低分子RNA種のノーザンブロット検出における強化
1Département de Génomique Fonctionnelle et Cancer, Institut de Génétique et de Biologie Moléculaire et Cellulaire, 2Center for Life NanoScience, Istituto Italiano di Tecnologia

Biology

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Summary

本書の目的は、 キイロショウジョウバエの胚、細胞、および組織から抽出されたRNA上の強化されたノーザンブロットプロトコルの手術の手順を視覚化し、議論することである。このプロトコルは、小さなRNA種の効率的な検出のために特に有用である。

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Laneve, P., Giangrande, A. Enhanced Northern Blot Detection of Small RNA Species in Drosophila Melanogaster. J. Vis. Exp. (90), e51814, doi:10.3791/51814 (2014).

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Abstract

最後の十年は、RNAレベルでの遺伝子発現制御機構の周りの科学的関心の爆発を目撃した。分子生物学のこのブランチは大幅に転写後調節の主要なプレーヤーとして非コードRNAの発見に支えられてきた。このような革新的な観点は、ハイスループットレベル(ゲノムワイド同定)または単一の候補解析(特定の種の定常状態の蓄積)の両方、を伴うと短いRNA発現をプロファイリングするための強力な技術の開発によってトリガされている。いくつかの最先端技術の戦略は投薬や、逃げるの分子を可視化するために現在利用可能であるが、ノーザンブロットアッセイは、RNA発現の迅速かつ正確な評価のための分子生物学の適格なアプローチのまま。それは、より洗練され、コストのかかる技術の応用に向けた最初のステップであると、多くの場合、簡単に洞察を得るための優先方法のままRNA生物学へ。ここでは、手動で幼虫/成体組織を切開しまたはインビトロ培養細胞 、胚全体キイロショウジョウバエから弱く発現マイクロRNA(または他の小さな調節RNA種)を検出する(ノーザンブロット拡張)効率的なプロトコルの概要。 RNAの非常に限られた量が必要とされ、フローサイトメトリー、単離された細胞からの材料の使用も想定することができる。

Introduction

RNAの生化学は、過去数年1で壮大な進歩を経験している。遺伝子発現の制御におけるRNA電位の私たちの理解は、新規RNAに基づく調節機構3,4の発見によって、すでに知られている転写後事象のより深い特性評価により、強力な非コードリボ-レギュレータ2の同定により破裂されました5。すべて一緒にこれらの研究は、現在の科学的景観における主要な研究対象となってきて、RNAの生物学は劇的場面を作ることができました。特に、ここ数年、私たちは、分子神経生物学6、現代の生命科学の中で最もダイナミックな研究領域の一つの「RNAワールド」の蔓延インパクト感を得ている。前世紀の最後の10年間では、全体的な科学的なシナリオは、RNA干渉7,8の発見によって、小さな調節RNA 9,10の革命をもたらしてきたマイクロRNA 11への特定に関しては、内因的遺伝子発現の多面的コンビナトリアル規制当局などのほぼすべての細胞機能の制御に関与する小さな非コードRNAを発現した。

miRNAの高い番号は、ショウジョウバエで、同様に12〜15ヒト細胞で同定された際に約10年アンブロスとRuvkunのラボによる線虫(Caenorhabditis elegans)におけるmiRNA最初の発見後に、再び注目がフィールドになっていた。それ以来、汎用性の高い遺伝子導入のアプローチのおかげで、 キイロショウジョウバエは、miRNAの生合成と活動掘り下げるための貴重な生物学的状況として際立っていました。 ショウジョウバエ miRNAがシグナル伝達経路、代謝に高齢化から及ぶ、特定昆虫または進化的に保存されたプロセスで異なる機能を明らかにした、行動や、もちろん、神経発生。この方向に沿って、私たちは最近、興味深い共同で新たなリンク16を発表マスター遺伝子GCM /グライドとRNA合成経路との間に発生するrrelation。フライ転写因子GCM /グライド17-19は神経前駆体20を飛行多能においてニューロンの運命の選択対グリアを規定する細胞運命決定因子のユニークな例を構成している。二十年このトピックに関する長期研究は明らかに複数の発生を下線とGCM /神経発達中の神経細胞とグリアカウンターパートとの間の微妙な比率のバランスをとるために必要な閾値レベルを確立するために21-28 グライドにわたって収束遺伝子発現制御の入力が重複しています。

私たちは、DMEL-miR279ターゲティング経由その規制がGCM /発現16 グライドの転写後の微調整に寄与し、さらに制御レベルを表して発見した。世界的には、これらの研究の行は、特定の方法論的な改善を必要とした。年に沿って、いくつかの技術が独自に開発したトラッドを分析するitional RNAは、RNアーゼ保護アッセイなどのような小さな非コーディングRNA、cDNAアレイ29-31、リアルタイムPCR法32〜35および配列36,37を定量化するために変換されている。反対側には、技術的なアプローチの再キャリブレーションは、現場での連続進歩を助長しています。

ノーザンブロットアッセイ(NB、またはRNAゲルブロットアッセイ)代表のインスタンスを構成している:それは、発現レベルの定量だけでなく、サイズ決定の両方を確保しているので、それは主に、RNA蓄積をプロファイルするために使用される。しかし、この方法の本質的な乏しい感度は、それが短いRNAのような、低豊富な遺伝子発現細かいチューナーに適用する場合に限定される。有害な結果は、特定の生物学的試料への応用は困難になり、総RNA、大量の要件である。このような理由から、低分子RNA検出のための具体的なNB変異体は38〜40が開発されている:私たちは改善されたNB procを利用したedure 41(ENB、拡張ノーザンブロット)、DMEL-miR279およびGCM /グライドの間、上記の相互作用を解明している。

この方法は、固体支持体上に核酸を固定する[EDC、1 - エチル-3-(3 - ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド]カルボジイミド誘導体の活性に基づく化学的架橋工程に依存している。カルボジイミド活性化カルボキシルまたはリン酸基およびアミン基42との間のアミド結合の形成を触媒することが知られている汎用性のクロスリンカーである。このプロパティは、ナイロン膜の表面にアミノ基に自分のモノリン酸化された5'-ヒドロキシル基を介して共有結合小さなRNAに活用することができる。得られ取付け構成が顕著検出強化43を生じる固定化された核酸と、今度は、プローブ-標的ハイブリダイゼーションの効率のアクセシビリティを増大させる。

技術は、特定のrelevancを想定しているショウジョウバエ分子的研究におけるeは、それによって、小さな非コードRNAの新規で独特のクラスの発生が44を浮上している。これらの中でも、rasiRNAs 45,46は配列特異的遺伝子サイレンシングに関与PIWI相互作用性RNA(piRNAは47)の特定のサブタイプを構成する。この方法の手術の詳細は十分に説明し、以下に可視化し、マイクロRNA DMEL-miR279DMEL-miR286の分析に相対的で、初めて、1 rasiRNA、rasi4のされています。私たちは、RNA(1μg未満)の最小量から不十分な表現の目標を明らかにすることができたこの方法を、極端に押した。

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Protocol

1サンプル採取

  1. ピペッティングにより半接着性のシュナイダー2細胞、(平均して1〜5×10 6細胞)を、外し、遠心分離(1分間100×g)で、それらを収穫。 in vitroで培養された接着細胞の場合には、標準的な条件下でそれらをトリプシン処理、または直接細胞スクレーパーの助けによって、RNA抽出試薬の好都合な量にプレートからそれらを集める。
  2. 胚のコレクションのために、フライケージにショウジョウバエ株を成長し、胚は産卵のプレート上に蓄積してみましょう。蒸留水(のdH 2 O)中の絵筆によって胚を拭き取り、ふるいフィルタリングによって破片を廃棄し、バイアル48内の胚を洗浄し、回復。
  3. 代替手法として、手動で組織/器官を解剖。可視ように解剖針又は鉗子を用いて、実体顕微鏡(20倍倍率)下でリン酸緩衝生理食塩水(PBS)中にショウジョウバエ腹部から精巣(piRNAの分析のための優先的なシステム)を単離サリバン 49にualized。
  4. 杵は、RNA抽出試薬の0.5容量の中毒の際にサンプルを均質化する。

2 RNA抽出/分析

  1. 続いて、製造者の指示は、市販の試薬 ​​を介してRNAの単離を行う。 注意!RNA抽出剤は、通常、有毒で腐食剤である。または、次のように、RNA単離のための50のプロテイナーゼKベースのプロトコルを適用します。
    1. ストップ·ミックスを400μlにサンプルを希釈し、15分間RTでインキュベートする。
    2. クロロホルム:イソアミルアルコールおよびクロロホルム抽出およびエタノール(EtOH)沈殿/洗浄により、標準的なフェノールによる水溶性成分を回収。空気のサンプルを乾燥し、ジエチルピロカーボネート()内に再懸濁し、二重(DD)、H 2 Oを蒸留-処置
  2. 紫外線分光光度測定によってRNA濃度を評価する。また、RNAの純度が2.0に近い、高い浅を確保260上のED / 280読書。
  3. 次のように変性アガロースゲル上でRNA調製を確認します。
    1. きれいなビーカーに、連続撹拌下で、DEPC-のddH 2 O 82 mlのアガロース1.2gを溶解する。完全に溶解するまで煮る。
    2. ゲル溶液を冷却して;温度が到達したときに60℃で10倍4 -モルホリンプロパンスルホン酸の10ミリリットルを追加(MOPS)1X最終濃度(FC)にバッファリングし、3%のFCへの37%ホルムアルデヒドの8ミリリットル。 注意!ホルムアルデヒドは発がん性物質である。
    3. 水平電気泳動セル内にゲルを注ぐ。ゲルは、少なくとも1時間、フードの下で固化させます。固化後、M​​OPS 1Xにジェルを沈める。
    4. RNAサンプルおよびラダーを1μgのアリコート2μgの(正確な評価が望まれるときにRNAマーカーを使用します)。 RNAにアガロースローディング色素(ALD)の3容量を追加し、ラダーする。氷上で5分、すぐに涼しい70℃で加熱する。 カリフォルニア州UTION!ALDの内容(エチジウムブロマイドおよびホルムアミド、マテリアルを参照)は、それぞれ、変異原と腐食性である。
    5. サンプルをロードし、時折バッファのリサイクルで約1時間、50Vでゲルを実行します。 UV視覚化またはゲルイメージングによるRNA分画パターンを確認してください。 28Sおよび18SのrRNAおよびtRNAのに対応した離散的なバンドを認識します( 図1を参照)。
  4. -80℃で、ノーザンアッセイまたはストアRNAに進​​みます。

3変性アクリルアミドゲルの準備

  1. この分画工程(プレートサイズ約8cm×9センチ、櫛の厚さ0.75ミリメートル)のための小さな縦型電気泳動装置を使用してください。
  2. 鋳造フレームで一緒にきれいなガラスを組み立てます。
  3. MOPS 1X、7 M尿素溶液:10%アクリルアミド/ビスアクリルアミドの10ミリリットル(1〜19)を準備します。すぐに注ぐ前、10%の過硫酸アンモニウムとTEMED10μlを100μlのを追加し、迅速に溶液を混合。 注意!アクリルアミドは神経毒性や発がん性物質である。
  4. ガラス板の間にゲルを注ぎ、泡を避けるために、慎重によくコームを挿入します。ゲルは、使用前に少なくとも45分間RTで重合しましょう​​。別の方法として、ゲル、O / N、水に浸したろ紙に包み、サランラップで密封して保管してください。

4。サンプル調製

  1. 各サンプルの全RNAのアリコート0.5〜20μgの。ボリューム3-4μlのを超えた場合、真空は、サンプルを乾燥する。
  2. サイズ決定のために、マーカーとして(調製のためのセクション4.3および4.4を参照)、サンプルと平行に放射性標識された低域のはしごの一部(20〜30 CPS)を実行します。ステップ4.5で説明したように、試料と平行して、それを扱う。
  3. ラダー10bpのステップラダー0.1μgのを使用して、リン酸正反応を設定します。 30分間37℃でインキュベートし、20mMのFCにエチレンジアミン四酢酸(EDTA)を添加することによって反応を停止させる。
  4. エタノール沈殿/洗浄、空気乾燥によって精製し、のddH 2 O(約100μl)中に再懸濁。 注意!32 Pが放射線源である。
  5. 各試料にアクリルアミド青色色素(ABD)、等量のを追加します。 5分間80℃で加熱することにより変性させ、積載。 注意まで、氷上でクールホルムアミド(ABDの内容は)腐食性である。

5。電気泳動分画

  1. キャスティング支持体からガラスプレートを取り外し、適切に電気泳動セルでそれらを組み立てる。十分なランニングバッファー(RB)との内側と外側の両方のチャンバーを埋める。
  2. ゆっくりとコームを削除し、10分間、200Vでゲルを事前に実行します。サンプルをロードする前に、注射器を介して、いくつかのRB潮吹きによってウェルから尿素預金を洗い流す。
  3. 各ウェルの底に段差4.5から慎重に層別サンプルに平らなヒントを参考にしてください。反転実行を回避するために、アノードとカソードの接続を確認してください。サンプルを5分間、100Vでゲルを入力した後、私200 Vに電圧をncrease
  4. 約7cmの分別の長さのために、45分、長い目で見れば十分です。ゲルをオーバーフローするブロモフェノールブルー(ABDト​​ラッキング顔料)は避けてください。
  5. オプションのステップとして、臭化エチジウム(EtBrを)染色によって分画し、長いRNAをゲル上、可視化:
    1. ゲルの上部から徒歩2センチカットし、簡単にのddH 2 Oのスライスをすすぐ
    2. RB、EtBrを0.5 / mlのFC緩やかなshackingで15分間、室温でゲルスライスをインキュベートする。
    3. RBで15分間ゲルを脱色、UV照射またはゲルイメージングによって長時間のrRNAを可視化する。 RNAのロードと品質を確認してください(パネル7、 図1を参照)。 注意!ジウムブロマイドは変異原である。
  6. 一方、小さなRNA種を含有するゲルの下部をブロッティング進みます。

6ジェルブロッティング

  1. 6ブロッティング領域に合わせて吸い取り紙の作品や荷を下ろすと同等の部分をカットd個のナイロン膜。紙シート、膜とRB 2ブロッティングパッドを湿らせます。完全に繰り返しRBでそれらを絞ることによって、パッドを浸すようにしてください。
  2. 装置からゲルを取り出し、へらの平均​​によって眼鏡を開きます。井戸を除去するクリーンなカッターを使用してください。ゲル上に湿ったワットマン紙を置き、静かに持ち上げます。
  3. ゲルの自由面にナイロン膜を配置します。サンプルの負荷に応じてフィルタを配向するコーナーをマークします。 「サンドイッチ」(3紙片各辺)を完了する。任意の可能な気泡を除去するために、ブロット面にプラスチック製の棒を振る。
  4. 2ブロッティングパッド間ブロットを置き、その後ブロッティングカセット内。 (ナイロンメンブレンをゲルと正の末端の間滞在する必要があります)ブロッティングモジュール内にカセットを組み立て、RBで室内を満たし、正しい方向を確認してください。
  5. 20分間、20Vで転送します。注:10分ブロッティングモジュールとrを開いた後、均質な条件を確保するために転送が完了する前に、180°のサンドイッチをotate。

7。メンブレン架橋

  1. 新鮮な架橋溶液(XLS)の6ミリリットルを用意してください。 XLSを吸い取り紙10cmの×10センチメートル(ナイロン膜よりも大きい)部分を飽和させる。 注意!塩酸(XLSの構成要素)は非常に腐食性である。
  2. ブロットを解体し、湿った3MMろ紙上の膜を配置します。注:RNAが飽和紙に直接接触してはいけません。 2枚のガラス板との間にフィルタや紙を置き、サラン·ラップで包む。
  3. のddH 2 O洗浄を2時間60℃で膜を加熱する。 -20℃で保存してくださいまたはハイブリダイゼーションに進みます。

8。メンブレンプレハイ

  1. RNA負荷が(オプションのステップ5.5)をチェックされている場合は、直接ハイブリダイゼーションに進みます。さもないと、プローブのクロスhybridizatioを避けるために、ナイロンフィルターの上部から離れて1cmに切る長いRNAを分画しするためのナノ秒。
  2. 37℃でのハイブリダイゼーション溶液(HS)を10mlの予熱。 5分間、95℃でのサケ精子1mgを変性させ、氷上でクールでHSに追加する。
  3. ハイブリダイゼーションオーブンで回転下で、少なくとも1時間、37℃でのHSでフィルタをインキュベートする。フィルターのRNA側はHSに直面していることを確認してください。

9。プローブ合成

  1. 4.3で説明したように、特定のアンチセンスオリゴヌクレオチド10pmolの上のリン正反応を設定します。
  2. (エタノール沈殿によっても、または)、トリス-EDTA-NaClを(TEN)の5容量を反応にバッファリングし、G-25セファデックスカラム上でのゲル排除クロマトグラフィーによる取り込まれなかったヌクレオチドから標識されたプライマーを浄化追加します。プローブの活性は、液体シンチレーションカウンターにより評価することができる。

10メンブレンハイブリダイゼーション

  1. 新鮮な10ミリリットルの分量(上記のように調製し、補完)で排気し、HSを交換してください。でプローブを加熱95℃で10分間、氷上でクールで小説HSに追加する。 37℃ONでフィルターをインキュベートする。

11膜洗浄

  1. ハイブリダイゼーション溶液を回収し、放射能遮蔽ボックスに-20℃で保管してください。
  2. 洗浄緩衝液(WB)でフィルタをすすぎ、室温で10分間、それを徹底的に洗ってください。
  3. フィルターコーナーに残留放射能をチェックするためにガイガーミュラー検出器を使用してください。背景放射は約5 cpsです場合には、博覧会、膜に進みます。

12信号検出

  1. オートラジオグラフィーフィルム上または分子イメージャ画面をONにフィルタを公開します。写真処理やデジタル変換した信号を明​​らかにした。
  2. 専用の定量化ソフトウェア(ImageJのかOptiquant)によるバンド強度を分析します。

13メンブレンストリップ

  1. 剥離液の沸騰の500mlに浸し、膜を一次信号を除去するために、、次いで1分間RTでインキュベートする。小説(プレ)ハイブリダイゼーションに進んで、-20℃でのフィルターを格納します。

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Representative Results

全体的な手順テキストで説明し、 図1に概略的に表現さに従うことによって、私たちは異なる起源の複雑なRNAサンプルから低分子RNAの発現を評価した。 (:アガロースゲル分画変性任意の工程)と、二重にロードされ、図1に示す実験では、RNAは、整合性をチェックプロテイナーゼK抽出によるショウジョウバエシュナイダー2細胞から単離した。ゲルの半分は、中性膜上にブロットし、そして化学的に架橋されたEDCにより;後半(5μJ/ cm 2と1.2×10)後、UV架橋し、正に帯電したナイロンフィルター上に移した。 DMEL-miR279ファミリーに属する2つのマイクロRNAの内因性発現が(DMEL-miR279自身とDMEL-miR286 15)は、両方の条件で検証した。改良された手順(ENB)が標準のもの(SNB)に対するより高い感度敬意を保証します。

図2および図3で強調表示されます。実験的な根拠は上記と同じです。ここに私たちはのpiRNAのノーザンブロットのオートラジオグラフィー検出の代表的結果を報告し、大人飛ぶ精巣から抽出した全RNAの滴定に沿ってrasi4。 RNA0.5μgのがロードされたときにENBは、すでに特定のバンドを検出することを可能にする。定量化はさておき、信号が比例用量/応答比は検出の直線範囲内にあることを示す、分画されたRNAの量と共に増加する方法を示しています。下のパネルは、SNBに比べて、この方法の改良された感度を批准。この場合、検出可能なシグナルは、少なくともSNBのためのRNAの10μgを電気泳動分画の際に得られる。

図3に報告されているように、同様の結果は、<、、例えば 、異なる非コードRNA種を用いて得られた5S rRNAをしている/強い>。

図1
全体的なノーザンブロット法の1模式図 。主な処理手順は、記載されていると次第に番号が付けられています。 ショウジョウバエシュナイダー2細胞(パネル1)からのRNAの分離、電気泳動(パネル2)、転送(パネル3)およびハイブリダイゼーション(:結果は同じ条件で行われる強化されたノーザンブロット(ENB)および標準ノーザンブロット(SNB)との間で比較され、パネル5)。 ENBは、(標的RNAの5 '末端と膜との間の共有結合を確立するニュートラルフィルター(パネル3、膜の左半分)およびEDC系架橋(パネル4)が必要です。この報告書に記載されて改良された手順を指し、パネル4ピンクドット)。 SNBに、RNAの架橋は、正に帯電したナイロに(パネル4)UV処理することにより得られるnは、膜(パネル3は、膜の右半分)。それはまた、SNBとENB手続きとの違いに応答するので、5秒、RNAの特定の信号は、比較条件の校正器ではありません。このように、標識された5 'の(10 CPSに相当)の量は、(ポイント4.3およびプロトコルの4.4を参照)、50ヌクレオチド長、スクランブルオリゴヌクレオチド(参照「スパイク」として機能するように、電気泳動の前に各サンプルに加え、パネル7)。ローディングも長いのrRNA(プロトコルの点5.5を参照)の上にゲルのEtBr染色によって評価することができる。 L =ラダー。 FV =正面図、LV =側面図、HV =水平ビュー。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図2
図2:比較例rasi4式のativeノーザンブロット解析。精巣特異的のpiRNA rasi4の内因性レベルは、強化された(ENB)または標準(SNB)ノーザンブロットによって明らかにされている、大人のショウジョウバエの精巣から抽出した(各レーンの上に示されている)全RNAの量を増加に対して実行、または全腹部から(ABD)。各方法論については、さておきヒストグラムローディングコントロール」のスパイク」と同量rasi4尊敬の相対量を報告している。二つの方法から定量化は、ゲルの下方に配置された決定的なグラフに結合されます。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図3
5秒rの図3の比較ノーザンブロット解析RNAの発現が。ポジティブ対照および実験のキャリブレーションとして、以前の分析では、5S rRNAのに拡張された。詳細は、 図2のように。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

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Discussion

RNAは神経発生を調節を通して絡み合う高度化の感謝を連続的に増加しているが、神経幹細胞生物学、神経分化/機能統合、神経病理および癌の発生に影響を与えるRNAに基づく回路網の機構影響は未踏のまま。 ショウジョウバエは、短い非コードRNAおよび転写因子が主要な分子の選手と見なされている未踏細胞経路を解明するために尽力キイロとしての王国を通して、このようなネットワークの維持は、遺伝的システムの潜在的になります。このビューでは、候補小さなRNA発現レベルのプロファイリングは正確な機能解析への準備研究です。例として、ノーザンブロットアッセイの改良版を通じて達成、DMEL-miR279が生体内で行列式GCM /グライド運命を調節する私たちの最近のデモから来ている発現解析のためのツール。

51年の初期の開発以来= "jove_content">、NBはRNA分析用の参照方法と考えられてきた。このアッセイのいくつかの本質的な限界をもかかわらず、信号の定量化とフォーマットやエラーの可能性を多重化することは困難変換など、RNA分子生物学における最近の進歩は、小さなリボ核酸の内因性発現をアッセイするための「迅速でクリーンな」システムと、この従来の技術を再発見した酸またはゲイン - または機能喪失のアプローチの有効性を検証するため。アプローチは調節RNA 52の絶えず新しいプロパティの特徴づけにおける関連性のために最前線に残っているのに対し、パラダイムのインスタンスとして、ノーザン分析は、マイクロRNAの最初の発見を基に産む。

ここで説明する変異体によるRNAの化学架橋に対する感受性の増大に基づいています。私たちbelievethe方法はまだよくショウジョウバエ 、(b)に採用されているそれはRNA標的の検出41,43の平均10〜30倍の改善と少量の試料(1μg未 ​​満)から可能なプロファイリングRNA発現を作るので、私たちは私たちの条件で得られたUT悪用、重要な発見が52をもたらした( 図図2および3)。

RNAの完全性、一貫性および再現性のある結果を得るために重要な問題となっている。 RNA操作は、抽出とロードの間に発生する可能性のサンプルの分解を制限するために正確さと迅速性を必要とする。この目的では、すべてのソリューションは、RNase活性を回避するために(DEPC)(オートクレーブした後、37℃で0.1%のDEPCの存在下での2時間のインキュベーションと)は、使用前に処理diethylpyrocarbonate-にする必要があります。溶体化処理は、溶媒としてDEPC水を使用するより良い結果の尊重を保証します。すべての機器は、同様のRNase特異的表面汚染除去剤による洗浄の後、DEPCのddH 2 Oでリンスされます。

例えば、rasi4、 図2.)またはRNA精製は(新鮮なサンプルで実施されていない場合、たとえば、組織ストレージに保存試薬)。経験から、安定化されたサンプルからのRNAの単離を大幅に厳しい結果と、より劇的な抽出条件が必要であった。標準的な条件では、記載されプロテイナーゼKベースの方法は、同様に良質の準備を保証する(重要な例は図1.に表されている)が、ストレージ·試薬中で保存サンプルのための最適な選択ではありません。

この手順は、小さなRNAを特異的に検出することを目指しているので最終的に、専用のカラム精製ベースのキットであっても、第かかわらず、直接の小さなRNA単離のために使用することができるRNAの完全性を検証することが困難になっている。上記のRNAの完全性制御のための古典的なゲルベースの​​手順の代わりに、RNAの質は、核酸パターンのオンチップ小型化分析のための機器により評価することができる。

バッファ選択:MOPS-NaOH緩衝液(pH7)を強化ノーザンゲル電気泳動およびブロッティングの両方の優先バッファとして提案された。また、十分に実験でトリ​​ス - ホウ酸-EDTA(TBE)緩衝液を使用していました。トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンの求核アミン基の存在は、それ自体を加水分解し、治療中にDEPCを不活性化するので、この場合には、それはDEPC処理水の代わりに、治療TBE緩衝液中にすでに準備トリスを溶解することをお勧めします。

電気泳動ファイル名を指定して実行ブロッティング:ゲルを事前実行すると、過剰な過硫酸塩を除去し、hyperfocusingを排除するために不可欠である。前の実行パラメータが速すぎるelectrophoを避け、分別時にも維持されるべきである網状赤血球ラン。ロードする前に、内部バッファを噴出することにより、井戸からの可能な尿素の堆積物を除去するようにしてください。これは、信号検出中に解決オートラジオグラフィーのバンドを生成し、サンプルスピルオーバーや保証、正確なRNAの層別化が制限されます。任意の中性ナイロン膜は、核酸導入のための支持体として使用することができる。指定された条件に複数の20〜30分のためのRNAをブロットしないでください。

架橋:EDCベースの化学的架橋は、この強化されたノーザンブロットバージョンの重要な方法論的進歩を示す。 RNA 5'mono-リン酸基およびナイロン一級アミンとの間の共有境界によって中立面に短いRNA種を架橋する可能性は、ハイブリダイゼーションに利用可能な塩基の大半を残す。これは、従来の架橋に10-20xrespectによる感度を向上させます。これは、適切な膜の飽和のために十分な量で、各ブロッティングのために架橋溶液の新鮮な量を用意することが重要である。

ハイブリダイゼーションおよび洗浄:プローブは、好ましくは、新鮮にラベル付けする必要があります。比活性(組み込まれた放射性標識ヌクレオチドの特異的活性及び量にもハイブリダイゼーションのために利用可能なプローブの量に依存した)標的検出の感度を決定するプローブ。 CI /ミリモルを使用する場合は[γ-32 P] ATP 3000の比活性を有する、5の100%の標識化のための10 6 / pmolで'末端が期待されている。

ハイブリダイゼーション溶液を回収して再利用することができるにより32 P崩壊にあることを考慮すると、約14日の活動の半分をプローブ。

、膜の中立性に、低バックグラウンドノイズは、ハイブリダイゼーションの際に期待されている。よりストリンジェントな洗浄条件が必要な場合は、漸進的に(0.2×SSPEまで)洗浄緩衝液のイオン強度を下げるか(SDS 0.5%まで)イオン性界面活性剤の量の増加を追加するか、または37°Cまで洗浄温度を上昇させる。

RNAサイズ測定が必要な場合にノーザンブロット分析が不可欠である。このアッセイは、蛍光ベースのqPCRの精度を欠いていても小さなRNAの推定に近づき、利点が標的RNAの検出の前に固有のステップとして、変性分別/ブロッティングおよびプローブに依存するハイブリダイゼーションを使用することから導出する。その結果、サンプルから特定の信号の啓示は、直接的であり、専用の市販のキットを使用することを暗示する酵素処理/変換/増幅の追加の工程を必要としない。 RNAレベルを定量化し、単一の膜上の複数のサンプル間で比較することができる。したがってNorthernのブロットは、一般のqPCRデータのための厳格な検証として使用される。具体的な実験要件によって促され、この方法は、RNAの限られた量( 図2および図3参照は、そのようにしても、両方の感度、解像度のレベルで、最後の年の間に改善されている成功した分析のために必要とされる。

私たちが提示されたプロトコルは、材料が限られた量で提供され、特に、広範囲の用途に適合させることができる。 RNAサンプルの生物学的供給源は、不均一であることができる。限りショウジョウバエに関しては 、胚または他の発達段階が適切であるだけでなく、手動で切開した組織または器官、個体の細胞を選別、単離cytotypesまたは細胞培養物。

さらに、マイクロRNAが、細胞とRNAを介した遺伝子発現制御の分野での研究の主要な対象において短い調節RNAの最も豊富なクラスであっても、そうではありませconsは何セルラー非コードRNAの唯一の家族をtitute。小さ ​​なRNAの多くのクラスターが( 例えば 、内在性siRNAはpiRNAは、のsnoRNA、植物tasiRNAs)王国全体に機能し、それらのほとんどは、一般的に前駆体分子のエンド-リボ核酸分解処理に由来、遊離の5 '末端(未修正)から特徴付けられる。この機能は、RNAの大きさがより長いRNAを分析する際、同様に考慮しなければならないとしても、厳密に化学的架橋に基づいて、特定の改善された方法論を適用するために必要な固有の構造的必要条件を構成する。 図2では、私たちは、貧困層や特定の発現レベルの条件では(のPiwi相互作用RNAまたはpiRNAは。)強化された感度を比較的rasi4 54のレベルの生殖系列特異的な低分子RNAのクラスのメンバーを検出するノーザンブロット解析を報告この方法の特に報告されたプロトコルをさらに櫛によって改善することができることを考慮すると、成功した結果を是認することができ既に文献55,56に記載されている他の実用的な実装でそれをining。

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Acknowledgements

この作品は、研究所国立デ·ラ·サンテら·デ·ラ·ルシェルシュMédicaleによってサポートされていました、センター国立·デ·ラ·ルシェルシュ科学研究、大学·デストラスブール、HOPITALデストラスブール、協会注ぐラ·ルシェルシュシュルルがん、研究所国立デュがん、アジャンス国立·デ·ラ·ルシェルシュ·地域アルザス。

ピエトロLANEVEはラ·ルシェルシュMédicaleを注ぐ財団によってサポートされています。現在は、イスティトゥーイタリアーノTecnologia(IIT)フェローシップの受信者である。出版費用はNeurexネットワークによってサポートされている(TriNeuron - プログラムINTERREG IVオーバーライン)

Materials

Name Company Catalog Number Comments
FINAL COMPOSITION/NAME COMPANY CATALOGUE (Stock) COMMENTS
GENERAL REQUIREMENT
Centrifuge, 5418 Eppendorf 5418 000.017
Decontaminant, RNase Away Sigma-Aldrich 83931 Apply on glass/plasticware, wipe and rinse
RNase inhibitor, DEPC Sigma-Aldrich D5758 Hazardous //// 1609-47-8
SAMPLE PREPARATION
Stereo Microscope, M60 Leica 
1X PBS Buffer
137 mM NaCl Sigma-Aldrich S3014 7647-14-5  
2.7 mM KCl Sigma-Aldrich P9541 7447-40-7 
10 mM Na2HPO4 Sigma-Aldrich S3264 7558-79-4 
1.8 mM KH2PO4 Sigma-Aldrich P9791 7778-77-0 
RNA EXTRACTION/ANALYSIS
UV-Vis Spectrophotometer Thermo Scientific Nanodrop 2000
Gel Imager, ChemiDoc XRS+ Biorad 170-8265
Horizontal Electrophoresys, Mini-Sub Cell GT BioRad 170-4487EDU
RNA extraction reagent, TRIzol Reagent Life Technologies 15596026 Hazardous
PCA (25:24:1), 1:1 for extraction Sigma-Aldrich 77617 136112-00-0
Chlorophorm, 1:1 for extraction Sigma-Aldrich C2432 67-66-3  
EtOH, 2.5 vol. for precipitation, 70% for washing Sigma-Aldrich 59844 64-17-5 
Gene Ruler 1Kb DNA Ladder Thermo Scientific SM0311
Stop Mix
300 mM NaOAc, pH 5.5 Sigma-Aldrich S2889 127-09-3
1x RSB Solution
2% sodium dodecyl sulfate (SDS) Sigma-Aldrich 71736 Never cool down SDS to avoid  precipitation //// 151-21-3
2 mg/ml Proteinase K Roche Applied Science 0-3115828001 EC 3.4.21.64 9
10X Reticulocyte Standard Buffer (RSB)
100 mM Tris-Cl, pH 7.4 Sigma-Aldrich T5941 1185-53-1  
100 mM NaCl Sigma-Aldrich S3014 7647-14-5  
30 mM MgCl2 Sigma-Aldrich M8266 7786-30-3
Denaturing Agarose Gel
1.2% Agarose Sigma-Aldrich A9539 Let the gel solidify for at least 1 hr //// 9012-36-2
10X MOPS Buffer
0.2 M MOPS sodium salt, pH 7 Sigma-Aldrich M9381 Do not confuse MOPS sodium salt with MOPS //// 71119-22-7
Agarose Loading Dye
1x MOPS Buffer
3% formaldehyde Sigma-Aldrich F8775 Hazardous //// 50-00-0
50% formamide Sigma-Aldrich 47670 Hazardous //// 75-12-7
Ethidium bromide (EtBr) 30 μg/ml Sigma-Aldrich E1510 Hazardous //// 1239-45-8
Bromophenol blue  Sigma-Aldrich B0126 115-39-9 
SMALL RNA FRACTIONATION
Flat gel loading tips Life Technologies LC1002
Savant SpeedVac Concentrator Thermo Scientific  DNA120
Vertical Electrophoresis, Mini-PROTEAN Tetra Cell  Biorad 165-8000
Denaturing Acrylamide Gel
10% acrylamide/bis-acrylamide (19:1) Sigma-Aldrich A3449 Hazardous. Let the gel polymerize for 45 min before use
1x TBE Buffer (or 1x MOPS Buffer)
7 M urea Sigma-Aldrich U6504 57-13-6
0.1% ammonium persulfate Sigma-Aldrich 215589 7727-54-0 
0.1% TEMED Sigma-Aldrich T9281 110-18-9
Gene Ruler Ultra Low Range DNA Ladder (10 bp-step) Thermo Scientific SM1211 Label 0.1 μg, as described in the "probe labeling" reaction
Acrylamide Blue Dye 
50% formamide Sigma-Aldrich 47670 Hazardous //// 75-12-7
Bromophenol blue Sigma-Aldrich B0126 115-39-9 
Running Buffer (RB)
1x MOPS Buffer 
Alternative RB: 1x TBE Buffer
1x TBE Buffer
5X TBE
445 mM Tris-base Sigma-Aldrich T1503 77-86-1 
445 mM boric acid Sigma-Aldrich B7901 10043-35-3
20 mM EDTA Sigma-Aldrich EDS 60-00-4  
Gel Staining Solution
Ethidium bromide 0.5 μg/ml Sigma-Aldrich E1510 Hazardous //// 1239-45-8
1x RB Stain for 15 min with EtBr, destain for 15 min w/o EtBr
BLOTTING
3MM Whatman paper Sigma-Aldrich Z270849
Neutral Nylon Membrane, Hybond NX GE Healthcare Life Science RPN203T Photosensitive
CROSSLINKING
Crosslinking Solution (XLS)
1% 1-methylimidazole (v/v) Sigma-Aldrich 336092 Always prepare a fresh aliquot of XLS //// 616-47-7
12.5 mM HCl Sigma-Aldrich H1758 Hazardous //// 7647-01-0
3.1% EDC (w/v) Sigma-Aldrich 3450 25952-53-8  
(PRE)-HYBRIDIZATION
Liquid Scintillation Counter  Beckmann LS 6500
Sheared Salmon Sperm, 0.1 mg/ml  Life Technologies AM9680
rasi4 anti-sense probe 5' CGGUGUUCGACAGUUCCUCGGG -3'
5s-rRNA anti-sense probe 5'-CAACACGCGGTGTTCCCAAGCCG-3'
Dmel-miR279 anti-sense probe 5'-TTAATGAGTGTGGATCTAGTCA-3'
Dmel-miR286 anti-sense probe 5'-AGCACGAGTGTTCGGTCTAGTCA-3'
Purification Kit, Illustra MicroSpin G-25 Columns GE Healthcare Life Science 27-5325-01
(Pre)-Hybridization Solution (HS)
0.5% SDS Sigma-Aldrich 71736 151-21-3 
5x Denhardt's Solution
20X SSPE
3.6 M NaCl Sigma-Aldrich S3014 7647-14-5  
0.2 M sodium phosphate Sigma-Aldrich 342483 7601-54-9  
20 mM EDTA (pH 8.0) Sigma-Aldrich EDS  60-00-4  
50x Denhardt's Solution
1% Ficoll 400 (w/v) Sigma-Aldrich F2637 26873-85-8
1% Polyvinylpyrrolidone Sigma-Aldrich PVP40 9003-39-8
1% BSA Sigma-Aldrich A7906 9048-46-8  
1X TEN Buffer
10 mM Tris-Cl (pH 8.0) Sigma-Aldrich T1503 77-86-1 
100 mM NaCl Sigma-Aldrich S3014 7647-14-5  
1 mM EDTA (pH 8.0) Sigma-Aldrich EDS 60-00-4  
Probe Labelling
0.4 μM oligonucleotide
1.5 μl Ci/μl [γ-32P] ATP Perkin Elmer NEG002A Hazardous //// 51963-61-2
1x T4 Polynucleotide Kinase Buffer Biolabs B0201
T4 Polynucleotide Kinase 0.5 units/μl Biolabs M0201 EC 2.7.1.78
WASHING
Geiger Mueller Detectors Canberra Industries MCB2/CPS – EM77021
Washing Buffer (WB), 2x SSPE
Stringent Washing Buffers
0.2x SSPE
2x SSPE, 0.5% SDS
0.2x SSPE, 0.5% SDS
SIGNAL DETECTION
PharosFX Plus System Biorad 170-9460
Image J Freely available
Quantity One Biorad
X-ray films , BioMax XAR Sigma-Aldrich F5888 Photosensitive
Developer for X-ray films Sigma-Aldrich P7042
Fixer for X-ray films Sigma-Aldrich P7167
STRIPPING
Stripping Solution
10 mM Tris-HCl pH 8.8 Sigma-Aldrich T1503 77-86-1 
5 mM EDTA Sigma-Aldrich EDS 60-00-4  
0.1% SDS Sigma-Aldrich 71736 Add SDS after boiling to avoid foaming //// 151-21-3

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