बरकरार vomeronasal अंग और गौण घ्राण बल्ब की पूर्व vivo तैयारी

1Department of Neuroscience, UT Southwestern Medical Center, 2Department of Anatomy and Neurobiology, Washington University in St. Louis
Published 8/04/2014
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Neuroscience

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Summary

माउस गौण घ्राण बल्ब (AOB) संवेदी कोडिंग के संदर्भ में अध्ययन करने के लिए मुश्किल हो गया है. यहाँ, हम एओबी न्यूरॉन्स माउस pheromones और kairomones की सूचना संसाधन में अनुसंधान की सुविधा, उनके परिधीय आदानों के लिए कार्यात्मक जुड़े रहते हैं जिसमें एक पूर्व vivo तैयारी का उत्पादन एक विच्छेदन प्रदर्शित करता है.

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Doyle, W. I., Hammen, G. F., Meeks, J. P. Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb. J. Vis. Exp. (90), e51813, doi:10.3791/51813 (2014).

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Abstract

माउस गौण घ्राण प्रणाली (AOS) nonvolatile सामाजिक odors, pheromones, और kairomones का पता लगाने के लिए एक विशेष संवेदी मार्ग है. AOS मार्ग में पहली तंत्रिका सर्किट, गौण घ्राण बल्ब (AOB), ऐसे क्षेत्रीय आक्रामकता और संभोग के रूप में सेक्स विशिष्ट व्यवहार स्थापित करने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है बुलाया. इस छोटे (<1 मिमी 3) सर्किट ऐसे conspecifics का स्राव और उत्सर्जन में chemosensory cues से सेक्स, तनाव, और तनाव के रूप में अद्वितीय व्यवहार राज्यों, भेद करने की क्षमता के पास. इस प्रणाली की कॉम्पैक्ट संगठन एक साथ सर्किट के बड़े हिस्से से रिकॉर्डिंग के लिए अद्वितीय अवसर प्रस्तुत करता है, वहीं एओबी में संवेदी प्रसंस्करण की जांच बड़े पैमाने पर की वजह से मस्तिष्क में अपनी प्रयोगात्मक हानिकर स्थान पर, चुनौती बनी हुई है. यहाँ, हम कनेक्ट छोड़ने, पूर्वकाल माउस खोपड़ी का एक भी गोलार्द्ध के अंदर बरकरार एओबी निकालता है कि एक बहुमंज़िला विच्छेदन का प्रदर्शनदोनों परिधीय vomeronasal संवेदी न्यूरॉन्स (VSNs) और स्थानीय neuronal circuitry बरकरार आयनों. प्रक्रिया anesthetics के अभाव में electrophysiological और एओबी सर्किट तत्वों से ऑप्टिकल रिकॉर्डिंग की सुविधा, दृश्य निरीक्षण करने के लिए प्रत्यक्ष एओबी सतह को उजागर करता है. एओबी में नीचे की ओर गतिविधि जबकि रिकॉर्डिंग VSNs जो घरों vomeronasal अंग (VNO), में एक पतली प्रवेशनी डालने पर, एक सीधे सामाजिक odors और फेरोमोन को परिधि बेनकाब कर सकते हैं. इस प्रक्रिया के व्यवहार में परिवर्तन करने के लिए फेरोमोन जोखिम जोड़ने तंत्र पर प्रकाश डाला सकता है, जो AOS सूचना संसाधन में नियंत्रित पूछताछ में सक्षम बनाता है.

Introduction

स्तनधारी मस्तिष्क में संवेदी प्रसंस्करण आमतौर पर संवेदी इनपुट से विशेष सुविधाओं निकालता है, जिनमें से प्रत्येक कई आपस में जुड़ा हुआ neuronal सर्किट तक फैला है. संवेदी रास्ते में, जल्दी सूचना संसाधन सामान्य धारणा और व्यवहार के लिए महत्वपूर्ण है. गौण घ्राण प्रणाली (AOS) में, गौण घ्राण बल्ब (AOB) हार्मोनल संतुलन 1,2, आक्रामकता 3, और कामोत्तेजना 4 हुक्म है कि नीचे की ओर संरचनाओं के लिए संवेदी परिधि जोड़ने प्रिंसिपल तंत्रिका सर्किट है. जैसे, इस सर्किट के भीतर सूचना संसाधन दृढ़ता से पशुओं के व्यवहार में परिवर्तन से जुड़ा हुआ है.

गौण घ्राण बल्ब घने नीचे मुख्य घ्राण बल्ब (भीड़) के पृष्ठीय / दुम / पीछे पहलू पर चूहों और चूहों में स्थित है, नासीय साइनस vascularized. एओबी vomeronasal अंग (VNO) में रहते हैं कि परिधीय vomeronasal संवेदी न्यूरॉन्स (VSNs) के axons से अभिवाही तंत्रिका वितरण प्राप्त करता है, एक smalबस कोमल तालू ऊपर पूर्वकाल थूथन में एल अंधा समाप्त ट्यूब. इन axons नासिका मार्ग की औसत दर्जे का सीमा पर सेप्टल ऊतक के नाजुक चादर पार. कई अध्ययनों से anesthetized चूहों 5-7 या आज़ादी की खोज जानवरों 8 का उपयोग vivo में (जैसे माउस मूत्र के रूप में) AOS odors के सूत्रों के एओबी तंत्रिका प्रतिक्रियाओं की जांच की है. वीर (एक) tracheotomies nonvolatile odors को लागू करने के लिए गहरी संज्ञाहरण सुनिश्चित करने और तरल उत्तेजनाओं 5-7 की आकांक्षा को रोकने, सहानुभूति ग्रीवा नाड़ीग्रन्थि 6 या vomeronasal अंग 5,7 के प्रत्यक्ष केन्युलेशन (ख) उत्तेजना को शामिल vivo अध्ययन में anesthetized और (ग) ललाट पालि ablations के साथ या बिना craniotomies एओबी 6 में इलेक्ट्रोड उन्नति अनुमति देने के लिए. जाग / पढ़ाई एक Microdrive के 8-10 शामिल शल्य आरोपण बर्ताव. संक्षेप में, इन प्रयोगात्मक मानदंड शक्तिशाली, लेकिन बेहद मुश्किल हो जाता है और अक्सर संज्ञाहरण की आवश्यकता होती है.

11-15 के साथ शरीर (पूर्व vivo) के बाहर जिंदा संवेदी संरचनाओं और नीचे की ओर तंत्रिका सर्किट बनाए रखने के लिए प्रयास किया. VNO और AOB के बीच कनेक्शन ipsilateral बने हुए हैं, और midline सेप्टल ऊतक एक एकल गोलार्द्ध में ऑक्सीजन superfusate उजागर करने के लिए किया जा सकता है, क्योंकि हम उनके कार्यात्मक कनेक्टिविटी को बनाए रखते हुए इन संरचनाओं को अलग करने के लिए इस तरह के एक एकल गोलार्द्ध पूर्व vivo दृष्टिकोण को विकसित करने की मांग की है. हमने हाल ही में इस लक्ष्य को 16 को प्राप्त करने में सफल रहा. (Midline नरम सेप्टल ऊतक साथ) axons और एओबी दोनों oxygenated कृत्रिम मस्तिष्कमेरु द्रव (superfused लिए पहुंच रहे हैं कि 600 माइक्रोन सुविधाओं <अपेक्षाकृत उथले हैं क्योंकि 6 घंटा - यह तैयारी VNO और एओबी जीवित है और कार्यात्मक रूप में कम से कम 4 के लिए लॉग इन दोनों रहता है ACSF). इस VNO-एओबी पूर्व vivo तैयारी एक पतली प्रवेशनी के माध्यम से VNO में नियंत्रित उत्तेजनाओं की शुरूआत की अनुमति देता है, औरलक्षित इलेक्ट्रोड नियुक्ति और / या जी प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के लिए छोटे AOB के लिए सीधे दृश्य का उपयोग. एक निश्चेतक के अभाव में इन सर्किट का अध्ययन करना चाहता है यह विधि फायदेमंद है. इस दृष्टिकोण केन्द्रापसारक कनेक्शन severs, क्योंकि यह अच्छी तरह से एओबी समारोह का केन्द्रापसारक मॉडुलन में पूछताछ करने के लिए अनुकूल नहीं है. VNO-एओबी पूर्व vivo तैयारी जानने के लिए मुश्किल है, लेकिन एक बार हासिल की इस शक्तिशाली संवेदी सर्किट में सर्किट संगठन, सूचना संसाधन, और तंत्रिका plasticity की जांच के लिए जिस पर एक विश्वसनीय मंच पैदा करता है.

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Protocol

सभी प्रयोगों UT दक्षिण संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित प्रोटोकॉल के अनुसार किए गए, और प्रायोगिक पशुओं द्वारा अनुभव तनाव, बेचैनी, और दर्द को कम करने के रूप में इसलिए चुना गया.

1. विच्छेदन चैंबर

एक कस्टम विच्छेदन कक्ष और छोटे, पतली प्लास्टिक तख़्त सबसे अच्छा परिणाम (चित्रा 1) के लिए आवश्यक हैं. इस प्रोटोकॉल का प्रयास करने के अग्रिम में इस तरह के एक कक्ष का निर्माण या प्राप्त करते हैं.

2. विच्छेदन समाधान

  1. कदम 3.22-5.4 में उपयोग के लिए मानक कृत्रिम मस्तिष्कमेरु द्रव (ACSF) का 1 एल तैयार करें. NaCl 125 मिमी, KCl 2.5 मिमी, 2 CaCl 2 मिमी, 2 MgCl 1 मिमी, 3 NaHCO 25 मिमी, नाह 2 पीओ 4 1.25 मिमी, Myo-inositol 3 मिमी, सोडियम पाइरूवेट 2 मिमी, सोडियम एस्कॉर्बेट 0.4 मिमी जोड़ें, और 25 ग्लूकोज मिमी pyrogen मुफ्त पानी का 1 एल.
  2. के लिए प्रारंभिक विच्छेदन aCSF (200 मिलीलीटर) तैयार करेंकदम 3.3-3.22 में उपयोग करें. स्टैंडर्ड aCSF की 200 मिलीलीटर ले लो और 2 MgCl hexahydrate की 0.366 ग्राम जोड़कर 9 मिमी से 2 MgCl एकाग्रता बढ़ा.
  3. NaCl 115 मिमी, KCl 5 मिमी, 2 CaCl, 2 मिमी, 2 MgCl, 2 मिमी, 3 NaHCO 25 मिमी, HEPES 10 मिमी युक्त कदम 4.11-5.4 में उपयोग के लिए प्रवेशनी के माध्यम से VNO उत्तेजनाओं ले जाने के लिए मानक घंटी समाधान तैयार करें, 10 मिमी ग्लूकोज.
  4. बुलबुला उपयोग करें जब तक 15 मिनट की एक न्यूनतम के लिए एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में 95% ओ 2, 5% सीओ 2 गैस के साथ मानक aCSF और घंटी के 0.5 एल के 0.8 एल.
  5. बुलबुला 95% 2 हे के साथ प्रारंभिक विच्छेदन aCSF की 200 मिलीलीटर, यह 4 डिग्री सेल्सियस 15-20 मिनट के लिए बर्फ पर 5% सीओ 2 गैस पहुंचता है जब तक

3. प्राथमिक विच्छेदन

  1. विच्छेदन क्षेत्र तैयार करें. तीन 35 मिमी पेट्री डिश, जगह ऑक्सीजन aCSF, सीधे कैंची, Adson संदंश, एक # 11 खोपड़ी विदारक कैंची विदारक घुमावदार कत्ल कैंची,,एल ब्लेड और संभाल और बर्फ पर एक रेजर ब्लेड.
  2. ऑक्सीजन aCSF 4 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा है, के बाद गहरा 2-5 मिलीलीटर Isothesia (99.9% isofluorane) का उपयोग कर एक सुखाना कक्ष में पशु anesthetize. पशु गहरा anesthetized है यह सुनिश्चित करने के लिए पूंछ और पैर चुटकी परीक्षण प्रदर्शन.
  3. गहरी संज्ञाहरण की पुष्टि होती है, पशु सिर काटना और तुरंत ठंडा विच्छेदन aCSF से भरा एक पेट्री डिश में सिर जगह है. नोट: जब उपयोग में प्रक्रिया के दौरान शांत रखने के लिए यह ठंडा विच्छेदन aCSF में ऊतक विसर्जित कर दिया.
  4. एक घुमावदार कैंची से कम पहलू (उदर ग्रसनी, निचले जबड़े, और जीभ) निकालें.
  5. Adson संदंश deglove (छील) सतही त्वचा और खोपड़ी से पेशी अनुलग्नकों का उपयोग करना. पील विजय - स्तम्भ को दुम से खोपड़ी लगाव का ही साइट तक सामने दाँत पर है. एक घुमावदार कैंची का उपयोग लगाव बिंदु पर ऊतक में कटौती. संदंश के साथ यह लोभी द्वारा आंखों निकालें और तैयारी से दूर खींच. एनकान degloving प्रक्रिया के अंत में, ऊपरी जबड़े की हड्डियों से मुक्त पेशी अनुलग्नकों को Adson संदंश का उपयोग करके नाजुक नाक उपास्थि पर अतिरिक्त बल से बचें. नोट: सीधे कैंची के साथ खोपड़ी की दुम पहलू से खोपड़ी को अलग करें.
  6. कैंची सुझावों (सिर्फ पूर्व नासीय साइनस के लिए) ललाट हड्डियों में कुछ मिमी तक सीधे कैंची के साथ, विजय - स्तम्भ को दुम से खोपड़ी के midline कटौती.
  7. Adson संदंश का उपयोग खोपड़ी के पार्श्विका और ललाट हड्डियों निकालें. नोट: ललाट हड्डी के टुकड़े अक्सर नासीय साइनस को दुम नाक हड्डियों से जुड़ी रहेगी. घ्राण बल्ब संपर्क करने के लिए नहीं लिया देखभाल के साथ इन टुकड़ों को निकालें.
  8. Sinuses के ललाट पालि 2 मिमी दुम के माध्यम से एक राज्याभिषेक कटौती करने और फिर कटौती करने के लिए मस्तिष्क दुम को दूर करने के लिए स्केलपेल का प्रयोग करें. पूरी तरह से पीछे ऊतक तोड़ स्केलपेल संपर्क उदर खोपड़ी की बोनी समोच्च की नोक सुनिश्चित करें. नोट: यह सक्षम बनाता हैपार्श्व घ्राण इलाकों या घ्राण बल्ब पर यांत्रिक दबाव डालने के बिना मस्तिष्क के बहुमत को हटाने.
  9. सीधे कैंची से उदर खोपड़ी के उजागर दुम पहलुओं निकालें. साइनस और शेष तंत्रिका ऊतक छोड़ दें.
  10. सीधे कैंची का उपयोग खोपड़ी के संरचनात्मक दाईं ओर गण्डचाप और चेहरे की मांसपेशियों को निकालें
  11. मुँह की छत को बेनकाब करने के लिए (उदर पक्ष) थूथन पर बारी.
  12. कट और कृन्तक को तालू तुरंत दुम हटा दें. मुँह की छत को तालू समानांतर तहत स्केलपेल ब्लेड की नोक डालने से यह करो और फिर कृन्तक ओर ब्लेड चाल है.
  13. Adson संदंश के साथ तालू से मुक्त (विजय - स्तम्भ) बढ़त समझ और दुमदारी खींच कर हटा दें.
  14. खोपड़ी की संरचनात्मक बाईं ओर, दाढ़ के पास छोटे रंध्र से शुरू दुमदारी तालु रंध्र विस्तार करने के लिए स्केलपेल ब्लेड का उपयोग करें. स्केलपेल bla की नोक डालने से इस लक्ष्य को हासिलदाढ़ के पास शून्य में डे और कलाई घूर्णन. नोट: ब्लेड की टिप का उपयोग केवल करने के लिए अत्यधिक सावधानी का प्रयोग करें - एक गहरा घाव सेप्टल ऊतकों को नुकसान पहुंचा सकता है.
  15. संरचनात्मक बाईं vomeronasal अंग को विजय - स्तम्भ शुरू, कृन्तक के माध्यम से तालु रंध्र से काट स्केलपेल ब्लेड की नोक, का उपयोग करना. कई स्कोरिंग कटौती का प्रयोग करें. भी गहरी ब्लेड डालने से सेप्टल ऊतक और vomeronasal तंत्रिकाओं को नुकसान नहीं है.
  16. इसलिए पृष्ठीय खोपड़ी का सामना करना पड़ रहा है ऊतक बारी और फिर तैयारी की दुम किनारे पर खड़ी सीधे धार (midline के समानांतर) पूरबी.
  17. ऊतक के उदर किनारे पर, तुरंत midline की बाईं ओर धार की धार को छूने. धीरे ब्लेड रॉक और बाईं तालु रंध्र (स्टेप 3.14 में पेश क्षेत्र में कटौती) के साथ कदम.
  18. ऊतक के पृष्ठीय किनारे पर, तुरंत midline की बाईं (कम से कम 1 मिमी) को उस्तरा की धार जगह है.
  19. रखनाब्लेड ऊतक के पूर्वकाल की ओर दबाव के साथ धीरे धीरे धार रॉक, midline के समानांतर. चालनी - पटल पर प्रतिरोध सूचना है. इस प्रतिरोध के माध्यम से तोड़ने के बाद तुरंत बंद करो. नोट: इस बिंदु पर, सही गोलार्द्ध बाएँ गोलार्द्ध से ढीला है. केवल शेष कनेक्शन चालनी - पटल तक पृष्ठीय थूथन पूर्वकाल साथ गोलार्द्धों के बीच है.
  20. दस्ताने उंगलियों के साथ दुम पक्षों के पास उन्हें लोभी और धीरे laterally और पूर्व से उन्हें घूर्णन द्वारा गोलार्द्धों अलग. नोट: यह कदम विशेष रूप से भटक या भंगुर snouts (जैसे, बड़े चूहों) के साथ चूहों में, प्रयोगात्मक परिवर्तनशीलता का एक स्रोत है. इसके अलावा, मजबूत प्रतिरोध संयोजी ऊतक को कमजोर करने के लिए पृष्ठीय थूथन (चालनी - पटल तक पूर्वकाल) स्कोर का सामना करना पड़ा है, तो एक दूसरे से दूर गोलार्द्धों बारी बारी से करने का प्रयास करते. ऐसा करते समय, सेप्टल तिवारी को नुकसान पहुंचा सकता है, जो गहरा स्केलपेल डालने के लिए नहीं अत्यधिक सावधानी रखनाssue और vomeronasal नसों.
  21. तख़्त के लिए ऊतक गोंद की एक छोटी राशि (50-100 μl) लागू करें और धीरे Adson संदंश का उपयोग गोंद पर सही गोलार्द्ध के पार्श्व किनारे जगह है. तख़्त को समय से पहले गोंद polymerization और ढीली आसंजन को रोकने के लिए एक कागज तौलिया का उपयोग कर तैयारी के पार्श्व की ओर से अतिरिक्त नमी को दूर. नोट: ऊतक गोंद पर रखा गया है के बाद गोंद polymerization में तेजी लाने के नमूने पर ठंडा विच्छेदन aCSF की कुछ बूँदें लागू करें. इस ऊतक तख़्त को कसकर आयोजित बनी हुई है कि यह सुनिश्चित करता है.
  22. माध्यमिक विच्छेदन कक्ष के मध्य में वैक्यूम तेल की एक छोटी राशि (3-5 मिमी व्यास, गहरी 2 मिमी) प्लेस और मजबूती से तेल के खिलाफ ऊतक विपरीत तख़्त की ओर रखें. तुरंत ठीक विच्छेदन क्षेत्र के लिए स्थानांतरण और ऑक्सीजन मानक aCSF के साथ छिड़काव शुरू, ठंडा विच्छेदन aCSF साथ विच्छेदन कक्ष को भरने. घ्राण बल्ब में सीधे है कि इतनी तख़्त पूरबीहौसले से ऑक्सीजन मानक aCSF की धारा.

4. माध्यमिक विच्छेदन

  1. ठीक संदंश का उपयोग कर तैयारी से किसी भी दृश्य contralateral (बाएं) घ्राण बल्ब या cortical ऊतक निकालें. (एक अर्द्ध कुंद बिंदु बनाने) ठीक संदंश साथ चुटकी, और उसके बाद मध्यम रेखा के पास पृष्ठीय और ऊतकों की दुम भाग पर यह जगह. धीरे दूर पूर्वकाल गति में धीरे धीरे सही गोलार्द्ध से ऊतक छीलने, midline साथ pinched संदंश चलाते हैं. Contralateral घ्राण बल्ब ऊतक सहित contralateral ऊतक के सभी निकालें. एओबी या vomeronasal तंत्रिका को नुकसान हो सकता है, जो ऊतक, के माध्यम से वार करने के लिए नहीं अत्यधिक ध्यान रखना.
  2. घ्राण बल्ब की पृष्ठीय / औसत दर्जे का सतह के साथ सफेद ड्यूरा मेटर को ध्यान से देखें. ठीक संदंश के दो जोड़े के साथ ड्यूरा के whitest हिस्से पर लोभी द्वारा घ्राण बल्ब की पृष्ठीय / दुम बढ़त के साथ इस ड्यूरा मेटर आंसू और दूर उस जगह से उन्हें खींच. ड्यूरा कसकर हैघ्राण बल्ब के चारों ओर लिपटा, और इसे हटा दिया जा रहा है, जबकि आसानी से खुद के ऊतकों के माध्यम से टुकड़ा कर सकते हैं. घ्राण बल्ब और AOB के ही औसत दर्जे की सतह को नुकसान से बचने. नोट: ड्यूरा इस बिंदु पर आसानी से फाड़ को तैयार नहीं हैं, तो जुदाई की सुविधा के लिए ठीक वसंत टिप विच्छेदन कैंची के साथ एक छोटे से कट परिचय.
  3. धीरे से और ध्यान अंतर्निहित घ्राण बल्ब को नुकसान पहुँचाए बिना ठीक संदंश के साथ ललाट प्रांतस्था दूर छील. एओबी को तुरंत दुम एक अर्द्ध पारदर्शी तंत्र के रूप में प्रदर्शित होने के रक्त वाहिकाओं के एक संग्रह को ध्यान से देखें. Electrophysiological प्रयोगों में इलेक्ट्रोड प्रवेश की सुविधा के लिए ठीक संदंश के साथ इस शुद्ध निकालें. यह ललाट प्रांतस्था त्याग के दौरान एओबी से अलग रूप में संदंश के साथ नेट समझ और एओबी छू नहीं सावधान किया जा रहा है, दुमदारी और मध्यवर्ती खींच कर उसे हटा दें. ललाट प्रांतस्था घ्राण बल्ब से अलग हो जाने के बाद, एओबी को उदर और पीछे संदंश के साथ कटौती करके इसे हटा दें. नोट: पूर्व ले लोयह भी मोटे तौर पर किया जाता है, तो नेट को हटाने के साथ देखभाल treme, के लिए glomerular परत क्षतिग्रस्त हो सकता है.
  4. उजागर contralateral नाक गुहा में, ठीक संदंश का उपयोग कर किसी भी शेष contralateral सेप्टल ऊतक (रक्त वाहिकाओं युक्त तार पीले चादर) को हटा दें. (सेप्टल हड्डी के पास) दुम / पृष्ठीय क्षेत्र में ऊतक समझ और तो पूर्वकाल पक्ष की ओर ऊतक लिफ्ट / खींच. नोट: contralateral सेप्टल ऊतक अनजाने hemisection कदम (स्टेप 3.20) के दौरान हटाया जा सकता है. ऐसे मामले में, एक सफेद, avascular सेप्टल उपास्थि और थोड़ा पारदर्शी, vascularized सेप्टल हड्डी निरीक्षण करते हैं. यह मामला है, तो चरण 4.4 छोड़ी जा सकती हैं.
  5. ध्यान सेप्टल उपास्थि और VNO "पंख" (दोनों VNOs के पृष्ठीय बढ़त के साथ चलता है कि बोनी ऊतक के एक पतले टुकड़े के बीच ठीक संदंश का एक बिंदु चलाकर contralateral VNO हटा दें.
    1. उपास्थि से विंग टुकड़ी के बाद पेट के बल संदंश की नोक स्थानांतरितmidline पास contralateral VNO में. संदंश के साथ लोभी और दूर उठाने के द्वारा हटाया जा करने के लिए सक्षम है, यह ढीला करने के लिए प्रतिपक्षी VNO की विजय - स्तम्भ / दुम अक्ष के साथ कई स्थानों पर इस चरण को दोहराएँ.
  6. ठीक संदंश के साथ दुम / वेंट्रल किनारे पर एक कटौती (यह सेप्टल हड्डी के उदर बढ़त के साथ एक सफेद avascular पट्टी चल संकरी जहाँ) बनाकर सेप्टल उपास्थि दूर करने के लिए तैयार करते हैं.
  7. एक अर्द्ध कुंद बिंदु बनाने के लिए एक साथ ठीक संदंश pinching द्वारा सेप्टल उपास्थि निकालें. चरण 4.6 में की गई कटौती को पहचानें, कि कटौती करने के लिए (पार्श्व) के पीछे pinched संदंश डालें, और फिर धीरे धीरे दूर सेप्टल ऊतक से और rostrally आगे बढ़ने उपास्थि उठा. नोट: अंतर्निहित सेप्टल ऊतक को बाधित न करें. उपास्थि को उठा लिया जाता है, कारण उपास्थि को ढीला adhesions को सेप्टल ऊतक खिंचाव की अंतर्निहित चादर निरीक्षण करते हैं. ढीला एक की इस साइट के साथ pinched ठीक संदंश की एक, आवधिक कोमल, और स्थिर आंदोलनdhesion बहुत दो संरचनाओं के सफल जुदाई सुविधा कर सकते हैं.
  8. सेप्टल हड्डी को दूर करने के लिए एक तुला टिप के साथ # 3 संदंश की एक जोड़ी का उपयोग करें. एक कोण पर सेप्टल हड्डी दृष्टिकोण लगभग सेप्टल हड्डी के विमान के समानांतर. सेप्टल ऊतक और सेप्टल हड्डी के बीच घुमावदार शाखा डालें. संदंश के साथ हड्डी समझ और धीरे चालनी - पटल के पास यह दरारें तक आगे और पीछे की हड्डी चाल है. नोट: कुछ मामलों में, सेप्टल हड्डी चालनी - पटल के पास तोड़ने का विरोध करेंगे. इस मामले में, धीरे बस कदम 4.8 दोहराना तो, चालनी - पटल के लिए पूर्वकाल पृष्ठीय / वेंट्रल अक्ष सेप्टल हड्डी स्कोर करने के लिए ठीक संदंश का उपयोग करें.
  9. प्रवेश द्वार पर ठीक संदंश की एक जोड़ी के साथ बन्द रखो और ठीक संदंश की एक और जोड़ी के साथ rostrally खींच द्वारा बस VNO को व्याख्यान चबूतरे वाला सफेद उपास्थि निकालें.
  10. एक तेजी से छिड़काव उपकरण के लिए Polyimide प्रवेशनी देते हैं और Polyimide प्रवेशनी के माध्यम से घंटी समाधान (0.1-0.3 मिलीग्राम / मिनट) के प्रवाह शुरू करते हैं.नोट: एक में लाइन, छोटी मात्रा फ्लो मीटर के साथ उपाय प्रवाह की दर. कंप्यूटर नियंत्रित वायवीय प्रोत्साहन स्विचिंग उपकरण के इस्तेमाल की उत्तेजना के दौरान प्रवाह दर में परिवर्तन कम कर देता है. प्रतिक्रियाओं प्रोत्साहन विशिष्ट हैं सुनिश्चित करने के लिए एक नकली उत्तेजना (घंटी समाधान नियंत्रित) करने के लिए प्रतिक्रियाओं के साथ उत्तेजनाओं परीक्षण करने के लिए तंत्रिका प्रतिक्रियाओं से तुलना कर लें.
  11. VNO द्वार पर प्रवेशनी समानांतर पूरबी. प्रवेशनी संतोषजनक ढंग से VNO प्रवेश द्वार के समानांतर है जब आउटलेट दबाव VNO का कारण बनता है, के रूप में रक्त वाहिनियों की निकासी के लिए अग्रणी "फुलाना," देखते हैं. इसे तुरंत VNO उद्घाटन के समानांतर रहता है, ताकि प्रवेशनी निरंतर का कोण रखने, VNO में प्रवेशनी डालें. नोट: यह प्लास्टिक तख़्त के खिलाफ ठीक संदंश की एक जोड़ी के साथ प्रवेशनी पकड़ और थोड़ा ऊपर की ओर कोण को प्रवेशनी के अंत ठीक संदंश की एक और जोड़ी का उपयोग करने के लिए सहायक हो सकता है. एक अनजाने VNO पीछे प्रवेशनी देता है, तो बहिर्वाह भी VNO रक्त वाहिका पैदा कर सकता हैखाली करने के लिए, एक उचित केन्युलेशन प्रदर्शन किया था धारणा के लिए अग्रणी. उचित स्थान घंटी समाधान में एक डाई को शामिल करके इसकी पुष्टि की जा सकती है. प्रवेशनी ठीक से रखा जाता है, डाई तभी करना चाहिए VNO प्रवेश द्वार के माध्यम से बाहर निकलें. इसके अतिरिक्त, एक प्रवेशनी VNO की अर्द्ध पारदर्शी औसत दर्जे का पहलू के माध्यम से आसानी से दिख रहा है कि यह सुनिश्चित करके उचित स्थान की पुष्टि कर सकते हैं.
  12. एओबी VNO से प्रवेशनी बेदखल करने के लिए नहीं सावधान किया जा रहा है, मानक aCSF के प्रत्यक्ष प्रवाह में है जब तक धीरे धीरे प्लास्टिक तख़्त ले जाएँ. विच्छेदन पूरा हो गया है और शारीरिक समारोह के आकलन के तुरंत शुरू कर सकते हैं. चरण 5 संक्षेप में इस तरह के एक आकलन करने के लिए एक दृष्टिकोण का वर्णन करता है.

5. मूल्यांकन

  1. एक बाह्य एम्पलीफायर और आस्टसीलस्कप से जुड़ी एक 2-4 MΩ borosilicate ग्लास microelectrode साथ एओबी की सतह घुसना.
  2. धीरे से 100-200 मीटर की गहराई तक microelectrode अग्रिम50 माइक्रोन / मिनट की दर से सतह. नोट: इस ऊतक गहराई में, एक microelectrode वोल्टेज में तेज, संक्षिप्त (~ 1-2 मिसे) deflections द्वारा उदाहरण सामयिक सहज कार्रवाई संभावित waveforms का सामना करेंगे.
  3. एक संभावित कार्रवाई तरंग का सामना होने पर, microelectrode आगे बढ़ बंद करो.
  4. ध्यान से देखें और / या VSN गतिविधि का एक ज्ञात उत्प्रेरक (जैसे, 50 मिमी KCl युक्त घंटी समाधान) के लिए कंट्रोल घंटी से प्रेरणा वितरण समाधान बदलते समय कार्रवाई संभावित दर रिकॉर्ड. विच्छेदन सफल रहा था, तो कार्रवाई संभावित दर या स्थानीय क्षेत्र की क्षमता में एक प्रेरणा पर निर्भर परिवर्तन देखा जा सकता है. नोट: सभी एओबी न्यूरॉन्स (50 मिमी KCl युक्त घंटी समाधान सहित) फायरिंग दर में वृद्धि के साथ हर प्रोत्साहन का जवाब देंगे. फायरिंग दर में एक प्रेरणा पर निर्भर कमी भी कार्यात्मक कनेक्टिविटी और एक सफल विच्छेदन इंगित करता है. दो या दो से अधिक न्यूरॉन्स सामना कर रहे हैं कि घटना में है किVNO उत्तेजना को अनुत्तरदायी हैं, या कोई कार्रवाई क्षमता एकाधिक इलेक्ट्रोड पेनेट्रेशन के बाद मनाया जाता है, तो यह एक असफल विच्छेदन पता चलता है. यदि यह मामला है, एक नया विच्छेदन चरण 3 में शुरू किया जा सकता है.

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Representative Results

इस तैयारी के साथ सफलता प्राप्त व्यापक अभ्यास लेता है, और यह असफल हो सकता है, जिस पर कई कदम है. एक सफलता प्राप्त करने से पहले कई कोशिशें की आवश्यकता की उम्मीद करनी चाहिए. कस्टम विच्छेदन कक्ष इस प्रोटोकॉल के सफल समापन के लिए आवश्यक है, और पूर्व विच्छेदन के बाद के चरणों की शुरुआत के लिए प्राप्त की जानी चाहिए. चित्र 1 में प्रस्तुत कक्ष डिजाइन इस उद्देश्य के लिए पर्याप्त है, और कम से कम मशीनिंग की मांग के साथ अपेक्षाकृत सस्ती प्लास्टिक का बनाया जा सकता है. ऐसा ही एक एक कक्ष का उत्पादन करने की क्षमता का अभाव है, स्थानीय या ऑनलाइन मशीनिंग कंपनियों से सलाह ली जा सकती है और एक शुल्क के लिए कक्ष का निर्माण कर सकते हैं.

तैयारी भर में परिवर्तनशीलता का एक बड़ा स्रोत प्रायोगिक पशुओं की खोपड़ी और थूथन की हड्डियों के घनत्व और भंगुरता है. Hemisection कदम (कदम 3.14-3.20) के दौरान, लक्ष्य ipsilateral सेप्टल ऊतक के साथ दोनों vomeronasal अंगों को अलग करने के लिए है औरipsilateral गौण घ्राण बल्ब. हालांकि, यह contralateral गोलार्द्ध से जुड़ी रहने के लिए सेप्टल ऊतक के लिए, थूथन के पृष्ठीय हड्डियों के लिए विशेष रूप से निकट लगाव अंक. 2 एक प्रभावी और अप्रभावी hemisection का एक उदाहरण से पता चलता है असामान्य नहीं है.

अन्य आम विच्छेदन त्रुटियों vomeronasal तंत्रिका के axons vomeronasal अंग निकट सेप्टल ऊतक (आंकड़े 3 ए और 3 बी) या AOB के पास (आंकड़े -3 सी और 3 डी) में क्षतिग्रस्त किया जा सकता है, जिसके दौरान ठीक विच्छेदन के दौरान उत्पन्न होती हैं. ये और इसी तरह की घटनाओं व्यर्थ की तैयारी प्रतिपादन, VSNs और AOB के बीच अधूरा कनेक्टिविटी में परिणाम होगा.

तैयारी की सफलता के लिए अंतिम बाधा VNO केन्युलेशन कदम (4.11 चरण) है. VNO प्रवेशनी के उचित स्थान के तत्काल निष्कासन के कारण VNO लुमेन के दबाव में परिणाम होगा vomeronasal पंप से अवशिष्ट रक्त. प्रवेशनी अपेक्षाकृत पारदर्शी vomeronasal उपकला नीचे स्पष्ट रूप से दिखाई जानी चाहिए और प्रवेशनी की उपस्थिति VNO अंदर इसकी लंबाई के साथ एक समान होना चाहिए. प्रक्रिया के सफल समापन पर, एक VSN odorants के ज्ञात स्रोत (चित्रा 4) के साथ VNO उत्तेजना के जवाब में इस तरह के तंत्रिका गतिविधि की एक इकाई electrophysiological रिकॉर्डिंग के रूप में एक मनोवैज्ञानिक परख का उपयोग कार्यात्मक कनेक्टिविटी की पुष्टि कर सकते हैं.

चित्रा 1
चित्रा 1. ए) इंजीनियरिंग कदम 3.22-5.4 में इस्तेमाल कस्टम विच्छेदन कक्ष का चित्र. नोट:. छोटे छिद्रों इस प्रोटोकॉल में प्रयोग किया जाता विच्छेदन कक्ष के वांछित बी) उदाहरण तस्वीर के रूप में समाधान और बक inlets और दुकानों को समायोजित करने के लिए drilled किया जा सकता है. m/files/ftp_upload/51813/51813fig1highres.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 2
चित्रा 2. ए, बी) सफल (ए की छवियों प्रतिनिधि) और hemisection मंच (3.20 चरण) के बाद असफल (बी) की तैयारी. VNO, सेप्टल ऊतकों, और घ्राण बल्ब (OBS) सभी ipsilateral गोलार्द्ध (इस मामले में, सही (नीचे) गोलार्द्ध से बनाए रखा जाना चाहिए. नाक turbinates ipsilateral गोलार्द्ध पर दिखाई दे रहे हैं, विच्छेदन में नाकाम रही है. निशान हैं टिक अलग 1 मिमी. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

d/51813/51813fig3highres.jpg "चौड़ाई =" 600 "/>
चित्रा 3. ए, बी) VNO और AOB के बीच बरकरार है और क्षतिग्रस्त सेप्टल ऊतक के प्रतिनिधि छवियाँ. बी में, विदारक संदंश वी.एन. अक्षतंतु इलाकों. सी, डी) बरकरार है और क्षतिग्रस्त AOBs को नुकसान पहुँचाए, ऊतक के साथ अनजाने में संपर्क किया. डी में, ipsilateral ओबी आसपास के ड्यूरा को हटाने की औसत दर्जे का एओबी निकट ऊतक का एक दृश्य बूँद, जिससे एओबी निकट vomeronasal तंत्रिका विच्छेद में हुई. स्केल सलाखों लंबाई में 1 मिमी हैं.

चित्रा 4
एक सफल तैयारी में एक एओबी न्यूरॉन (बाह्य एकल इकाई रिकॉर्डिंग) से दर्ज की गई कार्रवाई क्षमता की चित्रा 4. एक) उदाहरण रेखापुंज साजिश है. काला शो में निशान नियंत्रण घंटी समाधान 5 सेकंड (ग्रे बी के लिए VNO के लिए दिया गया था जब दर फायरिंग में कोई परिवर्तन नहींबैल). लाल शो में निशान BALB / ग महिला माउस मूत्र के साथ VNO उत्तेजना के लिए एक ही न्यूरॉन की प्रतिक्रिया घंटी खारा. बी ए में एक ही प्रतिक्रियाओं का) पेरी उत्तेजना समय हिस्टोग्राम में 100 गुना पतला. त्रुटि सलाखों के मतलब की मानक त्रुटियों का प्रतिनिधित्व करते हैं.

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Discussion

इस प्रोटोकॉल में वर्णित VNO-एओबी पूर्व vivo तैयारी विवो 5-7 और तीव्र लाइव टुकड़ा एओबी समारोह के 17 प्रयोगों में anesthetized लिए एक उपयोगी विकल्प है. भी electrophysiological और ऑप्टिकल रिकॉर्डिंग के लिए सर्किट तत्वों को बेनकाब जो तीव्र एओबी टुकड़ा प्रयोगों के विपरीत, इस तैयारी सभी संवेदी afferents और भीतर एओबी कनेक्शन बरकरार रखती है. यह भी विवो दृष्टिकोण में anesthetized के बारे में कहा जा सकता है, निश्चेतक की उपस्थिति जरूरी इस और अन्य घ्राण सर्किट 18 में सूचना संसाधन के लिए महत्वपूर्ण है जो तंत्रिका समारोह, अर्थात् उत्तेजक / निरोधात्मक संतुलन, बदल. तैयारी anesthetics के प्रयोग से बचा जाता है, क्योंकि और एओबी सतह पूरी तरह से superfusate के संपर्क में है, क्योंकि यह स्थानीय तंत्रिका प्रसंस्करण में औषधीय पूछताछ करने के लिए उत्तरदायी है.

इस तैयारी की कुछ सीमाएं हैं, ज़ाहिर है, कर रहे हैं. EV हैगहरी एओबी परतें, कई निरोधात्मक ग्रेन्युल कोशिकाओं 16 घरों जो आंतरिक सेलुलर परत, अर्थात् गहरे भागों का क्रमिक अध: पतन के लिए idence. इसके अतिरिक्त, केन्द्रापसारक आदानों एओबी समारोह में सक्रिय भागीदारी से उन्हें नष्ट करने, विच्छेदन के दौरान कटे हैं. VNO की केन्युलेशन vomeronasal पंप के सामान्य कार्रवाई बाइपास, और VNO लुमेन में उपस्थित अंतर्जात तरल पदार्थ दूर flushes.

इस विधि के साथ सफलता प्राप्त करने के लिए गंभीर कदम नाजुक hemisection (3.20 चरण) और VNO केन्युलेशन (स्टेप 4.11) हैं. एक मज़बूती से कार्यात्मक रूप से जुड़े पूर्व vivo तैयारी का उत्पादन करने के लिए व्यापक अभ्यास की आवश्यकता की उम्मीद कर सकते हैं. यहाँ उपयोग माध्यमिक विच्छेदन कक्ष (जैसे मूत्र पतला के रूप में) माउस pheromones के स्रोतों के साथ VNO की उत्तेजना के दौरान एकल इलेक्ट्रोड रिकॉर्डिंग का उपयोग कार्यात्मक कनेक्टिविटी का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. माध्यमिक विच्छेदन कक्ष के 13,15 संशोधन कर सकते हैं खई तैयारी ऐसी multiphoton इमेजिंग के रूप में अन्य प्रयोजनों के लिए उपयुक्त कोण पर घुमाया कि अनुमति बनाया है.

रह AOB का अध्ययन करने के लिए कई तकनीकी बाधाओं लंबे सामाजिक गंध और फेरोमोन संवेदी प्रसंस्करण के बारे में हमारी समझ के लिए एक बाधा के समक्ष रखी है. इस विच्छेदन प्रोटोकॉल में यह संवेदी मार्ग का जल्द से जल्द तंत्रिका घटकों दूर विदारक करके, एक इन मुश्किल से अध्ययन सर्किट को प्रयोगात्मक पहुँच प्राप्त करने में सक्षम है. हम vomeronasal संवेदी प्रसंस्करण 19 और संवेदी मानचित्रण (Hammen एट अल., अप्रकाशित) में विस्तृत जांच के लिए इस तैयारी का उपयोग किया है. इस तकनीक एओबी में संवेदी प्रसंस्करण में भविष्य के अध्ययन, ऊतक (जैसे, multiphoton इमेजिंग और optogenetics) के लिए ऑप्टिकल का उपयोग की आवश्यकता होती है, खासकर उन लोगों के लिए उपयोगी हो जाएगा. इस दृष्टिकोण के लाभ में विवो दृष्टिकोण के उन पूरक, और के तंत्रिका तंत्र की जांच के लिए हमारे टूलकिट में सुधार vomeronasal की मध्यस्थता तोसामाजिक और प्रजनन व्यवहार.

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए ब्याज की कोई महत्वपूर्ण संघर्ष किया है.

Acknowledgements

, F30 DC011673 (GFH: NINDS, एनआईएच) और केन्द्र शासित प्रदेशों के पश्चिमी स्टार्टअप फंड (JPM): इस शोध R00 DC011780 (NINDS, एनआईएच JPM) द्वारा समर्थित किया गया.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Straight Scissors Fine Science Tools 14002-14
Fine Scissors-Straight Fine Science Tools 14060-10
Fine Scissors-Curved Fine Science Tools 14061-10
Adson Forceps Fine Science Tools 11006-12
#3 Scalpel Handle Fine Science Tools 10003-12
#11 Scalpel Blades Fisher Scientific 3120030
Straight Carbon Steel Razor Blades Fisher Scientific 12-640
35 mm Petri Dish Fisher Scientific 08-772-21
Dissection Chamber Custom  N/A See Figure 1
Delrin plastic plank 0.6 cm x 1.5 cm x 0.1 cm Custom  N/A
Dow Corning Silicon Vacuum grease Fisher Scientific 146355D
#5 Forceps, Student Fine Science Tools 91150-20
#5 Forceps, Biologie Tip Fine Science Tools 11295-10
#5 Forceps, Student Fine Science Tools 91150-20
Vannas Spring Scissors Fine Science Tools 15000-08
1/16" Male Luer Cole-Parmer EW-45505-00
1/16" Tubing Fisher Scientific 14-171-129
Two ton epoxy Grainger 5E157
ValveBank Pressurized Perfusion Kit AutoMate Scientific 09-16
ValveLink digital/manual controller AutoMate Scientific 01-18
NaCl Sigma-Aldrich various
KCl Sigma-Aldrich various
CaCl2 dihydrate Sigma-Aldrich various
MgCl2 hexahydrate Sigma-Aldrich various
NaHCO3 Sigma-Aldrich various
NaH2PO4 Sigma-Aldrich various
myo-inositol Sigma-Aldrich various
Na-pyruvate Sigma-Aldrich various
Na-ascorbate Sigma-Aldrich various
HEPES buffer Sigma-Aldrich various
Glucose Sigma-Aldrich various

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References

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