Visualisation endocytose clathrine de G récepteurs couplés aux protéines à un seul événement résolution par microscopie TIRF

Biology

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Soohoo, A. L., Bowersox, S. L., Puthenveedu, M. A. Visualizing Clathrin-mediated Endocytosis of G Protein-coupled Receptors at Single-event Resolution via TIRF Microscopy. J. Vis. Exp. (92), e51805, doi:10.3791/51805 (2014).

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Abstract

Introduction

Le processus de clathrine endocytose (CME) dépend de l'arrivée au bon moment des nombreux composants de la machinerie d'endocytose clathrine pour recueillir le fret et manipuler la membrane plasmique dans les vésicules 1-3. CME est initiée par la déformation de la membrane et de la cargaison à l'adaptateur protéines qui se réunissent sur ​​les sites naissantes d'endocytose 1. Ces protéines recrutent la clathrine de protéine d'enveloppe, qui rassemble dans une structure en forme de cage qui forme la fosse recouverts de clathrine (PCC) 4. Une fois que le PCC est entièrement assemblé en une forme sphérique, la scission de la membrane, principalement grâce à l'action de la grande GTPase dynamine, génère gratuits vésicules de clathrine (CCVS) 5,6. Cette internalisation déclenche démontage rapide de la couche de clathrine, permettant aux composants d'être réutilisés pour de multiples séries de CME.

La découverte et la caractérisation des protéines impliquées dans la FMC a été enracinée dans Bioch traditionnelleemical, génétiques, et des techniques de microscopie 4-6,8. Ces essais ont permis d'élucider les rôles et les points d'interaction de ces composants d'endocytose. Bien que très utile pour définir des éléments essentiels de la machinerie de trafic, ces tests sont très limités à capturer le comportement dynamique des composants de FMC ou de la concentration de la cargaison. Il s'agit d'une limitation critique, puisque CME est entraîné par l'ensemble chorégraphié des ensembles de modules de protéines dans les étapes définies, et depuis de petits changements dans la dynamique des événements d'endocytose individuels peut avoir de grandes conséquences cumulatives sur l'endocytose. En outre, des données récentes indiquent que les CCP individuelles peuvent différer à la fois dans la composition et dans le comportement, ce qui suggère que la régulation physiologique de ce processus est très spatialement et temporellement limitée 9-14. Visualisation des événements d'endocytose individuels, par conséquent, il est essentiel de comprendre pourquoi il ya plusieurs protéines impliquées dans redondants CME et b comment ces protéines pourraient être contrôléssignaux physiologiques y pour réglementer cargaison internalisation.

Nous décrivons ici l'utilisation de la réflexion interne totale microscopie de fluorescence (TIRFM) pour observer CME au niveau de la dynamique des contreparties centrales individuelles dans les cellules vivantes. TIRFM repose sur la différence d'indice de réfraction entre la lamelle de verre et l'environnement de fluide de cellules 15,16. Lorsque la lumière d'excitation est dirigée vers les cellules situées plus à l'angle critique, elle est réfléchie à l'intérieur, ce qui crée une onde évanescente qui maintient un champ d'illumination mince s'étendant à peu près 100 nm au-dessus de la lamelle. Cela garantit que seules les molécules fluorescentes dans ce domaine étroit sont excités. En pratique, cela permet à l'excitation des molécules fluorescentes sur ou près de la membrane plasmique, et minimise la fluorescence à partir des parties intérieures de la cellule. Ceci permet d'obtenir un rapport signal sur bruit et la résolution de l'axe z sensiblement plus élevé pour visualiser les événements à la membrane plasmique, compared de modes plus couramment utilisés tels que épifluorescence classique ou microscopie par fluorescence confocale. Nous décrivons également, à une initiation et pratique, l'utilisation d'une image couramment utilisé la plate-forme d'analyse pour analyser et quantifier les caractéristiques et la dynamique des événements individuels cargaison de endocytose morphologiques simples.

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Protocol

1 Expression de fluorescence Tagged CME composants dans des cellules cultivées

Cellules HEK293 sont des cellules de modèles utiles qui ont été largement utilisés pour étudier la biologie RCPG et l'endocytose, et ne sont donc utilisés comme modèles de ce protocole. Utiliser n'importe quel protocole de transfection fournir expression uniforme sans surexpression et une faible cytotoxicité.

  1. Gérer toute la culture de cellules dans une hotte à flux laminaire stérile. Remplir 4 puits d'une plaque de 12 puits avec 1 ml de milieu essentiel modifié par Dulbecco (DMEM) avec 10% de sérum bovin fœtal (FBS). A partir d'une fiole T25 confluente de cellules HEK293 diluer 01:50, 01:25, 01:16, 01:10, respectivement dans chacun des quatre puits.
    1. Sinon, semences cellules sur une plaque multi-puits de la taille souhaitée, selon les instructions du fabricant. Graine de 0,4 à 2 x 10 4 cellules dans une plaque à 12 puits. Cultiver les cellules pendant une nuit dans une solution stérile à 37 ° C avec 5% de CO2 et 95% d'humidité.
      NOTE: Étant donné que la croissance rates varient en fonction des conditions et des lignées cellulaires, il peut être préférable pour ensemencer des puits multiples pour assurer la confluence idéal pour la transfection, le lendemain ou la possibilité de réaliser des transfections en double.
  2. Le lendemain matin, sélectionner un bien qui est ~ 70% de confluence pour la transfection (voir figure 1B). Si aucun puits a atteint cet état, attendre un autre jour.
    NOTE: 70% de confluence est idéal pour les cellules HEK293. Transfecter des cellules qui sont plus rares résultats dans la mort cellulaire et la toxicité. Transfection de cellules confluentes sur les résultats en faible expression.
  3. Ajouter 60 ul de tampon EC (de la trousse de transfection), 400 ng de plasmides codant étiqueté GPCR et / ou des composants de la machinerie de la clathrine et 2,4 pi d'activateur dans le tube de 1,5 ml, comme décrit dans le protocole du fabricant. Vortex pendant 2 secondes pour assurer un mélange suffisant, et tourner dans une microcentrifugeuse à 2000 g pendant 2 s pour collecter le liquide au fond.
  4. Ajouter6 pl Effectene comme décrit dans le protocole du fabricant. Vortex pendant 2 secondes, et centrifuger à 2000 g pendant 2 secondes dans une centrifugeuse pour collecter le liquide au fond. Attendre 20 min pour permettre la formation de micelles complexes de transfection.
  5. Aspirer le milieu du puits à être transfectées. Ajouter avec précaution 0,8 ml de DMEM avec 10% de FBS dans le mélange réactif de transfection et mélanger par pipetage de haut en bas afin de réduire lentement la rupture des micelles. Ajouter le support et le mélange de transfection pour le bien que très lentement à partir du côté. Ajouter tout mélange de transfection restante du tube à centrifuger pour le puits à l'aide d'une micropipette.
    NOTE: En option, ajouter un supplément de 0,5 ml de DMEM avec 10% de FBS au bien transfectées de donner les cellules nourriture supplémentaire résultant en transfection doux et expression transitoire inférieure.
  6. Retour aux cellules de la 37 ° C incubateur pendant 5 heures.
  7. Aspirer le milieu contenant le mélange de transfection. Remplacer avec 1 ml de DMEM avec 10% de FBS. Permettreles cellules de se développer pendant la nuit.
  8. Le lendemain, passer les cellules à lamelles non couchés, préalablement stérilisés par autoclave.
    1. Ajouter 0,5 ml de tampon phosphate salin (PBS) avec 1 mM d'EDTA dans chaque puits. Vous pouvez également utiliser 0,5 ml de 0,05% de trypsine-EDTA. Laisser dans l'incubateur pendant 1 min.
    2. Placez 3 rond, 25 mm lamelles stériles dans des puits séparés d'une plaque à 6 puits. Remplir chaque puits avec 2 ml de milieu. Pousser doucement la lamelle vers le fond du puits pour empêcher les cellules de se développer sur le fond de la lamelle.
    3. Manuellement agiter le bien décoller les cellules du fond du puits. Ajouter 1 ml de DMEM avec 10% de FBS pour suspendre à. Distribuez les cellules levées à partir du 1er puits d'une plaque de 12 puits de manière égale entre les trois lamelles. Alternativement, la plaque cellules sur 3 plats à fond de verre.
  9. Permettre aux cellules de se développer sur les lamelles pendant au moins 48 heures avant l'imagerie. Veiller à ce que les cellules sont étalées et plat.

2.Imagerie PCC et de fret Dynamics Utilisation TIRFM

  1. Anticorps anti-FLAG conjugué M1 avec des colorants Alexa utilisant Alexa Fluor kit protéines d'étiquetage selon le protocole de la fabrication. Alternativement, les anticorps pré-conjugués peuvent être achetés.
  2. Pré-incuber les cellules avec les anticorps à une dilution de 1: 1000 à 1 ml de milieu préchauffé Leibovitz avec 10% de FBS, ou Opti-MEM avec 50 mM de HEPES pH 7,4 et 10% de FBS pendant 10 min à 37 ° C (formation d'image moyen), pour marquer des GPCR étiquetée FLAG sur la surface de la cellule. Passer ces étapes si les protéines fluorescentes codées génétiquement, comme la GFP, sont utilisés comme étiquettes (voir la discussion pour plus de détails).
  3. Transférer la lamelle à une chambre d'imagerie des cellules vivantes. Sinon, pour les plats à fond de verre, aspirer médias anticorps-étiquetage et ajouter 700 pi de milieu de l'imagerie pré-chauffé.
    1. Utilisez une paire de pinces et plier la pointe d'une aiguille de calibre 25 dans un crochet.
    2. Tenez une paire de pinces à la main dominante. Tenez l'aiguille recourbée en OTHer. Tourner l'aiguille jusqu'à ce que les courbes de crochet vers le bas vers le verre. Faire glisser doucement l'aiguille, côté crochet vers le bas, à travers le fond d'une plaque à 6 puits jusqu'à ce qu'il s'accroche à la lamelle. Prenez soin de ne pas rayer la surface de la lamelle, comme il détacher les cellules. Soulevez délicatement la lamelle du fond du puits. Équilibrer la lamelle contre le mur du puits de soutien.
    3. Utiliser la pince pour saisir à proximité du bord de la lamelle couvre-objet et déplacer du côté de la cellule de la lamelle jusqu'à la chambre d'imagerie, et à assembler la chambre. Ajouter 700 ul (ou quantité appropriée) du milieu de l'imagerie pré-chauffé. Manipuler avec précaution les lamelles sans pression pour éviter les fissures ou rupture.
  4. Transférer la chambre sur le microscope et maintenir la température des cellules à 37 ° C en utilisant un dispositif de chauffage de l'étape ou un incubateur fermé.
  5. Apportez cellules dans le foyer en utilisant un objectif à immersion d'huile 100X ou 60X FRBR (1,45 NA ou au-dessus). Image les cellules en épifluorescence ou con classiquemodes d'intervention de l'éclairage (c'est à dire pas TIRFM) pour identifier les cellules exprimant les constructions appropriées. Out-of-focus cellules sont presque invisibles dans la mince profondeur d'éclairage FRBR ce qui rend difficile de trouver le plan focal et cellules.
    REMARQUE: Certains systèmes utilisent les mêmes lasers pour TIRFM à l'image en épifluorescence classique, en déplaçant l'angle d'incidence du laser au-dessus de l'angle critique. Comme une mesure de sécurité importante, toujours être conscient de l'angle du faisceau laser, et toujours diriger loin de l'observateur.
  6. Concentrer le bas à la surface inférieure d'une cellule exprimant jusqu'à ce que le contour de la membrane de plasma autour de la cellule disparaît et le centre de la cellule apparaît. Ceci est plus évident avec une protéine cargo localisée de la membrane plasmique, tels que le récepteur de μ-opioïdes (voir figure 2A).
  7. Passez à l'imagerie TIRF.
    1. Si l'on utilise le même laser pour l'imagerie à épifluorescence classique, d'augmenter l'angle d'incidence de l'fluorescence laser jusqu'à ce que l'extérieur de la mise au point à l'intérieur de la cellule disparaît, et sans contour de la membrane de plasma autour de la cellule est considéré. (Comparez la figure 2C aux figures 2A et 2B)
      NOTE: Dans TIRFM, déplacer le plan focal, l'image d'aller complètement hors du foyer et / ou faible, et les niveaux de fluorescence globale diminue en raison de la plus petite profondeur d'éclairage. Par conséquent, une autre méthode pour mettre à l'illumination de TIRFM est d'abord mise au point sur le centre de la cellule en épifluorescence confocale / classique, puis à augmenter l'angle d'incidence jusqu'à perdre plus de la fluorescence, et ensuite concentrer jusqu'à la membrane plasmique.
    2. Une fois dans TIRFM, assurer le laser d'excitation reflète à travers l'objectif et n'est pas visible au-dessus de l'objectif. Confirmer en vérifiant si le spot laser est visible.
      NOTE: Dans les modes de épifluorescence ou confocale classiques, l'illumination laser est visible au-dessus de l'objectif,par exemple sur le plafond.
    3. Affiner la mise au point pour obtenir une image nette. Les principaux composants de la machinerie d'endocytose, telles que la clathrine, seront visibles dans lacrymaux. Réglez la mise sur amende, si les points lacrymaux sont aussi ronde que possible.
      REMARQUE: Pour le fret membrane localisée, ajuster la mise au point fine jusqu'à la filopodia semble distincte.
    4. Utilisez un programme d'acquisition pour enregistrer tous les paramètres d'imagerie tels que les miroirs et l'angle de la FRBR. Faites de même pour toutes les longueurs d'onde nécessaires.
  8. Scannez autour de la lamelle de trouver des cellules exprimant tous les marqueurs d'endocytose souhaités: le récepteur μ-opioïde et l'adaptateur β-arrestine dans l'exemple représenté sur la figure 3A. Sélectionnez les cellules qui expriment mais pas trop exprimant. Voir discussion pour plus de détails.
  9. Une fois que les cellules sont identifiées, d'acquérir des images toutes les 3 secondes pendant 10 min. Cela est suffisant pour capturer la durée de vie d'une contrepartie centrale, puisque la durée de vie moyenne d'un CCP dans les cellules HEK293 imagées dans ces conditions est aro40 und 10 à 11 sec. Cela permet environ 12-14 images d'observer le PCC. Par exemple, voir le film 1. Répéter toutes les étapes de cellules supplémentaires d'image.

3 Analyse de la dynamique endocytose par vérification manuelle

Bien que la vérification manuelle de la durée de vie du PCC est fortement limitée par le nombre de contreparties centrales qui peuvent être détectés, il reste encore un moyen précis de détection sans se laisser décourager par les changements globaux dans l'image et de détection des objets. Voir discussion pour plus de détails.

  1. Ouvrez le fichier dans ImageJ. Les images sont stockées dans une pile de fichiers TIFF avec chaînes entrelacées. Convertir les images en hyperstacks. Allez dans Image> Hyperstacks> Pile à HyperStack. Entrez le nombre de canaux acquis (c'est à dire si l'imagerie β-arrestine et le récepteur μ-opiacé, entrez 2), Saisissez 1 pour Z pile (TIRFM est un seul plan), et le nombre d'images du film (c'est à dire 10 min film à 1 image toutes les 3 s is 200) dans la fenêtre pop-up.
  2. Le format HyperStack donne une fenêtre avec deux barres de défilement. Utilisez la barre haut pour parcourir les canaux et le fond de se déplacer à travers le temps. Faites défiler jusqu'au canal de la protéine dont la durée de vie va être testée.
  3. Déplacez à encadrer 10 ou 15 du film à réduire l'inclusion des contreparties centrales préexistantes dont les durées entier ne sont pas visibles. Dessiner une boîte de ROI autour d'un point choisi au hasard.
  4. Comptez le nombre de cadres est un endroit visible.
    REMARQUE: Voir la figure 3B et 3C pour des exemples de trois catégories morphologiques d'événements d'endocytose 10,11,16-19.

4 Analyse de la dynamique endocytose par reconnaissance Objectif

Reconnaissance objective permet la détection de la quasi-totalité des contreparties centrales imagées dans une cellule, mais peut être sujette à l'erreur due à la détection des rayonnements non essentiels des structures erronées. Voir discussion pour plus de détails pesant les avantages et les inconvénients de l'eméthode d'ach. Plusieurs programmes, y compris des algorithmes sur mesure, peuvent être utilisés pour détecter objectivement CCP. Ce protocole décrit reconnaissance objective des contreparties centrales utilisant Imaris, un logiciel d'analyse d'image (voir Matériaux).

  1. Pour commencer, ouvrez le fichier image brute dans le logiciel d'analyse d'image. Par défaut, une image couleur fusionné s'affiche. Utilisez la fenêtre "Réglage de l'affichage" pour régler la luminosité d'un canal. Cliquez sur le nom d'un canal pour changer la couleur affichée. Décochez la case à côté du canal pour empêcher son affichage (voir la figure 4A).
  2. Créer des «spots» en cliquant sur l'icône avec des taches orange. Voir la Figure 4B. Choisissez une région d'intérêt (ROI) autour de la cellule. Voir la figure 4C. Utilisez un retour sur investissement à exclure les zones qui seront mal détecter les bords d'attaque et de plaques lumineuses. Analyser plusieurs cellules avec différents niveaux séparément d'expression.
  3. Mesurer le diamètre d'un spot à ProviDe premières estimations pour l'algorithme. Passez en mode "Slice", et cliquez sur les extrémités polaires d'un endroit pour mesurer le diamètre. Voir la figure 4E. Pour ce faire, pendant 4 ou 5 taches rondes qui ressemblent indicatif d'une contrepartie centrale à la hauteur de sa stabilité, après la formation et avant la scission. Utilisez ces mesures pour calculer le diamètre moyen jusqu'à la dixième de micron.
  4. Détecter les points. Retour au mode "surpasser". Sélectionnez le canal approprié pour la détection. Entrez le diamètre moyen mesuré, généralement 0,3 ou 0,4 um. Cliquez sur la flèche bleue vers l'avant pour quantifier les taches. Voir la figure 4E. Si le diamètre des taches est sous-estimée, les points parasites de fluorescence seront considérés comme des points. Si le diamètre est trop grand, les vrais spots seront ignorés. En cas de doute, estimer un peu plus bas, et filtrer les détections incorrectes ultérieurement.
  5. Filtre Spots par la qualité. Réglez le filtre de capturer autant de points que possible sans retoursol. Le filtre de qualité est sélectionné par défaut 20. Voir la figure 4F.
    1. Utilisez la courbe «qualité» comme guide pour définir un seuil approprié. Déplacez le seuil bas du filtre avec le bouton gauche de la souris pour ce premier plongeon dans la courbe. C'est un bon point de départ pour le filtre, comme cette position affine généralement la détection de taches visibles seulement. Voir la figure 4F.
    2. Spots détectés apparaissent sur le film sous forme de sphères ou de pixels centraux. Utilisation de l'onglet "Couleurs", régler la couleur des taches de couleur contrastante pour le rendre plus facile de les voir. Faites défiler le film d'examiner les points dans chaque trame. L'objectif est de détecter le plus de points que possible pour l'ensemble de leur durée de vie.
    3. Éliminer les taches de gradation ou manuellement les connecter en pistes continues plus tard, car ils ne sont pas bien détectés par le cours de leur vie.
    4. Retirer des plaques lumineuses avec une "intensité" filter, si nécessaire. Cliquez sur le signe plus vert pour ajouter un nouveau filtre. Voir la figure 4F. Créer un filtre d'intensité de filtrer ou à taches d'un des signaux de fluorescence donnés. Utilisez la courbe générée intensité, (analogue à la qualité Curve discuté en 4.5) pour définir le seuil. Utilisez le bouton gauche de la souris pour enlever l'extrémité gauche de la courbe qui représente les points brillants.
      REMARQUE: Les grandes structures de la plaque sont généralement parmi les éléments les plus brillants de la cellule, et ils sont facilement exclus de ce filtre.
    5. Faites défiler le film de veiller à ce que les contreparties centrales sont détectés comme des taches et les plaques brillantes ne sont plus détectés. Figure 3D montre une cellule où la détection des contreparties centrales (notée sphères blanches) a été optimisé avec le filtre de la qualité et des plaques ont été exclus de la qualité filtre.
    6. Réduire les bords de cellules lumineuses avec le filtre de qualité. Objets brillants peuvent encore être supprimés manuellement, à l'étape suivante. Continuer avec le bleuflèche.
    7. Enlever les taches aberrantes dans l'écran Modifier Spots. Passez à "Sélection" en mode. Cliquez sur le champ. Il devient jaune. Cliquez sur "Supprimer". Cliquez sur la flèche bleue pour continuer la construction de l'algorithme. Voir Figure 4G.
  6. pistes de mesure. Réglez les pistes de "mouvement brownien." Le PCC doit pas présenter de mouvement dirigé, ne dérive minimale à travers la membrane plasmique. Cet algorithme est le plus approprié pour cette motion. Voir la Figure 4H.
    1. Réglez la Distance maximale à une petite valeur telle que 0,7 um. Voir la Figure 4H.
      REMARQUE: Le réglage sur une petite distance minimise connexion des taches adjacentes et permet encore pour le suivi continu d'un point de cellule par CCP ou le mouvement des cellules.
    2. Réglez Max Gap Taille à 1 Ceci permet une bonne voie pour continuer s'il n'y a qu'une seule trame manquante dans la succession. Cliquez sur la flèche bleue pour calculer pistes. Voir la Figure 4H.
      REMARQUE: Gtailles ap de plus de 3 causes différentes pistes à mal reliés entre eux.
    3. piste de commutation écoute de "Dragon Tail". Faites défiler le film en observant la qualité de détection. Si les points adjacents sont connectés, diminuer le Max Distance inférieure à 0,7 um. Si les points sont divisés trop facilement, augmentez la taille maximale Gap. Cliquez sur la flèche bleue pour créer des pistes. Cela conduit à l'écran des plages de filtration. Voir la Figure 4H.
  7. Pistes de filtrage et d'exportation de données. Utilisez une "intensité" filtre pour éliminer les plaques lumineuses supplémentaires. Utilisez un filtre "Déplacement" pour supprimer les endosomes qui entrent dans le champ de la FRBR. Faites preuve de prudence, car plus les points auront plus de déplacements ainsi. Cliquez sur la double flèche verte pour compléter le protocole. Voir la figure 4E.
    1. Utilisez l'onglet Modifier Tracks, avec l'icône de crayon, de supprimer les détections faussement positives de chansons qui ne peuvent être éliminés par des filtres. Vérifiez discontinuities ou de fausses connexions. Pour relier deux pistes, sélectionnez-les en appuyant sur Ctrl-clic gauche, puis cliquez sur "Connect" dans la boîte d'édition des pistes. Pour déconnecter pistes en taches distinctes, sélectionnez une piste et cliquez sur "Déconnecter". Sélectionnez plusieurs points avec Ctrl + clic gauche et cliquez sur "Connect" pour créer une nouvelle piste. La méthode est la même pour les taches Edition, décrits dans 4.5.7. Voir Figure 4J.
    2. Pour exporter les données, cliquez sur l'onglet Statistiques. Cliquez sur l'icône unique de disquette pour exporter la statistique sélectionnée. Cliquez sur l'icône qui ressemble à une série de disquettes d'exporter toutes les statistiques. Le "Track Durée" statistique contient la longueur des pistes d'endocytose. Voir Figure 4K.

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Representative Results

En utilisant des cellules vivantes microscopie TIRF nous avons enregistré la dynamique d'endocytose de la μ-récepteurs opioïdes (MOR), un récepteur couplé aux protéines G (GPCR) et son endocytose protéine adaptatrice β-arrestine. La construction β-arrestine été transfecté de manière transitoire dans une lignée cellulaire exprimant de manière stable MOR en utilisant le protocole présenté sur la figure 1, et 96 heures plus tard imagée. Le MOR dans la lignée cellulaire stable est le N-terminale marquée avec une GFP sensible au pH. Cette protéine fluorescente émet une fluorescence seulement dans le fluide extracellulaire neutre. En outre, le MOR endocytoses seulement une fois activé par un agoniste, et reste par ailleurs distribué uniformément à travers la membrane plasmique. En se concentrant sur la membrane plasmique adhérent qui est assis sur le couvercle de verre dans les résultats de mode confocal dans une cellule qui est rempli avec une faible fluorescence. Ceci est différent d'une mise au point sur l'axe de la cellule, où la membrane plasmique est seulement considéré comme un anneau autour de la fluorescence de la cellule. Comparer la gaucheet les panneaux de droite de la figure 2A. Le passage à épifluorescence ou TIRF classique avec un angle erroné provoque la fluorescence de la mise au point de devenir apparent dans les mêmes cellules, comme illustré sur la figure 2B. Lorsque l'angle de la FRBR est correct, la membrane plasmique est très nette, claire et lumineuse et de fluorescence de mise au point ne perturbe l'image. Comparer la figure 2C pour les figures 2A et 2B.

L'image est claire et nette parce que le MOR est sur la membrane plasmique adhérent, qui est en grande partie dans le domaine de la FRBR. En revanche, la β-arrestine reste dans une piscine cytosolique lorsqu'il n'est pas encore engagé pour puncta endocytose, et apparaît trouble et de mise au point, car il n'est pas dans le champ de TIRF. Une fois que le MOR est activé par un agoniste, β-arrestine est recruté à la membrane plasmique, et les deux β-arrestine et le récepteur redistribuer aux contreparties centrales (figure 3A et Film 1 , Β-arrestine en vert, en rouge MOR, recouvrement est jaune).

Les durées de vie de ces groupes peuvent être quantifiés manuellement à l'aide des trois paramètres pour l'endocytose complété comme illustré à la figure 3B. Les points indiquant les contreparties centrales peuvent soit disparaître complètement (voir aussi la figure 3C), "clignote" sur et en dehors ou "pincer off" une structure plus grande. Les deux dernières conditions représentent des événements qui sont spatialement trop proches pour être résolus comme des événements distincts. L'algorithme de détection de spot dans Imaris est également utile de quantifier les contreparties centrales, comme indiqué sur la Figure 4. Figure 3D représente CCP détecté en utilisant Imaris, après filtration pour éliminer les structures de la plaque non dynamiques. Sphères blanches superposées indiquent spots détectés. Taches Dimmer qui ne pouvaient pas être détectés pour leurs vies entières ont été également exclus avec le filtre «Qualité».

"> Figure 1
Figure 1: Organigramme de procédure transfection. (A) d'abord, semer une variété de dilutions (01:50, 01:25, 01:16, 01:10) sur une plaque de 12 puits. Permettent aux cellules de se développer pendant la nuit. Le lendemain, la recherche d'un bien qui est d'environ 70% de confluence, et uniformément répartie, comme illustré. C'est le bien qui sera transfectées. (B) Ajouter 60 ul de tampon CE et 400 ng d'ADN dans un tube à centrifuger. Vortex pendant 10 secondes et centrifuger le liquide de fond du tube. Ajouter 2,4 ul de Enhancer. Vortex pendant 2 secondes et centrifuger le liquide de fond du tube. Incuber à température ambiante pendant 3 min. Ajouter 6 pi de Effectene. Vortex pendant 2 secondes et centrifuger le liquide de fond du tube. Incuber à température ambiante pendant 20 min. (C) mélanger lentement 0,8 ml de DMEM avec 10% de FBS avec de la transfection. Ajouter aux cellules préalablement bien sélectionné. Incuber les cellules pendant 5 heures à 37 ° C. Remplacer avec des produits fraisDMEM avec 10% de FBS.

Figure 2
Figure 2: Trouver le domaine de TIRFM. (A) La membrane plasmique imagé dans confocale. Le panneau de gauche montre des cellules dans confocale avec un accent sur le centre de la cellule. La membrane plasmique est seulement considéré comme un "anneau" autour de la cellule. De mise au point vers la membrane plasmique de la base, à côté de la lamelle couvre-objet provoque la cellule pour être rempli avec une faible fluorescence. La membrane plasmique "anneau" ne devrait pas être visible dans le domaine de la FRBR plus mince. (B) La membrane plasmatique basale avec un angle de la FRBR profonde produisant un éclairage à épifluorescence classique à travers l'échantillon. Ceci illumine toute la cellule et beaucoup de fluorescence de mise au point à partir de la partie supérieure de la cellule est présente. (C) La membrane plasmique dans TIRF. En se concentrant sur filopodia aide à trouver ce plan. Notez qu'il estun plan lisse unique. Les barres d'échelle sont de 10 um. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3
Figure 3: Visualisation et quantification des événements endocytose dans la FRBR. (A) Une cellule exprimant le μ-récepteurs opioïdes (MOR) et β-arrestine avant et après l'addition d'un agoniste qui induit l'endocytose. L'agoniste provoque une redistribution des deux protéines à puncta endocytose. La barre d'échelle est de 10 um. (B) Trois types d'événements d'endocytose, vus par la visualisation dynamique de arrestin, compatible avec des morphologies décrites précédemment. "Steady", un signal continu qui disparaît rapidement. C'est le type principal, indiquant que le PCC a germé et a quitté le champ de la FRBR. "Blink", un signal qui clignote à un signal faible et réapparaît au même endroit en raison de l'assemblage d'un deuxième PCC au même endroit. "Pincez", une saillie tubulaire se détache une tache, lorsque deux contreparties centrales sont trop proches les uns des autres pour être résolus taches distinctes, et on est réabsorbée par endocytose. La boîte est de 2 x 2 pm. (C) Visualisation endocytose clathrine de MOR à la résolution d'un événement isolé. Deux exemples qui représentent la majeure partie des événements d'endocytose MOR sont présentés. Les cadres sont toutes les 3 sec. La boîte est de 2 x 2 pm. (D) Détection des événements individuels à l'aide d'endocytose Imaris. Sphères blanches représentent les contreparties centrales détectés comme Spots. Détection spot a été optimisé à l'aide d'un filtre «Qualité». Taches Dimmer qui ne pouvaient pas être détectées pour l'ensemble de leur vie ont également été exclus par le filtre de qualité. Structures de grande plaque qui sont présentés comme étant détectés ont été omises à l'aide d'une "intensité" filtre.ig3large.jpg "target =" _blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4
Figure 4: Objectif de reconnaissance de la dynamique des événements endocytose utilisant Imaris. (A) La fenêtre de réglage de l'affichage, utilisé pour ajuster l'affichage de l'image comme décrit dans l'étape 4.1. (B) Ouverture de la "Spots" algorithme constructeur. Le constructeur est affiché dans la fenêtre ci-dessous. (C) La première étape du constructeur Spots algorithme. Cochez la case "taches de piste (dans le temps)." Check "Segment seulement une région d'intérêt," si nécessaire. L'écran (D) de sélection de ROI. Voir l'étape 4.2 pour plus de détails. (E) Les multiples fenêtres nécessaires pour définir le diamètre d'un spot mesurée. Panneaux représentent: commutation de Surpass en mode Slice utilisant le Navigation Bar en haut, en cliquant sur les extrémités polaires d'un endroit, où le diamètre mesuré affiché, généralement sur le côté extrême droite, où entrer le diamètre mesuré. Voir les étapes de 4,3-4,4. (F) Le filtre réseau Qualité spot décrit dans 4.5-4.5.3. (G) Modifier __gVirt_NP_NN_NNPS<__ fenêtre spots décrit dans 4.5.7. (H) Tracks Mesure et affichage des fenêtres de pistes, décrites à la section 4.6. (I) fenêtre Tracks de filtrage décrit en 4.7. (J) Modifier suit fenêtre décrite dans 4.7.1. l'écran de données (K) Enregistrer décrit au paragraphe 4.7.2. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Film 1 .

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Discussion

Nous décrivons ici l'utilisation de TIRFM de visualiser endocytose clathrine (CME) au niveau de l'individu CCP dans les cellules vivantes en temps réel. CME est un événement rapide et très dynamique induite par l'effet cumulatif de plusieurs spatialement et temporellement séparées épreuves individuelles. La plupart des tests qui sont actuellement utilisés, tels que les mesures biochimiques de l'internalisation en utilisant biotinylation de surface ou de liaison ligand, la cytométrie de flux ou des cellules fixes dosages mesurant quantité de protéines internalisées ou électronique localisation microscopique de protéines, de suivre l'évolution d'ensemble de la localisation des protéines à des moments fixes . Ces méthodes existantes ont été très utiles dans l'identification des protéines qui sont nécessaires pour la FMC, mais n'ont pas la résolution spatiale et temporelle qui correspond aux échelles physiologiques de FMC ou d'autres processus de la traite de la membrane dynamique. Ceci est important, car des données récentes suggèrent que les CCP sont hétérogènes dans leur composition en protéines et dynamique 9-12, et que la FMC est probablement réglé rapidement de façon discrète dans l'espace. Direct TIRFM cellulaire offre la possibilité d'analyser CME au niveau de l'espace séparé seule CCP, en temps réel, dans les cellules vivantes.

L'application réussie de cette analyse puissante s'appuie sur deux facteurs clés: la bonne santé des cellules et l'analyse approfondie des paramètres de FMC. Pour le premier, l'expression correcte de protéines marquées et des techniques de microscopie en minimisant la phototoxicité sont essentiels. Les lignées cellulaires de façon stable exprimant les protéines d'intérêt sont idéales, que les niveaux d'expression peuvent être estimés de manière fiable. Nous baliser les récepteurs avec soit épitope FLAG N-terminal ou SPH balises 21-25. Bien que n'étant pas strictement nécessaire, les deux systèmes d'étiquetage de faciliter TIRFM CME parce que les récepteurs peuvent être détectés de manière sélective sur la membrane plasmique au début de l'expérience. Les composants supplémentaires souhaités endocytose peuvent également être transfectées de manière transitoire dans ces lignées cellulaires stables. Le trprotocole de ansfection noter ici est optimisé pour l'imagerie CME en utilisant TIRFM. Tout d'abord, il est conçu pour les niveaux même modérés et d'expression. Pauvre expression nécessite une puissance de laser pour la détection et augmente le risque à la fois pour la phototoxicité et photoblanchiment. En outre, puisque ce test enregistre la disparition des points lacrymaux comme étant des CCP intériorisées, signaux faibles et photoblanchiment nuisent également à l'analyse. Nous suggérons que, dans ces circonstances, la durée totale et / ou la fréquence des images réduites. Deuxièmement, la courte incubation des réactifs de transfection sur des cellules, la transfection et l'intervalle entre l'expérience et le passage de cellules transfectées frais à lamelles avant l'imagerie, tout en sorte que les cellules sont imagés dans une santé optimale. En troisième lieu, ce qui garantit que la majorité des structures de clathrine sont CCP et des feuilles non planes de clathrine ou des plaques clathrine. Quatrièmement, ce protocole minimise surexpression des composants de FMC transfectées, qui a été shown à modifier la dynamique de FMC 20,26.

Pour l'imagerie de faible phototoxicité, il est important d'optimiser le système de formation d'image pour une résolution optimale et un maximum de sensibilité. Le grossissement de l'objectif et de la taille du détecteur de la caméra doit être adapté à minimiser ou à un grossissement de sous-échantillonnage et de vide. Une ouverture numérique élevée (1,45 ou plus) objectif de la FRBR doivent être utilisés pour collecter le maximum de lumière possible. Nous acquérons des images avec une caméra de dispositif à couplage de charge de l'électron-multipliant pour un rendement quantique élevé, les temps d'exposition très faibles, et des vitesses de lecture rapide. En outre, pour assurer la santé des cellules, ils sont imagés dans les médias Leibovitz, qui est tamponnée indépendant de CO 2, et est complété avec 10% de FBS, dans une chambre entièrement clos réglé sur 37 ° C. Parce que TIRFM est très sensible et les objectifs de grande ouverture numérique utilisés peuvent détecter la lumière ambiante, même minime, il est essentiel de créer un environnement d'imagerie clos gratuitde la lumière externe et les vibrations qui peuvent perturber le plan focal amende.

Il est important de noter que la durée de vie absolus et de la dynamique de la plupart des composantes de la CME varient fortement en fonction de types de cellules, les niveaux de protéines d'expression, de la température, jours après placage, et d'autres variations dans les conditions de culture 7,10,14,17,20, 25,27. Cela se reflète dans les énormes variations dans les délais et les distributions observées entre les différents groupes à l'aide de cette technique, une limitation claire de ce test. En outre, il est possible que les CCP sur la surface inférieure de la cellule, dans TIRFM imagé, se comportent différemment de la surface supérieure 23,25. S'il est permis de se demander qui représente avec précision la surface d'une cellule «typique», entouré par des composants de la matrice extracellulaire dans un tissu, les interprétations de la dynamique du PCC vus par cette technique doivent tenir compte de cette différence de potentiel. La véritable force de l'analyse consiste donc à comparer les changements dans dynamics de CCP, dans les mêmes cellules dans des conditions de culture identiques, après manipulations aiguës, y compris le regroupement des molécules cargo, tels que les GPCR, en réponse à l'activation. Cette comparaison permet de normalisation des modifications apportées à la même cellule, contrôlant ainsi pour tous les paramètres mentionnés ci-dessus qui pourraient induire des variations dans le comportement du PCC.

Nous employons habituellement deux analyses manuelles et automatisées, décrites ci-dessus, pour analyser la durée des événements d'endocytose: la vérification manuelle et la reconnaissance objectif l'aide du logiciel d'analyse d'image Imaris. La vérification manuelle est Labor- et prend beaucoup de temps, car il est limité par le nombre de CCP un utilisateur peut compter, mais il est sans doute la technique la plus précise disponible. Un œil humain formé peut facilement continuer à suivre un CCP par le mouvement de la cellule, et les changements dans la forme ou la mise au point, à l'exclusion des plaques de précision et des pixels défectueux. Il peut également détecter des changements morphologiques dans le PCC indicatif de veille terminéents, ​​comme le montre la figure est 3B et 3C. Il est impératif, cependant, que l'analyse reste objective que possible de ces contraintes. Ceci nécessite la définition de critères spécifiques qui sont utilisées systématiquement dans tous les ensembles de données. En outre, nous analysons généralement des images dans un double aveugle, où les noms des images sont brouillées afin que les conditions restent inconnues à la personne à analyser les images. Détection automatique, par exemple en utilisant les "points" et "Track Durée" algorithmes Imaris, peut être utilisé pour détecter la plupart des sites d'endocytose dans un film donné, générer un grand nombre d'échantillons. Alors que de nombreuses options, y compris des algorithmes sur-mesure très complexes 3,14,23,26,27, sont générés, la fiabilité de ces méthodes pour détecter des événements d'endocytose correctes tout en évitant la détection parasite reste la plus grande préoccupation. Par exemple, dans Imaris, le mouvement des cellules créant bords d'attaque lumineuses, plaques, et surcadres de discussion peuvent facilement se débarrasser de l'algorithme de détection de place, car il a tendance à détecter des structures lumineuses comme étant composé entièrement de taches. Afin d'éviter que ces points soient reliés dans une piste, ils doivent tous être enlevés. Spots aberrantes simples qui ne sont pas dans de grandes structures telles que les plaques peuvent être enlevées à l'onglet Modifier Spots, tandis que les points connectés peuvent être enlevés plus tard en utilisant l'onglet Modifier les chansons. Les points aberrants peuvent également être enlevées avec des filtres personnalisés. Par exemple, la figure 3D montre un filtre d'intensité utilisé pour limiter éviter notamment les plaques de détection PCC. Le filtre de la qualité est un autre filtre très utile pour supprimer les taches erronées. "Qualité" est une mesure cumulative de la luminosité et la forme trouvée en prenant l'intensité de fluorescence de la tache et le filtrage gaussien par ¾ de la longueur du rayon de la place 20. La courbe de la qualité se trouve sous les filtres sélectionnés. Il représente le nombre de spots (y) détectéelorsque la qualité est d'une certaine valeur (x). Plus la qualité, les taches plus détectés. Si le filtre est trop faible qualité, les taches sont détectées en l'absence de fluorescence visible, à l'inverse, si le filtre de qualité est trop élevée, seuls les spots brillants sont détectés. Suivez le long de la courbe vers des valeurs supérieures (x); le nombre de points détectés (y) est généralement chuter de façon spectaculaire. Déplacez le seuil bas à ce point. C'est le point minimum à placer le seuil bas. Autres contributeurs majeurs à de fausses taches dans le domaine de la FRBR sont endosomes qui se déplacent à la périphérie de la cellule et entrent dans le champ de la FRBR. Un critère robuste pour éliminer ceux-ci est la mobilité des taches, à savoir le déplacement des points dans le temps. CCP se déplacer très peu sauf dans le cadre du mouvement de l'ensemble de la cellule, tandis que les endosomes présentent un mouvement brownien ou dirigé rapide. Nouveaux algorithmes, tandis que nettement améliorée, sont encore affinés et optimisés 3,14,23,26,27. Comme ceux-ci sont réunishottes deviennent plus sophistiqués et fiables, nous pouvons analyser des centaines ou des milliers de sites, sans avoir à les vérifier manuellement à chaque point. Actuellement, cependant, nous suggérons que ces deux analyses sont utilisés ensemble pour se compléter mutuellement pour la précision.

Le protocole que nous avons décrit peut être facilement adapté pour répondre à de nombreuses questions concernant la cargaison endocytose. Il peut être utilisé pour effectuer la co-localisation simple des cargaisons avec des composants de FMC, et utilisé pour montrer les changements sur les composants spécifiques de la machine d'endocytose due à un stimulus particulier. Le test peut également être facilement adapté pour tout processus d'endocytose, comme caveolae 28, qui montrent des concentrations discrètes de fret et manteau composants, et à l'étude de ces processus fondamentaux dans les types de cellules spécialisées. Dans l'avenir, comme l'édition du génome devient plus courant 20,29,30, nous prévoyons qu'il va devenir la méthode préférée pour le marquage des composants, et que la dynamique et le comportement odifférentes composantes f seront affinés. Considérant que notre compréhension des processus cellulaires a été largement tirée par l'identification des gènes, des modifications de protéines, et interactomes, l'analyse que nous avons décrit ici représente une des prochaines frontières de l'enquête, à savoir. la définition de la dynamique spatio-temporelle de ces procédés et mécanismes.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM/High Glucose with L-glutamine and sodium pyruvate Fisher Scientific  SH3024301
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS), no calcium, no magnesium Gibco, by Life Technologies 21600-010
EDTA Free Acid Amresco 0322-500G
Fetal Bovine Serum Gibco, by Life Technologies 10437-028
Leibovitz's L-15 Medium, no phenol red Gibco, by Life Technologies 21083-027
Opti-MEM Gibco, by Life Technologies
HEPES CellPURE by Fisher Scientific BP2937-100
Effectene Qiagen 301425 Transfection reagent
25 mm coverglass Fisher Scientific 12-545-86
Corning cell culture treated flasks, 25 cm2 Fisher Scientific 10-126-28
Cell culture 6-well plate Greiner Bio-One, by VWR 82050-896
Monoclonal ANTI-FLAG M1 Sigma Aldrich F3040-5MG
[D-Ala2, N-Me-Phe4, Gly5-ol]-Enkephalin acetate salt (DAMGO) Sigma Aldrich E7384-5MG
Alexa Fluor 647 Protein Labeling Kit Life Technologies A20173
ImageJ NIH http://rsb.info.nih.gov/ij/
Imaris Image analysis software BitPLane http://www.bitplane.com/imaris/imaris, for automated analysis
Nikon Eclipse Ti inverted microscope and required accessories including filter cubes and filters Nikon
Nikon TIRF arm with required adapters for Nikon Eclipse Ti Nikon For adjusting angle of incidence
iXon+ EMCCD camera and adapters Andor

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