 걸쳐 각 동물의 상자 할당을 추적해야합니다. 애니 마로드 개인테스트 챔버 및 연구 기간에 걸쳐 동물에 운반 LS는 치료군 멀게하고, 동물 균주시 가능해야한다. 많은 경우에 영향을 유전자형 관련 컨트롤에서 현저하게 상이하고, 눈을 멀게하는 것은 불가능합니다. 그러나, 개인은 항상 치료 및 치료 그룹 사이의 눈을 멀게한다. 또한, 모든 개인은 객실 내에서 잡음 및 혼란을 줄이기 위해 데이터를 수집하는 동안 공간을 확보해야하며, 모든 챔버들은 철저 데이터 수집 각 세션 다음 세척한다. 이러한 작업은 크게 데이터의 변화를 줄일 수 있습니다. 그것은 동물도 적응 (15)에 매우 민감주의하는 것이 중요합니다. 따라서 동물이 한 달에 한 번 이상은 평가하지 데이터를 직접 수집의 60 분 매일 그 열기 필드의 활동 수준 다음 시험 챔버에서 제거하는 것이 좋습니다.

총 이동 거리와 총 이동, 표준 시간 측정은 가장 민감한 열기 필드 활성 측정 5 경향이있다. Dy2J 모델에서 수직 활성 측정은 가장 민감한 열기 필드 활성 측정 (도 3) 경향이있다; 그러나, 작은 동물에서 정확한 수직 활성 측정을 포착하기가 어려울 수있다. 예를 들어, 작은 동물 사육 동작을 나타낼 것이며, 센서에 의한 센서의 수직 높이에 포착되지 않을 수있다. 결과적으로, 우리는 이전 시대의 오주 이상의 시험 동물을 권장하지 않습니다. 그것은 동물 데이터 수집 세션 기간에 걸쳐 잘 것 또한 가능하다. 이 경우, 그것은 데이터 수집의 추가 일을 추가하는 것이 적절하다. 마지막으로, 상자 내에서 상한 분할 또는 센서의 막힘 가난한 정렬뿐만 아니라 부정확 한 데이터가 발생할 수 있습니다. 따라서, 다음 단의 모든 데이터를 테스트에 앞서, 센서 PreCheck를 수행 및 검토하는 것이 중요각 데이터 수집 세션.

열기 필드 활동 데이터를 분석 할 때주의 사항은주의해야한다. 오픈 필드 활동 데이터는 비 - 정규 분포하고 4 특이점을하는 경향이있다. 어떤 통계 분석을 수행하기 전에, 우리의 biostatisticians 매우 정상과 이상 값에 대한 데이터를 확인하는 것이 좋습니다. 데이터가 아닌 정규 분포를하는 경우, 하나의 수단을 비교할 때 비모수 테스트를 활용하는 것이 좋습니다. 또, 모든 데이터가 처리 군이 무엇 멀게 개별적으로 분석한다.

전반적으로, 오픈 필드 활동 측정의 주요 장점이 있습니다) 강하게, 그러나 항상 기관차 기능과 상관 관계가 모두 전위 행동 활동의 포괄적 인 평가입니다; B)이 수행 할 수있는 쉬운 측정이다 C)는 테스트 중에 동물 처리를 필요로하지 않는다; D)는 STU의 기간에 걸쳐 한 번 이상 수행 할 수있는 비 침습적 측정은DY; E) 특별한 훈련이 시험을 수행하기 위해 필요하지 않다; f)의 여러 동물 한번에 테스트 될 수있다; 및 g)는 임상 적 결과를 측정 5,16이다. 치료제를 테스트 할 때 그러나, 다른 요소는 동물의 행동에 영향을 차례로 오픈 필드 활동을 측정 할 수 있다는 점에 유의하십시오. 마약 및 CNS 또는 신체의 다른 넓은 영향을 미칠 수 있고, 동작은 환경 스트레스에 의해 영향을받을 수있다. 그 결과, 기관차 또는 행동 활동 수준의 변화가 근육 기능의 변화, 근력과 관련된, 또는 약물 부작용의 결과 인 경우를 구별하기 어려울 수있다. 따라서, 추가, 기능 조직 학적 및 또는 분자 분석은 물론 수행되어야한다. 이 표준화 된 프로토콜은 성공적으로 다른 근육 질환 4,17을 이용하고있다; 도 3에서 볼 수 있듯이 그러나, 파일럿 연구는 동물에서 측정의 감도를 평가하기 위해 초기에 수행되어야모델입니다.

Disclosures

저자가 공개하는 게 없다.

Acknowledgments

이 책은 치료 CMD, 프랑스어 근육 Distrophy 협회 (AFM), 근육 영양 장애 협회, 건강 (1K26RR032082, 1P50AR060836-01, 1U54HD071601, 2R24HD050846-06)의 국립 연구소, 국방부에서 병진 연구 보조금 (자금을 통해 W81XWH-11-1-0330, W81XWH-11-1-0782, W81XWH-10-1-0659, W81XWH-11-1-0809, W81XWH-09-1-0599) 및 부모 프로젝트 근육 Distrophy에서 파일럿 부여 ( PPMD).

이 논문은 선천성 근육 질환 분야에서 일상적으로 사용하는 방법에 대한 표준 운영 절차의 일련의 몇 가지 중 하나입니다. 그것은 노력이 워싱턴 DC 4 월 2013 년에 개최 된 최근 선천성 근육 질환 컨소시엄 워크숍에서 선천성 근육 질환 분야에서 20 개 이상의 전문가들에 의해 논의 설립 반영

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment
VersaMax Open Field Activity Monitoring system with acrylic test chambers, and X, Y, Z axis sensors AccuScan Instruments, Inc. Columbus Ohio, USA Retired
Fusion Open Field Activity Monitoring system with acrylic test chambers, and X, Y, Z axis sensors Omnitech Electronics, Inc. Columbus Ohio, USA Suggested system currently on the market
Computer Dell, Inc. 
Materials
Virkon-S Broad spectrum disinfectant (potassium peroxymonosulfate/ sodium chloride) Pharmacal Research Laboratories, Inc.
Mice
B6.WK-Lama2dy-2J/J (Dy2J) Jackson Lab 000524
C57BL/6J (BL6) Jackson Lab 000664
SJL/J (SJL) Jackson Lab 000686
C57BL/10ScSn-Dmdmdx/J (mdx) Jackson Lab 001801
C57BL/10ScSnJ (BL10) Jackson Lab 000476

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References

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