زراعة

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

عادة ما يزرع C. ايليجانس على لوحات أجار الصلبة أو السائلة في الثقافات المصنف مع E. القولونية. لمنع المنتجات الثانوية البكتيرية من التباس الدراسات السمية والغذائية، ونحن تستخدم وسيلة السائل ممحوضة، CeHR، لتنمو ومزامنة عدد كبير من الديدان لمجموعة من التطبيقات المصب.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Samuel, T. K., Sinclair, J. W., Pinter, K. L., Hamza, I. Culturing Caenorhabditis elegans in Axenic Liquid Media and Creation of Transgenic Worms by Microparticle Bombardment. J. Vis. Exp. (90), e51796, doi:10.3791/51796 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

في هذا البروتوكول، ونحن تقديم المواد المطلوبة، وإجراءات لجعل C تعديلها. legans ه التعويد والاستنساخ وسائل الإعلام (mCeHR). بالإضافة إلى ذلك، فإن الخطوات لفضح والتأقلم C. ايليجانس نمت على E. وصفت وسائل الإعلام القولونية إلى ممحوضة السائل. أخيرا، والتجارب التي تستخدم المصب ممحوضة C. توضيح ايليجانس الفوائد من هذا الإجراء. القدرة على تحليل وتحديد C. وقد تجلى ايليجانس شرط المغذيات التي تنمو N2 البرية من نوع الديدان في وسائل الإعلام السائل ممحوضة مع اختلاف تركيزات الهيم. يمكن تكرارها هذا الإجراء مع المواد المغذية الأخرى لتحديد تركيز الأمثل للنمو الدودة والتنمية، أو لتحديد الآثار السمية للعلاجات الدوائية. وتم تحديد آثار تركيزات الهيم متنوعة على نمو البرية من نوع الديدان من خلال الملاحظة المجهرية النوعية وquantitating ركان عدد من الديدان التي نمت في كل تركيز الهيم. بالإضافة إلى ذلك، تأثير تركيزات المغذيات متنوعة يمكن أن يعاير من خلال الاستفادة من الديدان التي تعبر عن أجهزة استشعار الفلورسنت التي تستجيب للتغيرات في العناصر الغذائية من الفائدة. وعلاوة على ذلك، تم إنتاج عدد كبير من الديدان بسهولة لتوليد C. ايليجانس المعدلة وراثيا باستخدام microparticle القصف.

Introduction

الديدان الخيطية التربة وانواع معينة ايليجانس، هو كائن نموذج قوي يستخدم في العديد من الدراسات من علم الوراثة لعلم السموم. نتيجة لحجمه 1 مم، الوقت جيل السريع لأربعة أيام، وسهولة زراعة، وأرقام ذرية كبيرة، وقد تم استخدام هذه الديدان الخيطية في عدد من شاشات الوراثية والدوائية 1، 2. الباحثون الاستفادة من هذه الدودة لتحديد الجزيئات ومسارات المحفوظة في نظم الفقاريات. وتشمل هذه المسارات إشارات موت الخلايا، ومسارات الشيخوخة والتمثيل الغذائي، والجهاز العصبي 3-6. بالإضافة إلى ذلك، شفافية C. ايليجانس يسمح لتوليد خطوط المعدلة وراثيا باستخدام بروتين فلوري للصحفيين، والتي يمكن تصور مباشرة لتحليل أنماط التعبير الجيني والبروتين التعريب.

في العديد من الدراسات ومثقف هذه الديدان الخيطية على سطح القائم على أجار الصلبة باستخدام الديدان الخيطية متوسطة النمو (NGM) لوحات أو في لترالثقافات iquid المصنف مع كولاي كمصدر للغذاء 7،8. ويمكن لهذه المصادر الغذائية البكتيرية نخلط الدراسات البيوكيميائية وعلم السموم مع تدخل من البكتيريا من المنتجات التي تؤثر على تفسير النتائج. من أجل تجنب هذه الآثار المركبة، C. ايليجانس يمكن تربيتها في وسائل الإعلام السائل ممحوضة أن يخلو من البكتيريا كمصدر للغذاء. باستخدام هذه الوسائط، ونحن مثقف بنجاح الملايين من الديدان متزامنة للغاية بالنسبة للعديد من المعايير C. ايليجانس البروتوكولات بما في ذلك تحليل ميكروأري الجينات ينظم بشكل مختلف في C. ايليجانس يتعرضون لتركيزات مختلفة الهيم، وإنتاج الديدان المعدلة وراثيا باستخدام القصف الجينات. ويعرف كيميائيا هذه الوسائط ومعدلة من وصفة الأصلي صاغها الدكتور اريك كليج 9. باستخدام هذه الوسائط mCeHR، حددنا الجينات المسؤولة عن الهيم التوازن بنجاح، ويشار إلى الجينات كما تستجيب الهيم (HRG ق) 10، التي من شأنها أنلم يكن ممكنا في ظل ظروف النمو العادية التي تستخدم لوحات أجار NGM المصنف مع E. القولونية.

في هذا البروتوكول وصفنا الإجراء لإدخال وصيانة C. ايليجانس نمت على E. كولاي إلى mCeHR ممحوضة واستخدام هذه الطريقة للحصول على عدد كبير من الديدان المعدلة وراثيا لإنتاج C. خطوط ايليجانس باستخدام microparticle القصف. كما أننا الدراسات الحالية التي تظهر جدوى استخدام وسائل الإعلام ممحوضة لتحديد الاحتياجات الغذائية للC. ايليجانس باستخدام الهيم كمثال على ذلك. تظهر هذه الدراسات أن استخدام وسائل الإعلام mCeHR يسمح للنمو السريع في عدد كبير من C. ايليجانس للعديد من التطبيقات المستخدمة من قبل الباحثين المصب دودة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. سلالات دودة

  1. الحصول C. ايليجانس wildtype سلالات بريستول N2 من مركز علم الوراثة انواع معينة (CGC) (http://www.cbs.umn.edu/cgc) والمحافظة عليها على لوحات NGM المصنف مع E. كولاي سلالة OP50 7. ملاحظة: الدودة المعدلة وراثيا سلالات IQ6011 (Phrg-1 :: GFP) المستخدمة تم إنشاؤها كما هو موضح سابقا 11. يمكن طلب IQ6011 من مؤلف كتاب المقابلة.

2. إعداد التعديل C. ايليجانس إسكان والاستنساخ متوسطة (mCeHR)

إعداد وسائل الاعلام mCeHR السائل كما هو موضح أدناه 12. هذه الوسائط السائل ممحوضة يسمح الديدان في النمو دون أي مصادر غذائية إضافية. تنفيذ جميع التلاعبات السائل وسائل الإعلام ممحوضة والديدان ممحوضة باستخدام ظروف معقمة بشكل صارم مثل غطاء تدفق الصفحي.

  1. الحصول على الحليب المبستر الخالي من الدهون جدا من متجر البقالة. استخدام الموالية المبردةالقناة وليس المنتج درجة حرارة الغرفة. قبل استخدامها في mCeHR المتوسطة، خط الحليب على الدماغ القلب تسريب (بهي) أجار لوحات واحتضان لمدة 3 أيام في 30 درجة مئوية و 37 درجة مئوية للتحقق من العقم. نقل الحليب إلى 50 مل أنابيب معقمة وتخزينها في -80 درجة مئوية
  2. إعداد كل عنصر من العناصر التالية والجمع في النظام والمبالغ الممنوحة لتحضير 1 لتر من mCeHR (الجدول 1A): 10 مل من حمض ثنائي القاعدة 2 مم الكولين السيترات، 10 مل من الفيتامينات وعامل النمو مزيج (انظر الوصفة في الجدول 1B)، 10 مل من 2.4 ملي ميو اينوزيتول، 10 مل من 2 ملي كلوريد همين، 250 مل من الماء منزوع الأيونات. تطبيق الشفط والتصفية من خلال وحدة مرشح 0.22 ميكرون.
  3. إضافة 20 مل من مزيج الحمض النووي (وصفة في الجدول 1C)، 100 مل من مزيج المعادن (وصفة في الجدول 1D)، و 20 مل من 170 ملغ / مل ألبومين اللبن حلامة، 20 مل من الأحماض الأمينية الأساسية، و 10 مل من غير الأمينية الأساسية الأحماض، 20 مل من 450 ملي KH 2 PO 50 مل من 1.45 M مد الجلوكوز، 10 مل من 1 M HEPES، ملح الصوديوم، 250 مل من الماء منزوع الأيونات.
  4. تطبيق شفط لتصفية تعقيم المكونات. إزالة عامل التصفية وإضافة 1 مل من 5 ملغ / مل الكولسترول. تأكد من أن الرقم الهيدروجيني للسائل الإعلام ما يقرب من 6-6.5. ملاحظة: يمكن تخزين هذا الحل في -80 درجة مئوية لمدة سنة واحدة.
  5. إضافة 20٪ (ت / ت) فائقة المبستر الحليب الخالي من الدسم العضوية إلى متوسطة mCeHR قبل الاستخدام. استخدام تقنية معقمة بدقة (على سبيل المثال في غطاء تدفق الصفحي) عند فتح وaliquoting الحليب. تخزين وسائل الاعلام في 4 درجات مئوية.

3. إعداد C. ايليجانس للثقافة في ممحوضة mCeHR السائل متوسطة

  1. تنمو الديدان على عشرة 60 ملم لوحات NGM حتى هناك العديد من الديدان حامل والحد الأدنى من OP50 E. القولونية على لوحات.
  2. إزالة الديدان من كل لوحة من قبل الشطف مع 5 مل من العازلة M9 (وصفة في الجدول 1F)، والجمع بين في أنبوب 50 مل المخروطية.
  3. السماح للديدان لياليettle من خلال ترك أنبوب للوقوف لمدة 5 إلى 10 دقيقة ثم إزالة بعناية طاف يحتوي على E. القولونية.
  4. كرر الخطوات من 3.2 و 3.3 2X لإزالة أكبر قدر من البكتيريا المتبقية ممكن قبل مواصلة الإجراء.
  5. resuspend والديدان في 0.1 N كلوريد الصوديوم في وحدة تخزين متعددة من ثلاثة، على سبيل المثال 1.5 مل، 3 مل أو 6 مل فيه الديدان الفردية يمكن أن ينظر في الأنبوب.
  6. تبييض الديدان بإضافة 5 N هيدروكسيد الصوديوم و 5٪ هيبوكلوريت الصوديوم (مبيض) حل في نسبة 01:02:06 إلى تعليق دودة. على سبيل المثال، 1 مل 5 N هيدروكسيد الصوديوم: 2 مل 5٪ هيبوكلوريت الصوديوم: 6 مل من تعليق دودة. مزيج من هيدروكسيد الصوديوم والتبييض قبل إضافة إلى تعليق دودة.
  7. دوامة الحل بقوة حتى يتم حل الديدان وحامل البيض فقط مرئية داخل تعليق (حوالي 5 إلى 10 دقيقة). رصد عملية باستخدام المجهر النقيض من المرحلة مع الهدف 10X.
  8. بعد الديدان قد حلت تماما، بيليه على الفورالبيض في 800 x ج لمدة 45 ثانية في 4 درجات مئوية. إزالة طاف بيليه وشطف مرتين مع 10 مل من الماء المعقم بواسطة الطرد المركزي بيليه في 800 x ج لمدة 45 ثانية في 4 درجات مئوية.
  9. بعد التبييض، ونقل بيليه البيض إلى 25 سم 2 الأنسجة قارورة الثقافة تحتوي على 10 مل من وسائل الإعلام mCeHR تستكمل مع 100 ميكروغرام / مل التتراسيكلين. تنفيذ هذا الإجراء باستخدام تقنيات العقيمة. إذا رغبت في ذلك، إضافة المضادات الحيوية إضافية، بما في ذلك 250 ميكروغرام / مل حمض الناليديكسيك، لمنع نمو البكتيريا في الثقافات السائل ممحوضة.
  10. احتضان الثقافات السائل عند 20 درجة مئوية في حاضنة تهتز في حوالي 70 دورة في الدقيقة.
  11. تحقق الديدان يوميا لاحظ مرحلة من مراحل التنمية ومعدل النمو.
    ملاحظة: سوف تنمو الديدان في البداية ببطء وتتطلب من 7 إلى 10 يوما لتصبح حامل. لكن، وكما التأقلم الديدان إلى الوسط السائل ووقت توليد تنخفض إلى حوالي 4 أيام لwildtype (N2) الديدان.
  12. بعد الديدان ديك ديفيمتخطى إلى مرحلة حامل السائل في وسائل الإعلام، ونقل الثقافة الدودة إلى أنبوب مخروطي الشكل وبيليه في 800 x ج الديدان لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية باستخدام الدوار الدلو المتأرجح.
  13. إزالة طاف وبلطف resuspend الكرية دودة في حجم مساو من 0.1 M كلوريد الصوديوم. على سبيل المثال، استخدم 10 مل من كلوريد الصوديوم 0.1 M للديدان تربيتها في 10 مل من mCeHR. السماح للديدان لتسوية لمدة 5 دقائق على الجليد.
  14. تنفيذ الإجراء التبييض كما هو موضح أعلاه في الخطوات 3،5-3،8، والسماح الديدان أن تنمو لجيل الثاني في وسائل الإعلام السائل ممحوضة. إذا لزم الأمر، إضافة المضادات الحيوية مرة أخرى لتثبيط نمو البكتيريا.
  15. نسمح مرة أخرى لتصبح الديدان حامل ثم بيليه و resuspend الديدان في 0.1 M كلوريد الصوديوم كما هو موضح في الخطوات 3.12 و3.13، ثم تبييض مرة أخرى كما هو موضح في الخطوات 3،5-3،8، لإنتاج السكان متزامنة. تنمو الديدان اليرقات L1 في وسائل الإعلام دون المضادات الحيوية السائلة من الآن فصاعدا.

4. مزامنة الديدان من السائلثقافة

  1. بيليه و resuspend الديدان في 0.1 M كلوريد الصوديوم كما هو موضح أعلاه في الخطوات 3.12 و3.13. التبييض كما هو موضح أعلاه في الخطوات 3،5-3،8.
  2. resuspend الكرية البيض في 10 مل من العازلة M9 والسماح لليرقات أن يفقس O / N عند 20 درجة مئوية على منصة دوارة شاكر. ملاحظة: سوف يفقس البيض إلى يرقات L1، ولكن لن تتطور أبعد من ذلك، مزامنة الديدان في مرحلة L1.
  3. للحفاظ على الديدان وثقافة فرعية، بيليه L1 اليرقات في 800 x ج لمدة 5 دقائق، ثم resuspend واليرقات في 10 مل من mCeHR ونقل إلى 25 سم 2 القارورة. السماح للديدان أن ينمو بمعدل 20 درجة مئوية على منصة دوارة. الحفاظ على الكثافة القصوى من / 3،000 الديدان مل / سم 2 لضمان التغذية الكافية للديدان.
    ملاحظة: في هذه المرحلة، لا يطلب من المضادات الحيوية للحفاظ على الظروف ممحوضة عندما تتم الإجراءات خارج باستخدام تقنيات معقمة في غطاء تدفق الصفحي. يجب فحص الديدان اليومية لرصد النمو.

5. الحرةزينغ وذوبان الثقافات الديدان لممحوضة متوسطة

  1. تجميد ممحوضة الثقافات دودة أو غير متزامن متزامنة اليرقات L1 في النيتروجين السائل. الديدان بيليه في 800 x ج لمدة 5 دقائق ثم resuspend في S العازلة (6.45 ملي KHPO 43.55 ملي KHPO 146.25 ملي مول كلوريد الصوديوم) باستخدام 0.5 مل لكل قارورة. إضافة حجم مساو من S العازلة مع 30٪ ت / ت الجلسرين إلى كل قارورة ونقل الديدان إلى -80 ° C قبل التخزين على المدى الطويل في السائل N 2. تجميد ما يقرب من 1 × 10 6 الديدان لكل مل في كل قنينة.
  2. ذوبان الجليد الديدان التي يحتضنها قارورة عند 37 درجة مئوية لمدة حوالي 2 دقيقة حتى يتم ذاب كلها تقريبا من الجليد. في غطاء تدفق الصفحي، ونقل الديدان إلى قارورة معقمة تحتوي على mCeHR ووضعها في 20 درجة مئوية.

6. تحديد تأثير هيمن التركيز على النمو والتكاثر في mCeHR

  1. استخدام وسائل الإعلام mCeHR ممحوضة لفحص النمو تعتمد المغذيات من C. ايليجانس. لتحديد تأثير سو تركيز هيمن على نمو دودة والتنمية، واستخدام متزامنة الديدان N2 ممحوضة أو سلالات أخرى من الفائدة. مزامنة اليرقات L1 كما هو موضح أعلاه في القسم 4.
  2. في اليوم التالي، بيليه والاعتماد متزامنة اليرقات L1 وتمييع إلى 1 دودة في ميكرولتر من وسائل الإعلام ممحوضة. جعل 10 ملي كلوريد همين في 0.3 M NH 4 OH وضبط درجة الحموضة إلى 8 باستخدام حمض الهيدروكلوريك المركز.
  3. إضافة 800 ميكرولتر من وسائل الإعلام mCeHR إلى 24 لوحة جيدا. إضافة 100 الديدان إلى كل بئر في 100 ميكرولتر من وسائل الإعلام. إضافة كلوريد هيمن على كل بئر في تركيزات تتراوح من 0 ميكرومتر، ميكرومتر 1.5 ميكرومتر إلى 1،000 في ثلاث نسخ. التأكد من أن جميع الآبار تحتوي على نفس التركيز من 0.3 M NH 4 OH. معلق بلطف الديدان قبل pipetting للضمان أن 100 L1 اليرقات تضاف إلى كل بئر.
  4. دراسة الديدان اليومية ونلاحظ النمو في كل التركيز في كل بئر. حساب عدد من الديدان بعد 9 أيام من الحضانة ورسم عدد من الديدان / مل المقابلة لكل الهيمتركيز (الشكل 1).

7. تأثير هيمن التركيز على الاستشعار هيم الديدان

  1. احتضان متزامنة L1 الديدان استشعار الهيم (Phrg-1 :: GFP) في mCeHR تحتوي على 4 ميكرومتر، ميكرومتر 8، 10 ميكرومتر و 20 ميكرومتر هيمن.
  2. الصورة الديدان باستخدام مضان المجهري متحد البؤر، 48 ساعة آخر الحضانة (الشكل 2).

8. الاستفادة mCeHR لتوليد المعدلة وراثيا C. ايليجانس عن طريق قصف Microparticle

ملاحظة: الإجراء لتوليد وتنفيذ microparticle القصف باستخدام UNC-119 (ED3) الديدان نمت في mCeHR ويرد في الشكل 3 13.

  1. إعداد دودة
    1. نقل ما يقرب من 1 × 10 6 متزامنة UNC-119 (ED3) الديدان في 90 مل من وسائل الإعلام mCeHR في 175 سم 2 قارورة أسبوع واحد قبل القصف. السماح للديدان أن ينمو بمعدل 20 درجة مئوية سغ يهز منصة في ~ 70 دورة في الدقيقة (الشكل 3-1).
      ملاحظة: بعد أسبوع واحد، وينبغي أن تكون كثافة دودة أكبر بكثير مع العديد من الكبار الديدان حامل. وسوف تكون هناك حاجة حوالي 3 × 10 7 الديدان لmicroparticle القصف.
    2. البرد JM109 E. المصنفة القولونية 10 سم لوحات NGM على الجليد.
    3. نقل الديدان ممحوضة إلى أنبوبين 50 مل المخروطية والطرد المركزي الديدان في 800 x ج لمدة 2 دقيقة. نضح طاف و resuspend الديدان في كل أنبوب في 50 مل من العازلة M9 (الشكل 3-2).
    4. السماح للالديدان البالغة لتكوير عن طريق الجاذبية لمدة 10 إلى 15 دقيقة على الجليد.
      ملاحظة: يجب أن يحتوي على 2 مل بيليه الآن> 90٪ الديدان البالغة. يجب أن يكون هذا بيليه 2 مل ما يقرب من 5 × 10 6 الديدان ويكفي لأحد القصف microparticle.
    5. معطف كامل سطح JM109 المبردة المصنفة NGM وحة مع بيليه 2 مل من الديدان. تسمح السائل لاستيعابها تماما ثم يترك لوحةلمدة 30 دقيقة على الجليد قبل الشروع (الشكل 3-3).
  2. إعداد جزيئات الذهب
    1. تزن 30 ملغ من جزيئات الذهب في أنبوب microcentrifuge siliconized. إضافة 1 مل 70٪ من الإيثانول ودوامة أنبوب لمدة 5 دقائق.
    2. السماح للأنبوب على الجلوس لمدة 15 دقيقة، ثم الطرد المركزي في 6000 x ج لمدة 10 ثانية لتكوير جزيئات الذهب. إزالة طاف باستخدام طرف ماصة عن طريق لمس بعناية تلميح إلى الجانب المعاكس من أنبوب إلى جزيئات الذهب.
    3. غسل جزيئات الذهب مع 1 مل من الماء المعقم، دوامة لمدة 1 دقيقة، وأجهزة الطرد المركزي لفترة وجيزة في الأنبوب 6،000 x ج لمدة 10 ثانية. كرر الخطوة غسل مرتين، ثم resuspend وجزيئات الذهب في 0.5 مل من 50٪ معقمة الجلسرين.
      ملاحظة: إن تركيز النهائي من جزيئات الذهب يكون 60 ملغ / مل ويمكن تخزينه ل1-2 أشهر في 4 درجات مئوية.
  3. تحضير مزيج الجسيمات الحمض النووي الذهب
    1. الجمع بين 10 ميكروغرام من الحمض النووي البلازميد المطلوب مع 10 و# 956؛ غرام من البلازميد الانقاذ UNC-119 في siliconized 1.5 مل أنبوب microcentrifuge. إضافة 50 ميكرولتر من المياه DI و 100 ميكرولتر من معلق كذلك حل الجسيمات الذهب ثم دوامة لمدة 1 دقيقة.
    2. إضافة 150 ميكرولتر من 2.5 M و CaCl 2 ودوامة الحل مرة أخرى لمدة 1 دقيقة. لهذا الحل، إضافة 60 ميكرولتر من 0.1 M سبيرمدين ودوامة لمدة 3 إلى 5 دقائق.
    3. نبض الطرد المركزي الحل في 6،000 x ج لمدة 10 ثانية، وإزالة طاف وإضافة 300 ميكرولتر من الايثانول 70٪. دوامة جيدا لمدة 1 دقيقة، الطرد المركزي نبض في 6،000 x ج، وإزالة طاف و resuspend في 170 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 100٪. دوامة بقوة الحل لمدة 5 إلى 10 دقائق ثم نبض الطرد المركزي وإزالة طاف.
  4. القصف (الشكل 3-3)
    ملاحظة: يتم تنفيذ هذا البروتوكول بها مع نظام التسليم الجسيمات المحدد في جدول المواد / المعدات. اتبع الإرشادات للصك تسليم الجسيمات المتاحة.
      <لى> ضع ورقة من المناديل الورقية إلى 15 سم لوحة. باستخدام الملقط، وتراجع سبعة macrocarriers بشكل فردي في الإيثانول بنسبة 100٪ ويضعونها على الأنسجة لتجف.
    1. تماما تنظيف غرفة biolistic، حامل macrocarrier، ولوحة الهدف مع الايثانول 70٪. نظيفة والأوتوكلاف شاشات التوقف قبل كل إجراء القصف.
    2. تحميل macrocarrriers في حامل باستخدام الملقط والصحافة في حامل باستخدام أداة جلوس.
    3. موزعة بالتساوي 20 ميكرولتر من الحمض النووي المغلفة جزيئات الذهب في وسط كل macrocarrier ومن ثم السماح الحل حتى يجف تماما.
    4. تنظيف شطري المفرق الضغط مع الإيثانول والتجمع مع الإيثانول تنظيف الأقراص تمزق. المسمار المفرق الضغط تجميعها والأقراص تمزق في غرفة القصف.
    5. تجميع شاشة التوقف تعقيمها مع حامل macrocarrier ووضع الجهاز إلى الرف المعادن المطلوبة وقفل في مكان.
    6. إدراج هذه السن الدنيا تجميعهاجهاز ocarrier في غرفة biolistic في الفتحة المخصصة تحت ضغط مقسم ومقسم تتلاءم مع الضغط.
    7. الشريط لوحة NGM مفتوحة مع الديدان على لوحة الهدف الجرف وإغلاق باب الغرفة.
    8. لقصف الديدان، وضبط الضغط إلى أن هناك حاجة لكسر الأقراص تمزق. بدوره على فراغ إلى 28 بوصة من الزئبق الضغط، ثم اضغط على زر اطلاق النار حتى تمزق الأقراص.
    9. الافراج عن فراغ وإزالة لوحة NGM من الجهاز. غسل الديدان من لوحة توزيع والعشرين في 10 سم لوحات NGM المصنف مع JM109 E. القولونية (الشكل 3-4).
    10. تسمح الديدان أن تنمو لمدة 10 إلى 14 يوما عند 25 درجة مئوية وتجويع لوحات. سوف الديدان انقاذهم من الخلل UNC-119 لها الحركة الطبيعية، ويمكن تحديدها في هذا الوقت. اختيار لا يقل عن 10 "wildtype" الديدان من لوحات منفصلة لمزيد من التحليل وهذه تمثل خطوط المعدلة وراثيا المستقلة (الارقام ..ه 3-5).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

زراعة C. ايليجانس في ممحوضة المساعدات المتوسطة السائل في تحديد العناصر الغذائية التي يتطلبها الديدان، ودون تدخل من المركبات الثانوية التي تنتجها E. القولونية. الديدان Wildtype N2 تأقلم على وسائل الاعلام mCeHR ضمن ثلاثة أجيال وتظهر نمو مماثلة لالديدان نمت على لوحات NGM البكتيرية. في الواقع، هذه الديدان أصبحت حامل في غضون 4 أيام بالمقارنة مع 3.5 أيام للديدان نمت على البكتيريا OP50.

واعتبر احد الاستفادة من استخدام mCeHR في الدراسات التي درست متطلبات المغذيات الدقيقة لهذه الديدان 14. في الشكل 1 كانت تزرع الديدان في mCeHR تستكمل مع كميات متزايدة من الهيم، وتصل إلى 1 ملم. أظهرت الملاحظات من هذه الديدان تأخير واضح في النمو بتركيزات أقل من 4 ميكرومتر الهيم، مع الديدان النامية إلى مرحلة اليرقات L4 كنها غير قادرة على التقدم إلى مرحلة حامل بعد تسعة أيام في mCeHR. بتركيزات من 10 ميكرومتر و 2056؛ M الهيم الديدان تطوير لمرحلة حامل في 4 أيام وإنتاج عدد كبير من ذرية. ولوحظ أن الحد الأقصى لعدد النسل عندما كانت تزرع الديدان في mCeHR تحتوي على 20 ميكرومتر الهيم. واصلت الديدان لتطوير وإنتاج ذرية في 100 ميكرومتر و 500 ميكرومتر الهيم. ومع ذلك، فإن عددا من ذرية اليرقات انخفضت بشكل ملحوظ بالمقارنة مع الديدان نمت في تركيز الهيم الأمثل لل20 ميكرومتر الهيم. أسفرت تركيزات الهيم عند أو فوق 800 ميكرومتر في التقزم، الديدان مريضا في مرحلة اليرقات L3، التي أشارت إلى أن هذه التركيزات الهيم كانت سامة للديدان.

بالإضافة إلى تحديد تركيز الهيم الأمثل وتأثير الحرمان الهيم وسمية الهيم على C. النمو ايليجانس، يمكن أن تستخدم سلالات مراسل الهيم لتقييم الوضع بشكل غير مباشر الهيم من دودة داخل نطاق تركيز أصغر. الدودة هي دودة IQ6011 المعدلة وراثيا التي تعبر عن الهيم استجابة مراسل النسخي، P-1 HRG > :: GFP، التي تعبر عكسيا GFP ردا على تركيزات الهيم البيئية. عندما يتعرض لهذه الدودة الهيم منخفض على البيئة في mCeHR، يتم التعبير عن GFP للغاية. يتم عكس هذا الرد في ظل ظروف مليئة الهيم، كما رأينا في الشكل 2. يتم قمع التعبير GFP في 20 ميكرومتر الهيم وزيادة تركيز الهيم كما انخفضت. التغييرات التدريجية في تركيز الهيم يمكن ربط بدقة مع استجابة الجينات والتعبير في وسائل الإعلام mCeHR.

بالإضافة إلى كونها قادرة على السيطرة بعناية تركيزات المغذيات التي قدمت إلى دودة، mCeHR سائل الإعلام ممحوضة يسمح لنمو فعالة من عدد كبير من الديدان متزامنة. يمكن استغلال هذه الميزة لmicroparticle القصف (الشكل 3). باستخدام هذا الإجراء خط متكامل واحد على الأقل وضعت كل من القصف microparticle نفذت (الجدول 2).

ن = صفحة "دائما"> الشكل 1
الشكل 1. C. ايليجانس منحنى النمو الهيم. كانت تزرع الديدان في مجموعة من تركيزات الهيم من 0 إلى 1،000 ميكرومتر ميكرومتر في mCeHR لمدة 9 أيام. وقد أحصى عدد الديدان في كل تركيز وتآمر. في 1.5 ميكرومتر كانت الهيم تركيزات الديدان L4 وغير قادر على مواصلة تطوير. في 800 ميكرومتر الهيم تم توقف الديدان في مراحل L2-L3 وأظهرت آثار سمية الهيم.

الرقم 2
الشكل 2. استجابة من أجهزة الاستشعار الهيم (Phrg-1 :: GFP) سلالة لتركيزات مختلفة الهيم في mCeHR. تزامن المعدلة وراثيا C. كانت تزرع ايليجانس معربا عن HRG-1 :: GFP في وسائل الإعلام mCeHR تستكمل مع 4، 8، 10، أو 20 ميكرومتر الهيم لمدة 48 ساعة. وقد أخذت صور مع زايس LSM 710 confocaل المجهر. شريط المقياس هو 100 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 3
الرقم 3. تخطيطي من القصف microparticle في C. تزرع ايليجانس باستخدام UNC-119 الديدان نمت في mCeHR. (1) ما يقرب من 3 × 10 7 UNC-119 (ED3) الديدان في 90 مل mCeHR سائل الإعلام. (2) سمح Gravids ليستقر على الجليد لمدة 10-15 دقيقة في أنابيب مخروطية 50 مل. (3) انتشر A بيليه 2 مل من ما يقرب من 5 × 10 6 الديدان حامل بالتساوي على لوحة NGM غير المصنف. وقد قصفت الديدان مع 12 ميكروغرام من البلازميد من الاهتمام و6 ميكروغرام من UNC-119 البلازميد الانقاذ المعقد للجزيئات الذهب. (4) Tوقال انه تم تقسيم قصفت الديدان على عشرين 10 سم لوحات المصنف مع E. كولاي سلالة JM109. (5) بعد 2 أسابيع الحضانة عند 25 درجة مئوية، وقد تم اختيار لوحات مع نوع البرية الديدان لتحليل التحوير قوة التعبير ومعدلات العزل.

إيه "> الجدول 1DIGN: مركز "> 1E الجدول
1A الجدول
CeHR، 1 L
باستخدام تقنية معقمة و1 L (0.22 ميكرون) وحدة تصفية فراغ، تحديد الكميات التالية من الحلول الأوراق المالية والمياه في الامر الذي وصفه.
الكولين حمض ثنائي القاعدة سيترات 10 مل
الفيتامينات وعامل النمو مزيج 10 مل
ميو اينوزيتول 10 مل
كلوريد همين 10 مل
الماء منزوع الأيونات 250 مل
مزيج الحمض النووي 20 مل
ميكس المعدنية 100 مل
ألبومين اللبن حلامة 20 مل
الأحماض الأمينية الأساسية ميكس 20 مل
غير الضرورية الأحماض الأمينية ميكس 10 مل
KH 2 PO 4 20 مل
D-جلوكوز 50 مل
HEPES، ملح الصوديوم 10 مل
الماء منزوع الأيونات 250 مل
وسوف يكون حجم 800 مل في هذه المرحلة
إزالة وحدة مرشح من فراغ ثم إضافة:
كولسترول 1 مل
الحليب الخالي من الدسم فائقة المبستر 200 مل
الجدول 1B
الفيتامينات وعامل النمو المزيج، 100 مل
الحل 1: 60 مل من الماء الوظيفة:
N-أسيتيل α-D-الجلوكوزامين 0.15 ز
DL-ألانين 0.15 ز
نيكوتيناميد 0.075 غرام
D-pantethine 0.0375 غرام
حمض البانتوثنيك-DL، هيمي الملح الكالسيوم 0.075 غرام
حمض الفوليك 0.075 غرام
بيريدكسامين 2HCl 0.0375 غرام
البيريدوكسين هيدروكلوريد 0.075 غرام
فلافين وحيد النوكليوتيد، ملح الصوديوم 0.075 غرام
هيدروكلوريد الثيامين 0.075 غرام
الحل 2: إعداد المواد الكيميائية التالية في 5 مل 1 N KOH:
البارامينوبنزوئيك حمض 0.075 غرام
D-البيوتين 0.0375 غرام
سيانوكوبالامين (B12) 0.0375 غرام
حمض الفولينيك والملح الكالسيوم 0.0375 غرام
حمض النيكوتينيك 0.075 غرام
بيريدكسال 5 فوسفات 0.0375 غرام
الحل 3: 0.0375 ز (±) α-L-حمض ليبويك، شكل المؤكسد في 1 مل من الإيثانول:
الجمع بين الحلول 1، 2، و 3، وجلب الحجم النهائي إلى 100 مل. متجر في الظلام في 4 درجات مئوية أو تجميد aliquots في -20 درجة مئوية.
جعل كميات صغيرة من الاسهم لهذا المزيج بحيث يتم استخدامه بسرعة.
1C الجدول
مزيج الحمض النووي، و 100 مل
إلى 60 مل من الماء الوظيفة:
الأدينوساين 5 'أحادي، ملح الصوديوم 1.74 ز
سيتيدين 5 'فوسفات 1.84 ز
غوانوزين 2 '- و 3' أحادي 1.82 ز
أو
غوانوزين 5 'فوسفات 2.04 ز
يوريدين 5 'من الفوسفات، الصوديوم الملح 1.84 ز
الثايمين (إضافة مشاركة) 0.63 ز
تجلب الحل إلى 100 مل وتخزينها في الظلام في 4 درجة مئوية أو تجميد aliquots في -20 درجة مئوية.
جعل كميات صغيرة من الاسهم لهذا المزيج بحيث يتم استخدامه بسرعة.
المعدنية ميكس، 1 L
MgCl 2 • 6H 2 O 4.1 ز
سيترات الصوديوم 2.9 ز
البوتاسيوم سيترات مونوهيدرات 4.9 ز
CuCl 2 • 2H 2 O 0.07 ز
MnCl 2 • 4H 2 O 0.2 ز
ZNCL 2 0.1 ز
الحديد (NH 4) 2 (SO 4) 2 • 6H 2 O 0.6 ز
و CaCl 2 • 2H 2 O (دائما إضافة مشاركة) 0.2 ز
جعل كميات صغيرة من الاسهم لهذا المزيج بحيث يتم استخدامه بسرعة.
مكونات أخرى
KH 2 PO 4 450 ملي
الكولين ثنائي حمض سترات 2 مم
ميو اينوزيتول 2.4 ملي
D-جلوكوز 1.45 M
كلوريد همين 2 مم في 0.1 N هيدروكسيد الصوديوم 8.0 درجة الحموضة
HEPES، ملح الصوديوم 1 M حل الأوراق المالية
كولسترول 5 ملغ / مل في الإيثانول
ألبومين اللبن الأنزيمية حلامة 170 ملغ / مل
الجدول 1F
M9 العازلة، 1 L
KH 2 PO 4 3 ز
نا 2 هبو 4 6 ز
كلوريد الصوديوم 5 ز
H 2 O 1 L
الأوتوكلاف 30 دقيقة
1 M MgSO 4 (معقمة) 1 مل

الجدول 1. صفات لمكونات mCeHR وmCeHR.

قصف خطوط مع نوع البرية الإنقاذ خطوط مع الانقاذ / التحوير خطوط مستقرة
1 2 2 1
8 5 0
3 4 4 2
4 5 2 1
5 5 3 1
متوسط 4.8 3.2 1

الجدول 2. افيراجنرال الكتريك عدد المعدلة وراثيا C. ولدت ايليجانس باستخدام microparticle القصف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

في هذا البروتوكول نقدم ممحوضة mCeHR سائل الإعلام السائل تعديل يسمح السريع C. الجيل ايليجانس مع إنتاج عدد كبير من الديدان. ويبين هذا الإعلام العديد من المزايا كما تزرع الديدان دون تلويث E. كولاي أو مشتقات البكتيرية ويمكن استغلالها في الدراسات الغذائية والسمية. استخدام E. كولاي أو البكتيريا الأخرى في مثل هذه الدراسات لديها العديد من السلبيات. على سبيل المثال، يمكن للنمو البكتيريا تغيير في ظل ظروف مختلفة والبكتيريا قد استقلاب الجزيئات التي يجري يعاير، التباس تفسير النتائج. وبالتالي، فإن تطوير وسيلة محددة لتنفيذ هذه الدراسات هو مفيد للغاية.

على الرغم C. وقد نمت في وسائل الإعلام ايليجانس السائل في الدراسات السابقة 15 والديدان نمت في C. ايليجانس الصيانة المتوسطة (CEMM) تظهر تأخير متميزة في أوقات جيل 16، وعلى عكس ما كنا obseRVE في mCeHR المتوسط. كان هدفنا الرئيسي لاستغلال C. ايليجانس لدراسة توازن العناصر الغذائية مع التركيز بوجه خاص على الهيم والأيض المعدنية. مع هذا في الاعتبار، mCeHR والتعديلات الناتجة عن مجموعتنا تحقيق هذا الهدف، وأدى بشكل مباشر إلى تحديد عدد من الجينات المطلوبة للحفاظ على التوازن الهيم في نهاية المطاف ودودة في نظم نموذج الفقاريات 17، 18. ويمكن أيضا إعادة صياغة mCeHR-1 وسائل الاعلام يمكن استغلالها للأنواع النيماتودا الأخرى بما في ذلك Panagrellus redivivus، Oscheius myriophila، وC. remanei. بالإضافة تركيبات معدنية منخفضة mCeHR-2-3 وmCeHR يمكن استغلالها في الدراسات دراسة السمية ومتطلبات 12 المعادن الثقيلة.

قبل التأقلم، والديدان N2 يحمل الجيل قتا أطول من ما يقرب من 7 إلى 10 أيام في mCeHR سائل الإعلام. كما يتم subcultured الديدان، هذا الجيل الوقت تنخفض إلى 4 أيام، مماثلة لتلك التي نمت على الديدان OP50 البكتيريا. ومع ذلك، قد تكون هذه هي المرة الجيل أطول لبعض الديدان متحولة، ظاهريا بسبب عيوب في التغذية، والحركة، أو متطلبات غذائية محددة.

عند استخدام وسائل الإعلام السائل ممحوضة فمن الأهمية بمكان أن تقنيات معقمة وتستخدم الحساسية. عادة، يتم التقليل من استخدام المضادات الحيوية والقضاء عليها في نهاية المطاف كما التأقلم الديدان إلى متوسطة ويتم القضاء على البكتيريا المتبقية. هناك حاجة المضادات الحيوية في البداية للتأكد من أن الثقافات هي ممحوضة عندما أنشأت كما أنه يمنع نمو البكتيريا المتبقية التي يمكن أن تطغى على الثقافات دودة. بعد جولتين متتاليتين من التبييض، يتم حذف المضادات الحيوية من الثقافات كما الاستخدام المستمر للمضادات الحيوية أقنعة فقط تقنيات العقيم الفقراء التي هي ضرورية لنمو الديدان axenically. باستخدام هذه التقنيات في مجلس الوزراء تدفق الصفحي، كانت قادرة على النمو من الكتاب الديدان axenically دون تلوث. بالإضافة إلى ذلك، والتخزين السليم للميدالجيش العراقي وعناصر ضرورية لصيانة دودة والنمو. يجب فحص الديدان لمعدل النمو وsubcultured لمنع الازدحام، والتي يمكن أن تؤدي إلى تشكيل داور مع استنزاف المواد الغذائية الأساسية. هذا يمكن الوقاية منها عن طريق التأكد من أن كثافة الديدان لا يتجاوز 3،000 الديدان / مل / سم 2. الباحثون أن جديدا على تنامي C. ايليجانس axenically يمكن تحقيق هذا عن طريق التحقق من الديدان اليومية والأسبوعية عد الديدان.

C. ايليجانس الباحثين الاستفادة من خصائصه شفافة عن طريق توليد الديدان المعدلة وراثيا معربا عن علامات الموسومة fluorescently التي تسمح لتصور من التعبير الجيني والبروتين التعريب. وأشار الاستفادة القصف biolistic يسمح لجيل من integrants نسخة المنخفضة التي تجنب قضايا صفائف خارج الصبغي ومرتفعة التعبير الجيني مع البذور المعدلة وراثيا تم إنشاؤها باستخدام الحقن 19. سابقا، عيب واحد من البذور المعدلة وراثيا توليد باستخدامmicroparticle قصف C. كان ايليجانس شرط لإعداد لوحة البيض لتوليد عدد كبير من UNC-119 (ED3) الديدان اللازمة لإجراء 20. كل التحول المطلوب 20 لوحات البيض لعدد من الديدان الحاجة. باستخدام ممحوضة الثقافة السائل mCeHR يسمح نمو أكثر كفاءة وأكثر في وقت لاحق الديدان لعمليات القصف. بالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام القصف بالتزامن مع اختيار الدواء لتجنب استخدام UNC-119 (ED3) الديدان 21.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب تعلن عدم وجود مصالح أو تضارب في المصالح المالية المتنافسة.

Acknowledgments

وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للHealthGrants DK85035 وDK074797 (IH).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MgCl2•6H2O Sigma M-2393
Sodium citrate Sigma S-4641
Potassium citrate monohydrate Sigma P-1722
CuCl2•2H2O Fisher C455-500
MnCl2•4H2O Fisher M87-100
ZnCl2 Sigma Z-0152
Fe(NH4)2(SO4)2•6H2O Sigma F-1018
CaCl2•2H2O Fisher C70-500
Adenosine 5 -monophosphate, sodium salt Sigma A-1752
Cytidine 5 -phosphate Sigma C-1006
Guanosine 2' - and 3' -monophosphate Sigma G-8002
Uridine 5 -phosphate, disodium salt Sigma U-6375
Thymine Sigma T0376
N-Acetylglucosamine Sigma A3286
DL-Alanine Fisher S25648 
p-Aminobenzoic Acid Sigma A-9878
Biotin Sigma B-4639
Cyanocobalamine (B-12) Sigma V-2876
Folinate (Ca) Sigma F-7878
Niacin Sigma N-0761
Niacinamide Sigma N-3376
Pantetheine Sigma P-2125
Pantothenate (Ca) Sigma P-6292
Pteroylglutamic Acid (Folic Acid) ACRCS 21663-0100
Pyridoxal 5'-phosphate Sigma P-3657
Pyridoxamine 2HCl Sigma P-9158
Pyridoxine HCl Sigma P-6280
Riboflavin 5-PO4(Na) Sigma R-7774
Thiamine HCl Sigma T-1270
DL-6,8-Thioctic Acid Sigma T-1395
KH2PO4 Sigma P-5379
Choline di-acid citrate Sigma C-2004
myo-Inositol Sigma I-5125
D-Glucose Sigma G-7520
Lactalbumin enzymatic hydrolysate Sigma L-9010
Brain Heart Infusion BD 211065
Hemin chloride Frontier Scientific H651-9
HEPES, sodium salt Sigma H-3784
Cholesterol J.T. Baker F676-05
MEM Non-Essential Amino Acids Invitrogen 11140-076
MEM Amino Acids Solution Invitrogen 11130-051
Nalidixic acid sodium salt Sigma N4382
Tetracycline Hydrochloride MP Biomedicals 2194542
Biolistic Delivery System BioRad 165-2257
Gold particles (Au Powder)   Ferro Electronic Material Systems 6420 2504, JZP01010KM
or
Gold Particles 1.0 μm BioRad  165-2263

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kamath, R. S., et al. Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi. Nature. 421, 231-237 (2003).
  2. Nass, R., Blakely, R. D. The Caenorhabditis elegans dopaminergic system: opportunities for insights into dopamine transport and neurodegeneration. Annual review of pharmacology and toxicology. 43, 521-544 (2003).
  3. Lapierre, L. R., Hansen, M. Lessons from C elegans signaling pathways for longevity. Trends in endocrinology and metabolism TEM. 23, 637-644 (2012).
  4. Kenyon, C. The plasticity of aging insights from long-lived mutants. Cell. 120, 449-460 (2005).
  5. Vanfleteren, J. R., Braeckman, B. P. Mechanisms of life span determination in Caenorhabditis elegans. Neurobiology of aging. 20, 487-502 (1999).
  6. Poole, R. J., Bashllari, E., Cochella, L., Flowers, E. B., Hobert, O. A Genome-Wide RNAi Screen for Factors Involved in Neuronal Specification in Caenorhabditis elegans. PLoS genetics. 7, e1002109 (2011).
  7. Stiernagle, T. Maintenance of C elegans WormBook the online review of C. elegans biology. 1-11 (2006).
  8. Win, M. T., et al. Validated Liquid Culture Monitoring System for Lifespan Extension of Caenorhabditis elegans through Genetic and Dietary Manipulations. Aging and disease. 4, 178-185 (2013).
  9. Clegg, E. D., LaPenotiere, H. F., French, D. Y., Szilagyi, M. Use of CeHR Axenic Medium for Exposure and Gene Expression Studies. East Coast Worm Meeting. (2002).
  10. Severance, S., et al. Genome-wide analysis reveals novel genes essential for heme homeostasis in Caenorhabditis elegans. PLoS genetics. 6, e1001044 (2010).
  11. Rajagopal, A., et al. Haem homeostasis is regulated by the conserved and concerted functions of HRG-1 proteins. Nature. 453, 1127-1131 (2008).
  12. Nass, R., Hamza, I. Chapter 1 Unit 1 9. The nematode C. elegans as an animal model to explore toxicology in vivo: solid and axenic growth culture conditions and compound exposure parameters. Current protocols in toxicology editorial board, Mahin D. Maines. (2007).
  13. Schweinsberg, P. J., Grant, B. D. C. elegans gene transformation by microparticle bombardment WormBook the online review of C. elegans biology. 1-10 (2013).
  14. Rao, A. U., Carta, L. K., Lesuisse, E., Hamza, I. Lack of heme synthesis in a free-living eukaryote. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 4270-4275 (2005).
  15. Szewczyk, N. J., Kozak, E., Conley, C. A. Chemically defined medium and Caenorhabditis elegans. BMC biotechnology. 3, 19 (2003).
  16. Szewczyk, N. J., et al. Delayed development and lifespan extension as features of metabolic lifestyle alteration in C elegans under dietary restriction. The Journal of experimental biology. 209, 4129-4139 (2006).
  17. White, C., et al. HRG1 is essential for heme transport from the phagolysosome of macrophages during erythrophagocytosis. Cell metabolism. 17, 261-270 (2013).
  18. Chen, C., Samuel, T. K., Sinclair, J., Dailey, H. A., Hamza, I. An intercellular heme-trafficking protein delivers maternal heme to the embryo during development in C elegans. Cell. 145, 720-731 (2011).
  19. Praitis, V., Casey, E., Collar, D., Austin, J. Creation of low-copy integrated transgenic lines in Caenorhabditis elegans. Genetics. 157, 1217-1226 (2001).
  20. Berezikov, E., Bargmann, C. I., Plasterk, R. H. Homologous gene targeting in Caenorhabditis elegans by biolistic transformation. Nucleic acids research. 32, e40 (2004).
  21. Semple, J. I., Biondini, L., Lehner, B. Generating transgenic nematodes by bombardment and antibiotic selection. Nature Methods. 9, 118-119 (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics