Ex Vivo preparati della lampadina vomeronasale Organo e accessori olfattivo intatto

1Department of Neuroscience, UT Southwestern Medical Center, 2Department of Anatomy and Neurobiology, Washington University in St. Louis
Published 8/04/2014
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Neuroscience

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Summary

L'accessorio bulbo olfattivo mouse (AOB) è stato difficile studiare nel contesto della codifica sensoriale. Qui, dimostriamo una dissezione che produce un vivo preparazione franco in cui i neuroni AOB rimangono funzionalmente collegati agli ingressi periferici, facilitando la ricerca di elaborazione delle informazioni dei feromoni mouse e cairomoni.

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Doyle, W. I., Hammen, G. F., Meeks, J. P. Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb. J. Vis. Exp. (90), e51813, doi:10.3791/51813 (2014).

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Abstract

Il sistema olfattivo accessorio mouse (AOS) è un percorso sensoriale specializzato per rilevare gli odori volatili sociali, feromoni, e cairomoni. Il primo circuito neurale nel pathway AOS, chiamato il bulbo olfattivo accessorio (AOB), svolge un ruolo importante nello stabilire comportamenti sesso tipico come l'aggressività territoriale e accoppiamento. Questo piccolo circuito (<1 mm 3) possiede la capacità di distinguere gli stati comportamentali unici, come il sesso, tensione, e lo stress da spunti chemiosensoriali nelle secrezioni ed escrezioni di conspecifici. Mentre l'organizzazione compatta di questo sistema offre opportunità uniche per la registrazione da grandi porzioni del circuito contemporaneamente, ricerca di elaborazione sensoriale nel AOB rimane impegnativo, in gran parte dovuto alla sua posizione svantaggiosa sperimentalmente nel cervello. Qui, dimostriamo una dissezione più stadi che rimuove il AOB intatto all'interno di un singolo emisfero del mouse cranio anteriore, lasciando collegareioni ad entrambi i vomeronasali periferica neuroni sensoriali (VSNs) e circuiti neuronali locali intatti. La procedura espone la superficie AOB dirigere ispezione visiva, facilitando elettrofisiologica e registrazioni ottiche da elementi circuitali AOB in assenza di anestetici. Dopo l'inserimento di una cannula sottile nell'organo vomeronasale (VNO), che ospita le VSNs, si può esporre direttamente la periferia agli odori sociali e feromoni durante la registrazione di attività a valle nella AOB. Questa procedura consente indagini controllate in AOS elaborazione delle informazioni, che possono far luce sui meccanismi che legano l'esposizione feromone a cambiamenti nel comportamento.

Introduction

Elaborazione sensoriale nel cervello dei mammiferi si estende in genere più circuiti neuronali reciprocamente collegate, ciascuna delle quali estrae particolari caratteristiche da input sensoriali. In percorsi sensoriali, elaborazione delle informazioni precoce è di vitale importanza per la percezione e il comportamento normale. Nel sistema olfattivo accessorio (AOS), il bulbo olfattivo accessorio (AOB) è il principale circuito neurale che collega la periferia sensoriale alle strutture a valle che determinano l'equilibrio ormonale 1,2, aggressività 3, e l'eccitazione 4. Come tale, l'elaborazione delle informazioni all'interno di questo circuito è fortemente legata ai cambiamenti nel comportamento animale.

Il bulbo olfattivo accessorio è situato in topi e ratti nella parte dorsale / caudale / posteriore del bulbo olfattivo principale (MOB) sotto la fitta, vascolarizzato seno rhinal. L'AOB riceve afferente innervazione da assoni dei neuroni sensoriali vomeronasali periferico (VSNs) che risiedono nell'organo vomeronasale (VNO), un small tubo cieco-ended nel muso anteriore, appena sopra il palato molle. Questi assoni attraversano il delicato strato di tessuto settale al confine mediale dei passaggi nasali. Diversi studi hanno sondato AOB risposte neurali alle fonti di odori AOS (come l'urina del mouse) in vivo utilizzando topi anestetizzati 5-7 o animali liberamente esplorare 8. L'eroico anestetizzati studi in vivo coinvolti (a) tracheotomia per garantire l'anestesia profonda e prevenire l'aspirazione di stimoli liquido 5-7, (b) stimolazione del ganglio cervicale simpatico 6 o incannulamento diretta dell'organo vomeronasale 5,7 per introdurre gli odori volatili e (c) craniotomie con o senza ablazione del lobo frontale per consentire elettrodo avanzamento nella AOB 6. Awake / comportarsi studi 8-10 coinvolti impianto chirurgico di un microdrive. In sintesi, questi paradigmi sperimentali sono potenti, ma estremamente difficile e spesso richiedono l'anestesia.

(ex vivo) con un certo successo 11-15. Poiché i collegamenti tra il VNO e AOB rimangono omolaterale, e perché il tessuto linea mediana del setto può essere esposto a superfusate ossigenato in un singolo emisfero, abbiamo cercato di sviluppare un ex vivo approccio unico emisfero isolare queste strutture pur mantenendo la loro connettività funzionale. Recentemente siamo riusciti a raggiungere questo obiettivo 16. Questa preparazione mantiene sia il VNO e AOB vivo e funzionalmente collegato per almeno 4-6 ore perché entrambi gli assoni (lungo la linea mediana del setto tessuti molli) e AOB sono relativamente poco profonde <600 micron caratteristiche che sono accessibili a superfuse ossigenato liquido cerebrospinale artificiale ( aCSF). Questo ex vivo preparazione VNO-AOB permette l'introduzione di stimoli controllati nel VNO tramite una cannula sottile, eaccesso visivo diretto al piccolo AOB per il posizionamento degli elettrodi e / o alla microscopia a fluorescenza diretta. Questo metodo è vantaggioso se la si vuole studiare questi circuiti in assenza di anestetici. Poiché questo approccio recide le connessioni centrifughe, non è adatto a inchieste modulazione centrifuga della funzione AOB. L'ex vivo di preparazione VNO-AOB è difficile da imparare, ma una volta raggiunto produce una piattaforma affidabile su cui indagare l'organizzazione del circuito, elaborazione delle informazioni, e la plasticità neurale in questo circuito sensoriale potente.

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Protocol

Tutti gli esperimenti sono stati condotti secondo protocolli approvati dal Sud Institutional Animal Care ed uso commissione UT, e sono stati scelti in modo da minimizzare lo stress, il disagio e il dolore provato dagli animali sperimentali.

1. Dissezione Camera

Una camera di dissezione costume e piccolo, sottile tavola di plastica sono necessari per ottenere i migliori risultati (Figura 1). Costruire o ottenere tale camera in anticipo di tentare questo protocollo.

2. Dissezione Solutions

  1. Preparare 1 L di liquido cerebrospinale artificiale standard (aCSF) per l'uso in Piazza di 3,22-5,4. Aggiungi NaCl 125 mM, KCl 2,5 mm, CaCl 2 2 mM, MgCl2 1 mM, NaHCO 3 a 25 mm, NaH 2 PO 4 da 1,25 mm, mio-inositolo 3 mM, piruvato di sodio 2 mM, ascorbato di sodio 0,4 mM e glucosio 25 mm a 1 L di acqua apirogena.
  2. Preparare la aCSF dissezione iniziale (200 ml) perutilizzare nei passaggi 3,3-3,22. Prendere 200 ml di aCSF standard ed aumentare la concentrazione MgCl 2 da 9 mM aggiungendo 0,366 g di MgCl 2 esaidrato.
  3. Preparare soluzione standard di Ringer per portare stimoli alla VNO attraverso la cannula per l'uso in fasi 4,11-5,4 contenente NaCl 115 mM, KCl 5 mM, CaCl 2, 2 mM, MgCl 2, 2 mM, NaHCO 3 25 mM, HEPES 10 mM, glucosio 10 mm.
  4. Bubble il 0,8 L di aCSF norma e 0,5 L di Ringer con 95% O 2, 5% CO 2 gas in un bagno d'acqua a 37 ° C per un minimo di 15 min fino al momento dell'uso.
  5. Bubble 200 ml di aCSF dissezione iniziale con 95% O 2, 5% CO 2 gas in ghiaccio per 15-20 minuti fino a raggiungere 4 ° C.

3. Dissezione primaria

  1. Preparare l'area dissezione. Mettere tre piatti 35 millimetri Petri, ossigenato aCSF, forbici decapitazione, curve dissezione forbici, diritto dissezione forbici, pinze Adson, un cuoio capelluto # 11el lama e manico e una lama di rasoio sul ghiaccio.
  2. Dopo ossigenato aCSF è stata raffreddata a 4 ° C, profondamente anestetizzare l'animale in una camera di essiccazione con 2-5 ml Isothesia (99,9% isofluorano). Eseguire i test pizzico di coda e piedi per garantire l'animale è profondamente anestetizzato.
  3. Una volta che l'anestesia profonda è confermata, decapitare l'animale e collocare immediatamente la testa in una capsula di Petri riempita con la dissezione aCSF refrigerata. NOTA: immergere il tessuto nella dissezione refrigerati aCSF per tenerlo fresco durante tutta la procedura quando non in uso.
  4. Rimuovere l'aspetto inferiore (ventrale faringe, mascella inferiore, e la lingua), con un paio di forbici curve.
  5. Utilizzando Adson forcipe deglove (buccia), la pelle superficiale e inserzioni muscolari del cranio. Sbucciare il cuoio capelluto da caudale al rostrale fino a quando l'unico sito di attacco è sopra i denti anteriori. Tagliare il tessuto al punto di attacco con un paio di forbici curve. Rimuovere gli occhi afferrandolo con una pinza e tirarlo fuori dalla preparazione. Norecchio termine della procedura degloving, evitare una forza eccessiva sulla cartilagine nasale delicato in base alle pinze Adson agli allegati muscolari liberi dalle ossa mascellari superiori. NOTA: Staccare il cuoio capelluto dalla parte caudale del cranio con le forbici diritte.
  6. Con le forbici dritte, tagliare lungo la linea mediana del cranio da caudale a rostrale fino a quando le punte delle forbici sono pochi mm nelle ossa frontali (appena prima il seno rhinal).
  7. Rimuovere il parietale e ossa frontali del cranio con pinze Adson. NOTA: Pezzi di osso frontale spesso rimangono attaccati alle ossa nasali caudali al seno rhinal. Rimuovere questi pezzi con cura adottate non a contattare i bulbi olfattivi.
  8. Utilizzare il bisturi per fare un taglio coronale attraverso il lobo frontale 2 millimetri caudale ai seni e poi togliere la caudale cervello al taglio. Assicurarsi che la punta dei contatti bisturi del contorno osseo del cranio ventrale di recidere completamente il tessuto posteriore. NOTA: Questo consenterimozione della maggior parte del cervello senza mettere sollecitazioni meccaniche sui tratti olfattivi laterali o bulbi olfattivi.
  9. Rimuovere gli aspetti caudali esposte del cranio ventrale con le forbici diritte. Lasciare i seni e le restanti tessuto nervoso.
  10. Rimuovere zigomatica e muscoli facciali sul lato anatomico destro del cranio con le forbici diritte
  11. Girare il muso sopra (lato ventrale) per esporre il tetto della bocca.
  12. Tagliare e rimuovere il palato immediatamente caudale agli incisivi. Fare inserendo la punta della lama bisturi sotto il palato parallelo al tetto della bocca e quindi spostare la lama verso gli incisivi.
  13. Afferrare l'(rostrale) bordo liberato del palato con una pinza Adson e rimuovere tirando caudale.
  14. Sul lato sinistro anatomica del cranio, utilizzare il bisturi per estendere il forame palatino caudalmente, partendo dalle piccole forame vicino molari. Conseguire questo inserendo la punta del bisturi blade nel vuoto in prossimità dei molari e rotazione del polso. NOTA: Utilizzare estrema cautela per usare solo la punta della lama - un taglio profondo può danneggiare il tessuto del setto.
  15. Utilizzando la punta della lama del bisturi, tagliare dal forame palatino attraverso gli incisivi, a partire rostrale alla anatomica sinistra, organo vomeronasale. Utilizzare più tagli di punteggio. Non danneggiare il tessuto del setto e nervi vomeronasali inserendo la lama troppo profondo.
  16. Ruotare il tessuto in modo che il cranio dorsale è rivolto verso l'alto e poi orientare la lama di rasoio verticale (parallelo alla linea mediana) all'estremità caudale della preparazione.
  17. Sul bordo ventrale del tessuto, toccare il tagliente della lama di rasoio immediatamente alla sinistra della linea mediana. Agitare delicatamente la lama e muoversi lungo il forame palatino sinistra (tagliate regione introdotto nel passaggio 3.14).
  18. Al bordo dorsale del tessuto, posizionare il tagliente del rasoio immediatamente alla sinistra della linea mediana (meno di 1 mm).
  19. Conservazionela lama parallelamente alla linea mediana, Rock il lama lentamente con pressione verso la parte anteriore del tessuto. Notare resistenza a lamina cribrosa. Interrompere immediatamente dopo la rottura attraverso questa resistenza. NOTA: A questo punto, l'emisfero destro è allentato dalla emisfero sinistro. Il collegamento Rimane solo tra gli emisferi lungo la dorsale muso anteriore alla piastra cribrosa.
  20. Separare gli emisferi da loro afferrando vicino ai lati caudale con le dita guantate e delicatamente ruotare lateralmente e anteriormente. NOTA: Questo passaggio è una fonte di variabilità sperimentale, soprattutto in topi con musi deviate o fragili (ad esempio, topi anziani). Inoltre, durante il tentativo di ruotare gli emisferi distanti, se forte resistenza si incontra segnare il muso dorsale (anteriore alla piastra cribrosa) per indebolire i tessuti connettivi. Nel farlo, fare estrema attenzione a non inserire il bisturi in profondità, che possono danneggiare il setto tissue e nervi vomeronasale.
  21. Applicare una piccola quantità (50-100 ml) di colla tessuto per la tavola e inserire delicatamente il bordo laterale dell'emisfero destro sulla colla utilizzando le pinze Adson. Rimuovere l'umidità in eccesso dal lato laterale della preparazione con un tovagliolo di carta per evitare premature polimerizzazione della colla e l'adesione allentato per la tavola. NOTA: Applicare alcune gocce di aCSF dissezione refrigerata sul campione di accelerare la polimerizzazione colla dopo tessuto viene posizionato sulla colla. Questo assicura che il tessuto rimane saldamente in attesa alla plancia.
  22. Mettere una piccola quantità (diametro 3-5 mm, 2 mm di profondità) di grasso per vuoto nel centro della camera di dissezione secondaria e posizionare il lato della doga di fronte al tessuto saldamente contro il grasso. Riempire subito la camera di dissezione con refrigerati dissezione aCSF, il trasferimento alla zona dissezione fine e cominciare perfusione con lo standard ossigenato aCSF. Orientare la tavola in modo che il bulbo olfattivo è direttamente nelflusso di appena ossigenato aCSF standard.

4. Dissezione secondario

  1. Rimuovere eventuali controlaterale (a sinistra) bulbo olfattivo visibile o tessuto corticale dalla preparazione utilizzando una pinza sottile. Pizzicare insieme le belle pinze (formando un semi smussato), e poi metterlo alla dorsale e caudale porzione del tessuto vicino alla linea mediana. Eseguire delicatamente la pinza pizzicato lungo la linea mediana, peeling il tessuto lontano dal emisfero destro lentamente in moto anteriore. Rimuovere tutto il tessuto controlaterale, compreso il tessuto bulbo olfattivo controlaterale. Fate molta attenzione a non colpire attraverso il tessuto, che può causare danni al AOB o vomeronasale nervo.
  2. Osservare la dura madre bianca lungo la superficie dorsale / mediale del bulbo olfattivo. Strappare questa dura madre lungo il bordo dorsale / caudale del bulbo olfattivo afferrandolo in corrispondenza della porzione più bianco della dura con due coppie di pinza sottile e tirare via da quel punto. La durata è strettamenteavvolto intorno bulbi olfattivi, e si può facilmente tagliare attraverso il tessuto mentre viene rimosso. Evitare danni alla superficie mediale del bulbo olfattivo e la AOB stessa. NOTA: Se la dura resiste strappare facilmente, a questo punto, introdurre un piccolo taglio con punta fine primavera forbici dissezione per facilitare la separazione.
  3. Lentamente e con attenzione staccarsi la corteccia frontale con una pinza sottile senza danneggiare i bulbi olfattivi sottostanti. Osservare una collezione di vasi sanguigni appaiono come una rete semi-trasparente immediatamente caudale al AOB. Rimuovi questa rete con una pinza sottile per facilitare la penetrazione elettrodo in esperimenti di elettrofisiologia. Afferrare la rete con una pinza come si separa dalla AOB durante la corteccia retrazione frontale e rimuoverlo tirando caudalmente e medialmente, facendo attenzione a non toccare la AOB. Una volta che la corteccia frontale è stato separato dai bulbi olfattivi, rimuoverla tagliando con una pinza ventrali e posteriori alla AOB. NOTA: Prendere extreme attenzione con la rimozione rete, perché se è fatto troppo grosso modo il livello glomerulare può danneggiarsi.
  4. Nella cavità nasale controlaterale esposto, rimuovere ogni residuo di tessuto del setto controlaterale (foglio di velina gialla contenente i vasi sanguigni) utilizzando le belle pinze. Afferrare il tessuto in corrispondenza della regione caudale / dorsale (vicino all'osso del setto) e poi tirare / sollevare il tessuto verso il lato anteriore. NOTA: Il tessuto del setto controlaterale può essere inavvertitamente rimosso durante la fase di emisezione (Step 3.20). In tal caso, osservare un bianco, avascolare cartilagine settale e la leggermente trasparente, vascolarizzato setto osseo. Se questo è il caso, Passaggio 4.4 può essere saltata.
  5. Rimuovere con attenzione il controlaterale VNO eseguendo un unico punto delle belle pinze tra la cartilagine del setto e la "ala" VNO (un sottile pezzo di tessuto osseo che corre lungo il bordo dorsale di entrambi vnos.
    1. Dopo il distacco dell'ala dalla cartilagine, spostare la punta della pinza ventrenel VNO controlaterale nei pressi della linea mediana. Ripetere questo passaggio in diverse località lungo l'asse rostrale / caudale del controlaterale VNO per allentarla, le consente di essere rimosso da afferrare con una pinza e di sollevamento di distanza.
  6. Preparare per rimuovere la cartilagine del setto effettuando un taglio sul bordo ventrale / caudale (dove si restringe a un bianco avascolare striscia che corre lungo il bordo ventrale dell'osso del setto) con una pinza sottile.
  7. Togliere la cartilagine del setto pizzicando insieme i pinza sottile per fare un semi punto smussato. Identificare il taglio fatto nella Fase 4.6, inserire le pinze pizzicato dietro (laterale) a quel taglio, e poi sollevare lentamente la cartilagine lontano dal tessuto settale e procedendo rostralmente. NOTA: Non distruggere il tessuto del setto sottostante. Poiché la cartilagine viene sollevato, osservare il foglio sottostante tratto di tessuto del setto causa di aderenze sciolti alla cartilagine. Un movimento periodico, dolce e stabile delle pinza sottile pizzicato lungo questo sito di perdere undhesion può facilitare notevolmente efficace separazione delle due strutture.
  8. Usare un paio di # 3 pinze con una punta piegata per rimuovere l'osso del setto. Avvicinarsi l'osso del setto con un angolo quasi parallela al piano dell'osso settale. Inserire il dente curvo tra il tessuto del setto e setto osseo. Afferrare l'osso con la pinza e delicatamente spostare l'osso e indietro fino a quando si incrina vicino alla lamina cribrosa. NOTA: In alcuni casi, l'osso settale resisterà rottura in prossimità della piastra cribrosa. In questo caso, utilizzare una pinza sottile a segnare delicatamente l'osso del setto lungo l'asse / ventrale dorsale appena anteriormente alla piastra cribrosa, quindi ripetere il punto 4.8.
  9. Togliere la cartilagine bianca appena rostrale alla VNO pizzicando con un paio di pinze sottili all'ingresso e tirando rostralmente con un altro paio di pinze sottili.
  10. Fissare la cannula poliimmide ad un dispositivo perfusione veloce e avviare il flusso di soluzione di Ringer (0,1-0,3 ml / min) attraverso la cannula poliimmide.NOTA: la portata di misura con una, flussometro in linea piccolo volume. L'uso del dispositivo di commutazione stimolo pneumatico controllato da computer riduce variazioni di portata durante la stimolazione. Confronta risposte neurali per testare stimoli con le risposte ad uno stimolo finto (controllare la soluzione di Ringer) per garantire risposte sono specifici stimoli.
  11. Orientare la cannula parallelo all'ingresso VNO. Quando la cannula è soddisfacente parallelo all'ingresso VNO, osservare come la pressione di uscita fa sì che il VNO a "gonfiare", che consenta l'evacuazione del vaso sanguigno. Inserire immediatamente la cannula nel VNO, mantenendo l'angolo della costante cannula in modo che rimanga parallelo all'apertura VNO. NOTA: Può essere utile per tenere la cannula con un paio di pinze fini contro la plancia plastica e utilizzare un altro paio di pinze sottili angolare l'estremità della cannula leggermente verso l'alto. Se si mette inavvertitamente la cannula dietro la VNO, il deflusso può anche causare il vaso sanguigno VNOevacuare, determinando l'impressione di una corretta incannulamento stata eseguita. Posizione corretta può essere confermata incorporando un colorante in soluzione di Ringer l'. Quando la cannula viene posizionato correttamente, il colorante deve unica uscita tramite l'ingresso VNO. Inoltre, si può confermare il corretto posizionamento facendo in modo che la cannula è facilmente visibile attraverso l'aspetto mediale semi-trasparente del VNO.
  12. Spostare la plancia in plastica lentamente fino a quando la AOB è nel flusso diretto della norma aCSF, facendo attenzione a non spostare la cannula dal VNO. La dissezione è completo e la valutazione della funzione fisiologica può iniziare immediatamente. Fase 5 descrive brevemente un approccio per fare una tale valutazione.

5. Valutazione

  1. Penetrare la superficie della AOB con un 2-4 mW microelettrodo vetro borosilicato collegato ad un amplificatore extracellulare e oscilloscopio.
  2. Far avanzare lentamente l'microelettrodo ad una profondità di 100-200 micron dallasuperficie ad una velocità di 50 um / min. Nota: A questa profondità il tessuto, uno incontrerà occasionali azione spontanea potenziali forme d'onda esemplificate dalla taglienti, brevi (~ 1-2 msec) deviazioni della tensione microelettrodo.
  3. Su incontrare un potenziale forma d'onda d'azione, interrompere avanzare il microelettrodo.
  4. Osservare e / o registrare il tasso potenziale di azione mentre si cambia la modalità di consegna da stimolo Controllo suoneria di un attivatore noto di attività VSN (ad esempio, la soluzione di Ringer contenente 50 mM KCl). Se la dissezione era successo, un cambiamento di stimolo-dipendente in azione tasso potenziale o potenziale ambito locale può essere osservato. NOTA: Non tutti i neuroni AOB risponderanno ad ogni stimolo con un aumento della frequenza di scarica (tra cui la soluzione di Ringer contenente 50 mM KCl). Una diminuzione stimolo-dipendente della frequenza di scarica indica anche connettività funzionale e una dissezione di successo. Nel caso in cui due o più neuroni che si incontranonon rispondono alla stimolazione VNO, o se non potenziali d'azione si osservano dopo più penetrazioni degli elettrodi, questo suggerisce una dissezione senza successo. Se questo è il caso, un nuovo dissezione può essere avviata nella Fase 3.

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Representative Results

Raggiungere il successo con questa preparazione richiede pratica estesa, e ha diverse fasi in cui si può fallire. Ci si dovrebbe aspettare da richiedere molti tentativi prima di raggiungere il successo. È richiesta la camera di dissezione personalizzata per il completamento di questo protocollo, e deve essere ottenuto prima di avviare le fasi successive della dissezione. Il disegno della camera illustrato nella figura 1 è sufficiente per questo scopo, e può essere realizzato in materia plastica relativamente economici con esigenze di lavorazione minimi. Se uno manca la capacità di produrre una tale camera, aziende di lavorazione locale o online possono essere consultati e possono costruire la camera a pagamento.

Una grande fonte di variabilità di tutti preparati è la densità e la fragilità delle ossa del cranio e muso degli animali da esperimento. Durante le fasi emisezione (Fasi 3,14-3,20), l'obiettivo è quello di isolare entrambi gli organi vomeronasali insieme al tessuto settale omolaterale eipsilaterale bulbo olfattivo accessorio. Tuttavia, non è raro che il tessuto settale da rimanere fissato nell'emisfero controlaterale, punti particolarmente vicino attaccamento alle ossa dorsali del muso. Figura 2 mostra un esempio di un hemisection efficace e inefficace.

Altri errori dissezione comuni presentano durante la dissezione multa, durante il quale gli assoni del nervo vomeronasal possono essere danneggiati nel tessuto settale vicino all'organo vomeronasale (Figure 3A e 3B) o vicino alla AOB (Figure 3C e 3D). Queste e simili eventi si tradurrà in connessione incompleta tra VSNs e AOB, rendendo i preparativi inutilizzabile.

L'ultimo ostacolo al successo della preparazione è l'incannulamento passo VNO (punto 4.11). Il corretto posizionamento della cannula VNO comporterà pressurizzazione del lume VNO, provocando l'espulsione immediata di sangue residuo dalla pompa vomeronasal. La cannula deve essere chiaramente visibili sotto il vomeronasal epitelio relativamente trasparente e l'aspetto della cannula deve essere uniforme lungo la sua lunghezza all'interno del VNO. Al completamento della procedura, si può verificare la connettività funzionale utilizzando un saggio fisiologica come unità singola registrazioni elettrofisiologiche dell'attività neurale in risposta alla stimolazione VNO con una fonte nota di odoranti VSN (Figura 4).

Figura 1
Figura 1. A) Engineering disegni della camera di dissezione personalizzato utilizzato nei passaggi 3,22-5,4. NOTA: I piccoli fori possono essere praticati per ospitare soluzione e gasatura ingressi e le uscite come desiderato B) Esempio fotografia della camera di dissezione utilizzato in questo protocollo.. m/files/ftp_upload/51813/51813fig1highres.jpg "target =" _blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 2
Figura 2. A, B) Immagini rappresentative di successo (A) e falliti (B) preparati dopo la fase emisezione (punto 3.20). Il VNO, tessuti settali, e bulbo olfattivo (OB) devono essere tutti mantenuti dal emisfero ipsilaterale (in questo caso, il diritto (basso) emisfero. Se turbinati nasali sono visibili nell'emisfero ipsilaterale, la dissezione è fallita. Segni di graduazione sono 1 millimetro di distanza. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Figura 3. A, B) Immagini rappresentative del tessuto del setto intatto e danneggiato tra il VNO e AOB. In B, il dissettore preso contatto involontario con il tessuto, danneggiando le vie assoni VN. C, D) AOBS intatte e danneggiati. In D, rimozione della dura circonda l'OB omolaterale comportato recidere il nervo vomeronasale vicino alla AOB, causando un blob visibile del tessuto vicino alla AOB mediale. Barre di scala sono 1 mm di lunghezza.

Figura 4
Figura 4. A) Esempio raster terreno di potenziali d'azione registrati da un neurone AOB (extracellulare registrazione singola unità) in un preparato di successo. Tracce in mostra il nero alcun cambiamento nella velocità di fuoco, quando la soluzione del controllo Ringer è stato consegnato al VNO per 5 secondi (grigio box). Tracce in rosso indicano la risposta dello stesso neurone alla stimolazione VNO con BALB / c urina femminile del mouse diluiti 100 volte in soluzione salina. B Ringer) Peri-stimolo istogramma in tempo le stesse risposte in A. Le barre di errore rappresentano gli errori standard della media.

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Discussion

L'ex vivo di preparazione VNO-AOB descritto in questo protocollo è una valida alternativa alla anestetizzato in vivo 5-7 e acuta fetta vivo 17 esperimenti di funzione AOB. A differenza acuti esperimenti fetta AOB, che espongono anche elementi circuitali per le registrazioni elettrofisiologiche e ottici, questa preparazione conserva tutte le afferenze sensoriali e collegamenti intra-AOB. Anche se questo può anche essere detto di anestetizzato negli approcci vivo, la presenza di anestetici altera necessariamente funzione neurale, cioè l'equilibrio eccitatorio / inibitorio, che è cruciale per l'elaborazione delle informazioni in questo e in altri circuiti olfattivi 18. Poiché la preparazione evita l'uso di anestetici, e perché la superficie AOB è completamente esposto al superfusate, è suscettibile di indagini farmacologiche nel trattamento neurale locale.

Ci sono, naturalmente, alcune limitazioni di questa preparazione. C'è evidence per progressiva degenerazione dei più profondi strati AOB, cioè le porzioni profonde dello strato cellulare interna, che ospita molte cellule granulari inibitorie 16. Inoltre, gli ingressi centrifughe vengono interrotti durante la dissezione, eliminandoli dalla partecipazione attiva nella funzione AOB. Incannulazione del VNO bypassa la normale azione della pompa vomeronasale, e vampate via i fluidi endogeni presenti nel lume VNO.

Passaggi critici per raggiungere il successo con questo metodo sono la emisezione delicati (punto 3.20) e VNO incannulamento (punto 4.11). Ci si può aspettare di richiedere pratica estesa a produrre in modo affidabile ex vivo preparazioni funzionalmente collegate. La camera di dissezione secondario utilizzato qui può essere utilizzato per valutare la connettività funzionale utilizzando registrazioni singolo elettrodi durante la stimolazione del VNO con fonti di feromoni mouse (come l'urina diluita). 13,15 Modifiche della camera di dissezione secondario possono be fatto che consentono la preparazione di ruotare per angoli adatti per altri scopi, come l'imaging multiphoton.

I numerosi ostacoli tecnici al studiando la AOB vivente hanno a lungo rappresentato un ostacolo alla nostra comprensione di odore sociale e feromone elaborazione sensoriale. Sezionando via i componenti neurali primi di questo canale sensoriale in questo protocollo dissezione, si è in grado di accedere sperimentale per questi circuiti difficili da studio. Abbiamo utilizzato questo preparato per informarsi dettagliatamente in elaborazione sensoriale vomeronasale 19 e mappatura sensoriale (Hammen et al., Inedito). Questa tecnica sarà utile per i futuri studi in elaborazione sensoriale nel AOB, in particolare quelle che richiedono accesso ottico al tessuto (ad esempio, imaging multiphoton e optogenetics). I vantaggi di questo approccio sono complementari a quelli degli approcci in vivo, e migliorare il nostro kit di strumenti per indagare i meccanismi neurali di vomeronasale-mediata cosìcomportamenti sociali e riproduttivi.

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Disclosures

Gli autori non hanno significativi conflitti di interesse da dichiarare.

Acknowledgements

Questa ricerca è stata sostenuta da R00 DC011780 (JPM: NINDS, NIH), F30 DC011673 (GFH: NINDS, NIH) e fondi di avvio UT Southwestern (JPM).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Straight Scissors Fine Science Tools 14002-14
Fine Scissors-Straight Fine Science Tools 14060-10
Fine Scissors-Curved Fine Science Tools 14061-10
Adson Forceps Fine Science Tools 11006-12
#3 Scalpel Handle Fine Science Tools 10003-12
#11 Scalpel Blades Fisher Scientific 3120030
Straight Carbon Steel Razor Blades Fisher Scientific 12-640
35 mm Petri Dish Fisher Scientific 08-772-21
Dissection Chamber Custom  N/A See Figure 1
Delrin plastic plank 0.6 cm x 1.5 cm x 0.1 cm Custom  N/A
Dow Corning Silicon Vacuum grease Fisher Scientific 146355D
#5 Forceps, Student Fine Science Tools 91150-20
#5 Forceps, Biologie Tip Fine Science Tools 11295-10
#5 Forceps, Student Fine Science Tools 91150-20
Vannas Spring Scissors Fine Science Tools 15000-08
1/16" Male Luer Cole-Parmer EW-45505-00
1/16" Tubing Fisher Scientific 14-171-129
Two ton epoxy Grainger 5E157
ValveBank Pressurized Perfusion Kit AutoMate Scientific 09-16
ValveLink digital/manual controller AutoMate Scientific 01-18
NaCl Sigma-Aldrich various
KCl Sigma-Aldrich various
CaCl2 dihydrate Sigma-Aldrich various
MgCl2 hexahydrate Sigma-Aldrich various
NaHCO3 Sigma-Aldrich various
NaH2PO4 Sigma-Aldrich various
myo-inositol Sigma-Aldrich various
Na-pyruvate Sigma-Aldrich various
Na-ascorbate Sigma-Aldrich various
HEPES buffer Sigma-Aldrich various
Glucose Sigma-Aldrich various

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References

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