In Vivo L'électroporation et microinjection de testicule de souris

1Institute of Reproductive Biology, Leibniz Institute for Farm Animal Biology (FBN)
Biology

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Summary

Cet article décrit la micro-injection et l'électroporation de testicule de souris in vivo en tant que technique de transfection de cellules testiculaires de souris pour étudier les procédés uniques de la spermatogenèse. Le protocole présenté implique des étapes de préparation capillaire en verre, la micro-injection par le conduit efférent, et la transfection par électroporation.

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Michaelis, M., Sobczak, A., Weitzel, J. M. In Vivo Microinjection and Electroporation of Mouse Testis. J. Vis. Exp. (90), e51802, doi:10.3791/51802 (2014).

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Abstract

Cette vidéo et l'article contribution donne une description complète de micro-injection et l'électroporation des testicules de souris in vivo. Cette technique de transfection particulier pour les cellules testiculaires de souris permet l'étude des processus uniques de la spermatogenèse.

Le protocole qui suit se concentre sur la transfection de cellules testiculaires de souris avec des constructions plasmidiques. Plus précisément, nous avons utilisé le vecteur rapporteur pEGFP-C1, qui exprime renforcée protéine fluorescente verte (eGFP) et aussi le vecteur pDsRed2-N1 exprimant la protéine fluorescente rouge (DsRed2). Les deux gènes rapporteurs codés étaient sous le contrôle du promoteur du cytomegalovirus humain précoce immédiat (CMV).

Pour effectuer un transfert de gène dans les testicules de souris, les constructions de plasmides rapporteur sont injectés dans les testicules de souris vivantes. À cette fin, les testicules d'un animal anesthésié est exposé et le site de micro-injection est préparée. Notre lieu privilégié deinjection est conduit efférent, avec le rete testis finalement connecté en tant que voie de transport anatomique des spermatozoïdes entre le testicule et l'épididyme. De cette manière, le remplissage des tubes séminifères après la micro-injection est très bien gérée et contrôlée grâce à l'utilisation de solutions d'ADN colorées. Après avoir observé un remplissage suffisant du testicule par sa structure de tube de couleur, l'organe est soumis à une électroporation. Ceci permet le transfert de la solution d'ADN dans les cellules testiculaires. À la suite de 3 jours d'incubation, le testicule est enlevé et étudiée au microscope à fluorescence verte ou rouge, ce qui illustre le succès de la transfection.

Généralement, ce protocole peut être utilisé pour fournir l'ADN ou l'ARN construit dans les testicules de souris vivante pour (sur) exprimer ou abattre des gènes, ce qui facilite l'analyse de la fonction des gènes in vivo. En outre, il est adapté pour l'étude de constructions rapporteurs ou règlements de gène putatiféléments conservateurs. Ainsi, les principaux avantages de la technique d'électroporation sont des performances rapides en combinaison avec peu d'effort ainsi que l'équipement technique modérée et les compétences requises par rapport à d'autres techniques.

Introduction

Spermatogenèse chez les mammifères est considérée comme un processus complexe de cellules souches auto-renouvelables subissant successivement la mitose, la méiose et de la différenciation, afin de développer dans les spermatozoïdes matures haploïde. Ces changements morphologiques sont orchestrées par différents types de cellules et malgré les tentatives profondes, il est encore impossible d'imiter ces procédés en culture cellulaire 1,2. Par conséquent, la recherche sur la spermatogenèse jusqu'à maintenant s'appuie sur les organismes vivants comme des modèles in vivo. En général, les études de la fonction des gènes sont généralement basées sur les animaux transgéniques. Toutefois, la génération et le maintien de ce type de modèle animal est long, coûteux et très élaboré. Ceci est attribué au processus de sélection de temps nécessaire pour générer et maintenir le transgène au cours des générations. En outre, la manipulation génétique de l'organisme tout entier par l'approche transgénique ou knock-out est sujette à provoquer des déficiences physiologiques lors du ciblage gènes avec des fonctions essentielles dans plusieurs régions, par exemple, en dehors du testicule ou systémique.

En outre, certaines méthodes de transfection transitoire sont associés à des inconvénients cruciaux. Par exemple, les inconvénients typiques de transfert de gène à médiation virale sont la provocation possible de réactions immunologiques et des règlements de sécurité supplémentaires, tandis que la lipofection 3 et 4 bombardement de microparticules peut endommager les tissus et sont limités à une certaine profondeur de la cellule pour l'efficacité de la transfection suffisante.

En revanche, l'électroporation (EP) comme une autre façon commune de transfection transitoire, semble constituer une technique prometteuse pour permettre à la transfection in vivo et in vivo une analyse cohérente de gène. En général, les PE est désigné comme un phénomène dynamique qui dépend de la tension transmembranaire locale avec des pores au sein médiées par conséquent nanosecondes. Ces écarts peuvent être maintenus pendant millisecondes, suffisant to accorder l'accès à l'ADN, de l'ARN ou des petites molécules 5. Lorsque la tension appliquée est trop élevée, le caractère généralement transitoire de PE est compensée en raison de la production de chaleur et de perméabilisation induction trop étendu avec en conséquence des dommages irréversibles de la cellule 5.

Ici, nous montrons que l'électroporation est un système de transfection efficace et économique, qui est capable d'être utilisé pour la transformation génétique du testicule afin d'élucider les caractéristiques de gène in vivo sur les testicules. Cet article traite de la préparation de plasmides, la micro-injection par le conduit efférent et l'électroporation ultérieure de testicule de souris. Cette procédure peut être le moyen de choix pour atteindre transfection rapide, spécifique et efficace des tubes séminifères des testicules de souris in vivo afin d'étudier les processus de la spermatogenèse.

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Protocol

Toutes les expériences pratiquées sur les animaux ont été approuvés par le comité d'éthique local (Landesamt für Landwirtschaft, Lebensmittelsicherheit und Fischerei, Mecklenburg-Vorpommern, Allemagne).

Préparation 1 Le plasmide

  1. Pour la préparation de plasmides, en utilisant des kits de purification de plasmide (voir le tableau des matériaux) ou des procédés similaires avec du tampon d'élimination de l'endotoxine de sorte que les réactions immunitaires de l'animal peuvent être évités. Suivez les instructions du manuel. Employer le trou DDH 2 O pour diluer la solution de plasmide.
  2. Eliminer les débris par filage de la solution d'ADN à la vitesse maximale (20 000 xg). Ramassez ensuite le surnageant.
  3. Déterminer la concentration de plasmide avec un spectrophotomètre (voir matériaux).
  4. Ajuster la concentration de plasmide avec le trou DDH 2 O à 1-3 mg (ADN) / pl. Remarque: Des concentrations plus faibles réduisent l'efficacité de la transfection, tandis que des concentrations plus élevées peuvent causer une solution d'injection trop visqueux. En outre, leefficacité de la transfection dépend de la taille du plasmide et doit être testé individuellement.
  5. Avant l'injection, préparer un mélange de la solution avec 40 ul par exemple plasmide avec 5 ul de PBS (10x) et 5 ul vert Fast (0,5%). Fast Green est nécessaire pour suivre le processus d'injection. De préférence, utiliser murales PCR tubes minces ou parafilm. Remarque: En fonction de la taille des testicules, un volume de 20-50 ul sera nécessaire pour chaque testicule.

2 Préparation de microinjection Pipette

  1. Utilisez capillaires de borosilicate (voir le tableau des matériaux) pour préparer les pipettes de micro-injection.
  2. Tirez capillaires en verre avec un extracteur capillaire vertical (voir le tableau des matériaux).
  3. Casser l'embout capillaire avec une pince par baguage doucement. La pointe est habituellement de 50-80 m de diamètre et d'environ 1 cm de long. Essayez d'éviter les trucs trop longtemps que ceux-ci ne sont pas suffisamment rigide pour pénétrer dans le tissu.
  4. Enfin, sharpen la pointe dans un 30 ° à 45 ° en utilisant un chanfreiner micropipette (voir le tableau des matériaux).
  5. Charger la pipette de micro-injection avec le mélange de solution d'injection (voir la préparation de plasmide). Appliquer la solution à l'arrière du capillaire de verre avec une petite seringue. Remarque: Essayez d'éviter les bulles d'air pendant le chargement, sinon ceux-ci seront injectés dans les tubes séminifères avec la solution de plasmide et donc permettra de réduire la conductivité ainsi que, éventuellement endommager les tissus.

3. anesthésie et de chirurgie

  1. Effectuer l'opération dans des conditions aseptiques en utilisant du matériel stérile (c'est à dire, seringue, aiguille, instruments chirurgicaux, etc). Cela permettra de réduire l'infection de l'animal et assurer un bon taux de survie.
  2. Utilisez la souris mâle pour l'électroporation à l'âge de 6-8 semaines.
  3. Pour initialiser un traitement analgésique postopératoire, fournir la souris avec des analgésiques ajouté de l'eau potable le jour avant la chirurgie. Ce culUres une analgésie préventive en cas de hypodipsia postopératoire hautement probable (de la consommation d'eau a diminué). A cet effet, exposer à de l'eau potable, par exemple une suspension d'ibuprofène pédiatrique (20 mg / ml). L'eau de boisson médicamenteuse doit également être fourni le jour un et deux de la reprise en concentration identique. Cela signifie une dose journalière de 7,5 mg / kg, valable pour poids de 25 g âgés de 8 semaines C57BL / 6J 5 ml / j d'eau potable et le corps. Ce schéma analgésique garantit un soulagement de la douleur fondamentale et récupération accélérée avec bien-être élevé 26.
  4. Pour la préparation de l'anesthésie solution sur le jour de la chirurgie de travail, mélanger 10% kétamine et xylazine 2% dans un rapport 1: 1 (voir le tableau des matériaux).
  5. Pour anesthésier l'animal, appliquer 0,25 ml / 100 mg de poids corporel de manière sous-cutanée de la solution anesthésique (Kétamine = 0,125 g / kg; xylazine = 0,025 g / kg). Utilisez un site d'injection entre pelvienne et des membres afin d'éviter des dommages aux organes et les blessures de la souris. Habituellement, 10 min sont nécessairesjusqu'à ce que la souris est profondément anesthésié.
  6. Couvrir les yeux de souris avec une pommade vétérinaire pour prévenir la sécheresse pendant l'anesthésie.
  7. Testez arrestation anesthésie profonde, qui est perceptible par une absence totale de réponse. A cet effet, il suffit de pincer le bout de l'animal.
  8. Pour démarrer l'opération, enlever les poils abdominale avec un rasoir électrique ou similaire et désinfecter la zone de coopération avec sterilium ou similaire.
  9. Faire une incision ventrale directement au-dessus des glandes préputiales dans le centre de la région abdominale. A cet endroit, tirez d'abord la peau loin et mener une petite incision cutanée transversale d'environ 8-14 mm. Ensuite, continuer le long de la couche musculaire abdominale.
    Remarque: La lésion doit être aussi faible que possible pour réduire les méfaits de l'animal.
  10. Tirez vers le haut les coussinet adipeux abdominal soin d'exposer les testicules ci-joint et le placer sur une feuille de papier jetable étanche drap préparé avant juste à côté du site de l'incision (figure 2A).
  11. Utilisez des jumelles à find conduit efférent en tant que cible d'injection. La persistance du canal efférent est identifié comme la jonction de beau navire entre le testicule et l'épididyme. Il est situé à proximité de l'artère testiculaire important. La persistance du canal fonctionne presque à un angle de 45 ° par rapport à l'artère et visiblement entre l'épididyme habitant. Remarque: En fonction de l'âge de la souris, le canal artériel est habituellement enterré dans les tissus gras.
  12. Utiliser des pinces fines pour dégager le conduit efférent de ce tissu adipeux. Après cela, placez le canal artériel publié sur une bande de papier stérile pour assurer la visibilité de la conduite sans nuire environnement.

La micro-injection d'ADN et 4 application

  1. Raccorder la pipette de micro-injection, qui est chargé avec la solution de plasmide à l'unité micromanipulateur / injecteur.
  2. Placez l'aiguille de microinjection parallèle au canal efférent avec la pointe dirigée vers le rete testis (figure 2B).
  3. Utilisez des pinces fines etdépouiller le conduit sur la pipette de micro-injection. Assurez-vous que le capillaire est maintenue parallèle à la conduite tout en tirant sur.
    Remarque: Cette procédure est plus pratique que pénétrer dans le navire en déplaçant l'aiguille avec le micromanipulateur.
  4. Dirigez l'aiguille délicatement vers le testicule et arrêter tout comme il pénètre dans le rete testis directement sous l'albuginée (figure 2C).
    Remarque: Dans le cas de trop loin le rete testis, la solution de plasmide fuite dans l'espace interstitiel. Cela conduit souvent à l'échec de la transfection des tubes séminifères.
  5. Pour l'injection de la solution de plasmide d'utiliser le micro-injecteur ayant les paramètres suivants: pi: 100 hPa, Ti: 0,2 sec, et pc: 0 hPa (figure 2D).
  6. Surveiller le processus d'injection ensemble en observant le testicule état de remplissage à l'aide de la couleur verte. Veillez à ce que le testicule est seulement rempli jusqu'au 2/3 de son volume avec le plsolution asmid (figure 2E).
    Remarque: Si le volume d'injection est dépassée, le tissu testiculaire pourrait en être affectée.

5. électroporation de testicule

  1. Pour activer l'électroporation efficace, faire tremper les électrodes de pincement dans du PBS (1x). Cela garantit conductance adéquate.
  2. Douceur serrer les testicules entre les électrodes humides (figure 2F). Mesurer la résistance électrique avec la électroporateur.
  3. Appliquer un courant au testicule. Effectuer huit impulsions carrées de 40 V à 4 sites différents testicules avec une durée constante de 50 temps d'impulsion ms et 950 ms de temps d'intervalle.

6. fermeture de la plaie et post-chirurgie

  1. Lorsque l'électroporation est terminé, placez le testicule de retour dans l'emplacement d'origine.
  2. Coudre la couche musculaire interne avec une suture chirurgicale (voir matériaux).
  3. Fermez la peau en utilisant des agrafes (voir le tableau des matériaux). Tirez la peau jusqu'à l'esprith pincettes. Assurez-vous d'exclure la couche musculaire. Placer les agrafes, chacune à une distance d'au plus 5 mm.
    Remarque: En raison suture chirurgicale peut être avalé par la souris, des agrafes sont favorisés pour la fermeture de la lésion de la peau.
  4. Laissez la souris pour récupérer de l'anesthésie sur des serviettes en papier stériles placées dans une cage de la souris vide stérile, qui est tempéré sur un bloc chaud 37 ° C. Le tampon doit assurer le réchauffement de la moitié de la cage de créer un gradient thermique. Pour l'animal ce fait possible de rechercher la zone individu, plus confortable du fait de la variété de la température dans la cage. En outre, couvrir la souris avec une feuille de papier essuie stérile afin que le stress peut être encore réduit. Remarque: Depuis la surface du corps de la souris est peu commune par rapport à la masse, par rapport à des animaux plus gros, le support thermique est d'une importance particulière pour la récupération réussie de rongeurs.
  5. Lorsque l'animal opéré a pleinement éveillé, transférer it pour poursuite de la reprise à une nouvelle cage de la souris entièrement équipée. Ne pas mettre l'animal à son ancienne cage ou à un groupe de souris. Assurez-vous que la cage est aussi propre et stérile que possible pour prévenir l'infection de la plaie. Surveiller le processus de récupération. Pour transférer de la souris vers l'établissement de soins des animaux, attendre jusqu'à ce qu'il ait totalement récupéré et semble se comporter normalement.
    Remarque: personne supplémentaire et les stratégies post-chirurgicales sont discutées par Pritchett-Corning KR et al 6.

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Representative Results

Le cadre expérimental pour réaliser une micro-injection et l'électroporation des testicules de souris in vivo tel qu'il est utilisé selon le protocole est illustré à la figure 1. Même si il est possible d'acquérir micropipettes fabriqués industriellement, nous avons préféré pour générer nos propres pipettes en tirant (figure 1A ) et le biseautage (figure 1B) des capillaires en verre de sorte que qu'ils équipés nos besoins. L'équipement pour la micro-injection et l'électroporation est illustré sur la figure 1C. Pour des raisons d'efficacité de la transfection, il est d'une importance d'utiliser un électroporateur carré.

Figure 2 montre les principales étapes de la chirurgie de la souris avec un accent particulier sur la préparation du canal efférent. Dans ce contexte, le testicule est exposée (figure 2A) et le conduit efférent est identifiée par observation binoculaire et libéré à partir de tissus adipeux (Figure 2B). Par la suite, le conduit efférent est percé avec une pipette de micro-injection et la solution de plasmide est administré (figures 2C-E). Enfin, le testicule chargé est coincé entre deux électrodes et transfecté par impulsions à ondes carrées appliqués (Figure 2F).

Cette approche in vivo dans de transfection permet l'utilisation de différents plasmides codant pour différents gènes rapporteurs. Ici, nous avons utilisé le vecteur rapporteur pEGFP-C1 (figure 3A), qui exprime la protéine fluorescente verte améliorée (EGFP) et également le vecteur pDsRed2-N1 (figure 3C) qui permet la transactivation de la protéine fluorescente rouge (DsRed2). Dans notre cas, les deux gènes rapporteurs étaient sous le contrôle du promoteur du cytomégalovirus humain immédiat-précoce (CMV).

Afin d'évaluer le succès de la transfection, la micro-injection et les testicules électroporées ont été récoltées 3 jours après la procédure entière et observées sous fluoresmicroscopie cence (figure 3). Pour une étude détaillée, les testicules ont été fixées au formaldehyde, inclus dans la paraffine, en tranches (5 um) et contre-colorées avec To-Pro-3, ce qui entraîne dans les noyaux de couleur bleue. Finalement, les coupes ont été examinées par microscopie à fluorescence. Deux exemples de résultats possibles de transfection peut être vu dans la figure 4. L'expression de l'EGFP de gène rapporteur est indiquée par une fluorescence verte, la transactivation de DsRed2 est désigné par émission rouge.

Figure 1
Figure 1: Équipement pour la micro-injection in vivo et l'électroporation des testicules de souris. Capillaires en verre sont formées en utilisant micropipette extracteur (A), tandis que les conseils sont affûtés en utilisant la micropipette chanfreiner ( (C). Au lieu d'utiliser un micromanipulateur commerciale, nous avons utilisé une table d'un microscope XYZ-cross et attachés une unité de tenir la micropipette. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2: Illustration de la micro-injection in vivo testicule et l'électroporation procédure chez la souris, y compris une intervention chirurgicale avant. Accès au testicule est accordée par l'ouverture des abdomen de la souris qui a été anesthésiée avant. La coupe est faite juste au-dessus des glandes préputiales. Après avoir révélé le testicule, il est libéré de la graisse abdominale pa ds (A). Sous observation binoculaire, le conduit efférent libéré est identifiée et la graisse. La pipette de micro-injection est positionnée à côté de la persistance du canal tandis que l'extrémité pointue de l'aiguille est dirigée vers le conduit efférent (B). Le capillaire de verre est insérée dans le canal artériel et est déplacé vers le testicule à être positionné directement dans le rete testis (C). La procédure de demande de l'ADN et le remplissage des tubes séminifères est surveillée à l'aide du Fast Green (D). Seulement 2/3 du testicule est rempli afin de prévenir les dommages du tissu (E). Pour l'étape d'électroporation finale, le testicule est coincé entre des électrodes de type pince à appliquer des impulsions électriques carrées (F). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

"> Figure 3
Figure 3 montage entier testicule 3 jours après l'électroporation in vivo En microscopie de fluorescence, les testicules transfectées de souris C57BL / 6 présentent une expression de protéine fluorescente verte améliorée -. EGFP (A) et la protéine fluorescente rouge - DsRed2 (C) à la fois codé sur pEGFP- C1 et N1-pDsRed2 plasmide, respectivement. L'expression des deux gènes rapporteurs était sous le contrôle de l'élément de promoteur CMV-actif de façon ubiquitaire. La transfection efficace des tubes séminifères ciblées est démontrée par des intensités de fluorescence. Panneaux (B) et (D) illustrent l'auto-fluorescence de testicule de contrôle non transfectées. Barre d'échelle = 1 mm. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4
Figure 4 sections de testicules de souris 3 jours après l'électroporation unilatérale in vivo avec pEGFP-C1 plasmide. Transfection issue de sections de testicules de souris fixe (5 um) sont présentés trois jours après l'électroporation unilatérale avec pEGFP-C1 plasmide. Transfectées avec succès cellsare tubulaire testiculaire indiquée par une fluorescence verte. TO-PRO-3 noyaux sont détectables contre-coloration par le bleu d'émission (A et B). Les structures rondes sont typiques pour l'organisation des cellules dans les tubules séminifères. Barre d'échelle = 20 um. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Discussion

La recherche dans le domaine de la biologie de la reproduction, en particulier dans le domaine de la fertilité masculine et la spermatogenèse inévitablement s'appuie sur les organismes vivants. Afin d'examiner la fonction testiculaire, pas de système de culture cellulaire adéquate / in vitro a été mis en place capable de réfléchir tous les essentiels des changements morphologiques d'un spermatogonies diploïdes à un 1,2 spermatozoïde haploïde maturité. Ainsi, la production d'animaux transgéniques est souvent nécessaire et comme un outil utile dans la biologie de la reproduction mâle. À cette fin, un nombre considérable de transgéniques, knock-out et souris knock-in ont été créés qui ont délivré un aperçu de la fertilité masculine. Toutefois, la génération de souris transgéniques se fait généralement par injection constructions de gènes dans le pronucleus d'oeufs fertilisés. Cependant, cette technique prend du temps et est censé être fait par des laboratoires spécialisés. La procédure de génération knock-out ou knock-in d'animauxest encore plus sophistiquée.

Une autre façon d'étudier la fonction des gènes d'organismes modèles vivant est par transfection transitoire. Cependant, la transduction commun avec des vecteurs viraux peut provoquer des réactions non spécifiques immunogènes ou autres et exige des règles de sécurité particulières. Lipofection 3 et 4 bombardement de microparticules approches sont retenus malheureusement à une profondeur spécifique de la cellule et même peuvent déclencher des effets indésirables sur le tissu.

Néanmoins, par le biais d'impulsions appliquées directement de carrés électrique sur le tissu cible, dite électroporation, il est effectivement possible de transfecter des tissus vivants, par exemple, les testicules de souris ici. De plus, cette méthode ne nécessite de faibles coûts, faible équipement et bien qualifié laboratoire personnel.

Un autre avantage remarquable associée à des méthodes de transfection in vivo en comparaison avec le mode de persistance de l'animal gène altéréls est la possibilité de co-transfection. Bien transgéniques ou knock-souris portent habituellement seulement une construction de gène, permet la transfection in vivo, des analyses globales simultanées de différentes constructions de gènes au sein de la même cellule. Ceci peut être réalisé par l'utilisation de divers gènes rapporteurs, par exemple, par rapport à la GFP ou YFP Gaussia- contre-luciférase de Renilla, de sorte que une étude comparative des effets de type sauvage et mutantes de gènes est possible.

En outre, par l'application de promoteurs spécifiques d'un type cellulaire, l'expression des constructions de gènes peut être extraordinairement dirigé sur des cellules spécifiques dans le testicule. Par exemple, cela peut permettre une expression de gène dans les cellules testiculaires de Sertoli tout ou spermatocytes.

Le protocole présenté dans cet article couvre deux méthodes importantes dans le domaine de la biologie de la reproduction masculine. Le premier est la micro-injection dans les tubes séminifères avec la préparation du capillaire d'injection. Cette technologienique a été généralement impliqué dans germe / transplantation de cellules souches d'animaux transgéniques, soit au destinataire ou 7 dans le contexte de xénogreffes 8. La seconde méthode est la transfection par électroporation capable d'induire des pores transitoires dans la membrane plasmique ainsi que d'un écoulement dirigé en vrac de molécules chargées comme des plasmides, en veillant à l'entrée dans certaines cellules ou tissus non. Cette orientation spécifique des macromolécules par électroporation est souvent apprécié dans la transfection de cellules neurales souvent fait de manière unilatérale in utero 9,10 ou 11 dans le développement de la rétine.

Le protocole détaillé de procédé précédentes, comprenant en tant que les premières étapes cruciales de l'anesthésie des souris mâles, les testicules de l'exposition par lésion abdominale, la préparation du conduit efférent ainsi que la micro-injection dans le canal artériel. Comme ces actions sont très exigeants, il est fortement conseillé de première pratique sur des animaux morts avant d'effectuer opérations sur des souris vivantes. En outre, des instructions sont fournies sur la façon d'injecter et de remplir les tubes séminifères avec l'ADN plasmidique et la façon de mener l'électroporation du testicule appropriée.

En raison de l'application d'électricité au cours de PE, la production de chaleur peut provoquer des lésions tissulaires en particulier à haute tension. Cette augmentation de l'efficacité de transfection 12, 13, 15 par la tension élevée est accompagnée par l'effet négatif de la diminution de 12 à 14 testiculaire. La plage de tension la plus favorable semble être de 30 à 50 V, ce qui garantit de faibles effets sur l'intégrité des testicules, une qualité normale de spermatozoïdes 16, un comportement d'accouplement normale 17, le maintien de la progéniture capacité de production de 16 à 20 ainsi que d'une efficacité de transfection suffisante.

En ce qui concerne l'intensité de l'expression génique de constructions de gènes transférés, Yomogida et al. 21 ont également révélé une expr nettement réduiteession de vecteurs linéarisés 3 jours après la mise en œuvre alors que le document EP-ADN plasmidique circulaire évidemment maintient encore l'expression après 35 jours avec la plus haute dans une des cellules de Sertoli. Ceci suggère que les meilleurs résultats sont obtenus en utilisant des constructions plasmidiques pour l'électroporation comme cela se fait ici. Dans notre approche, nous avons étudié l'efficacité de transfection de 3 jours après l'électroporation en raison de la constatation que cette période de temps est suffisant pour la cicatrisation adéquate, la réparation de l'intégrité des cellules ainsi que l'expression correcte souhaitée des protéines de rapporteur de l'EGFP et DsRed2. Ainsi, un temps d'incubation de 3 jours après l'intervention chirurgicale et la procédure de transfection entier semble être nécessaire pour assurer les fonctions des cellules restaurées de façon appropriée, y compris l'expression du gène de sorte qu'un signal de fluorescence intense que possible peut être détectée en assurant un résultat de transfection fiable. En ce qui concerne l'efficacité de la transfection, Yomogida et al. 21 a révélé que ee Les cellules de Sertoli somatique sont apparemment plus sensible à EP-transfection de cellules germinales. Il est recommandé de co-transfection avec des cibles de testicule et de contrôle des plasmides, chacun codant pour un gène rapporteur différent.

L'approche d'électroporation présenté est applicable à un large éventail de questions possibles relatifs aux procédures de sexe masculin des cellules germinales et de la fécondité. Par exemple, il peut être utilisé pour analyser des éléments régulateurs de gènes spécifiques de la spermatogenèse 17,22. Le procédé est également adapté pour les études de perte de fonction de petits ARN interférents 23 et gagner de fonction étudie 24. En outre, il ya des chances prometteuses même pour accomplir EP pour le traitement thérapeutique et la génération de descendants transgéniques comme des groupes de recherche ont déjà montré 18,20,25.

Par conséquent, la nouvelle approche méthodologique de testicules de souris dans l'électroporation in vivo illustré en regard de conduit efférent microinjection de constructions plasmidiques, nous l'espérons atteindre une technique précieuse pour démêler avec succès la nature de la spermatogenèse.

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Disclosures

Marten Michaelis, Alexander Sobczak, et Joachim M. Weitzel employés à l'Institut de biologie de la reproduction, de l'Institut Leibniz pour la biologie des animaux de ferme (FBN), Dummerstorf, Allemagne, déclarent qu'ils n'ont aucun intérêt financier concurrents.

Acknowledgements

Nous remercions Birgit Westernstroeer du Centre de médecine de la reproduction et d'andrologie à l'université de Münster pour l'enseignement de la micro-injection des testicules. En outre, nous sommes reconnaissants à Ursula Antkewitz et Petra Reckling pour l'assistance technique. Nous remercions la Fondation allemande pour la recherche (DFG) pour soutenir ce travail (WE2458 / 10-1).  

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Centrifuge Sigma 1-15 PK
Spectrophotometer Nanodrop ND-1000
Micropipette puller Narishige PC-10 vertical capillary puller
Microinjection capillaries Clark GC100-10 borosilicate standard wall
Micropipette beveler Bachofer Typ 462 rotating disk beveler
Electroporator Nepagene CUY 21EDIT square wave electroporator
Tweezer electrodes Nepagene CUY 650P5 5 mm Ø disk electrodes
Stereo microscope Zeiss Stemi 2000-C
Cold light source Zeiss KL 1500LCD
Microinjection pump Eppendorf Femtojet
Micromanipulator homemade XYZ cross table
Surgical instruments FST scissors, forceps, needle holder
Fine forceps FST Dumont #5, #7 efferent ducts preparation
Michel clip applying stapler FST Michel, 12029-12
Michel suture clips FST Michel, 12040-01 7.5 x 1.75 mm
Surgical suture Catgut, Markneukirchen, Germany Catgut 00
Syringe with 30 G needle B. Braun Omnican 40 to load micropipette and for anesthesia
Plasmid isolation kit Promega Cat. # A2495 plasmid Midiprep
Plasmid pEGFP-C1 Clontech Cat. #6084-1 CMV-promoter + EGFP
Plasmid pDsRed2-N1 Clontech Cat. #6084-1 CMV-promoter + DsRed2
Fast Green dye Sigma F7258-25G for dilution in ddH2O
10% Ketamine Serum Werk, Bernburg, Germany Urotamin mix in a rate 1:1 with xylazine
2% Xylazine Serum Werk, Bernburg, Germany Xylazin mix in a rate 1:1 with ketamine
Sterilium Bode Chemie Sterillium disinfection
Vet ointment S&K Pharma, GmbH Kerato Biciron 5%, Augensalbe opthalmic ointment to prevent eye dryness
To-Pro-3 iodide Invitrogen T3605
10x PBS, pH 7.4
1.37 M NaCl Carl Roth 3957.1
Ibuprofen, Dolormin Johnson & Johnson Consumer Health Care Germany 01094902 analgesic pediatric solution (NSAID) for postsurgery pain relief
27 mM KCl Carl Roth 6781.1
100 mM Na2HPO4·2H2O Carl Roth T106.2
18 mM KH2PO4 Carl Roth 3904.1

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References

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