I Vivo Mikroinjeksjon og Electroporation mus Testis

1Institute of Reproductive Biology, Leibniz Institute for Farm Animal Biology (FBN)
Published 8/23/2014
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

Denne artikkelen beskriver mikroinjeksjon og elektroporering av mus testis in vivo som transfeksjon teknikk for testikkelkreft museceller for å studere unike prosesser av spermatogenesen. Den presenterte protokollen innebærer trinnene i glass kapillær forberedelse, mikroinjeksjon via efferente duct, og transfeksjon av elektroporering.

Cite this Article

Copy Citation

Michaelis, M., Sobczak, A., Weitzel, J. M. In Vivo Microinjection and Electroporation of Mouse Testis. J. Vis. Exp. (90), e51802, doi:10.3791/51802 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Denne videoen og artikkelen bidrag gir en omfattende beskrivelse av mikroinjeksjon og elektroporering av mus testis in vivo. Denne spesielle transfeksjon teknikk for testikkelmuseceller tillater studiet av unike prosesser i spermatogenesen.

Den følgende protokoll fokuserer på transfeksjon av testikler museceller med plasmidkonstruksjoner. Nærmere bestemt, vi brukte reporter vektor pEGFP-C1, som uttrykker forbedret grønt fluorescerende protein (EGFP) og også pDsRed2-N1 vektor uttrykker rød fluorescerende protein (DsRed2). Begge kodede reporter genene var under kontroll av den humane cytomegalovirus umiddelbar-tidlig promoter (CMV).

For å utføre genoverføring inn i musetestikler, er reporter plasmidkonstruksjoner injisert i testikler hos levende mus. For å nå dette målet, er testis av en bedøvet dyret utsettes og området av mikroinjeksjon er forberedt. Vårt foretrukne sted forinjeksjon er den efferente duct, med til slutt koblet rete testis som den anatomiske transportrute av sædceller mellom testikkel og bitestikkel. På denne måten, blir fyllingen av de sædkanaler etter mikroinjeksjon utmerket administrert og kontrollert på grunn av bruk av farget DNA-løsninger. Etter å ha observert en tilstrekkelig fylling av testis det fargede tubulære strukturen, er det organ elektroporert. Dette muliggjør overføring av DNA-løsningen inn i testikkelceller. Etter tre dagers inkubasjon, blir testis fjernet og undersøkt under mikroskop for grønn eller rød fluorescens, som illustrerer transfeksjon suksess.

Vanligvis kan denne protokollen være ansatt for å levere DNA eller RNA- konstruerer til stue mus testis for å (eldre) uttrykte eller slå ned gener, tilrettelegging in vivo genet funksjonsanalyse. Videre er det egnet til å studere reporter konstruerer eller antatte genet regulaTory elementer. Dermed de viktigste fordelene med electroporation teknikken er rask ytelse i kombinasjon med lav innsats samt moderat teknisk utstyr og ferdigheter som kreves i forhold til alternative teknikker.

Introduction

Pattedyrspermatoge anses å være en sofistikert prosess med selv fornye stamceller suksessivt gjennomgår mitose, meiose og differensiering for å utvikle seg til modne haploide sædceller. Disse morfologiske endringer i scene av forskjellige celletyper, og til tross for dype forsøk, er det fortsatt umulig å etterligne disse prosessene i cellekultur 1,2. Derfor forskning på spermatogenesen inntil nå er avhengig av levende organismer som in vivo-modeller. Generelt blir genet funksjonsstudier vanligvis basert på transgene dyr. Men generere og opprettholde denne type dyremodell er tidkrevende, kostnadskrevende og ganske utførlig. Dette skyldes den nødvendige lange avl prosess for å generere og opprettholde transgenet gjennom generasjoner. I tillegg er den genetiske manipulering av hele organismen av den transgene eller knockout tilnærming tilbøyelige til å forårsake fysiologiske svekkelser ved målretting gEnes med viktige funksjoner i flere regioner, f.eks utenfor testikkel eller systemisk.

Videre er noen forbigående transfeksjonsmetoder forbundet med noen viktige ulemper. For eksempel typiske ulempene med virus-mediert genoverføring er mulig provokasjon av immunoreaksjoner og ekstra sikkerhetsforskrifter, mens lipofection 3 og mikropartikkel bombardement 4 kan skade vev og er begrenset til en bestemt celle dybde for tilstrekkelig transfeksjon effektivitet.

I kontrast, elektroporering (EP) som en annen vanlig måte å transient transfeksjon, synes å utgjøre et lovende teknikk for å muliggjøre in vivo transfeksjon og konsistent in vivo gen analyse. Generelt er EP referert til som en dynamisk fenomen som avhenger av lokale transmembrane spenning med følgelig medierte porer innenfor nanosekunder. Disse hullene kan opprettholdes i millisekunder, er tilstrekkelig to gi tilgang til DNA, RNA eller små molekyler fem. Når den tilførte spenning er for høy, er vanligvis forbigående karakter EP motvirkes på grunn av varmeproduksjonen og induksjon av altfor omfattende permeabilization med påfølgende irreversibel skade av cellen 5.

Her viser vi at elektroporering er en effektiv og økonomisk transfeksjon system som er i stand til å bli utnyttet for genetisk testis transformasjon for å belyse testikulære genet egenskaper in vivo. Denne artikkelen tar for plasmid forberedelse, mikroinjeksjon via efferente kanalen og den påfølgende elektroporering av mus testis. Denne fremgangsmåten kan være et middel til valg for å oppnå rask, bestemt og effektiv transfeksjon av sædkanaler av mus testis in vivo for å undersøke prosesser av spermatogenesen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle utført dyreforsøk har blitt godkjent av den lokale etikkutvalg (Landesamt für Landwirtschaft, Lebensmittelsicherheit und Fischerei, Mecklenburg-Vorpommern, Tyskland).

1. Plasmid Forberedelse

  1. For plasmid-preparat ved å bruke plasmid rensing kits (se Materialer tabellen) eller lignende fremgangsmåter med endotoksin fjerning buffer slik at immunreaksjoner av dyret kan unngås. Følg instruksjonene i bruksanvisningen. Ansett DDH 2 O for å fortynne plasmid løsning.
  2. Eliminere rusk ved å spinne DNA løsning med maksimal hastighet (20.000 xg). Deretter samle supernatanten.
  3. Bestem plasmid konsentrasjon med et spektrofotometer (se materialer).
  4. Juster plasmid konsentrasjon med DDH 2 O til 1-3 mikrogram (DNA) / mikroliter. Merk: Lavere konsentrasjoner vil redusere transfeksjon effektivitet, mens høyere konsentrasjoner kan føre til en for viskøs injeksjonsløsning. Dessutentransfeksjon effektivitet avhenger av størrelsen av plasmidet, og har til å bli testet individuelt.
  5. Før injeksjon forberede en løsning blandes med for eksempel 40 pl plasmid, sammen med 5 pl PBS (10x) og 5 pl Fast Grønn (0,5%). Fast Grønn er nødvendig for sporing av injeksjonsprosessen. Bruk gjerne tynne veggen PCR-rør eller Parafilm. Merk: Avhengig av størrelsen på testikler, et volum på 20-50 pl vil være nødvendig for hver testis.

2. Utarbeidelse av Mikroinjeksjon Pipette

  1. Bruk borosilikat kapillærer (se Materialer tabell) for utarbeidelse av mikroinjeksjon pipetter.
  2. Trekk glasskapillærer med en vertikal kapillær avtrekker (se Materialer tabell).
  3. Bryt kapillær spissen med tang etter mykt banding. Spissen er vanligvis 50-80 pm i diameter og ca 1 cm lang. Prøv å unngå tips som er for lenge disse ikke er stiv nok til å trenge inn i vevet.
  4. Endelig, sharpen spissen i en 30 ° til 45 ° vinkel ved hjelp av en mikropipette beveler (se Materialer tabell).
  5. Laste mikroinjeksjon pipette med injeksjonsoppløsningen mix (se Plasmid Forberedelse). Påfør løsningen inn på baksiden av glasset kapillær med en liten sprøyte. Merk: Prøv å unngå luftbobler under lasting, ellers vil disse bli injisert i sædkanaler sammen med plasmid løsning og dermed vil redusere ledningsevne samt muligens forårsake vevsskade.

3. Anestesi og kirurgi

  1. Utføre operasjonen under aseptiske betingelser ved hjelp av sterilt materiale (dvs. sprøyte, nål, kirurgiske instrumenter, etc.). Dette vil redusere infeksjon av dyret og sikre gode overlevelsesrater.
  2. Bruk hannmus for elektroporering i en alder av 6-8 uker.
  3. Å initial postsurgical smertestillende behandling, gi musen med analgetika lagt drikkevann på dagen før operasjonen. Dette assUres en preemptive analgesi i tilfelle svært sannsynlig postsurgical hypodipsia (redusert vanninntaket). For dette formål utsettes drikkevann med for eksempel en pediatrisk ibuprofen suspensjon (20 mg / ml). Den medisinert drikkevann skal også leveres på dag en og to av utvinning i identisk konsentrasjon. Dette betyr at en daglig dose på 7,5 mg / kg, gjelder for 5 ml / d drikkevann og kroppsvekt av 25 g i 8 uker i alderen C57BL / 6J. Denne smertestillende diett garanterer en fundamental smertelindring og akselerert utvinning sammen med høy velferd 26.
  4. For å forberede anestesi arbeidsløsning på operasjonsdagen, bland 10% Ketamin og 2% Xylazin i et 1: 1 forhold (se Materialer tabell).
  5. For å bedøve dyret, anvende 0,25 ml / 100 mg kroppsvekt av anestesi løsning subkutant (Ketamin = 0,125 g / kg; Xylazin = 0,025 g / kg). Bruk en injeksjonsstedet mellom bekken og lemmer for å hindre skader på indre organer og skade av musene. Vanligvis er 10 min trengsfør musen er dypt bedøvet.
  6. Dekk til muse øynene med veterinær salve for å hindre tørrhet under anestesi.
  7. Test dyp bedøvelse arrest, noe som er merkbart av en total mangel på respons. For dette formål, bare klemme på tåen av dyret.
  8. Å starte operasjonen, fjerne mage hår med en barbermaskin eller lignende og desinfisere operasjonsområdet med sterilium eller lignende.
  9. Foreta en ventral innsnitt direkte over dele seg kjertler i midten av mageområdet. På dette stedet, først dra huden vekk og gjennomføre en liten tverrgående kutan kutt på ca 8-14 mm. Deretter fortsetter langs abdominal muskulære laget.
    Merk: lesjon bør være så liten som mulig for å redusere skade på dyret.
  10. Trekk opp magefettputene nøye for å avsløre den vedlagte testis og plassere den på et tidligere forberedt vanntett disponibel papir drapere like ved snittstedet (Figur 2A).
  11. Bruk kikkert til find efferente kanalen når sprøytemålet. Ductus efferent er identifisert som den fine fartøy krysset mellom testikkel og bitestikkel. Det ligger ved siden av den fremtredende testikkelarterien. Ductus går nesten i en vinkel på 45 ° til arterien og synlig entrer caput epididymidis. Merk: Avhengig av musens alder, er ductus vanligvis begravd i fettvev.
  12. Bruk fin pinsett for å fjerne efferente duct av denne fettvevet. Etter det, plasserer utgitt ductus på et sterilt papir stripe for å sikre den klare sikten av kanalen uten å svekke omgivelser.

4. Mikroinjeksjon og DNA Application

  1. Koble mikroinjeksjon pipette, som er lastet med plasmidet løsning mikromanipluatoren / injektorenhet.
  2. Plasser mikroinjeksjon nålen parallelt med efferente kanal med spissen pekende mot rete testis (figur 2B).
  3. Bruk fin pinsett ogstripe duct over mikroinjeksjon pipette. Kontroller at kapillær holdes parallelt med kanalen mens du trekker den over.
    Merk: Denne prosedyren er mer praktisk enn å trenge inn i fartøyet ved å flytte nålen med micromanipulator.
  4. Direkte nålen forsiktig mot testiklene og stoppe akkurat som det trenger inn i rete testis rett under albuginea (figur 2C).
    Merk: I tilfelle av overreaching den rete testis, vil plasmidet løsning lekke inn i det interstitielle rom. Dette fører ofte til svikt i transfeksjon de sædkanaler.
  5. For injeksjon av plasmidet løsning utnytte microinjector med følgende innstillinger: pi: 100 hPa, ti: 0,2 sek, og pc: 0 hPa (figur 2D).
  6. Overvåke hele injeksjonsprosessen ved å observere testis fylling status ved hjelp av den grønne farge. Pass på at testiklene er bare fylt opp til 2/3 av sitt volum med plasmid løsning (figur 2E).
    Merk: Hvis injeksjonsvolum overskrides, kan testis vev bli skadet.

5. Electroporation av testikkel

  1. For å muliggjøre effektiv elektroporering, suge pinsetten elektroder i PBS (1x). Dette sikrer tilstrekkelig ledningsevne.
  2. Jevnt presse testis mellom de våte elektroder (Figur 2f). Måle den elektriske motstanden til electroporator.
  3. Påfør strøm til testis. Utfør åtte kvadrat pulser av 40 V på 4 forskjellige testis nettsteder med en konstant varighet på 50 msek pulstid og 950 msek intervalltiden.

6. lukking av sår og Post-kirurgi

  1. Når elektroporering er ferdig, plasserer testis tilbake i den opprinnelige plasseringen.
  2. Sy den indre muskulære laget med kirurgisk sutur (se materialer).
  3. Lukk huden ved å ansette sutur klipp (se Materialer tabell). Dra huden opp with pinsett. Sørg for å utelukke muskulære laget. Plasser klipsene, hver i en avstand på ikke mer enn 5 mm.
    Merk: Fordi kirurgisk sutur kan svelges av musen, er sutur klipp favoriserte for lukking av hudforandring.
  4. Tillat musen til å komme seg fra anestesi på sterile papirhåndklær som er lagt inn i et sterilt tom mus bur, som er varmebehandlet i en 37 ° C varm platen. Puten bør sikre oppvarming av den ene halvdelen av buret skape en varme-gradient. For dyret dette gjør det mulig å søke etter den enkelte, mest komfortabelt område på grunn av temperaturen variasjon i buret. I tillegg dekker mus med et ark av sterile papirhåndkle, slik at stress kan reduseres ytterligere. Merk: Siden musekroppsoverflate er usedvanlig høy i forhold til kroppsvekt, sammenlignet med større dyr, er den termiske støtte av spesiell betydning for en vellykket gjenoppretting av gnagere.
  5. Når det opererte dyret har fullt vekket, overfører jegt for videre oppgang til et fullt utstyrt ny mus bur. Ikke legg dyret tilbake til sitt gamle bur eller til en gruppe mus. Pass på at buret er så rene og sterile som mulig for å forhindre sårinfeksjon. Overvåke hele gjenopprettingsprosessen. Slik overfører du musen tilbake til dyret omsorg anlegget, vent til den er fullstendig restituert og ser ut til å oppføre seg normalt.
    Merk: Ytterligere per- og post-kirurgiske strategier er diskutert av Pritchett-Corning KR et al seks.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Den eksperimentelle omgivelser for å utføre mikroinjeksjon og elektroporering av mus testis in vivo som det er brukt i henhold til protokollen som er illustrert i figur 1. Selv om det er mulig å skaffe industrielt fremstilte mikropipetter, vi ønsket å generere egne pipetter ved å trekke (figur 1A ) og beveling (Figur 1b) glasskapillærer slik at de passet våre behov. Utstyr for mikroinjeksjon og elektroporering er illustrert i figur 1C. Av hensyn til effektiviteten av transfeksjon, er det av viktighet å benytte en firkantbølge electroporator.

Figur 2 viser de viktigste trinnene i muse kirurgi med spesielt fokus på utarbeidelse av efferent kanalen. I denne sammenheng testis er eksponert (figur 2A) og den efferente kanalen er identifisert av binokulær observasjon og frigjøres fra fettvev (Figure 2B). Derpå blir den efferente kanalen punktert med en mikroinjeksjon pipette og plasmidet oppløsningen administreres (figurene 2C-E). Til slutt blir den lastet testis klemt mellom to elektroder og transfektert ved anvendt firkantbølge pulser (figur 2f).

Denne in vivo transfeksjon tilnærming tillater bruk av forskjellige plasmider som koder for forskjellige rapportørgener. Her har vi brukt reporteren vektor pEGFP-C1 (figur 3A), som uttrykker forbedret grønt fluorescerende protein (EGFP) og også pDsRed2-N1 (Figur 3C) vektor slik transactivation av rødt fluorescerende protein (DsRed2). I vårt tilfelle, begge reporter genene var under kontroll av den humane cytomegalovirus umiddelbar-tidlig-promoteren (CMV).

For å evaluere transfeksjonen suksess ble microinjected og electroporated testikler høstet tre dager etter at hele fremgangsmåten, og observert i henhold elektronisk fcence mikroskopi (figur 3). For detaljert undersøkelse, testikler var formaldehyd-fast, dyppet i parafin, skiver (5 mikrometer) samt kontra med To-Pro-3, noe som resulterer i blå fargede kjerner. Til slutt ble de seksjoner undersøkt ved fluorescens-mikroskopi. To eksempler på mulige transfeksjon Resultatene kan sees i figur 4. Blir for ekspresjon av reportergen EGFP indikert av grønn fluorescens, er transactivation av DsRed2 betegnet med rød emisjon.

Figur 1
Figur 1. Utstyr for in vivo mikroinjeksjon og elektroporering av mus testis. Glasskapillærer dannes ved hjelp mikropipette avtrekker (A), mens spissene er skjerpet utnytte mikropipette beveler ( (C). I stedet for å ansette en kommersiell micromanipulator vi brukte en XYZ-krysstabell av et mikroskop og festet en enhet for å holde mikropipette. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2. illustrasjon av in vivo-testis mikroinjeksjon og elektroporering fortsetter i mus inkludert før kirurgisk inngrep. Tilgang til testis gis via åpning av musens abdomen som er bedøvet før. Kuttet er laget like over dele seg kjertler. Etter å ha avslørt testis, det er gitt ut fra magefett pa ds (B). Under binokulær observasjon, er den efferente kanalen identifisert og fett-fri. Den mikroinjeksjon pipette er plassert ved siden av ductus mens den skarpe enden av nålen peker mot efferente kanalen (B). Glasset kapillær er satt inn i ductus og beveges mot testis kan plasseres direkte i rete testis (C). Fremgangsmåten for påføring av DNA og fylling av de sædkanaler overvåkes ved hjelp av Fast Grønn (D). Bare 2/3 av testis blir fylt for å forhindre skade av vevet (E). For den endelige electroporation trinnet, er testis klemt mellom pinsett-type elektroder å gjelde elektriske firkantede pulser (F). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

"> Figur 3
Figur 3. Antall mount testikkel 3 dager etter in vivo electroporation Under fluorescens mikroskopi, transfektert testikkel av C57BL / 6 mus viser uttrykk for forbedret grønt fluorescerende protein -. EGFP (A) og rød fluorescerende protein - DsRed2 (C) både kodet på pEGFP- C1 og pDsRed2-N1 plasmid, respektivt. Ekspresjonen av både rapportørgener var under kontroll av den aktive ubiquitously CMV-promotor-element. Den effektive transfeksjon av de målrettede sædkanaler er demonstrert av fluorescens intensiteter. Paneler (B) og (D) illustrerer auto-fluorescens av untransfected kontroll testis. Scale bar = 1 mm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4
Figur 4. Delene av muse testis 3 dager etter unilateral in vivo elektroporering med pEGFP-C1-plasmidet. Transfeksjon utfallet av fast muse testis seksjoner (5 mikrometer) er vist tre dager etter unilateral electroporation med pEGFP-C1 plasmid. Vellykket transfektert testistubuli cellsare angitt med grønn fluorescens. TO-PRO-3 kontra kjerner kan påvises ved blå utslipp (A og B). De runde strukturer er typisk for organisering av celler i sædkanaler. Scale bar = 20 mikrometer. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Forskning på området reproduksjons biologi, spesielt i området av mannlig fertilitet og spermatogenese uunngåelig avhengig av levende organismer. For å undersøke testikkelfunksjon, har ingen tilfredsstillende cellekultur / in vitro-system er etablert i stand til å reflektere alle de avgjørende morfologiske endringer fra en diploid spermatogonium til en haploid moden spermatozoon 1,2. Således, er genereringen av genetisk modifiserte dyr ofte er en nødvendig og som sådan et verdifullt verktøy i å male reproduksjons biologi. For dette formål, et betydelig antall transgene, knock-out og knock-in mus har blitt opprettet som leverte innsikt i mannlig fruktbarhet. Likevel er generering av transgene mus vanligvis gjøres ved å injisere genet konstruerer inn i pronucleus av befruktede egg. Imidlertid er denne teknikken tidkrevende og er ment å bli utført av spesialiserte laboratorier. Fremgangsmåten for å generere knock-out eller knock-in dyrer enda mer sofistikert.

En annen måte å studere gen-funksjon av levende modellorganismer er av forbigående transfeksjon. Imidlertid kan det felles transduksjon med virale vektorer føre immunogene eller andre uspesifikke reaksjoner og krever spesielle sikkerhetsforskrifter. Lipofection 3 og mikropartikkel bombardement fire tilnærmingene er dessverre behersket til en bestemt celle dybde og selv kan utløse negative effekter på vev.

Ikke desto mindre, ved hjelp av direkte elektrisk anvendt firkantede pulser på målrettet vev, såkalt elektroporering, er det faktisk mulig å transfektere levende vev, f.eks heri mus testis. Dessuten krever denne metoden bare lave kostnader, lav utstyr og skikkelig dyktige lab personlig.

En annen bemerkelsesverdig fordel i forbindelse med in vivo transfeksjon metoder i forhold til varig-gen forandret dyr modusls er muligheten for co-transfeksjon. Mens transgen eller banke-mus vanligvis bærer bare én genkonstrukt gjør in vivo transfeksjon omfattende, samtidige analyser av ulike genet konstruksjoner innenfor samme celle. Dette kan gjøres ved bruk av ulike rapportørgener, f.eks GFP versus YFP eller Gaussia- versus Renilla-luciferase, slik at en sammenlignende undersøkelse av villtype og mutante genet effekter er mulig.

Videre, ved anvendelse av celletypespesifikke promotorer, ekspresjonen av gen-konstruksjoner kan utsøkt rettet på spesifikke celler i testis. For eksempel kan dette gi en testikkel genuttrykk bare i sertoliceller eller spermatocytter.

Protokollen som presenteres i denne artikkelen dekker to viktige metoder innen mannlig reproduksjonsbiologi. Den første er den mikroinjeksjon i sædkanaler med utarbeidelse av injeksjons kapillær. Dette technique har vært vanlig brukt i bakterie / stamcelletransplantasjon enten fra transgene dyr til mottakeren 7 eller i sammenheng med xenografting 8. Den andre metoden er electroporation transfeksjon stand til å indusere transient porene i plasmamembranen, så vel som en rettet strøm av bulk ladede molekyler som plasmider, som sikrer inngang til visse celler eller snarere vev. Denne bestemt retning av makromolekyler ved elektroporering er ofte verdsatt i ensidig nevrale celle transfeksjon ofte gjort i utero 9,10 eller i utviklingen av netthinnen 11.

Den foregående detaljerte metode protokollen omfatter som første avgjørende skritt anestesi av hannmus, framstillingen av testikkel via abdominal lesjon, fremstillingen av den efferente kanalen, så vel som mikroinjeksjon inn i ductus. Ettersom disse handlingene er ganske krevende, er det sterkt anbefalt å først øve på døde dyr før du utfører operations på levende mus. Videre er instruksjoner om hvordan du kan injisere og fylle sædkanaler med plasmid-DNA og hvordan gjennomføre electroporation av testis riktig.

På grunn av anvendelsen av elektrisitet under EP, kan varmeproduksjonen utløse vevsskade, spesielt ved høy spenning. Denne økning i transfeksjon effektivitet 12, 13, 15 ved forhøyet spenning er ledsaget av den negative effekten av testikulær krymper 12-14. Det mest gunstige spenningsområde synes å være mellom 30-50 V, som garanterer små effekter på testikkel integritet, en normal sperm kvalitet 16, en normal oppførsel parring 17, opprettholdelse av avkom produksjon evne 16 til 20 så vel som en tilstrekkelig transfeksjon effekt.

Angå genuttrykk intensitet av overførte genet konstruerer, Yomogida et al. 21 har også avdekket en markert redusert expression av lineariserte vektorer 3 dager etter EP gjennomføringen mens sirkulært plasmid-DNA åpenbart fremdeles opprett ekspresjon etter 35 dager med det høyeste en i sertoliceller. Dette tyder på at de beste resultatene oppnås ved bruk plasmidkonstruksjoner for elektroporering som gjøres her. I vår tilnærming, undersøkte vi transfeksjon effektivitet 3 dager etter elektroporering grunn av den observasjon at denne tidsperioden er tilstrekkelig for adekvat sårtilheling, oppreisning av celleintegritet, så vel som den ønskede riktig ekspresjon av rapportør proteiner EGFP og DsRed2. Dermed virker en inkubasjonstid på 3 dager etter kirurgisk inngrep og hele transfeksjon fremgangsmåte for å være nødvendig for å sikre riktig gjenopprettet cellefunksjoner, inkludert genekspresjon slik at et fluorescens-signal som intensivt som mulig kan oppdages noe som sikrer en pålitelig transfeksjon resultat. Angå transfeksjon effektivitet, har Yomogida et al. 21 avdekket at the somatisk Sertolicellene er tilsynelatende mer lydhør overfor EP-transfeksjon enn kjønnsceller. Vi anbefaler co-transfeksjon av testikkel med mål-og kontroll plasmider, som hver koder for en annen reporter gen.

Den presenterte electroporation tilnærmingen er gjeldende for et bredt spekter av mulige problemer henviser til mannlige bakterie celle og fruktbarhet prosesser. For eksempel kan det bli brukt for å analysere regulatoriske elementer av spermatogenesen spesifikke gener 17,22. Metoden er også egnet for tap-av-funksjon studier med små interfering RNA 23 og få-av-funksjon studier 24. I tillegg er det lovende sjanser til å selv oppnå EP for terapeutisk behandling og generering av transgene avkom som forskningsgrupper har allerede vist 18,20,25.

Derfor den illustrerte romanen metodiske tilnærming av mus testis in vivo electroporation i forbindelse med efferent duct microinjection av plasmidkonstruksjoner vil forhåpentligvis stige til en verdifull teknikk for å lykkes med å rakne natur spermatogenesen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Marten Michaelis, Alexander Sobczak, og Joachim M. Weitzel ansatt ved Institutt for Reproductive Biology, Leibniz Institute for Farm Animal Biology (FBN), Dummerstorf, Tyskland, erklærer at de ikke har noen konkurrerende økonomiske interesser.

Acknowledgements

Vi takker Birgit Westernstroeer av Centre of Reproductive Medicine og Andrologi ved Universitetet i Münster for undervisning i testikkelmikroinjeksjon. Dessuten er vi takknemlig for å Ursula Antkewitz og Petra Reckling for teknisk assistanse. Vi takker den tyske Research Foundation (DFG) for å støtte dette arbeidet (WE2458 / 10-1).  

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Centrifuge Sigma 1-15 PK
Spectrophotometer Nanodrop ND-1000
Micropipette puller Narishige PC-10 vertical capillary puller
Microinjection capillaries Clark GC100-10 borosilicate standard wall
Micropipette beveler Bachofer Typ 462 rotating disk beveler
Electroporator Nepagene CUY 21EDIT square wave electroporator
Tweezer electrodes Nepagene CUY 650P5 5 mm Ø disk electrodes
Stereo microscope Zeiss Stemi 2000-C
Cold light source Zeiss KL 1500LCD
Microinjection pump Eppendorf Femtojet
Micromanipulator homemade XYZ cross table
Surgical instruments FST scissors, forceps, needle holder
Fine forceps FST Dumont #5, #7 efferent ducts preparation
Michel clip applying stapler FST Michel, 12029-12
Michel suture clips FST Michel, 12040-01 7.5 x 1.75 mm
Surgical suture Catgut, Markneukirchen, Germany Catgut 00
Syringe with 30 G needle B. Braun Omnican 40 to load micropipette and for anesthesia
Plasmid isolation kit Promega Cat. # A2495 plasmid Midiprep
Plasmid pEGFP-C1 Clontech Cat. #6084-1 CMV-promoter + EGFP
Plasmid pDsRed2-N1 Clontech Cat. #6084-1 CMV-promoter + DsRed2
Fast Green dye Sigma F7258-25G for dilution in ddH2O
10% Ketamine Serum Werk, Bernburg, Germany Urotamin mix in a rate 1:1 with xylazine
2% Xylazine Serum Werk, Bernburg, Germany Xylazin mix in a rate 1:1 with ketamine
Sterilium Bode Chemie Sterillium disinfection
Vet ointment S&K Pharma, GmbH Kerato Biciron 5%, Augensalbe opthalmic ointment to prevent eye dryness
To-Pro-3 iodide Invitrogen T3605
10x PBS, pH 7.4
1.37 M NaCl Carl Roth 3957.1
Ibuprofen, Dolormin Johnson & Johnson Consumer Health Care Germany 01094902 analgesic pediatric solution (NSAID) for postsurgery pain relief
27 mM KCl Carl Roth 6781.1
100 mM Na2HPO4·2H2O Carl Roth T106.2
18 mM KH2PO4 Carl Roth 3904.1

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Reuter, K., Schlatt, S., Ehmcke, J., Wistuba, J. Fact or fiction: In vitro spermatogenesis. Spermatogenesis. 2, 245-252 (2012).
  2. Hunter, D., Anand-Ivell, R., Danner, S., Ivell, R. Models of in vitro spermatogenesis. Spermatogenesis. 2, 32-43 (2012).
  3. Zizzi, A., et al. fluorescent protein as indicator of nonviral transient transfection efficiency in endometrial and testicular biopsies. Microsc. Res. Tech. 73, 229-233 (2010).
  4. Williams, R. S., et al. Introduction of foreign genes into tissues of living mice by DNA-coated microprojectiles. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88, 2726-2730 (1991).
  5. Bockmann, R. A., de Groot, B. L., Kakorin, S., Neumann, E., Grubmuller, H., Kinetics, statistics, and energetics of lipid membrane electroporation studied by molecular dynamics simulations. Biophys. J. 95, 1837-1850 (2008).
  6. Pritchett-Corning, K. R., Luo, Y., Mulder, G. B., White, W. J. Principles of rodent surgery for the new surgeon. J. Vis. Exp. (47), (2011).
  7. Brinster, R. L., Avarbock, M. R. Germline transmission of donor haplotype following spermatogonial transplantation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91, 11303-11307 (1994).
  8. Schlatt, S., Von, S. V., Schepers, A. G. Male germ cell transplantation: an experimental approach with a clinical perspective. Br. Med. Bull. 56, 824-836 (2000).
  9. Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos. J. Vis. Exp. (6), (2007).
  10. Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. Mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection. J. Vis. Exp. (54), (2011).
  11. Blackshaw, S. In vivo electroporation of developing mouse retina. J. Vis. Exp. (52), (2011).
  12. Yomogida, K., Yagura, Y., Nishimune, Y. Electroporated transgene-rescued spermatogenesis in infertile mutant mice with a sertoli cell defect. Biol. Reprod. 67, 712-717 (2002).
  13. Ryoki, S., Park, H., Ohmori, Y., Shoji-Tanaka, A., Muramatsu, T. An integrase facilitates long-lasting foreign gene expression in vivo in mouse spermatogenic cells. J. Biosci. Bioeng. 91, 363-367 (2001).
  14. Umemoto, Y., et al. Gene transfer to mouse testes by electroporation and its influence on spermatogenesis. J. Androl. 26, 264-271 (2005).
  15. Muramatsu, T., Shibata, O., Ryoki, S., Ohmori, Y., Okumura, J. Foreign gene expression in the mouse testis by localized in vivo gene transfer. Biochem. Biophys. Res. Commun. 233, 45-49 (1997).
  16. Hibbitt, O., et al. In vivo gene transfer by electroporation allows expression of a fluorescent transgene in hamster testis and epididymal sperm and has no adverse effects upon testicular integrity or sperm quality. Biol. Reprod. 74, 95-101 (2006).
  17. Yamazaki, Y., Yagi, T., Ozaki, T., Imoto, K. In vivo gene transfer to mouse spermatogenic cells using green fluorescent protein as a. J. Exp. Zool. 286, 212-218 (2000).
  18. Dhup, S., Majumdar, S. S. Transgenesis via permanent integration of genes in repopulating spermatogonial cells in vivo. Nat. Methods. 5, 601-603 (2008).
  19. Huang, Z., et al. In vivo transfection of testicular germ cells and transgenesis by using the mitochondrially localized jellyfish fluorescent protein gene. FEBS Lett. 487, 248-251 (2000).
  20. Majumdar, S. S., et al. A method for rapid generation of transgenic animals to evaluate testis genes during sexual maturation. J. Reprod. Immunol. 83, 36-39 (2009).
  21. Yomogida, K., Yagura, Y., Tadokoro, Y., Nishimune, Y. Dramatic expansion of germinal stem cells by ectopically expressed human glial cell line-derived neurotrophic factor in mouse Sertoli cells. Biol. Reprod. 69, 1303-1307 (2003).
  22. Ike, A., et al. Transient expression analysis of the mouse ornithine decarboxylase antizyme haploid-specific promoter using in vivo electroporation. FEBS Lett. 559, 159-164 (2004).
  23. Gonzalez-Gonzalez, E., Lopez-Casas, P. P., Del, M. J. Gene silencing by RNAi in mouse Sertoli cells. Reprod. Biol. Endocrinol. 6, 29 (2008).
  24. Tang, H., Kung, A., Goldberg, E. Regulation of murine lactate dehydrogenase C (Ldhc) gene expression. Biol. Reprod. 78, 455-461 (2008).
  25. Yomgogida, K. Mammalian testis: a target of in vivo electroporation. Dev. Growth Differ. 50, 513-515 (2008).
  26. Hayes, K. E., et al. An Evaluation of Analgesic Regimens for Abdominal Surgery in Mice. J Am Assoc Lab Anim Sci. 6, 18-23 (2000).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats