增强Northern印迹检测小RNA种类的

Biology

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Summary

本刊物的目的是可视化和探讨手术步骤,从果蝇的RNA提取的增强Northern杂交协议的果蝇胚胎,细胞和组织。这个协议是用于有效地检测小RNA种类是特别有用的。

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Laneve, P., Giangrande, A. Enhanced Northern Blot Detection of Small RNA Species in Drosophila Melanogaster. J. Vis. Exp. (90), e51814, doi:10.3791/51814 (2014).

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Abstract

在过去的几十年目睹身边的基因表达调控机制的科学兴趣在RNA水平的爆炸。分子生物学的这个分支已经大大助长了非编码RNA作为主要参与者的转录后调控的发现。这样一种革命性透视一直伴随着与由强大的技术开发的仿形短的RNA表达触发,无论是在高通量水平(全基因组鉴定)或单候补分析(特定物种的稳态积累)。虽然国家的最先进的几种策略是目前可用于定量或可视化等逃离分子,RNA印迹分析仍然是分子生物学的RNA表达的即时和准确的评估资格的办法。它代表了对更复杂的,昂贵的技术,在许多情况下,应用程序的第一步,仍然是一个优先的方法来轻松地深入了解成RNA生物学。在这里,我们概述一个有效的协议(增强Northern杂交),用于检测果蝇弱表达的microRNA(或其他小调控RNA种类)全果蝇胚胎,人工解剖幼虫/成人组织或体外培养的细胞。是必需的RNA的一个非常有限的量,并利用材料从流式细胞仪,分离的细胞可以是也可以设想。

Introduction

RNA生物化学经历了惊人的进步,在过去的1年。我们的基因表达的对照RNA的潜在的理解已经爆裂通过强大的非编码核糖调节2的识别,通过新颖的基于RNA的调节机制3,4的发现和利用已公知的转录后事件更深的表征5。总之这些研究使RNA的生物学大大使场景,成为了目前的科学景观的一个主要研究课题。特别是近年来,我们越来越的“RNA世界”的分子神经生物学6,在现代生命科学中最具活力的研究领域之一的普遍冲击感。在过去的一个世纪的最后十年,整体科学的情景已经被彻底改变了小调控RNA 9,10的RNA干扰7,8的发现和特别是关于微小RNA 11,内源性表达牵连的几乎所有细胞功能基因表达的多效性和组合调节控制的小非编码RNA。

近10年后的miRNA最初发现在秀丽隐杆线虫由安布罗斯和Ruvkun的实验室,重新关注被拒绝到外地时,在果蝇和人类细胞以及12-15确定了高数量的miRNA。从那时起,这要归功于灵活的转基因方法, 果蝇已经站在了一个宝贵的生物背景的深入研究miRNA的生物合成和活性。 果蝇的miRNA揭示了不同的功能的昆虫特异性或进化上保守的过程,老化代谢,信号转导通路跨越,行为,当然,神经发生。沿着这个方向,我们最近推出了有趣的合作一个新的链接16rrelation主基因GCM /滑翔和RNA的通路之间发生。飞转录因子GCM /滑翔17-19构成的细胞命运的决定因素,这决定了胶质细胞与神经元命运的选择多能飞的神经前体20一个独特的例子。二十年对这个话题很长的研究已经清楚地强调了基因表达调控多和重叠的投入发生了融合GCM /滑行 21-28建立所需的神经发育过程中神经的平衡和神经胶质同行之间的微妙比例的阈值水平。

我们发现,通过DMEL-miR279目标,监管是进一步控制水平有助于转录后微调的GCM /滑动16。从全球来看,这些研究都行需要具体的方法改进:沿几年,一些技术最初开发分析TRADitional的RNA被转化为定量小的非编码RNA,等作为RNA酶保护测定,cDNA芯片29-31,实时PCR的方法32-35和测序36,37。在另一边,技术方法校准助长了持续进展的领域。

Northern印迹法(NB,或RNA凝胶印迹法)构成了一个有代表性的实例:它主要用于型材RNA的积累,因为它确保了表达水平的定量和尺寸确定。然而,该方法的特性差的灵敏度被限制时,它是被应用到低丰度的基因表达细调谐器,像短的RNA。甲不利后果是大量的总RNA,这使得难以应用到特定的生物样品的要求。对于这样的理由,小分子RNA检测特定NB变种已经发展38-40:我们采取了一种改进的NB PROC的优势edure 41(ENB,增强Northern印迹),同时阐明DMEL-miR279GCM /滑翔之间的上述相互作用。

此方法依赖于基于碳二亚胺衍生物的活性的化学交联步骤[1 - 乙基 - 3(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺,EDC]固定核酸到固体支持物。碳二亚胺是已知催化的酰胺键的活化羧基或磷酸基团和胺基团42之间形成一个多功能的交联剂。此属性可通过其单磷酸5'-羟基基团被利用共价耦合的小分子RNA,以氨基基团在尼龙膜的表面上。所得的附接结构增加了固定化的核酸的可访问性,反过来,探针-靶杂交,这导致显着的检测增强43的效率。

该技术假设特定relevancE在果蝇的分子生物学研究,通过这些新颖独特的类小非编码RNA的产生是新兴的44。在这些中,rasiRNAs 45,46构成PIWI相互作用RNA(了piRNA 47),参与序列特异性基因沉默的特异性亚型。此方法的执行细节中充分描述和可视化在下文中,相对于微小RNA DMEL-miR279DMEL-miR286的分析,并在第一时间,有rasiRNA,rasi4的。我们推走极端此方法,该方法允许我们从RNA(小于1微克)的最小量的揭示表达很差目标。

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Protocol

1,样品采集

  1. 分离半粘合施耐德2细胞(1-5×10 6个细胞的平均值),通过移液并通过离心(100×g离心1分钟)收获它们。如果在体外培养的贴壁细胞,trypsinize他们在标准条件下,或者直接从板上将它们收集到的RNA提取试剂的便利量,用细胞刮刀的帮助。
  2. 对于胚胎收集,成长果蝇株苍蝇笼子里,让胚胎积聚在产蛋板。在蒸馏水画笔(DH 2 O) 胚胎擦拭掉,丢弃杂物用筛子过滤,冲洗和一小瓶48收回胚胎。
  3. 作为一种替代技术,手动解剖组织/器官。在立体显微镜下(放大20倍)隔离腹果蝇睾丸(在piRNA基因分析的优惠制度)的磷酸盐缓冲液(PBS),用解剖针或镊子作为VISualized沙利文 49。
  4. 杵匀化后的0.5容积RNA提取试剂瘾样本。

2,RNA提取/分析

  1. 按照厂家的说明书,通过商业化的试剂进行RNA分离。 小心!RNA提取试剂通常毒性和刺激性。可替换地,应用的蛋白酶K的基于协议的RNA分离50,如下所示:
    1. 样品稀释到400微升停止混合,并在室温下孵育15分钟。
    2. 回收水溶性组分通过标准的苯酚:氯仿:异戊醇和氯仿提取并用乙醇(EtOH中)沉淀/洗涤。空气干燥样品重悬成焦碳酸二乙酯(DEPC)处理双蒸(DD)H 2 O
  2. 评估紫外分光光度法测定RNA浓度。也保证了RNA的纯度高,接近2.0,BAS版上的260/280的阅读。
  3. 检查RNA制备的变性琼脂糖凝胶如下:
    1. 在一个干净的烧杯中,溶解1.2克琼脂糖82毫升DEPC-DDH 2 O,在不断搅拌下。煮至完全溶解。
    2. 允许凝胶溶液冷却下来;当温度达到60℃,加上10×4吗啉酸10毫升(MOPS)缓冲液1X终浓度(FC)和8毫升37甲醛3%至%FC。 小心!甲醛是一种致癌物质。
    3. 倒胶至水平电泳槽。使凝胶的发动机罩下固化至少1小时。下面凝固,淹没凝胶进入公开资讯观测站1X。
    4. 分装2微克RNA​​样品和1微克天梯(使用一种RNA标记时,准确的评估需要)。加入3倍体积的琼脂糖样染料(ALD)的RNA和阶梯。热火在70℃下5分钟,立即在冰凉凉的。 加利福尼亚UTION!ALD的内容(溴化乙锭和甲酰胺,见材料)的诱变剂和腐蚀性,分别为。
    5. 装入样品和运行凝胶为50 V与偶尔的缓冲回收约1小时。检查用UV可视化或凝胶成像RNA的分离模式。识别相应于28S和18S个rRNA和tRNA的到离散的条带(参见图1)。
  4. 继续北检测,或将RNA在-80℃。

3,变性聚丙烯酰胺凝胶的制备

  1. 用于该分级步骤一个小型垂直电泳仪(板尺寸长约8厘米×9厘米,梳厚度0.75mm)组合。
  2. 组装清洁眼镜一起在试镜架。
  3. 制备将10ml 10%丙烯酰胺/双丙烯酰胺(19:1)在MOPS 1X溶液,7M尿素。立即浇注之前,加入100微升10%过硫酸铵及10微升TEMED,并快速混合的溶液。 小心!丙烯酰胺具有神经毒性和致癌物质。
  4. 倒入玻璃板之间的凝胶和仔细地插入以及梳,以避免气泡。让凝胶聚合​​在RT使用前至少45分钟。另外,存储凝胶的O / N,包裹在水中浸泡滤纸和保鲜膜密封。

4,样品制备

  1. 等分0.5-20总RNA为各样品的微克。如果体积超过3-4微升,真空干燥该样品。
  2. 对于尺寸确定,并行运行的放射性低的范围梯等分(20-30 CPS)来样订做,作为标记(见4.3和4.4的准备)。在并行处理以样品,如在步骤4.5中描述。
  3. 排行榜:设置使用0.1微克10个基点,阶梯的磷酸盐正向反应。在37℃下30分钟,使反应停止,加入乙二胺四乙酸(EDTA)以20mM的FC。
  4. 通过乙醇沉淀/洗衣机,空气干燥和净化悬浮在DDH 2 O(约100微升)。 小心!32 P是一个放射源。
  5. 向每个样品中添加的丙烯酰胺蓝色染料(ABD)的等体积。通过加热变性,在80℃下进行5分钟并在冰上冷却直到加载。 小心!甲酰胺(在ABD内容)是腐蚀性的。

5,电泳分级

  1. 从铸造支撑取出玻璃板并正确组装它们中的电泳单元。以足够的电泳缓冲液(RB)填充内和外室。
  2. 轻轻取出梳子和运行前,在200V的凝胶10分钟。装载样品前,洗去从井尿素存款通过注射器喷出一些包。
  3. 使用平头从步骤4.5在每个孔的底部仔细分层样本。检查阳极和阴极连接,以避免倒跑。后样品进入凝胶在100伏5分钟,我现象越来越多的电压200V。
  4. 对于约7厘米长的分馏,45分钟,长期来看是足够的。避免溴酚蓝(在ABD跟踪颜料)溢出的胶。
  5. 可视化的凝胶分级分离的长的RNA通过溴化乙锭(EtBr的)染色,作为一个可选的步骤:
    1. 切开2厘米的凝胶的顶部,并简要冲洗在DDH 2 O的片
    2. 孵育凝胶切片在室温下进行15分钟,在RB,EtBr的0.5微克/毫升的FC温和正遨游。
    3. 脱色在RB中的凝胶15分钟,可视化长个rRNA通过UV照射或凝胶成像。检查RNA的装载和质量( 见图1,面板7)。 小心!溴化乙锭是一种诱变剂。
  6. 同时继续进行印迹含有小RNA种类的凝胶的下部。

6,凝胶印迹

  1. 切成6片吸墨纸以适合印迹区域的和等效的一块unchargeð尼龙膜。挫伤张纸张,薄膜和在RB 2印迹垫。请务必反复挤压他们的RB完全浸泡垫。
  2. 除去从该装置中的凝胶并用抹刀​​的平均开眼镜。用干净的切割,除去孔内。将湿滤纸纸张上胶,轻轻抬不起来。
  3. 将尼龙膜在凝胶上的自由表面。标志着一个角落里按装样以定向筛选。完成“三明治”(3纸片每边)。卷上的印迹表面的塑料棒,以消除任何可能的气泡。
  4. 将两个印迹垫,然后之间的杂交,在杂交盒中。组装纸盒的印迹模块中,充满RB室,并检查是否有正确的方向(尼龙膜必须凝胶和正端之间留)。
  5. 在传输20 V 20分钟。注:为确保均匀的条件下,经过10分钟打开印迹模块和R完成转接之前otate夹心180°。

7,交联膜

  1. 制备6毫升新鲜交联溶液(XLS)。饱和一块10厘米×10公分(大于尼龙膜)一张吸水纸,XLS, 小心!盐酸(XLS的一个组成部分)具有很强的腐蚀性。
  2. 拆下的印迹,并将膜在湿3MM滤纸。注意:RNA必须不与饱和纸直接接触。将两块玻璃板之间的过滤器和纸,敷在萨兰换行。
  3. 加热膜在60℃2小时,接着是DDH 2 O洗涤。储存在-20°C或进行杂交。

8,膜预杂交

  1. 如果装载的RNA已检查(可选步骤5.5),直接进行杂交。否则,切有1厘米的尼龙过滤器的顶部,以避免探针跨hybridizations至分馏长的RNA。
  2. 预热在37℃10毫升杂交液(HS)的。变性1毫克鲑鱼精子在95℃下5分钟,在冰上冷却并添加到HS。
  3. 在杂交炉中孵育协过滤器在37℃至少1小时,下旋转。检查过滤器的RNA的侧面爆头。

9探针合成

  1. 设立磷酸正向反应在10皮摩尔的反义寡核苷酸,如4.3节。
  2. 加入5倍体积的Tris-EDTA-NaCl的(TEN)的缓冲液来进行反应和纯化来自未掺入的核苷酸的G-25葡聚糖凝胶柱的标记的引物通过凝胶排阻色谱法(或也通过乙醇沉淀)。探头活性可以通过液体闪烁计数器进行评估。

10膜杂交

  1. 更换用尽HS采用了新的10毫升一份(准备和补充如上所述)。热火在探头95℃下进行10分钟,在冰上冷却并添加到新的HS。孵育过滤器在37℃开。

11膜的清洗

  1. 恢复的杂交溶液中,它在-20℃下储存在放射性屏蔽盒。
  2. 在冲洗洗涤缓冲液(WB)过滤器彻底清洗它在室温下10分钟。
  3. 用盖革 - 米勒探测器为在滤波器的角落检查剩余放射性。当背景辐射大约是5厘,进入膜的论述。

12,信号检测

  1. 暴露在放射自显影胶片或在分子成像仪屏幕上的过滤器。揭示了照相处理或数字转换信号。
  2. 分析由专门的量化软件(ImageJ的或Optiquant)的谱带强度。

13,剥膜

  1. 要删除基色信号,淹没膜在500毫升煮沸剥离液,然后在室温下孵育1分钟。前进到新的(预)杂交或存储滤波器在-20℃。

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Representative Results

通过下面的文本中, 如图1中所描述和示意性地表示的整体过程中,我们评估不同来源的复杂的RNA样品的小RNA的表达。在图1中给出的实验中,RNA从果蝇施耐德2细胞通过蛋白酶K提取,检查其完整性分离(可选步骤:变性琼脂糖凝胶分离),并在双加载。凝胶的一半印迹在中性膜和化学交联的EDC;第二半被转移上带正电的尼龙过滤器,然后UV交联的(1.2×10 5个μJ/ cm 2)的。属于该DMEL-miR279家族2微RNA的内源性表达(DMEL-miR279本身和DMEL-miR286 15)在这两个条件下进行了验证。改进的步骤(ENB)确保了更高的灵敏度相对于标准1(SNB)。

图2和图3突出显示。实验原理是一样的上面:在这里,我们报告Northern杂交放射自显影检测的piRNA基因rasi4的代表结果以及成年提取飞睾丸总RNA滴定。当装载0.5微克的RNA ENB已经允许检测的特异性条带。量化一边显示了信号成比例地与分馏的RNA的量增加,这表明剂量/响应比率在于检测的线性范围。下面的面板批准本方法相比SNB的改进的灵敏度。在这种情况下,可检测的信号是在10微克的RNA至少在SNB的电泳分级分离获得的。

类似的结果用不同的非编码RNA种类, 例如 ,获得,5S rRNA基因,据报道在图3</ STRONG>。

图1
图整体Northern杂交过程的一示意图 。列出主要的程序步骤,并逐步编号。结果是增强Northern印迹(ENB)和标准Northern杂交(SNB),在相同的条件下进行的比较:从果蝇施耐德的2个细胞(图1),电泳(小组2),传输(面板3)和杂交(RNA分离面板5)。 ENB表示此报告,这需要一个中性滤光片(面板3中,左边的膜的一半)和EDC类交联剂(面板4)中描述的改进的程序,以建立一个共价键与靶RNA的5'末端和膜之间的结合(在第4小组的粉红色圆点)。在瑞士央行,由紫外线处理(面板4)带正电荷的NYLO获得的RNA交联N膜上(面板3,在膜的右半部分)。 5S RNA的特定信号是不是在比较条件下校准,因为它也响应SNB和ENB程序之间的差异。因此,其量(对应于10厘泊)的5'-标记的(见点4.3和4.4的协议的),50个核苷酸长扰码寡核苷酸加入到每个样品电泳前,以用作“尖峰”参照(面板7)。加载也可以评定长个rRNA(见该协议点5.5)对凝胶溴化乙锭染色。 L =梯子。 FV =正面图,LV =横向来看,HV =横向视图。 请点击这里查看该图的放大版本。

图2
图2对比例rasi4表达ative Northern blot分析,睾丸特异性piRNA基因rasi4的内源性水平被提高(ENB)或标准(SNB)Northern杂交结果显示,在增加成年果蝇的睾丸中提取总RNA(每个通道上面所示)的量进行,或者从整个腹部(ABD)。对于每一个方法,直方图抛开报告rasi4就到了相同数量的相对量“尖峰”负荷控制。从两种方法的量化结合在下面放置凝胶的决定性图。 请点击这里查看该图的放大版本。

图3
的5S R图3比较Northern blot分析RNA表达。作为阳性对照和实验校正,以前的分析扩展到5秒的rRNA。详情如图2所示请点击这里查看这个数字的放大版本。

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Discussion

虽然我们的阅历相互交织,通过它的RNA调节神经的升值​​不断增加,基于RNA的设计电路影响神经干细胞生物学,神经细胞的分化/功能集成,神经病变和癌症的发展机理的影响尚未被探索。这样的网络通过王国的维护使得遗传系统的潜力作为果蝇有助于揭开未开发的细胞途径,其中短的非编码RNA和转录因子被认为是主要的分子球员。在此视图中,候选小分子RNA表达水平的概要是propaedeutic到准确功能分析:一个例子来自我们最近证明了DMEL-miR279调节体内GCM /滑翔命运的决定因素,通过Northern印迹分析的改进版作为完成一种工具表达分析。

51其最初的发展,NB一直被视为用于RNA分析的参考方法。尽管该测定中的一些固有的限制,因为难以转换为复用信号的量化格式或可能出现的错误,最近的突破核糖核酸分子生物学重新发现该现有技术的“快速清洁”系统用于测定小核糖核酸内源性表达酸或用于验证GAIN-或功能丧失的方法的有效性。作为例证的实例,Northern分析勾画在微RNA的最初发现的基础上的,而该方法仍然处于前列其在调控RNA 52不断新特性表征的相关性。

此处所描述的变体是基于增加的敏感性由于RNA的化学交联。我们believethe方法还是采用果蝇不佳,B利用当UT导致显著发现52,因为它使得有可能仿形RNA表达从少量样品(小于1微克),与靶RNA的检测41,43的平均10-30倍的改善,如我们在我们的条件下得到的( 23)。

RNA的完整性,以便获得一致的和可重复的结果构成了一个重要的问题。 RNA的操作要求的准确性和快速性,限制提取和加载之间可能发生的样品降解。就这个目的,所有的解决方案需要是diethylpyrocarbonate-(DEPC),使用前处理过的(0.1%DEPC的存在下2小时,在37℃,然后高压灭菌)来规避RNase活性。固溶处理保证了较好的效果就用DEPC水作为溶剂。所有设备将被同样漂洗于DEPC ddH20,清洗由RNA酶特异性表面去污剂之后。

例如,rasi4, 图2),或当对新鲜样品不进行RNA纯化(例如,保存到组织存储试剂)。从以往的经验,从稳定的样品RNA分离导致显著更严厉的要求和更激烈的提取条件。在标准条件下,所描述的蛋白酶K类方法保证以及,(一显著例子示于图1)良好品质的制剂,但它是不适合的存储试剂保存的样品的最佳选择。

最后,由于此过程的目的是小RNA特异性检测,专用柱纯化系试剂盒可用于直接小RNA的分离,即使第就是使得难以验证RNA的完整性。在替代方案为如上所述的RNA完整性控制的传统的基于凝胶的过程中,RNA的质量可通过仪器用于片上的小型化的核酸型态分析评价。

缓冲器选择:MOPS-氢氧化钠缓冲液(pH 7)中提出了作为用于既增强北方凝胶电泳和印迹优先缓冲区。我们也满意地使用的Tris-硼酸-EDTA(TBE)缓冲液中的实验。在此情况下,由于三(羟甲基)氨基甲烷的亲核试剂的胺基基团的存在会水解,在治疗过程中灭活DEPC本身,建议溶解的Tris入DEPC处理过的水,而不是已经制备治疗TBE缓冲液。

电泳运行和印迹:预运行的凝胶是用于除去过量的过硫酸盐和消除hyperfocusing必不可少的。应维持前期运行参数也分馏过程中,避免过快electropho网状细胞运行。在安装之前,请务必从井中取出可能的尿素沉积,由内而外喷出缓冲区。这将限制样品溢出,并保证准确RNA的分层,在信号检测解决生产放射自显影带。任何中性尼龙膜可被用作用于核酸转移的载体。不要涂抹的RNA超过20-30分钟,在规定的条件。

交联:EDC基于化学交联代表的这种增强的Northern印迹版本的临界方法前进。的可能性,由核糖核酸5'mono磷酸基团和尼龙的伯胺之间的共价结合到交联的短的RNA种类,以中立面离开的大部分碱可用于杂交。这增强了由10-20xrespect传统交联的敏感度。关键的是要制备的交联溶液的新鲜量为每印迹,以足够的量进行适当的膜饱和。

杂交和洗涤:探头最好应新鲜标记。探针的比活性(取决于特定的活性和结合的放射性标记的核苷酸的量和也对探针可用于杂交的量)决定了目标检测器的灵敏度。当[γ-32 P] ATP的3000次/毫摩尔的比活性的情况下,10 6 CPM /皮摩尔的5'端的100%的标记的预期。

杂交溶液可以回收并再利用,考虑的是,由于32 p衰变,在约14天的探针活动半部。

由于膜的中立性,低背景噪音杂交后的预期。如果更严格的洗涤条件是必需的,逐渐减少清洗缓冲液的离子强度(高达0.2×SSPE)或者添加增加量的离子型去污剂(高达0.5%SDS)或提高洗涤温度至37℃。

Northern blot分析是必不可少的,当RNA的大小的测量是必需的。尽管该测定中可能缺乏的基于荧光定量PCR方法对估计的微小RNA的精确度,一个优点来自用变性分馏/印迹和探针依赖杂交作为检测靶RNA的前唯一步骤。因此,从样本的特定信号的启示是直接的,并且不需要酶处理/转换/放大的任何附加的步骤,这将意味着使用专用的市售试剂盒的。 RNA水平可以被量化并在单膜的多个样品之间进行比较。因此NortheRN印迹通常用作严格验证的qPCR数据。通过具体的实验要求促使中,该方法已被连在 ​​过去几年里改进,无论是在灵敏度和分辨率的水平,使得RNA的数量有限(参见图23)所需要的成功分析。

我们提出的方案可以适用于广泛的用途,尤其是材料是在有限数量的可用的。 RNA样品的生物来源可以是异构的:尽可能果蝇而言,胚胎或其他发育阶段是合适的,而且手动解剖组织或器官中,单个细胞分选,分离cytotypes或细胞培养物。

此外,即使微小RNA是最丰富的类的短调控RNA在细胞和调查中的RNA介导的基因表达控制领域的重大问题上,他们没有坏处titute细胞非编码RNA的唯一的亲人。微小RNA的许多簇跨越国度( 内源性的siRNA,了piRNA,核仁,植物tasiRNAs),其中大部分的特征,从一个免费的5'末端(未修改)的功能,从母体分子的内切核糖核酸处理一般推导。此功能构成严格要求申请基于化学交联的具体改进方法独特的结构前提下,即使RNA的大小必须加以考虑,当较长的RNA进行了分析。在图2中 ,我们报告一个Northern blot分析比较检测rasi4 54一类的种系特异性小RNA(Piwi蛋白相互作用的RNA或了piRNA)在贫穷和具体的表达水平条件中的一员的水平,增强敏感性这个方法可以制裁成功的结果,特别是考虑到所报告的协议可以通过梳能够进一步提高与文献55,56已经描述的其他实际实现都进不去了。

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Acknowledgements

这项工作是由国家研究所德拉桑特等德拉RECHERCHEMédicale的支持下,该中心的法国国家科学研究中,圣圣斯特拉斯堡总医院斯特拉斯堡,协会倒拉RECHERCHE河畔勒癌,国立研究所杜癌症,法新社的国立德拉RECHERCHE和地区阿尔萨斯。

彼得拉内韦一直支持基金会倒拉RECHERCHEMédicale。目前,他是一个因诺琴蒂基金会意大利语TECNOLOGIA(IIT)的奖学金的获得者。出版费用由Neurex网络支持(TriNeuron - 计划区域间四上莱茵省)

Materials

Name Company Catalog Number Comments
FINAL COMPOSITION/NAME COMPANY CATALOGUE (Stock) COMMENTS
GENERAL REQUIREMENT
Centrifuge, 5418 Eppendorf 5418 000.017
Decontaminant, RNase Away Sigma-Aldrich 83931 Apply on glass/plasticware, wipe and rinse
RNase inhibitor, DEPC Sigma-Aldrich D5758 Hazardous //// 1609-47-8
SAMPLE PREPARATION
Stereo Microscope, M60 Leica 
1X PBS Buffer
137 mM NaCl Sigma-Aldrich S3014 7647-14-5  
2.7 mM KCl Sigma-Aldrich P9541 7447-40-7 
10 mM Na2HPO4 Sigma-Aldrich S3264 7558-79-4 
1.8 mM KH2PO4 Sigma-Aldrich P9791 7778-77-0 
RNA EXTRACTION/ANALYSIS
UV-Vis Spectrophotometer Thermo Scientific Nanodrop 2000
Gel Imager, ChemiDoc XRS+ Biorad 170-8265
Horizontal Electrophoresys, Mini-Sub Cell GT BioRad 170-4487EDU
RNA extraction reagent, TRIzol Reagent Life Technologies 15596026 Hazardous
PCA (25:24:1), 1:1 for extraction Sigma-Aldrich 77617 136112-00-0
Chlorophorm, 1:1 for extraction Sigma-Aldrich C2432 67-66-3  
EtOH, 2.5 vol. for precipitation, 70% for washing Sigma-Aldrich 59844 64-17-5 
Gene Ruler 1Kb DNA Ladder Thermo Scientific SM0311
Stop Mix
300 mM NaOAc, pH 5.5 Sigma-Aldrich S2889 127-09-3
1x RSB Solution
2% sodium dodecyl sulfate (SDS) Sigma-Aldrich 71736 Never cool down SDS to avoid  precipitation //// 151-21-3
2 mg/ml Proteinase K Roche Applied Science 0-3115828001 EC 3.4.21.64 9
10X Reticulocyte Standard Buffer (RSB)
100 mM Tris-Cl, pH 7.4 Sigma-Aldrich T5941 1185-53-1  
100 mM NaCl Sigma-Aldrich S3014 7647-14-5  
30 mM MgCl2 Sigma-Aldrich M8266 7786-30-3
Denaturing Agarose Gel
1.2% Agarose Sigma-Aldrich A9539 Let the gel solidify for at least 1 hr //// 9012-36-2
10X MOPS Buffer
0.2 M MOPS sodium salt, pH 7 Sigma-Aldrich M9381 Do not confuse MOPS sodium salt with MOPS //// 71119-22-7
Agarose Loading Dye
1x MOPS Buffer
3% formaldehyde Sigma-Aldrich F8775 Hazardous //// 50-00-0
50% formamide Sigma-Aldrich 47670 Hazardous //// 75-12-7
Ethidium bromide (EtBr) 30 μg/ml Sigma-Aldrich E1510 Hazardous //// 1239-45-8
Bromophenol blue  Sigma-Aldrich B0126 115-39-9 
SMALL RNA FRACTIONATION
Flat gel loading tips Life Technologies LC1002
Savant SpeedVac Concentrator Thermo Scientific  DNA120
Vertical Electrophoresis, Mini-PROTEAN Tetra Cell  Biorad 165-8000
Denaturing Acrylamide Gel
10% acrylamide/bis-acrylamide (19:1) Sigma-Aldrich A3449 Hazardous. Let the gel polymerize for 45 min before use
1x TBE Buffer (or 1x MOPS Buffer)
7 M urea Sigma-Aldrich U6504 57-13-6
0.1% ammonium persulfate Sigma-Aldrich 215589 7727-54-0 
0.1% TEMED Sigma-Aldrich T9281 110-18-9
Gene Ruler Ultra Low Range DNA Ladder (10 bp-step) Thermo Scientific SM1211 Label 0.1 μg, as described in the "probe labeling" reaction
Acrylamide Blue Dye 
50% formamide Sigma-Aldrich 47670 Hazardous //// 75-12-7
Bromophenol blue Sigma-Aldrich B0126 115-39-9 
Running Buffer (RB)
1x MOPS Buffer 
Alternative RB: 1x TBE Buffer
1x TBE Buffer
5X TBE
445 mM Tris-base Sigma-Aldrich T1503 77-86-1 
445 mM boric acid Sigma-Aldrich B7901 10043-35-3
20 mM EDTA Sigma-Aldrich EDS 60-00-4  
Gel Staining Solution
Ethidium bromide 0.5 μg/ml Sigma-Aldrich E1510 Hazardous //// 1239-45-8
1x RB Stain for 15 min with EtBr, destain for 15 min w/o EtBr
BLOTTING
3MM Whatman paper Sigma-Aldrich Z270849
Neutral Nylon Membrane, Hybond NX GE Healthcare Life Science RPN203T Photosensitive
CROSSLINKING
Crosslinking Solution (XLS)
1% 1-methylimidazole (v/v) Sigma-Aldrich 336092 Always prepare a fresh aliquot of XLS //// 616-47-7
12.5 mM HCl Sigma-Aldrich H1758 Hazardous //// 7647-01-0
3.1% EDC (w/v) Sigma-Aldrich 3450 25952-53-8  
(PRE)-HYBRIDIZATION
Liquid Scintillation Counter  Beckmann LS 6500
Sheared Salmon Sperm, 0.1 mg/ml  Life Technologies AM9680
rasi4 anti-sense probe 5' CGGUGUUCGACAGUUCCUCGGG -3'
5s-rRNA anti-sense probe 5'-CAACACGCGGTGTTCCCAAGCCG-3'
Dmel-miR279 anti-sense probe 5'-TTAATGAGTGTGGATCTAGTCA-3'
Dmel-miR286 anti-sense probe 5'-AGCACGAGTGTTCGGTCTAGTCA-3'
Purification Kit, Illustra MicroSpin G-25 Columns GE Healthcare Life Science 27-5325-01
(Pre)-Hybridization Solution (HS)
0.5% SDS Sigma-Aldrich 71736 151-21-3 
5x Denhardt's Solution
20X SSPE
3.6 M NaCl Sigma-Aldrich S3014 7647-14-5  
0.2 M sodium phosphate Sigma-Aldrich 342483 7601-54-9  
20 mM EDTA (pH 8.0) Sigma-Aldrich EDS  60-00-4  
50x Denhardt's Solution
1% Ficoll 400 (w/v) Sigma-Aldrich F2637 26873-85-8
1% Polyvinylpyrrolidone Sigma-Aldrich PVP40 9003-39-8
1% BSA Sigma-Aldrich A7906 9048-46-8  
1X TEN Buffer
10 mM Tris-Cl (pH 8.0) Sigma-Aldrich T1503 77-86-1 
100 mM NaCl Sigma-Aldrich S3014 7647-14-5  
1 mM EDTA (pH 8.0) Sigma-Aldrich EDS 60-00-4  
Probe Labelling
0.4 μM oligonucleotide
1.5 μl Ci/μl [γ-32P] ATP Perkin Elmer NEG002A Hazardous //// 51963-61-2
1x T4 Polynucleotide Kinase Buffer Biolabs B0201
T4 Polynucleotide Kinase 0.5 units/μl Biolabs M0201 EC 2.7.1.78
WASHING
Geiger Mueller Detectors Canberra Industries MCB2/CPS – EM77021
Washing Buffer (WB), 2x SSPE
Stringent Washing Buffers
0.2x SSPE
2x SSPE, 0.5% SDS
0.2x SSPE, 0.5% SDS
SIGNAL DETECTION
PharosFX Plus System Biorad 170-9460
Image J Freely available
Quantity One Biorad
X-ray films , BioMax XAR Sigma-Aldrich F5888 Photosensitive
Developer for X-ray films Sigma-Aldrich P7042
Fixer for X-ray films Sigma-Aldrich P7167
STRIPPING
Stripping Solution
10 mM Tris-HCl pH 8.8 Sigma-Aldrich T1503 77-86-1 
5 mM EDTA Sigma-Aldrich EDS 60-00-4  
0.1% SDS Sigma-Aldrich 71736 Add SDS after boiling to avoid foaming //// 151-21-3

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References

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