In Vivo microinjeção e Eletroporação de testículos de camundongo

1Institute of Reproductive Biology, Leibniz Institute for Farm Animal Biology (FBN)
Published 8/23/2014
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Biology

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Summary

Este artigo descreve a microinjecção e a electroporação de testículo do rato in vivo, como uma técnica para a transfecção de células de testículo de rato para estudar os processos exclusivos da espermatogénese. O protocolo apresentado envolve os passos de preparação de capilar de vidro, através da conduta de microinjecção eferente, e transfecção por electroporação.

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Michaelis, M., Sobczak, A., Weitzel, J. M. In Vivo Microinjection and Electroporation of Mouse Testis. J. Vis. Exp. (90), e51802, doi:10.3791/51802 (2014).

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Abstract

Esta contribuição de vídeo e artigo apresenta uma descrição abrangente de microinjeção e eletroporação de testículo do rato in vivo. Esta técnica de transfecção particular para células testiculares de mouse permite o estudo de processos exclusivos na espermatogênese.

O protocolo a seguir concentra-se em transfecção de células de testículo de rato, com as construções de plasmídeos. Especificamente, utilizou-se o vector repórter pEGFP-C1, que expressa a proteína verde fluorescente melhorada (EGFP) e também o vector pDsRed2 N1-expressar a proteína fluorescente vermelha (DsRed2). Ambos os genes repórter foram codificados sob o controlo do promotor de citomegalovírus humano imediato precoce (CMV).

Para realizar a transferência de genes em testículos de rato, as construções de plasmídeos repórter são injectados em testículos de ratos vivos. Para esse efeito, o testículo de um animal anestesiado é exposta e o local de microinjecção é preparado. O nosso lugar preferido deinjeção é o ducto eferente, com a rede testicular, em última instância conectada como a rota de transporte anatômica dos espermatozóides entre o testículo e epidídimo. Desta forma, o enchimento dos túbulos seminíferos após microinjecção é excelentemente gerido e controlado, devido à utilização de soluções de ADN coradas. Depois de observar um enchimento suficiente do testículo por sua estrutura tubular de cor, o órgão é electroporado. Isto permite a transferência da solução de ADN para dentro das células dos testículos. Na sequência de 3 dias de incubação, os testículos são removidos e investigada sob o microscópio de fluorescência verde ou vermelho, ilustrando o sucesso da transfecção.

Geralmente, este protocolo pode ser utilizado para a entrega de DNA- ou RNA- constrói na vida do mouse testis, a fim de (mais) expressar ou derrubar genes, facilitando na análise da função dos genes vivo. Além disso, é adequado para o estudo de construções repórter ou regula gene putativoelementos Conservador. Assim, as principais vantagens da técnica de eletroporação é rápido desempenho em combinação com baixo esforço, bem como o equipamento técnico moderado e as habilidades necessárias em relação a técnicas alternativas.

Introduction

Espermatogénese mamíferos é considerado um processo sofisticado de células estaminais auto-renovação submetidos sucessivamente a mitose, meiose e a diferenciação, a fim de se desenvolver em espermatozóides maduros haplóide. Estas alterações morfológicas são orquestradas por diferentes tipos de células e, apesar das tentativas profundas, ainda não é possível para imitar esses processos de cultura de células de 1,2. Portanto, as pesquisas sobre a espermatogênese até agora depende de organismos vivos como modelos in vivo. Em geral, os estudos de função gênica são geralmente baseados em animais transgênicos. No entanto, gerar e manter este tipo de modelo animal é demorado, dispendioso e muito elaborado. Isto é atribuído ao processo de criação de comprimento necessária para a geração e manutenção do transgene ao longo de gerações. Além disso, a manipulação genética de todo o organismo pela abordagem transgênicos ou knockout é propenso a causar danos fisiológicos ao direcionamento genes com funções essenciais em várias regiões, como por exemplo, fora do testículo ou sistemicamente.

Além disso, alguns métodos de transfecção transiente estão associados com alguns inconvenientes fundamentais. Por exemplo, desvantagens típicas de transferência de genes mediada por vírus são a provocação de possíveis reacções imunológicas e regulamentos de segurança adicionais, ao passo que a lipofecção 3 e 4 bombardeamento com micropartículas pode danificar o tecido e são limitados a uma certa profundidade da célula suficiente para a eficiência de transfecção.

Em contraste, electroporação (EP) como outra forma comum de transfecção transiente, parece constituir uma técnica promissora para permitir na transfecção in vivo e na análise de genes in vivo consistentes. Em geral, a EP é referido como um fenómeno dinâmico que depende da tensão transmembranar local com poros consequentemente mediadas dentro nanossegundos. Essas lacunas podem ser mantidos por milésimos de segundo, suficiente to conceder acesso ao DNA, RNA ou pequenas moléculas 5. Quando a tensão aplicada for muito elevada, o carácter geralmente transiente de PE é contrariada, devido à produção de calor e de permeabilização de indução muito abrangente, com consequente dano irreversível da célula 5.

Aqui, mostramos que a electroporação é um sistema de transfecção mais eficaz e económica, que é capaz de ser utilizado para a transformação genética do testículo, de modo a elucidar as características de genes in vivo testiculares. Este artigo aborda preparação plasmídeo, microinjeção via o ducto eferente ea eletroporação posterior de rato testículo. Este procedimento pode ser o meio de escolha para atingir a transfecção rápida, específica e eficaz de túbulos seminíferos de testículo do rato in vivo, a fim de investigar os processos de espermatogénese.

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Protocol

Todos os experimentos com animais realizados foram aprovados pelo comitê local de ética (Landesamt für Landwirtschaft, Lebensmittelsicherheit und Fischerei, Mecklenburg-Pomerânia Ocidental, Alemanha).

1. plasmídeo Preparação

  1. Para a preparação de plasmídeo, utilizar kits de purificação de plasmídeo (ver tabela de materiais) ou métodos semelhantes com tampão de remoção de endotoxinas de forma que as reacções imunitárias do animal podem ser evitadas. Siga as instruções do manual. Empregar ddH2O para diluir a solução de plasmídeo.
  2. Elimine os restos girando a solução de DNA em velocidade máxima (20.000 xg). Em seguida, recolher o sobrenadante.
  3. Determinar a concentração de plasmídeo com um espectrofotômetro (ver materiais).
  4. Ajustar a concentração de plasmídeo com ddH2O a 1-3 ug (ADN) / uL. Nota: as concentrações mais baixas irão reduzir a eficiência de transfecção, enquanto que as concentrações mais elevadas pode causar uma solução de injecção muito viscoso. Além disso, oa eficiência de transfecção depende do tamanho do plasmídeo e tem de ser testado individualmente.
  5. Antes da injecção, preparar uma mistura de solução com, por exemplo, 40 ul de plasmídeo em conjunto com 5 mL de PBS (10x) e 5 ul Verde Rápido (0,5%). Fast Green é necessária para acompanhar o processo de injeção. De preferência, use parede PCR tubos finos ou Parafilm. Nota: Dependendo do tamanho do testículo, vai ser necessário um volume de 20-50 mL de cada testículo.

2 Preparação de microinjeção Pipeta

  1. Use capilares de borosilicato (ver tabela de materiais) para a preparação das pipetas de microinjeção.
  2. Puxe capilares de vidro com um extrator capilar vertical (veja a tabela de materiais).
  3. Quebre a ponta capilar com uma pinça por suavemente bandas. A ponta é geralmente de 50-80 fim de diâmetro e cerca de 1 cm de comprimento. Tente evitar dicas que são muito longos como estes não são rígidas o suficiente para penetrar no tecido.
  4. Enfim, sharpen a ponta na 30 ° a 45 ° de ângulo usando um beveler micropipeta (veja a tabela de materiais).
  5. Coloque a pipeta de microinjeção com a mistura de solução injectável (ver Preparação de plasmídeo). Aplicar a solução para o fundo do tubo capilar de vidro com uma pequena seringa. Nota: Tente evitar bolhas de ar durante o carregamento, caso contrário estes serão injetados nos túbulos seminíferos, juntamente com a solução de plasmídeo e, portanto, irá reduzir a condutividade, bem como, eventualmente, causar danos aos tecidos.

3 Anestesia e Cirurgia

  1. Executar a operação sob condições assépticas, utilizando materiais estéreis (ou seja, seringa, agulha, instrumentos cirúrgicos, etc). Isto irá reduzir a infecção do animal e garantir boas taxas de sobrevivência.
  2. Use camundongos machos para eletroporação em uma idade de 6-8 semanas.
  3. Para inicializar o tratamento analgésico pós-cirúrgico, fornecer o mouse com analgésicos adicionado água potável no dia anterior à cirurgia. Este burroUres a analgesia preventiva em caso de hypodipsia postsurgical altamente provável (a ingestão de água diminuída). Para este fim, expor a água potável, com por exemplo uma suspensão de ibuprofeno pediátrico (20 mg / ml). A água para beber medicada também deve ser fornecida em um dia e dois de recuperação na concentração idêntica. Isto significa que uma dose diária de 7,5 mg / kg, a validade de 5 ml / d de água potável e de 25 g de peso corporal durante 8 semanas, com idade C57BL / 6J. Este regime analgésico garante um alívio da dor fundamental e recuperação acelerada junto com elevado bem-estar 26.
  4. Para a preparação da solução de anestesia no dia da cirurgia de trabalho, misturar 10% cetamina e xilazina a 2% em uma proporção de 1: 1 (ver tabela Materiais).
  5. Para anestesiar o animal, aplicam-se 0,25 ml / 100 mg de peso corporal por via subcutânea da solução anestésica (cetamina = 0,125 g / kg; Xilazina = 0,025 g / kg). Utilize um local de injecção entre pélvica e nos membros, a fim de evitar danos a órgãos e lesões dos camundongos. Geralmente, são necessários 10 minaté que o mouse está profundamente anestesiados.
  6. Cubra os olhos do rato com vet pomada para evitar o ressecamento durante a anestesia.
  7. Teste a parada anestésico, o que é perceptível por uma total falta de resposta. Para esse efeito, basta apertar o dedo do pé do animal.
  8. Para iniciar a operação, remover o cabelo abdominal com um barbeador elétrico ou similar e desinfectar a área de operação com sterilium ou similar.
  9. Fazer uma incisão ventral directamente acima das glândulas prepucial no centro da área abdominal. Naquele lugar, primeiro puxe a pele longe e realizar um pequeno corte cutânea transversal de cerca de 8-14 mm. Em seguida, continuar ao longo da camada muscular abdominal.
    Nota: A lesão deve ser tão pequeno quanto possível para reduzir os efeitos nocivos para o animal.
  10. Puxe para cima as bolsas de gordura abdominal cuidadosamente para expor o testículo em anexo e coloque-o em uma cortina impermeável preparado antes descartável de papel ao lado do local da incisão (Figura 2A).
  11. Use binóculos para find o ducto eferente como o alvo da injeção. O eferente ductus é identificada como a junção navio tênue entre o testículo e epidídimo. Ele está localizado ao lado da artéria testicular proeminente. O canal funciona quase em um ângulo de 45 ° para a artéria e visivelmente entra no epidídimo caput. Nota: Dependendo da idade do mouse, o canal é geralmente enterrada no tecido adiposo.
  12. Use uma pinça fina para limpar o ducto eferente deste tecido adiposo. Depois disso, coloque o ductus lançado em uma tira de papel estéril para assegurar a clara visibilidade do ducto sem prejudicar arredores.

4. microinjeção e Aplicação DNA

  1. Ligue o pipeta microinjecção, que é carregado com a solução de plasmídeo para a unidade micromanipulador / injector.
  2. Inserir a agulha de microinjecção paralelo à conduta eferente com a ponta voltada para a rede testicular (Figura 2B).
  3. Use uma pinça fina etiras da conduta através da pipeta micro-injecção. Certifique-se de que o capilar é mantido paralelo ao ducto enquanto a puxa para cima.
    Nota: Este procedimento é mais conveniente do que penetrar no navio, movendo a agulha com a micromanipulador.
  4. Direcione a agulha cuidadosamente para o testículo e parar assim como penetra na rete testis diretamente abaixo da túnica albugínea (Figura 2C).
    Nota: No caso de overreaching rete testis, a solução plasmídeo vai vazar para o espaço intersticial. Isso geralmente leva ao fracasso de transfecção dos túbulos seminíferos.
  5. Para a injecção da solução de plasmídeo utilizar o microinjetor com seguintes configurações: pi: 100 hPa ti,: 0,2 seg, e pc: 0 hPa (Figura 2D).
  6. Acompanhar todo o processo de injecção por meio da observação do estado de enchimento do testículo com a ajuda da cor verde. Tome cuidado para que o testículo só é cheio até dois terços do seu volume com o plsolução asmid (Figura 2E).
    Nota: Se o volume de injeção for excedido, o tecido testicular podem ser prejudicados.

5. Eletroporação de Testículo

  1. Para habilitar eletroporação eficaz, mergulhe os eletrodos pinça em PBS (1x). Isto assegura condutância adequada.
  2. Suavemente aperte o testículo entre os eletrodos molhados (Figura 2F). Meça a resistência elétrica com a electroporator.
  3. Aplique corrente ao testículo. Execute oito pulsos quadrados de 40 V em 4 locais diferentes testículo com uma duração constante de 50 ms e tempo de pulso de 950 ms tempo de intervalo.

6. Wound Encerramento e Pós-cirurgia

  1. Quando eletroporação estiver concluída, coloque o testículo de volta ao local original.
  2. Costure a camada muscular interna com sutura cirúrgica (ver materiais).
  3. Feche a pele através do emprego de grampos de sutura (ver tabela de materiais). Retire a pele para cima sagacidadeh pinças. Certifique-se de excluir a camada muscular. Coloque os clipes, cada um a uma distância de não mais de 5 mm.
    Nota: Por causa de sutura cirúrgica pode ser engolido pelo mouse, clipes de sutura são favorecidos para fechar a lesão de pele.
  4. Permitir que o rato a recuperar da anestesia sobre toalhas de papel estéreis colocados numa gaiola do rato estéril vazio, que é temperado numa almofada quente 37 ° C. A almofada deve assegurar o aquecimento de um meio da gaiola criando um gradiente de calor. Para o animal torna-se possível procurar a área individual, mais confortável, devido à variedade de temperatura na gaiola. Além disso, cubra o mouse com uma folha de papel toalha estéril para que o estresse pode ser ainda mais reduzida. Nota: Como a superfície do corpo do rato é extraordinariamente alta em relação à massa corporal, quando comparados com animais de maior porte, o apoio térmica é de particular importância para a recuperação bem sucedida de roedores.
  5. Quando o animal tem operado totalmente desperto, transferir it para posterior recuperação para uma nova gaiola do rato completamente equipada. Não coloque o animal de volta para sua gaiola de idade ou para um grupo de camundongos. Certifique-se que a gaiola é limpa e estéril quanto possível para prevenir a infecção da ferida. Acompanhar todo o processo de recuperação. Para transferir o mouse de volta para a unidade de cuidados animal, espere até que ele se recuperou totalmente e parece comportar-se normalmente.
    Nota: estratégias pós-cirúrgicos per- adicionais e são discutidos por Pritchett-Corning KR et al 6.

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Representative Results

A configuração experimental para a realização de micro-injecção e de electroporação de testículo do rato in vivo, uma vez que é usado de acordo com o protocolo ilustrado na Figura 1. Embora seja possível para adquirir as micropipetas de fabrico industrial, que preferido para gerar os nossos próprios pipetas puxando (Figura 1A e) chanfradura (Figura 1B) capilares de vidro para se adequarem às necessidades. O equipamento para a microinjecção e electroporação é ilustrada na Figura 1C. Por razões de eficiência de transfecção, é de importância de utilizar um electroporador de onda quadrada.

Figura 2 mostra os principais passos da cirurgia rato com foco especial na preparação do ducto eferente. Neste contexto, o testículo é exposto (Figura 2A) e da conduta eferente é identificado por observação binocular e libertado a partir de tecido gordo (Figure 2B). Subsequentemente, o ducto eferente é perfurada com uma pipeta de microinjecção e a solução de plasmídeo é administrado (Figuras 2C-E). Finalmente, o testículo carregado é espremida entre dois eléctrodos e transfectadas por aplicados pulsos de onda quadrada (Figura 2F).

Esta abordagem in vivo transfecção permite o uso de diferentes plasmídeos que codificam vários genes repórteres. Aqui utilizou-se o vector repórter pEGFP-C1 (Figura 3A), que expressa a proteína verde fluorescente melhorada (EGFP) e também o vector pDsRed2-N1 (Figura 3C), permitindo a transactivação da proteína fluorescente vermelha (DsRed2). No nosso caso, ambos os genes repórteres estavam sob o controlo do promotor de citomegalovírus humano imediato precoce (CMV).

A fim de avaliar o sucesso da transfecção, os testículos microinjectados e electroporadas foram colhidas 3 dias após todo o procedimento e observado sob FLUORESmicroscopia de fluorescência (Figura 3). Para a investigação detalhada, testículos foram formaldeído-fixo, embebido em parafina, cortados (5 um), bem como contrastado com To-Pro-3, resultando em núcleos azuis coloridas. Finalmente, as secções foram examinadas por microscopia de fluorescência. Dois exemplos de possíveis resultados de transfecção pode ser visto na Figura 4. A expressão do gene repórter da EGFP é indicado por uma cor verde, a transactivação de DsRed2 é designado por emissão vermelha.

Figura 1
Figura 1 Equipamento para in vivo microinjecção e electroporação de rato testículo. Capilares de vidro são formados utilizando puxador de micropipeta (A), enquanto que as pontas são afiadas utilizando a micropipeta beveler ( (C). Em vez de empregar um micromanipulador comercial foi utilizada uma mesa XYZ-cross de um microscópio e anexado uma unidade para manter a micropipeta. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2
Figura 2 Ilustração da in vivo microinjeção testis e processo de eletroporação em rato, incluindo a intervenção cirúrgica prévia. Acesso ao testículo é concedido através de abertura de abdômen do rato que foi anestesiado antes. O corte é feito logo acima das glândulas prepucial. Depois de revelar os testículos, ele é liberado da pa gordura abdominal ds (A). Sob observação binocular, o ducto eferente é identificado e libertado em gordura. A pipeta microinjecção é posicionada ao lado do canal, enquanto a ponta da agulha está a apontar em direcção à conduta eferente (B). O capilar de vidro é introduzido no canal e é movido na direção do testículo para ser posicionado directamente na rede testicular (C). O procedimento de aplicação de DNA e de enchimento dos túbulos seminíferos é monitorizada com a ajuda de Verde Rápido (D). Apenas dois terços do testículo fica cheio, a fim de evitar danos do tecido (E). Para a etapa final eletroporação, o testículo é espremido entre tipo pinça eletrodos para aplicar pulsos quadrados elétricos (F). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

"> Figura 3
Figura 3. testículo inteiro de montagem 3 dias após a electroporação in vivo Na microscopia de fluorescência, testículo transfectadas de C57BL / 6 rato mostra expressão de proteína fluorescente verde melhorada -. ​​EGFP (A) e proteína fluorescente vermelha - DsRed2 (C) ambas codificadas na pEGFP- C1 e pDsRed2 N1-plasmídeo, respectivamente. A expressão de ambos os genes repórter estava sob o controlo do elemento promotor CMV-ubiquamente activo. A transfecção eficaz dos túbulos seminíferos segmentados é demonstrada por intensidades de fluorescência. Os painéis (B) e (D) ilustram auto-fluorescência de testículo de controlo não transfectadas. Barra de escala = 1 mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4
Figura 4 Seções do rato testículo 3 dias após unilateral in vivo eletroporação com pEGFP-C1 plasmídeo. Resultado transfecção de seções testículos do rato fixa (5 mm) são apresentados três dias após a eletroporação unilateral com pEGFP-C1 plasmídeo. Transfectadas com sucesso cellsare testicular tubular indicada por fluorescência verde. TO-PRO-3 núcleos contracorados são detectáveis ​​por emissão azul (A e B). As estruturas arredondadas são típicas para a organização de células dentro dos túbulos seminíferos. Barra de escala = 20 m. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

A investigação no campo da biologia reprodutiva, em especial na área da fertilidade masculina e, inevitavelmente, a espermatogénese depende de organismos vivos. A fim de examinar a função testicular, sem / sistema de cultura de células in vitro adequada foi estabelecida capaz de reflectir as alterações morfológicas importantes de um diplóide spermatogonium para um 1,2 espermatozóide maduro haplóide. Assim, a geração de animais geneticamente modificados é muitas vezes uma necessidade e como uma ferramenta valiosa na biologia reprodutiva masculina. Para este fim, um número considerável de transgênicos, knock-out e knock-nos camundongos foram criados que entregue insights sobre a fertilidade masculina. No entanto, a geração de ratinhos transgénicos é geralmente feito por injecção de construções de genes no pró-núcleo de ovos fertilizados. No entanto, esta técnica é demorado e deve ser realizado por laboratórios especializados. O procedimento para gerar knock-out ou knock-em animaisé ainda mais sofisticada.

Outra forma de estudar a função do gene de organismos vivos modelo é de transfecção transiente. No entanto, a transdução comum com vetores virais podem causar reações inespecíficas imunogênicos ou outros e exige regras especiais de segurança. Lipofecção 3 e 4 de bombardeamento de micropartículas abordagens são infelizmente restrita a uma profundidade da célula específica, e também pode provocar efeitos adversos sobre o tecido.

No entanto, por meio de diretamente aplicados pulsos quadrados elétrica no tecido alvo, chamada eletroporação, é realmente possível para transf tecido vivo, por exemplo, testículos aqui mouse. Além disso, este método só requer baixo custo, baixa de equipamentos e pessoal de laboratório devidamente qualificados.

Outra vantagem notável associado com in vivo métodos de transfecção em comparação com persistentemente modelo animal geneticamente alteradols é a possibilidade de co-transfecção. Enquanto transgênicos ou knock-camundongos têm, normalmente, apenas uma construção de gene, transfecção in vivo permite análises abrangentes e simultâneas de diferentes construções de genes dentro de uma mesma célula. Isto pode ser feito através da utilização de vários genes repórter, por exemplo, a GFP contra YFP ou Gaussia- contra-Renilla luciferase, para que num estudo comparativo de tipo selvagem e os efeitos do gene mutante é possível.

Além disso, através da aplicação de promotores específicos do tipo de célula, a expressão de construções de gene pode ser dirigido para células extraordinariamente específicos no testículo. Por exemplo, isso poderia permitir a expressão gênica testicular apenas em células de Sertoli ou espermatócitos.

O protocolo apresentado neste artigo abrange dois métodos importantes no campo da biologia reprodutiva masculina. O primeiro é a microinjecção em túbulos seminíferos com a preparação do capilar de injecção. Esta tecnologianica foi geralmente implicados na germe / ou transplante de células estaminais a partir de animais transgénicos para o receptor 7 ou no contexto de xeno-8. O segundo método é a transfecção electroporação capaz de induzir poros transientes na membrana plasmática, bem como um fluxo de grandes quantidades de moléculas carregadas dirigido como plasmídeos, assegurando entrada em certas células ou tecidos, em vez. Esta direção específica de macromoléculas por eletroporação é frequentemente apreciada na transfecção de células unilateralmente neural muitas vezes feito no útero 9,10 ou no desenvolvimento de retina 11.

O protocolo detalhado método anterior inclui, como os primeiros passos essenciais da anestesia dos ratinhos machos, a exposição dos testículos através de lesão abdominal, a preparação do ducto eferente, bem como a micro-injecção para o canal. Como essas ações são bastante exigentes, recomenda-se fortemente a primeira prática em animais mortos antes de executar oPERAÇÕES em ratos vivos. Além disso, as instruções são fornecidas em forma de injectar e preencher os túbulos seminíferos com plasmídeo-ADN e como conduzir a electroporação do testículo apropriadamente.

Devido à aplicação de energia eléctrica durante o EP, a produção de calor pode provocar danos nos tecidos, especialmente em alta tensão. Este aumento na eficiência de transfecção de 12, 13, 15 por tensão elevada é acompanhada pelo efeito adverso da testicular encolhendo 12-14. A faixa de tensão mais favorável parece ser entre 30-50 V, garantindo pequenos efeitos sobre a integridade dos testículos, uma qualidade de esperma normal 16, um comportamento normal de acoplamento 17, a manutenção da capacidade de produção de descendência 16-20, bem como uma eficácia de transfecção suficiente.

Quanto gene intensidade de construções de genes transferidos expressão, Yomogida et 21 al. Também revelaram uma expr marcadamente reduzidaessão de vetores linearizados 3 dias após a execução EP enquanto-DNA plasmídeo circular, obviamente, ainda sustenta a expressão depois de 35 dias, com a mais elevada em células de Sertoli. Isto sugere que os melhores resultados são obtidos quando se utiliza construções de plasmídeos para eletroporação como foi feito aqui. Na nossa abordagem, foi investigada a eficiência da transfecção de 3 dias após a electroporação, devido à observação de que este período de tempo é suficiente para a cicatrização da ferida, a reparação de integridade celular, bem como a expressão adequada desejada das proteínas repórter eGFP e DsRed2. Assim, um tempo de incubação de 3 dias após a intervenção cirúrgica, e o procedimento de transfecção inteiro parece ser necessário para assegurar as funções de células apropriadamente restaurados, incluindo a expressão de genes de modo a que um sinal de fluorescência como intensivo quanto possível pode ser detectada assegurar um resultado fiável transfecção. No que diz respeito a eficiência da transfecção, Yomogida 21 et al. Revelou que the células de Sertoli somáticas são, aparentemente, mais sensível à EP-transfecção de células germinativas. Sugerimos que a co-transfecção de testículo com alvo e controlo de plasmídeos, cada um de codificação para um gene repórter diferente.

A abordagem electroporação apresentado é aplicável a uma ampla gama de possíveis problemas referentes a processos de células germinais e de fertilidade masculina. Por exemplo, ele pode ser utilizado para a análise de elementos reguladores de genes específicos da espermatogénese 17,22. O método também é adequado para estudos de perda de função com pequeno RNA interferente 23 e obter-de-função estuda 24. Além disso, há chances promissoras até mesmo realizar EP para o tratamento terapêutico e geração de prole transgênica como grupos de pesquisa já demonstraram 18,20,25.

Assim, a abordagem metodológica romance de rato testis in vivo eletroporação ilustrada em conjunto com microi eferente dutonjection de construções de plasmídeos, esperamos subir para uma técnica valiosa para desvendar com sucesso a natureza da espermatogênese.

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Disclosures

Marten Michaelis, Alexander Sobczak, e Joachim M. Weitzel empregados no Instituto de Biologia Reprodutiva, do Instituto Leibniz de Biologia Animal Farm (FBN), Dummerstorf, Alemanha, declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Acknowledgements

Agradecemos Birgit Westernstroeer do Centro de Medicina Reprodutiva e Andrologia da Universidade de Muenster para o ensino da microinjeção testicular. Além disso, somos gratos a Ursula Antkewitz e Petra Reckling para assistência técnica. Agradecemos a Fundação Alemã de Pesquisa (DFG) para apoiar este trabalho (WE2458 / 10-1).  

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Centrifuge Sigma 1-15 PK
Spectrophotometer Nanodrop ND-1000
Micropipette puller Narishige PC-10 vertical capillary puller
Microinjection capillaries Clark GC100-10 borosilicate standard wall
Micropipette beveler Bachofer Typ 462 rotating disk beveler
Electroporator Nepagene CUY 21EDIT square wave electroporator
Tweezer electrodes Nepagene CUY 650P5 5 mm Ø disk electrodes
Stereo microscope Zeiss Stemi 2000-C
Cold light source Zeiss KL 1500LCD
Microinjection pump Eppendorf Femtojet
Micromanipulator homemade XYZ cross table
Surgical instruments FST scissors, forceps, needle holder
Fine forceps FST Dumont #5, #7 efferent ducts preparation
Michel clip applying stapler FST Michel, 12029-12
Michel suture clips FST Michel, 12040-01 7.5 x 1.75 mm
Surgical suture Catgut, Markneukirchen, Germany Catgut 00
Syringe with 30 G needle B. Braun Omnican 40 to load micropipette and for anesthesia
Plasmid isolation kit Promega Cat. # A2495 plasmid Midiprep
Plasmid pEGFP-C1 Clontech Cat. #6084-1 CMV-promoter + EGFP
Plasmid pDsRed2-N1 Clontech Cat. #6084-1 CMV-promoter + DsRed2
Fast Green dye Sigma F7258-25G for dilution in ddH2O
10% Ketamine Serum Werk, Bernburg, Germany Urotamin mix in a rate 1:1 with xylazine
2% Xylazine Serum Werk, Bernburg, Germany Xylazin mix in a rate 1:1 with ketamine
Sterilium Bode Chemie Sterillium disinfection
Vet ointment S&K Pharma, GmbH Kerato Biciron 5%, Augensalbe opthalmic ointment to prevent eye dryness
To-Pro-3 iodide Invitrogen T3605
10x PBS, pH 7.4
1.37 M NaCl Carl Roth 3957.1
Ibuprofen, Dolormin Johnson & Johnson Consumer Health Care Germany 01094902 analgesic pediatric solution (NSAID) for postsurgery pain relief
27 mM KCl Carl Roth 6781.1
100 mM Na2HPO4·2H2O Carl Roth T106.2
18 mM KH2PO4 Carl Roth 3904.1

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Reuter, K., Schlatt, S., Ehmcke, J., Wistuba, J. Fact or fiction: In vitro spermatogenesis. Spermatogenesis. 2, 245-252 (2012).
  2. Hunter, D., Anand-Ivell, R., Danner, S., Ivell, R. Models of in vitro spermatogenesis. Spermatogenesis. 2, 32-43 (2012).
  3. Zizzi, A., et al. fluorescent protein as indicator of nonviral transient transfection efficiency in endometrial and testicular biopsies. Microsc. Res. Tech. 73, 229-233 (2010).
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