Combinaison de Microstéréolithographie et Électrofilage à produire des membranes Equipé Niches pour la régénération de la cornée

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Summary

Nous rapportons une technique pour la fabrication de micropoches dans les membranes électrofilées dans lequel étudient le comportement des cellules. Plus précisément, nous décrivons une combinaison de microstéréolithographie électrofilage et pour la production de PLGA (poly (lactide-co-glycolide)), des dispositifs de biomatériaux équipés de micro-caractéristiques de la cornée.

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Ortega, Í., Sefat, F., Deshpande, P., Paterson, T., Ramachandran, C., Ryan, A. J., MacNeil, S., Claeyssens, F. Combination of Microstereolithography and Electrospinning to Produce Membranes Equipped with Niches for Corneal Regeneration. J. Vis. Exp. (91), e51826, doi:10.3791/51826 (2014).

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Abstract

Problèmes de cornée touchent des millions de personnes dans le monde en réduisant leur qualité de vie de manière significative. Maladie de la cornée peut être causée par des maladies telles que Aniridie ou le syndrome de Steven Johnson, ainsi que par des facteurs externes tels que des brûlures chimiques ou de radiations. Les traitements actuels sont (i) l'utilisation de greffes de cornée et (ii) l'utilisation de cellules souches étendu dans le laboratoire et remis sur des supports (par exemple, la membrane amniotique); ces traitements sont relativement efficace, mais malheureusement, ils peuvent échouer au bout de 3-5 ans. Il est nécessaire de concevoir et de fabriquer de nouveaux dispositifs de biomatériaux capables de mimer la cornée en détail l'environnement physiologique où les cellules souches se trouvent dans la cornée. Des cellules souches limbiques sont situés dans le limbe (zone circulaire entre la cornée et la sclère) dans des créneaux spécifiques connus sous le nom de Vogt palissades. Dans ce travail, nous avons développé une nouvelle technologie de plate-forme qui combine deux techniques de fabrication de pointe (microstéréolithographie et electrospinnING) pour la fabrication de membranes qui imitent la cornée dans une certaine mesure du limbe. Nos membranes contiennent micropoches artificiels dont le but est de fournir des cellules de protection comme le Palisades Vogt faire dans l'œil.

Introduction

La cornée, le tissu avasculaire extérieur plus centrale de l'oeil, est l'un des tissus les plus importants impliqués dans une vision. Il existe plusieurs types de cellules qui conservent la fonction de la cornée. La couche supérieure externe de la cornée est composée de cellules épithéliales qui peuvent être d'environ 5-7 couches d'épaisseur 2. Cette couche empêche l'invasion bactérienne dans la cornée et 3 permet l'entrée d'oxygène 4. Il a été rapporté que les cellules souches de l'épithélium de la cornée se trouvent dans des niches ou des cryptes (avec des tailles de 120 à 150 um) dans la région périphérique de la cornée du limbe connu comme 5,6. Comme les cellules souches se divisent, les cellules filles aussi appelées cellules d'amplification transitoire voyagent sur ​​des niches et que la division continue les cellules se déplacent de façon centripète vers l'intérieur et vers le haut résultant dans des cellules différenciées à la région centrale de la cornée 7,8. Ces cellules sont régulièrement effacés avec le clin d'œil exposing nouvelles cellules sous 9.

En plus d'être l'emplacement des cellules souches épithéliales, le limbe joue également un rôle dans le maintien de la conjonctive vascularisée loin de la région de la cornée 10. Dommages au limbe peut être causée par des brûlures thermiques / chimiques, les radiations et aussi les maladies génétiques 10. Lorsque cela se produit, la barrière de la limbe est décomposé en permettant aux cellules de la conjonctive de se déplacer sur la cornée, la vascularisation de la région, causant de la douleur et de la cécité dans certains cas. La condition est connue comme la carence en cellules souches limbiques (LSCD) 10.

Différents substrats naturels ont été rapportés en tant que supports de cellules souches possibles pour aider à la régénération de la cornée. Par exemple, les membranes à base de collagène ont été utilisés par dravidien et al. 11 et Rama et ses collègues 12 ont signalé l'utilisation de fibrine dans une étude de 112 patients. À l'heure actuelle cependant la méthode la plus couramment utilisée de traitementest d'utiliser la membrane amniotique humaine à partir d'une banque de tissus et de la culture des cellules épithéliales limbiques sur sa surface 13,14. Une fois qu'une monocouche est formée, la membrane amniotique est collée cellule vers le haut sur ​​la cornée endommagée, ce qui a toutes les cellules de la conjonctive et de tissus cicatriciels enlevée chirurgicalement de celle-ci avant cette transplantation de cellules 14. La membrane amniotique se dégrade en quelques semaines à quelques mois en laissant les cellules épithéliales attachés à la zone dénudée pour régénérer l'épithélium 15,16. Cette technique a réussi à restaurer la vision mais il ya encore quelques questions pratiques qui restreignent son adoption généralisée cliniquement. Comme la membrane amniotique est un tissu humain, il doit subir un dépistage par les procédures de la banque de tissus de bons avant d'être utilisé pour la transplantation de cellules sur des patients. Ce dépistage ne ​​réduit le risque de transmission de maladies, mais ne peut pas éliminer complètement 17. En plus de cela, il ya eu des rapports de la variabilité de la performance de la membrane amniotique due à la variation des donateurs entre 18,19 et différentes méthodes de traitement 19,20. Parallèlement le faible risque de transmission de maladies, il ya la nécessité de centres de chirurgie d'avoir accès à des banques de tissus bien gérées, ne sont pas disponibles pour tous.

Bien que la membrane amniotique est relativement de succès, il existe un besoin pour le développement de nouvelles alternatives synthétiques biodégradables de support cellulaire pour le traitement des maladies de la cornée. Transporteurs synthétiques seraient surmonter la nécessité de procédures bancaires ainsi que d'éliminer le faible risque de transmission de la maladie et de la variabilité inter-bailleurs de fonds. En ce sens, des matériaux tels que le polyethylene glycol 21,22 et 23,24 PLGA ont été étudiés.

En développant une alternative synthétique de la membrane amniotique humain, il ya aussi la possibilité de concevoir en elle des caractéristiques souhaitables pour aider espérons la survie des cellules cultivées. La inclusion de microcaractéristiques au sein des dispositifs de biomatériaux pour le contrôle spécifique du comportement des cellules est un domaine d'intérêt. De nombreux auteurs ont rapporté des travaux sur le développement des cellules souches artificielles niches 25-30. Ce groupe a récemment rapporté la création d'un PEGDA fibronectine biofunctionalized limbe artificielle micro-usiné pour la livraison des cellules epitheliales limbiques et 22 une méthode pour la fabrication de membranes électrofilées biodégradables contenant des micro-usinés poches pour le support de cellules epitheliales limbiques 31.

Le but de ce travail est de développer une nouvelle technologie de fabrication pour le développement de dispositifs biomatériaux contenant microcaractéristiques qui imitent dans une certaine mesure les micro-environnements dans lesquels les cellules souches se trouvent dans le corps. Nous avons développé une technique qui combine microstéréolithographie et électrofilature qui permet la fabrication de membranes biodégradables microstructurées qui montrent GREAt potentiel pour des applications de régénération tissulaire.

Il est important de remarquer que, bien que dans ce travail de cette technique a été appliquée à la fabrication de plaques pour la régénération de la cornée, la technologie peut être appliquée à la fabrication de dispositifs pour la régénération d'une large gamme de tissus épithéliaux, par exemple la peau, par voie orale épithélium muqueuse, de l'intestin, des voies respiratoires, et de la vessie. Plus précisément, dans cette étude, nous avons mis au point une membrane synthétique biodégradable, qui fonctionne d'une manière similaire à la membrane amniotique pour fournir des cellules de la cornée. Cette membrane contient micropoches de l'ordre de 300 um (plus grand que les cryptes limbiques des Pallisades de Vogt (environ 150 pm)). Enfin, nous avons mis en place un protocole d'emballage qui permet à ces membranes à être conservés à -20 ° C pendant plus de 6 mois sans montrer aucun signe de rupture.

Protocol

Déclaration éthique: Les yeux utilisés dans cette étude ont été utilisés conformément à la Déclaration sur la transparence de la recherche animale:

1 Fabrication de PLGA biodégradables membranes Equipé micropoches

  1. Les échafaudages cycliques ont été créées par une combinaison de techniques Microstéréolithographie électrofilage et 31. En essence, le processus peut être résumé en 2 parties (i) la création de modèles PEGDA par microstéréolithographie et (ii) électrofilature sur les modèles pour la reproduction de la structure sous-jacente PEGDA (dans ce cas un anneau microfabriquée). Ces deux étapes sont décrites en détail ci-dessous (figures 1 et 2).
    1. Fabrication de modèles PEGDA par microstéréolithographie (microSL)
      1. Fabriquer les anneaux à l'aide d'un modèle de couche 2, avec la première couche (L1) étant la base de la structure et de la deuxième couche (L2) présentant des micro-poches 6 Morphologi fer à chevales dans une gamme de tailles 300-500 um. La fabrication d'anneaux PEGDA a récemment été décrit par ce groupe 22.
        1. Créer L1 en dessinant un cercle de 1,2 cm noire en utilisant n'importe quel logiciel de dessin approprié.
        2. Créer L2 de la même manière mais inclure 8 des structures en forme de fer à cheval-blanc 0,5 x 0,35 mm. Distribuer les petites formes en fer à cheval blanc dans la structure de cercle noir.
        3. Enregistrer L1 et L2 au format JPEG.
      2. Dans un flacon en verre foncé, mélanger le polyéthylène glycol diacrylate (PEGDA, Mn = 250 g / mol) avec 1% p / p Camphorquinone, un photo-initiateur, sur un agitateur magnétique pendant 20 min.
      3. Développez le faisceau laser de la microstéréolithographie mis en place au moyen d'un agencement de lentille télescopique et le projeter sur un dispositif de multimirror numérique programmable par ordinateur (kit de démarrage DMD permis aux UV). NOTE: La DMD reflète l'image (dans ce cas un anneau) sur un miroir par une longueur focale lentille de tube de 10 cm. L'image est alors dirigé par l'argent-coated miroir dans un flacon contenant le polymère photodurcissable (PEGDA).
      4. Réglez et nettoyez soigneusement l'optique de l'microstéréolithographie mis en place.
      5. Mettre 300 ul du mélange PEGDA dans un puits d'une plaque de culture tissulaire à 12 puits. Assurez-vous que les puits sont pré-enduites de téflon ou autre matériau anti-adhésif pour un retrait facile de la structure après cuisson.
      6. Allumez le laser bleu (MBL-III 473 nm; 150 mW) et télécharger L1 dans le logiciel de ALP3-base antérieurement installés sur le PC. Irradier la première couche pendant 60 secondes. REMARQUE: ALP3-base est une interface USB qui assure la liaison entre le PC et le dispositif de micro-miroir numérique.
      7. Ajouter au bien 250 pi plus de la PEGDA, télécharger L2 comme décrit ci-dessus et irradier L2 pendant 60 secondes.
      8. Retirez le polymère non durci et laver l'anneau avec de l'isopropanol O / N.
    2. Fabrication de Biodégradable PLGA membranes utilisant électrofilature
      REMARQUE: Les anneaux PEGDA ont été utilisés comme modèles sur qui PLGA a été électrofilé avec le PLGA reproduire la topographie sous-jacente comme il est filé sur ces modèles. Après la filature, la feuille de polymère PLGA a été détachée de la collection. La membrane finale PLGA ne contient pas les anneaux PEGDA qui restaient attachés à la collecteur métallique.
      1. Distribuez les anneaux PEGDA sur une feuille d'aluminium électrolytique (12 cm x 20 cm) pour créer un collecteur de électrofilature statique.
      2. Fixez les anneaux avec du ruban de carbone conducteur. NOTE: Ces bagues, une fois formés peuvent être réutilisés en tant que modèles pour électrofilature.
      3. Préparer la solution de polymère pour la filature. Dissoudre PLGA (50/50 DL-lactide (52% en moles): glycolide (48% mol), 44 kg / mol) dans du dichlorométhane (DCM) à 20% p / p de concentration.
      4. Incorporer O / N avant utilisation.
      5. Place 4 seringues d'insuline (extrémités franches, des aiguilles de 0,8 cm de diamètre intérieur) sur une pompe à seringue. REMARQUE: Quatre seringues assuré électrofilature plus rapide que de travailler avec une seule seringue.
      6. Chargez 2,5 ml de solution de PLGA dans chaque seringue.
      7. Electrospin en utilisant un débit de 30 ul / min et des tensions allant de 12 à 15 kV. Laisser une distance entre les aiguilles et le collecteur de 15 cm.
      8. Electrospin pendant 1 h et 30 min et enfin éplucher soigneusement la feuille électrofilé PLGA du collecteur soutenir les anneaux PEGDA.
      9. Couper les échafaudages électrofilées dans 22 cercles mm de diamètre à l'aide d'un emporte-pièce circulaire et en laissant la structure du noyau placé au centre.

Stockage 2 à long terme de PLGA microfabriqués membranes

Remarque: Les anneaux de PLGA ont été fabriqués et stérilisés par des sociétés externes accrédités; échantillons ont été irradiés à une gamme de dose externe de 25-40 kGy.

  1. Monter la membrane dans un petit récipient (boîte de Pétri en plastique) et le placer dans un sac de qualité médicale.
  2. Utilisez du papier filtre pour créer de petits sacs de filtre pour les desséchants. To créer les sacs, pliez le papier filtre (125 mm de diamètre) et couper le demi-cercle résultant de moitié; puis sceller les extrémités ensemble avec du ruban adhésif.
    1. Remplir trois sacs en papier de filtre avec 1 g de silice orange, cobalt (II), le chlorure, le sulfate de cuivre et (II), respectivement.
    2. Mettre les trois sachets absorbeurs d'humidité à l'intérieur du sac de qualité médicale avec la membrane électrofilé.
  3. Ajouter à la valise une tache six carte indicatrice d'humidité disponible dans le commerce afin de détecter toute accumulation d'humidité au cours de la période de stockage.
  4. Utilisation d'une machine de soudage à chaud sous vide à un vide et sceller le sac.
  5. Envoyer les membranes annulaires à une société externe pour γ-irradiation.
  6. Magasin γ-membranes irradiées PLGA à une large gamme de températures de -20 ° C à 37 ° C dans un environnement humide à l'intérieur d'un incubateur contenant 5% de CO 2.
  7. stockage du message, examiner l'indicateur d'humidité pour confirmer que le niveau d'humidité est au-dessous de 30%.
  8. Usoi microscopie électronique à balayage (MEB) afin d'évaluer l'intégrité des fibres.

Isolement des 3 explants limbiques

Lapin explants limbiques ont été isolés à partir des yeux de lapin (obtenus à partir d'une ferme où les lapins sont élevés pour la consommation).

  1. Désinfecter les yeux de lapin à l'aide d'une solution antiseptique (3%).
  2. Nettoyer les yeux en retirant tout excès de tissu qui entoure la cornée.
  3. Séparer la région limbique (identifiée comme une zone circulaire mince entre la cornée (transparent) et la sclérotique (blanc)) à partir du reste de la cornée à l'aide d'un microscope à dissection.
  4. Coupez-les en segments (environ 1,5 cm de long) sous le microscope de dissection.
  5. Désinfecter les segments du limbe dans une solution antiseptique de 1,5% pendant 1 min.
  6. Couper les segments du limbe en petits morceaux (de 100 à 500 um) avec une lame de scalpel.
  7. Stockez les petits morceaux de tissus dans un milieu de culture (DMEM + Glutamax: Ham's F12 (1: 1), 10% de sérum fœtal bovin, 1 U / ml styloicillin, 100 mg / ml de streptomycine, 2,5 pg / ml d'amphotéricine 10 ng / ml d'EGF, et de 5 ug / ml d'insuline) à 37 ° C et 5% de CO 2 jusqu'à utilisation (pas plus de 60 min).

4. excroissance de cellules limbiques de explants

Lapin explants limbiques ont été placés sur les deux membranes microfabriqués fraîchement filés et des membranes qui étaient emballés sous vide et stockés pendant 6 mois à -20 ° C.

  1. Enduire les échafaudages cycliques avec 15 ul de la colle de fibrine (1: 1 d'un mélange de fibrinogène à partir de plasma humain à une concentration de 18,75 mg / ml et de la thrombine à partir de plasma humain à une concentration de 2,5 U / ml) en utilisant un racleur de cellules pour la diffusion de la fibrine uniformément.
  2. Placer les explants de tissu directement sur les micropoches PLGA en utilisant une aiguille de 25 G et un microscope à dissection.
  3. Ajouter milieux de culture de cellules très doucement pour éviter de détacher les explants.
    1. Changer de support tous les 3 jours (recette de milieux décrits dans la section 3.7) et keep en culture pendant 2 semaines dans un incubateur humidifié à 37 ° C et 5% de CO 2.
  4. Fixer les échantillons avec 3,7% de formaldéhyde tamponnée pendant 10 min suivi par 3 lavages avec du PBS.
  5. Contre-coloration par incubation à 1 ug / ml de 4 ', 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) ou l'iodure de propidium (PI) pendant 10 min à température ambiante.
  6. Laver 3 fois en PBS et stocker les échantillons recouverts de papier d'aluminium.
  7. Image les échantillons à l'aide d'un microscope de fluorescence à des longueurs d'onde de 543 nm et 800 nm (deux photons).

5. Mettre en place des lapins blessés modèles Cornée 3D

  1. Nettoyer et désinfecter les yeux des lapins comme décrit ci-dessus.
  2. Wound les yeux de lapins en les immergeant dans 0,14% d'hydroxyde d'ammonium pendant 5 min.
  3. Rincer les yeux dans du PBS et gratter l'épithélium avec un couteau de sclérotome.
  4. Couper et isoler le bouton de la cornée-scléral à enlever de tissu restant.
  5. Placez les cornées côté épithélial vers le bas surune tasse stérile et remplir avec de l'agar 0,5% made in DMEM.
  6. Une fois réglé, mis les cornées côté épithélial en place, en petites boîtes de Pétri et ajouter milieux de culture (recette ci-dessus) jusqu'à la zone limbique. NOTE: Ne pas couvrir l'ensemble de la cornée; maintenir la culture de l'orgue à l'interface air-liquide.

6 Isolation des explants limbiques et de l'inclusion de Ring échafaudages en lapin modèles Cornée 3D

  1. Enduire les membranes annulaires avec 15 ul de la colle de fibrine (1: 1 d'un mélange de fibrinogène à une concentration de 18,75 mg / ml et de la thrombine à une concentration de 2,5 U / ml) .Utilisez un racleur de cellules comme décrit ci-dessus.
  2. Placer les explants de tissu directement sur les micropoches PLGA en utilisant une aiguille de 25 G et un microscope à dissection.
  3. Placez les anneaux avec les explants de tissus sur les cornées dénudées avec les explants vers le haut et dans les conditions de l'interface air-liquide. (Ces conditions ont été décrites précédemment 22).
  4. Maintenir les modèles de culture d'organes pour4 semaines dans un incubateur humidifié à 37 ° C et 5% CO 2, le changement du support tous les 2 jours.

7 Évaluation de la cornée et la régénération des cellules souches de maintenance

  1. Après 4 semaines, fixer les cornées en utilisant 3,7% de formaldéhyde.
  2. Traiter les cornées pour l'histologie conventionnelle pour produire 6 um sections de paraffine.
  3. Colorer à l'hématoxyline et à l'éosine (H & E).
  4. Par immunocytochimie, déparaffiner les sections dans du xylene (3min) et réhydrater dans 100% d'éthanol (1 min), 70% d'éthanol (1 min), et de l'eau distillée (2 min).
  5. Délimiter les sections à l'aide d'un stylo Dako pour délimiter petites zones et éviter l'utilisation excessive d'anticorps.
    1. Traiter les zones délimitées par la trypsine à 0,05% (100 pi) pendant 20 min (37 ° C).
  6. Bien se laver avec du PBS et ajouter 100 ul de sérum de chèvre 10% (blocage) pendant 1 heure.
  7. Incuber les échantillons avec 100 pi d'anticorps monoclonal de souris cytokeraétain 3 (CK3) et 100 pi de p63 dans le sérum S de 1% chèvre / N à 4 ° C.
  8. Laver avec du PBS et on traite avec 100 pl d'anticorps anti-souris secondaire biotinylé (1: 1000 dans 1% de sérum de chèvre) pendant 1 heure à température ambiante.
  9. Ajouter 100 pi de streptavidine-FITC (1: 100 de sérum de chèvre à 1%) pendant 30 min à température ambiante.
  10. Traiter les échantillons avec du DAPI, comme décrit ci-dessus.
  11. Image les échantillons à l'aide d'un microscope de fluorescence à des longueurs d'onde de 800 nm (deux photons) et 488 nm.

Representative Results

Électrofilées microfabriqué anneaux ont été fabriqués en utilisant une combinaison de microstéréolithographie et électrofilage (figures 1 et 2). PEGDA anneaux de différentes tailles ont été fabriqués en utilisant microstéréolithographie (figure 3); Cette technique permet la fabrication de structures de l'ordre du cm et l'incorporation simultanée de microcaractéristiques. Dans ce cas, les anneaux de diamètres allant de 1,2 à 1,6 cm contenant micropoches de 350-500 um ont été fabriqués (Figure 4).

En ce qui concerne la production, l'emballage et la stérilisation de matériaux pour une utilisation clinique futur, il a été constaté que l'emballage sous vide dans des sacs de qualité médicale améliorée de façon significative la capacité de réaliser un stockage à long terme des membranes de PLGA (figure 5); l'utilisation d'un sac de qualité médicale (PET / feuille d'/ LDPE) ayant une épaisseur de 0,12 mm nous a permis d'atteindre une durée de conservation plus longue. Cela a été étudié par l'envoi membranes à nos collaborateurs en Inde et les membranes ont été stockés pendant une période de plusieurs mois à -20 ° C, à la température ambiante et à 37 ° C dans des conditions humides (délibérément un incubateur humide). figure 5 montre que l'utilisation des conditions délibérément provocatrices de stockage à 37 ° C dans des conditions humides, les membranes sont stables pendant seulement environ 1 mois sous des conditions non emballé sous vide, mais atteint 3 mois de stockage sous des conditions emballés sous vide (figure 5 et tableau 1).

Le tableau 1 montre l'amélioration des conditions de stockage qui peuvent être atteints même dans des conditions choisies pour être propice à l'absorption d'eau et gonflement des fibres si on fait attention au choix de sac utilisé.

Les anneaux en charge excroissance de cellules à partir d'explants limbiques dans différentes conditions (i) des anneaux fraîchement préparés et (ii) des anneaux stockées pendant 6 mois (figure 6). transfert des cellules a été réalisée après 4 semaines quand placing les membranes PLGA sur les modèles 3D blessés. Les cellules ont grandi à partir des explants tissulaires placés sur des membranes créant un nouveau épithélium de la cornée préalablement dénudées (Figure 7). Positifs (cornées sans aucun traitement) et des contrôles négatifs (cornées blessés) ont également été maintenues en culture pendant les mêmes périodes de temps. Les contrôles négatifs ont confirmé l'absence de formation d'un épithélium neuf en l'absence de cellules ajoutées. Immunocytochimie démontré que les cellules en croissance à partir des explants étaient des cellules épithéliales de la cornée, car ils étaient positifs pour la cornée marqueur de différenciation CK3 (Figure 7E).

Figure 1
Figure 1: Schéma de microstéréolithographie mis en place pour la création de sonneries PEGDA.

her.within page = "always"> Figure 2
Figure 2: Schéma de processus électrofilature utilisant des anneaux PEGDA microfabriqués tant que modèles.

Figure 3
Figure 3 (A) montre un exemple d'un capteur statique (feuille d'aluminium par électrolyse d'anneaux PEGDA) pour le filage de membranes PLGA micro-usinés. (B) et (E) afficher différents tapis électrofilées être pelées à partir de capteurs statiques. (C) montre PEGDA modèles de tailles différentes mettant en évidence la souplesse d'utilisation de microstéréolithographie pour la fabrication de la surface sous-jacente. (D) montre une réplique PLGA microfabriqué./files/ftp_upload/51826/51826fig3highres.jpg "target =" _blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4
Figure 4 Image MEB d'un anneau PEGDA avec un microdétail de fer à cheval (A); fort grossissement image MEB d'une poche microfabriquée (B). image en contraste de phase d'un anneau PLGA microdétail de fer à cheval (C); image de contraste de phase à fort grossissement d'une poche microfabriquée (D). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 5
Figure 5 Effet de la température et du temps sur le stockage de vide et non-emballés sous vide PLGA (50/50) des membranes (44 kg / mol) avec des micro-fabriqué des anneaux de plus de 6 mois. intégrité membranaire a été marqué comme fibres entièrement intacts (+++), une partie des fibres de gonflement (++), la fusion de la fibre (+) ou absence de fibres intacts (-). Images MEB et trois desséchants (silice d'orange, de cobalt (II) chlorure et du sulfate de cuivre (II)) ne montrent pas de modifications de l'intégrité ou de l'humidité fibre. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 6
Figure 6 montrant des images de fluorescence de LEC excroissance à partir d'explants limbiques sur fraîchement préparés anneaux biodégradables PLGA (A, B) et sur ​​des anneaux au bout de 6 mois de stockage à -20° C (C, D). D'images (A) et (B) correspondent à des cellules colorées avec du DAPI (bleu) et l'iodure de propidium (rouge), respectivement. Image b est une vue orthogonale d'un z-stack confocale d'un explant placé sur une poche microfabriquée. Images (C) et (D) montrent une coloration positive pour p63 (vert). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 7
La figure 7 (A) montre un modèle de cornée de lapin blessé avec un anneau d'échafaudage et des explants tissulaires situées sur l'échafaudage, qui a été préalablement revêtu avec la colle de fibrine (B) et (C) sont des témoins positifs et négatifs. le contrôle positif est un nouveau rabbin . t cornée et un contrôle négatif de la cornée, où l'épithélium a été volontairement enlevée (le témoin négatif a été également mis en culture pendant 4 semaines) (D) est une image de H & E d'un tissu conçu cornée après 4 semaines de culture; la figure montre le nouvel épithélium multicouche formé par les cellules qui sortent des explants placés sur les niches (E) est une image de immunocytochimie montrant excroissance de cellules à partir d'un explant limbique. noyaux sont colorés au DAPI (bleu) et les cellules montre une coloration positive pour la cytokératine 3, un marqueur de différenciation de la cornée (vert). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

x; "> intégrité de membranes à fibres stockées à 37 ° C humide 64px; "> -
PLGA (50/50)
Jour 0 Mois 1 Mois 2 Mois 3 Mois 4 Mois 5 Mois 6
Non Sous vide +++ - - - - - -
Vacuumed (Sac A) (PE, PA composite) Epaisseur: 0.14 mm +++ + - - - -
Vacuumed (sac B) (PET / feuille / LDPE) Epaisseur: 0,75 mm +++ +++ +++ + - - -

Tableau 1 Effet du vide et de stockage différents sacs sur l'intégrité de PLGA (50/50) des membranes (44 kg / mol) ont examiné plus de 6 mois de stockage. Intégrité membranaire a été marqué comme fibres entièrement intactes (+++), un gonflement de la fibre (++), fusion des fibres (+) ou absence de fibres intacts (-).

Discussion

Cette étude décrit (a) une technique pour la fabrication de membranes électrofilées microcaractéristiques contenant en leur sein, et (b) la préparation de telles membranes pour l'utilisation clinique de l'emballage sous vide, l'irradiation gamma et ensuite le stockage avant l'utilisation. Dans cette application particulière, nous avons mis au point des membranes de PLGA contenant des micro-poches qui imitent les caractéristiques physiques des niches de cellules souches limbiques. Les objectifs de cette étude sont (i) de décrire les méthodes à fournir aux lecteurs les connaissances nécessaires pour concevoir et fabriquer des échafaudages contenant microcaractéristiques pour la recherche sur la contribution des niches de cellules souches pour la régénération des tissus et (ii) de fournir au lecteur une meilleure compréhension de façon à stocker des échafaudages électrofilées pendant de longues périodes de temps.

En termes d'application clinique, le stockage des membranes d'anneau est d'une importance primordiale. Dans ce travail, la dégradation de l'anneau a été étudiée sur une période de 6 mois. La dégradation de l'membranes est entraîné par hydrolyse afin de simplement garder les membranes humidité sans le processus est arrêté. Blackwood et al. Rapporté qu'en faisant varier le rapport de PLA de PGA, la dégradation de la membrane change 32. Cette étude a également montré que, en augmentant la quantité d'AMP, le taux de membranes électrofilées de dégradation in vivo accrue 22. Ici, il a été montré que l'emballage sous vide avec les membranes avec un peu desséchant et les irradiant et en les stockant à basse température pendant 6 mois, il n'y a pas de changement dans l'intégrité de la fibre et de la dégradation. À l'heure actuelle, 6 mois est aussi loin que nous avons étudié avec ces membranes contenant micropoches mais les données de stockage pendant 1 an a été rapporté sur les membranes électrofilées simples à -20 ° C 22 et nous avons maintenant des données inédites pour leur stockage à -20 ° C pour 2 ans sans aucun signe de dégradation. Ainsi, pour le stockage à long terme, il serait recommandé de les stocker à sec à -206, C, mais il est possible de les stocker à la température ambiante, même en Inde pendant au moins 6 mois (peut-être beaucoup plus longue). L'inclusion d'un indicateur d'humidité donne un moyen facile de vérifier que l'emballage a gardé membranes sèches dans ce cas, ils seront aptes à l'emploi.

Transfert des cellules de ces anneaux aux modèles 3D de la cornée a été montré lors de la passation des explants limbiques dans les micropoches. Ce groupe a récemment rapporté le transfert des cellules sur un modèle in vitro de la cornée de lapin en plaçant les explants sur des membranes plates PLGA (membranes sans structures cycliques 24). Utilisation du transfert de cellules de échafaudages microfabriqués présent a été pris un peu plus loin que nous pouvons maintenant localiser précisément explants de tissus dans les microcaractéristiques. La possibilité de placer directement les explants dans les créneaux permet également au chirurgien d'utiliser les membranes directement dans la salle d'opération en évitant la nécessité d'une salle blanche à la première expansion des cellules souches limbiques. Bien que ce morceau de work a été axée sur le développement de dispositifs pour les maladies de la cornée, cette technologie de microfabrication peut également être demandée pour des dispositifs pour de nombreuses autres applications en développement. Les travaux à venir découvrir la fabrication de constructions pour la régénération d'autres tissus tels que la peau et les os.

Alors que la conception et la fabrication initiale des microstructures PEGDA peuvent prendre beaucoup de temps, une fois fabriqué les structures peuvent être réutilisés plusieurs fois sans dégradation. Par conséquent, la fabrication ultérieure de membranes biodégradables PLGA microstructurée par électrofilature peut être effectuée à un taux comparable à la production de «non structurées (') membranes lisses suite à l'assemblage du collecteur. Bien que, dans ce travail, nous avons utilisé microstéréolithographie pour fabriquer des moules, d'autres méthodes de fabrication telles que l'impression en 3D ou de moulage par injection peuvent être également utilisés. En conséquence, le moule sous-jacent peut être fabriqué à partir de polymères ou d'autres métaux au lieu de PEGDA. En tant que tel cette technique est très polyvalent et chercheurs peut facilement adapter la méthode en fonction de leurs propres besoins et des installations.

La maison en microstéréolithographie set-up utilisé dans cette étude ne permettra pas la préparation de constructions avec des caractéristiques moins de 30 microns; ce n'est pas une limitation de l'application de la cornée est décrit ici, mais il pourrait être essentielle dans la conception d'autres modèles. Dans ce cas, d'autres techniques telles que la polymérisation de 2 photons (2PP) pourrait être d'intérêt mais la technique de électrofilature pourrait ne pas permettre la reproduction des structures à l'échelle sub-micronique (ce qui est actuellement à l'étude par notre groupe).

Les étapes critiques dans le processus de fabrication sont (i) d'éviter la surcuisson des modèles PEGDA qui peuvent être contrôlés en ajustant le temps et les quantités de photo-initiateur. (Ii) contrôler les conditions électrofilage tels que la température et l'humidité. (Iii) Le stockage appropriée la electrospumembranes n anneau à l'aide de l'emballage sous vide et desséchants.

En résumé, en plaçant des explants de tissu du limbe dans les microcaractéristiques de la membrane, nous avons montré l'excroissance des cellules des explants sur le créneaux, le transfert des cellules sur une cornée de lapin blessé et après réépithélisation de la cornée. La dégradation des membranes stockés à différentes températures a également été étudié et un protocole de conditionnement qui permet le stockage à long terme de membranes a été mise au point, cette dernière étant indispensable à l'élaboration des membranes pour une utilisation clinique.

Disclosures

Les auteurs n'ont rien à divulguer.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Poly (lactic-co-glycolic acid) Purac PDLG5004
Dichloromethane Sigma Aldrich Or Fisher 270997 Or D/1850/17 >99.8% contains 50-150 ppm amylene stabilizer
Digital Micromirror Device (DMD) Discovery 1100 Controller Board & Starter Kit Texas Instruments 1076N732 (UV)
473 nm Laser Laser 2000 MBL-III 150 mW
Poly (ethylene glycol) diacrylate Sigma Aldrich 475629 Mn = 250 g/mol, 500 ml
DEMEM + Glutamax Fisher 12077549
Ham’s F12 Labtech biosera LMH1236/500
Fetal Bovine Serum Labtech biosera FB-1090/50
EGF R&D 236-EG-200
Insulin Sigma Aldrich 91077C-1G
Amphotericin Sigma Aldrich A2942-100ml
Penicillin/streptomycin Sigma Aldrich P0781-100ml
DAPI Sigma Aldrich 32670
Propidium iodide Sigma Aldrich P4864
Thrombin Sigma Aldrich T9326
Fibrinogen Sigma Aldrich F3879
p63 Sigma Aldrich P3737
CK3 Merck Millipore CLB218
Hematoxylin SLS HHS16-500ML
Eosin Sigma Aldrich HT110232-1L
Medical grade bag (PET/Foil/LDPE) Peelable pouch Riverside Medical Ltd. Derby, UK Foil laminate PET/Foil/LDPE, (12,7,50)
Gamma- irradiation (Sterilization) Applied Sterilisation Technologies (Synergy Health Laboratory Services (SHLS), Abergavenny UK) - external dose range of 25-40 KGy
Silica gel orange Sigma Aldrich 10087
Cobalt (II) chloride Sigma Aldrich 232696
Copper (II) sulfate Sigma-Aldrich C-1297
Six spot humidity indicator card SCC, USA 6HIC200
Vacuum heat seal machine Andrew James UK Ltd, Bowburn, UK VS518
Andrew James Vacuum Sealer rolls 28 cm x 40 meter rolls Andrew James UK Ltd, Bowburn, UK BR2805
Scanning Electron Microscope (SEM) Philips/FEI XL-20 SEM
Confocal Microscope Zeiss LSM 510 META
Videne Antiseptic Solution Ecolab, Swindon, UK 3%

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