मिलकर उच्च दबाव बर्फ़ीली और ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के लिए संयंत्र के ऊतकों के त्वरित रुक प्रतिस्थापन

Biology

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Bobik, K., Dunlap, J. R., Burch-Smith, T. M. Tandem High-pressure Freezing and Quick Freeze Substitution of Plant Tissues for Transmission Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (92), e51844, doi:10.3791/51844 (2014).

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Abstract

1940 ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (मंदिर) जैविक सामग्री के अति उच्च संकल्प छवियों के साथ जीव प्रदान किया गया है के बाद से. फिर भी, क्योंकि यह भी artifact मुक्त नमूनों की तैयारी में अनुभव है कि मांग श्रमसाध्य और समय लेने वाली प्रोटोकॉल का, मंदिर एक उपयोगकर्ता के अनुकूल तकनीक नहीं माना जाता है. मंदिर के लिए पारंपरिक नमूना तैयार सेलुलर संरचनाओं के संरक्षण के लिए रासायनिक fixatives इस्तेमाल किया. उच्च दबाव ठंड जिससे सेलुलर फैटी की अखंडता के लिए हानिकारक है जो बर्फ के गठन, सीमित, बहुत तेजी से ठंडा दरों का उत्पादन करने के लिए उच्च दबाव के तहत जैविक नमूने का cryofixation है. उच्च दबाव ठंड और फ्रीज प्रतिस्थापन वर्तमान में मंदिर के लिए राल वर्गों में उच्चतम गुणवत्ता आकृति विज्ञान के उत्पादन के लिए चुनाव के तरीके. इन विधियों सामान्य रूप से पतली वर्गों के मंदिर के लिए परम्परागत प्रसंस्करण से जुड़े कलाकृतियों को कम. Cryofixation बाद नमूने में जमे हुए पानी तरल के साथ बदल रहा हैकम तापमान पर कार्बनिक विलायक, एक प्रक्रिया फ्रीज प्रतिस्थापन बुलाया. रुक प्रतिस्थापन आमतौर पर समर्पित, महंगे उपकरण में कई दिनों में किया जाता है. हाल ही में एक नवाचार के बजाय हमेशा की तरह दो दिनों की, प्रक्रिया तीन घंटे में पूरा होने की अनुमति देता है. यह आमतौर पर घुसपैठ और सेक्शनिंग पहले epoxy रेजिन में एम्बेड भी शामिल है कि नमूना तैयार करने के कई दिन और उसके बाद है. यहाँ हम संयंत्र नमूना निर्धारण घंटे के भीतर पूरा किया जा करने के लिए सक्षम बनाता है कि उच्च दबाव ठंड और त्वरित फ्रीज प्रतिस्थापन संयोजन एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं. प्रोटोकॉल आसानी से अन्य ऊतकों या जीवों के साथ काम करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता. संयंत्र के ऊतकों क्योंकि पानी की बर्फ से मुक्त ठंड में बाधा कि वातित रिक्त स्थान और पानी से भरे रिक्तिकाएं की उपस्थिति की विशेष चिंता का विषय है. इसके अलावा, रासायनिक निर्धारण की प्रक्रिया के ऊतकों के भीतर गहरे तक रसायनों का प्रवेश impeding सेल दीवारों की वजह से पौधों में विशेष रूप से लंबा है. संयंत्र के ऊतकों इसलिए खास हैंularly चुनौतीपूर्ण, इस प्रोटोकॉल विश्वसनीय है और उच्चतम गुणवत्ता के नमूनों का उत्पादन लेकिन.

Introduction

सेल फैटी की हमारी ज्ञान कुछ नैनोमीटर 1 की श्रेणी में विवरण को हल कर सकते हैं जो इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी, मुख्य रूप से आता. नमूना तैयार करने के लिए समय लेने वाली और श्रमसाध्य प्रोटोकॉल की आवश्यकता है, और व्यवसायी से कुछ विशेषज्ञता की मांग के रूप में संकल्प मंदिर में इतनी शक्तिशाली होने के बावजूद, उपयोगकर्ता के अनुकूल नहीं माना जाता है. नमूने के पारंपरिक निर्धारण राल में एम्बेड और फिर तो भारी धातुओं के साथ दाग रहे हैं कि अति पतली वर्गों का उत्पादन करने के लिए सेक्शनिंग, निर्जलीकरण शामिल है कि आगे की प्रक्रिया से पहले aldehydes और आज़मियम tetroxide का उपयोग जोड़ रखा है. हालांकि, यह रासायनिक निर्धारण अंततः कई सेलुलर डिब्बों 2 को प्रभावित करने वाले झिल्ली प्रोटीन एकत्रीकरण और लिपिड 1 की हानि, और परिवर्तन सहित कलाकृतियों का उत्पादन कर सकते हैं कि जाना जाता है. इन कलाकृतियों को काफी हद तक कमरे के तापमान 3, 4, 5 में निर्धारण और निर्जलीकरण की धीमी दर के लिए जिम्मेदार हैं.

7. HPF एक कम हो जाती है,, 20 डिग्री से पानी की हिमांक कम करती है बर्फ क्रिस्टल की nucleation और विकास धीमा और सेलुलर घटक अनिवार्य रूप से 6 स्थिर रहे हैं तो एक जैविक नमूने में पानी की चिपचिपाहट बढ़ जाती है मिलीसेकेंड में बहुत ही उच्च दबाव (210 एमपीए या 2,100 बार) के तहत तरल नाइट्रोजन की है कि नमूना के तापमान,. जब ठीक से किया HPF सेल फैटी के लिए बड़ी क्षति पैदा कर सकता है कि बड़े बर्फ क्रिस्टल के गठन से बचाता है. HPF जैविक विलेय 7 की विशिष्ट सांद्रता में 100-200 माइक्रोन मोटाई के नमूनों को ठीक करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. HPF, जैसे 1, 7, 8 अंतर्निहित कई भौतिकी पर समीक्षा और सिद्धांत होते हैं.

HPF के बाद, नमूने -90 और के लिए कम तापमान पर (-78.5 डिग्री सेल्सियस incubated हैंआम तौर पर कुछ दिनों के लिए आज़मियम tetroxide तरह तरल जैविक विलायक युक्त रासायनिक fixatives, की उपस्थिति में सी), # 176. इस कम तापमान पर, नमूने में पानी कार्बनिक विलायक, आमतौर पर एसीटोन या मेथनॉल 1, 9 की जगह है. इस प्रकार, इस प्रक्रिया को कहा जाता है फ्रीज प्रतिस्थापन (एफएस). नमूना फिर धीरे धीरे गरम है और इस समय के दौरान आमतौर पर आज़मियम tetroxide और uranyl एसीटेट 9 के साथ, तय हो गई है. कम तापमान पर crosslinking 1 स्थिर रहे हैं कि अणुओं फिक्सिंग का लाभ दिया है. एफएस इसलिए यह सुधार ultrastructural संरक्षण में यह परिणाम विशेष रूप से कमरे के तापमान पर पारंपरिक रासायनिक निर्धारण द्वारा तय की उन की तुलना में बेहतर गुणवत्ता, प्रतिजनकता के बेहतर संरक्षण के नमूनों का उत्पादन और अपार सेलुलर घटकों 10, 11 के नुकसान को कम किया.

अधिकांश एफएस आम तौर पर कई दिनों तक लंबे समय अवधि में किया जाता है. यह विशेष रूप से Tru हैपौधों के नमूने 12, 13, 14 के लिए ई. मैकडॉनल्ड्स और वेब द्वारा विकसित हाल ही में एक प्रोटोकॉल बहुत कुछ घंटे 15 करने के लिए कई दिनों से एफएस के लिए समय कम कर देता है. सुपर त्वरित एफएस में (SQFS) नमूने 90 मिनट में कार्रवाई कर रहे हैं, जबकि उनके त्वरित फ्रीज प्रतिस्थापन (QFS) प्रक्रिया में, एफएस, 3 घंटे से अधिक किया जाता है. इन विधियों द्वारा निर्मित नमूनों की गुणवत्ता पारंपरिक एफएस प्रोटोकॉल से मिले उन लोगों के बराबर है. हम HPF के बाद संयंत्र के नमूने के बहाव के प्रसंस्करण के लिए QFS प्रोटोकॉल को अपनाया है. QFS और SQFS बजाय महंगा व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एफएस मशीनों की आम प्रयोगशाला उपकरणों का उपयोग करें, क्योंकि यह समय है लेकिन यह भी पैसे न केवल बचाने के लिए साबित हो गया है.

संयंत्र के ऊतकों अक्सर मंदिर के लिए तैयार करने के लिए बहुत चुनौती दे रहे हैं. औसत पर, पादप कोशिकाओं बैक्टीरियल या पशु कोशिकाओं या तो तुलना में बड़ा है. हाइड्रोफोबिक मोमी छल्ली, मोटी सेल दीवारों, कार्बनिक अम्ल, हाइड्रोलिसिस और phenolic सी युक्त बड़े पानी से भरे रिक्तिकाएं की उपस्थितिompounds कि कुल सेल मात्रा 16 से 90% तक पर कब्जा कर सकते हैं, और वातित रिक्त स्थान की उपस्थिति गंभीर रूप से प्रणाली 17 की गर्मी चालकता कम हो जाती है. इसके अलावा, पौधों के मामले में, नमूना मोटाई लगभग हमेशा 20 माइक्रोन, रासायनिक निर्धारण के प्रयोग के लिए सीमा से अधिक है. इन मोटाई में पानी की कम गर्मी चालकता नमूना के केंद्र में एक ठंड की दर से अधिक -10,000 डिग्री सेल्सियस / सेक रोकता है. उस दर हानिकारक हेक्सागोनल बर्फ गठन (एक कम घनत्व के साथ बर्फ क्रिस्टल और बड़ा से 10 से 15 एनएम) से बचने के लिए आवश्यक है 8. साथ में, नमूना और बाद एफएस के दोनों उचित ठंड के लिए इन वर्तमान चुनौतियों. बहरहाल, cryofixation संयंत्र नमूने फिक्सिंग के लिए सबसे अच्छा तरीका है. यहाँ संयंत्र के ऊतकों के नमूनों की HPF-QFS के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया है. यह मॉडल प्रजातियों Arabidopsis thaliana पर केंद्रित है, लेकिन यह भी निकोटियाना benthamiana के साथ प्रयोग किया गया है. ठेठ परिणामों HPF-QFS सा है कि उत्पादन का प्रदर्शनसमय का एक अंश में पारंपरिक HPF-FS के लिए तुलनीय गुणवत्ता के mples. उचित समायोजन के साथ, इस प्रोटोकॉल भी अन्य अपेक्षाकृत मोटी जैविक नमूने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

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Protocol

नोट: QFS प्रक्रिया उपयोगकर्ता द्वारा अत्यधिक ध्यान और सावधानी की आवश्यकता है और हम जहां लागू चेताते और नोट्स के रूप में यहाँ इन सुरक्षा सावधानियों पर प्रकाश डाला.

HPF भागो के लिए 1.Preparation

  1. नमूना तैयारी शुरू करने से पहले, निर्माता के निर्देशों का पालन उच्च दबाव फ्रीजर पर बारी.
    नोट: इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया HPF इकाई एक Wohlwend कॉम्पैक्ट 02 इकाई (चित्रा 1 ए) है, और HPF शुरू कर सकते हैं चलाता है इससे पहले यह शुरू हुआ प्रक्रिया की एक और एक से डेढ़ घंटे तक लगभग एक लेता है.
    1. Wohlwend कॉम्पैक्ट 02 उच्च दाब फ्रीज़र पर स्विचिंग.
      1. "1" के लिए "0" से मुख्य स्विच बदल कर साधन पर स्विच करें.
      2. मशीन को संकुचित हवा जारी.
      3. मशीन के लिए तरल नाइट्रोजन रिलीज.
      4. प्रेस "सिस्टम सूखी" बटन.
      5. 30 मिनट के बाद, "SYSTE दबाएँएम सूखी अप "फिर बटन.
      6. प्रेस "पर / बंद" बटन साधन पर स्विच करने के लिए.
      7. "नाइट्रोजन" बटन दबाएँ.
      8. बटन "में ड्राइव" पहले से ही जलाया गया है, भले ही मशीन 20 मिनट के लिए शांत करने की अनुमति दें.
      9. ऊपर बटन रोशनी "में ड्राइव".
      10. बटन "में ड्राइव" प्रेस.
      11. "ऑटो" बटन दबाएँ.
      12. "सिस्टम तैयार" बटन रोशनी.
      13. दबाव चेंबर में तापमान और दबाव जांच प्लेस और पिन के साथ यह ताला.
      14. "जेट ऑटो" बटन दबाएँ. वांछित के रूप में दबाव में वृद्धि और तापमान में कमी कर रहे हैं कि इस कदम के चेक; अनिवार्य रूप से एक परीक्षण रन. तापमान और दबाव में तेजी से वृद्धि में तीव्र बूँदें (चित्रा 1 बी) की उम्मीद कर रहे हैं.
      15. दो और जेट के चक्र से बाहर ले जाने.

Receivi के लिए 2 तैयारीएनजी जमे हुए नमूने

  1. धारकों पूरी तरह से (चित्रा 1C) कवर किया जाता है, ताकि तरल नाइट्रोजन के साथ cryovial धारकों युक्त एक अछूता बॉक्स भरें, (सुरक्षा चेतावनी देखें).
    नोट: तरल नाइट्रोजन से निपटने का उपयोग करें जब पीपीई cryogloves और काले चश्मे सहित.
  2. तरल नाइट्रोजन (चित्रा 1C) में एल्यूमीनियम ट्यूब धारकों में एफएस मध्यम युक्त शीशियों की उचित संख्या रखें. चार डिस्क के लिए इस प्रोटोकॉल के साथ एक भी नमूना युक्त प्रत्येक एक एकल cryovial में रखा जा सकता है.
    नोट: शीशियों एक हीरे की इत्तला दे दी मुंशी और बहुत नरम पेंसिल की तरह एक तेज साधन के साथ लेबल किया जाना चाहिए.
    1. QFS दौरान लगानेवाला लिए एसीटोन 9 में 1% Oso 4 और 0.1% uranyl एसीटेट का उपयोग करें. तरल नाइट्रोजन में जमे हुए cryovials और दुकान में 1.5 मिलीलीटर की aliquots बांटना, बड़ी मात्रा में समाधान तैयार है.
      नोट: Oso 4 और uranyl एसीटेट से निपटने के लिए सुरक्षा चेतावनी का पालन करें.
      नोट: Oso 4 नोट: QFS के लिए नमूने पकड़ इस्तेमाल cryovials ट्यूब Oso 4 के रिसाव से बचने के लिए QFS के दौरान सील कर रहने को सुनिश्चित करने के लिए एक कठिन हे अंगूठी होना चाहिए.
  3. पेस्ट चिकनी है जब तक एक दन्तखुदनी या अन्य ऐसे उपकरण के साथ 10% मेथनॉल के लगभग बराबर मात्रा के साथ बेकर की खमीर मिश्रण से खमीर पेस्ट तैयार करें. खमीर पेस्ट एक बाह्य cryoprotectant के रूप में कार्य करता है और नमूना वाहक में नमूना आसपास की जगह को भरने के लिए प्रयोग किया जाता है. पेस्ट की राशि नमूनों की संख्या पर निर्भर करता है; 10 नमूने या उससे कम पेस्ट (1 मिलीलीटर) एक microcentrifuge ट्यूब में मिलाया जा सकता है के लिए.

नमूने के 3 उच्च दबाव बर्फ़ीली

  1. संयंत्र से ब्याज की एक पत्ती (या अन्य ऊतकों) निकालें और धीरे denta के एक टुकड़े पर जगहएल मोम या अन्य काटने की सतह. पत्ती के बाहर एक नमूना कटौती करने के लिए 2.0 मिमी या इच्छित आकार का एक पंच का प्रयोग करें. संदंश की एक जोड़ी के साथ धीरे नमूना संभाल और जल्दी से जल्दी काम करते हैं.
  2. एक विदारक माइक्रोस्कोप के तहत कार्य करना, एक प्रकार नमूना वाहक के 0.2 मिमी पक्ष में पत्ती डिस्क जगह और खमीर पेस्ट में पूरी तरह से कवर किया. डिस्क पूरी तरह से भर जाता है कि यह सुनिश्चित करें और पेस्ट ठीक एक तूलिका (चित्रा 2) के साथ पेस्ट बाहर चौरसाई द्वारा धारक के रिम के साथ स्तर है.
  3. नमूना धारक में वाहक रखें. टाइप बी नमूना वाहक, फ्लैट सतह के नीचे के साथ नमूना कवर.
    नोट: नमूना धारक सूखा और कमरे के तापमान पर होना चाहिए.
  4. , नमूना धारक में नमूना ले लो मशीन में डालें और एक दूसरे या दो में पूरा करना चाहिए, जो "जेट ऑटो" बटन दबाकर एक ठंड चक्र आरंभ.
  5. के रूप में जल्दी संभव के रूप में कार्य, मशीन से धारक को हटाने और samp पकड़े टिप जगहLe HPF मशीन के शीर्ष पर अछूता बॉक्स में तरल नाइट्रोजन में. उन्हें ठंडा करने के लिए तरल नाइट्रोजन में संदंश के दो जोड़े के सुझावों को विसर्जित कर दिया.
    नोट: ठंड के बाद, वाहक केवल तरल नाइट्रोजन ठंडा संदंश के साथ संभाला जाना चाहिए. गर्म (कमरे के तापमान) संदंश अक्सर cryotechniques में विफलता के कारण कर रहे हैं.
  6. एफएस मीडिया वाले एक cryovial खोलें, और बॉक्स के किनारे पर ढक्कन रखें. तरल नाइट्रोजन ठंडा संदंश की एक जोड़ी की सहायता के साथ, धीरे डिस्क तरल नाइट्रोजन या वाष्प में हमेशा होता है कि यह सुनिश्चित करने, नमूना धारक से डिस्क को हटा दें. तरल नाइट्रोजन वाष्प में काम करते हुए, एक पूर्व ठंडा संदंश के साथ एफएस ट्यूब पकड़ और एफएस शीशी में धारक स्थान के लिए अन्य का उपयोग करें. पीठ पर एफएस शीशी का ढक्कन भाड़ में. नहीं जाल शीशी में किसी भी तरल नाइट्रोजन करो.
    नोट:, QFS के लिए cryovials कोई तरल नाइट्रोजन शीशियों में फंस गया है कि यह सुनिश्चित करने के लिए नमूने के हस्तांतरण है. तरल नाइट्रोजन वार्मिंग और किसी भी Trappe दौरान 700 गुना बढ़ती हैडी तरल नाइट्रोजन इस समय के दौरान विस्फोट हो सकता है.
  7. सभी वांछित नमूने जमे हुए हैं जब तक दोहराएँ 3.1-3.7 कदम. नमूना के एक ही प्रकार युक्त एकाधिक पत्ती डिस्क एक ही शीशी में रखा जा सकता है. नमूना धारक सूखे और ठंड रन के बीच कमरे के तापमान के लिए लाया जा करने की जरूरत है कि ध्यान दें. जल्दी से ऐसा करने के लिए, एक झटका ड्रायर के साथ यह गर्मी, और स्पर्श से उसके तापमान की निगरानी.

रुक प्रतिस्थापन के लिए 4 तैयारी

  1. पूरी तरह से 10 मिनट के लिए या नाभिक उबलते बंद हो जाता है जब तक तरल नाइट्रोजन में एल्यूमीनियम हीटर ब्लॉक विसर्जित कर दिया. इस पर जा रहा है, वहीं एफएस कक्ष (चित्रा 3) के रूप में इस्तेमाल किया कंटेनर के तल में सूखी बर्फ (1-2 सेमी) की एक परत जगह. एक स्टायरोफोम कंटेनर या बर्फ बाल्टी कुचल सूखी बर्फ या छर्रों के साथ, एफएस के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
  2. जल्दी हीटर ब्लॉक के बीच पंक्तियों में तापमान जांच के साथ साथ नमूने युक्त cryovials डालें. सुनिश्चित करें कि पर lidsएफएस मीडिया एफएस के दौरान बाहर लीक नहीं करता तो शीशियों कसकर पर खराब कर रहे हैं. तापमान रिकॉर्डिंग शुरू.
    1. यह ट्यूब के नीचे पहुंचता है तो एक cryovial के शीर्ष के माध्यम से एक thermocouple रखकर तापमान जांच करें. राल के साथ ट्यूब का ढक्कन इतना है कि कोई तरल लीक बाहर सील. प्रत्येक QFS रन की शुरुआत में 1.5 एमएल एसीटोन के साथ ट्यूब भरें.
  3. पृथक cryogloves या बड़े संदंश का प्रयोग, हीटर ब्लॉक से सभी तरल नाइट्रोजन डालना. Cryovials उंडेल को नहीं ख्याल रखना.
    नोट: तरल नाइट्रोजन से निपटने का उपयोग करें जब पीपीई cryogloves और काले चश्मे सहित.
  4. QFS कक्ष में सूखी बर्फ की परत पर शीशियों युक्त ब्लॉक रखें. ब्लॉक ट्यूब क्षैतिज झूठ बोल रहे हैं कि इतनी रखा लेकिन एक मामूली ऊपर की ओर झुकाव के साथ किया जाता है सुनिश्चित करें. सही cryovials उपयोग किया जाता है अगर कोई रिसाव होना चाहिए.
  5. एफएस ट्यूब कवर कर रहे हैं इतना है कि यह आवश्यक नहीं है, हालांकि, सूखी बर्फ के साथ QFS चैम्बर पैकब्लॉक के ऊपर कवर. चेंबर पर ढक्कन रखें.

5 त्वरित एफएस

नोट: Oso 4 में से किसी रिसाव अनजाने अन्य सावधानियों के बावजूद होता है कि घटना में एक धूआं हुड में QFS चलाने के प्रदर्शन.

  1. एक धूआं हुड में एक मंच रोटरी प्रकार के बरतन पर QFS कक्ष प्लेस और 120 मिनट के लिए 125 rpm पर बारी बारी से. इस दौरान ब्लॉक के तापमान के बारे में -80 डिग्री सेल्सियस के लिए धीरे धीरे वृद्धि करनी चाहिए. आंदोलन बेहतर एफएस के लिए घटकों के मिश्रण सुनिश्चित करता है.
    नोट: धूआं हुड में शेखर और धूआं हुड दरवाजा की स्थिति की नियुक्ति QFS प्रक्रिया के दौरान और नमूने के अनुरूप वार्मिंग सुनिश्चित करने के लिए चलाने के लिए हर QFS के लिए ही होना चाहिए.
  2. कक्ष से सूखी बर्फ निकालें और एक घंटे के लिए झटकों जारी है.
    नोट: तापमान के बारे में -15 डिग्री सेल्सियस के लिए -20 डिग्री सेल्सियस तक वृद्धि करनी चाहिए.
  3. QFS कक्ष से नमूने और तापमान जांच निकालें और पर जगहएक और 10-15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर एक प्रकार के बरतन, जब तक वे कमरे के तापमान तक पहुँचने. तापमान रिकॉर्डिंग बंद करो.
  4. एफएस के दौरान, HPF मशीन बंद कर देते हैं.
    1. HPF मशीन नाइट्रोजन के साथ भरा जा रहा है, जबकि तरल नाइट्रोजन टैंक के नल बंद कर दें.
    2. "नाइट्रोजन" बटन दबाएँ.
    3. लाल "पिस्टन नीचे" प्रकाश extinguishes जब तक प्रतीक्षा करें.
    4. "पर / बंद" बटन दबाएं.
    5. प्रेस "सिस्टम सूखी" बटन.
    6. मशीन को संपीड़ित हवा की आपूर्ति काट.
    7. 12 घंटे की एक न्यूनतम के बाद, (किसी भी नमी के सूखने सुनिश्चित करने के लिए) "0" के लिए "1" से मुख्य स्विच मोड़ से मशीन बंद.

6 डाक एफएस प्रसंस्करण

  1. ध्यान से विषाक्त अपशिष्ट के लिए उपयुक्त कंटेनर में प्लास्टिक हस्तांतरण pipettes और जगह एफएस के साथ मीडिया को हटा दें.
    नोट: Oso 4 और uranyl एसीटेट खतरनाक रसायन होते हैंबंद पंजे जूते, प्रयोगशाला कोट और दस्ताने सहित उपयुक्त व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण (पीपीई) पहने हुए और धूआं हुड में नियंत्रित किया जाना चाहिए.
  2. धो नमूने 100% एसीटोन के साथ चार बार. पहले दो washes लीजिए और विषाक्त अपशिष्ट कंटेनर में रखें.
  3. ठीक संदंश का प्रयोग, धारकों से ऊतकों के नमूनों को हटा दें. यह किया जाता है के रूप में एसीटोन के साथ गीला नमूने रखें, और तोड़ने के नमूने से बचने के लिए बहुत धीरे से काम करते हैं.
    नोट: यह असामान्य नहीं है और यह वास्तव में खमीर पेस्ट इस बिंदु पर दूर नमूनों से गिरावट है उपयोगी हो सकता है. पत्ता ऊतक अभी भी हरा है जबकि खमीर पेस्ट आमतौर पर बहुत ही गहरे भूरे रंग का है.
  4. एसीटोन युक्त cryovials में नमूने ले लीजिए. सामान्य प्रोटोकॉल के अनुसार मंदिर के लिए नमूना तैयार (घुसपैठ और एम्बेडिंग) के साथ आगे बढ़ें.

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Representative Results

नीचे प्रस्तुत परिणाम HPF के लिए एक Wohlwend कॉम्पैक्ट 02 (चित्रा 1 ए) का उपयोग कर प्राप्त किया गया है. इस उपकरण का एक प्रमुख लाभ नमूना वाहक और अपने धारकों के उपयोग में आसानी है. अन्य उपकरणों का उपयोग करते समय, मैकडॉनल्ड्स दो उपयोगकर्ताओं अन्य ठंड करता है और एफएस के लिए स्थानांतरण 9 cryovials जबकि नमूनों की तैयारी नमूना तैयार करने और HPF, एक बाहर ले जाना चाहिए कि सिफारिश की गई है. हालांकि, Wohlwend वाहक और धारक एक एकल उपयोगकर्ता स्वतंत्र रूप से (चित्रा 2A, बी, ई, एफ और जी) में हेरफेर करने के लिए काफी आसान कर रहे हैं नमूना. यह एक कुछ परीक्षण प्रदर्शन करना चाहिए कि हालांकि उल्लेख किया मूल्यवान नमूनों के साथ काम करने से पहले HPF साधन के साथ परिचित बनने के लिए चलाता किया जाना चाहिए. एक अनुभवी उपयोगकर्ता एक घंटे में (10 या अधिक) कई नमूने को ठीक करने में सक्षम होना चाहिए. हालांकि, इस प्रोटोकॉल में प्रस्तुत सिद्धांतों व्यावसायिक रूप से उपलब्ध HPF मशीनों में से किसी के साथ प्रयोग किया जा सकता है.

शायदHPF-QFS प्रक्रिया का सबसे महत्वपूर्ण हिस्सा नमूना वाहक (चित्रा -2) में लोड करने के लिए नमूना तैयार है. यह सहज नहीं हो सकता है, यह शोधकर्ता सबसे नियंत्रण नहीं है जिस पर प्रोटोकॉल में कदम है. HPF मशीन मजबूत है, और उचित उपयोग और रखरखाव के साथ नमूनों के बीच थोड़ा बदलाव के साथ दबाव और तापमान में होने की उम्मीद है परिवर्तन का उत्पादन करना चाहिए. एक नमूना खराब तैयारी के दौरान नियंत्रित किया जाता है, तो कोई अन्य कदम इसलिए वजह से नुकसान के एवज जाएगा. वे मध्यम में सभ्य नहीं हैं और उनकी कोशिकाओं की दीवारों कोशिकाओं अच्छा ताकत देने के रूप में संयंत्र के ऊतकों प्रक्रिया के इस चरण के दौरान हेरफेर करने के लिए काफी आसान कर रहे हैं. यह नमूने माता पिता के संयंत्र से हटाने से होने वाली ultrastructural परिवर्तन से बचने के लिए और तनाव और घायल हो गए प्रतिक्रियाओं को सीमित करने के लिए जल्दी से नियंत्रित किया जाता है कि फिर भी महत्वपूर्ण है. एक नमूना समायोजित कर सकते हैं कि सबसे छोटी नमूना वाहक छवि (कुशल और लगातार HPF सुनिश्चित करने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिएure -2 सी). अंत में, नमूना वाहक भरा लेकिन (चित्रा 2 डी) बह निकला नहीं किया जाना चाहिए. भरा नमूना वाहक आसानी से (चित्रा 2 एच और आई) ठंड के लिए HPF मशीन में डाला जाता है.

QFS प्रोटोकॉल में पहला कदम एक शुरुआत के लिए चुनौतीपूर्ण हो सकता है, इसलिए यह उपयोगकर्ताओं प्रक्रिया (चित्रा 3 ए ई) के साथ आराम कर रहे हैं जब तक दो लोगों को एक साथ काम करना चाहिए कि सिफारिश की है. तरल नाइट्रोजन और fixatives आज़मियम tetroxide और uranyl एसीटेट जब हैंडलिंग संबंधी सभी समय पर लिया जाना चाहिए. QFS के दौरान तापमान में परिवर्तन के लिए एक विशिष्ट वक्र चित्रा 2J में दिखाया गया है. के बारे में -80 डिग्री सेल्सियस के लिए तेजी से -196 डिग्री सेल्सियस, तरल नाइट्रोजन के तापमान से तापमान बढ़ता है,. यह फ्रीज प्रतिस्थापन 9 घटित करने के लिए माना जाता है कि चारों ओर -78 डिग्री सेल्सियस के लिए -90 डिग्री सेल्सियस के तापमान पर है. QFS प्रोटोकॉल में एक चुनौतीपूर्ण कदम एफएस के 2 घंटे के बाद सूखी बर्फ को हटाने की है. मेंइस कदम के नमूने की mishandling तापमान में एक कील का उत्पादन कर सकते हैं. इस के लिए, हीटर ब्लॉक तेजी से जल्दी से एक माध्यमिक कंटेनर में डाला बाहर एक cryoglove और सूखी बर्फ का उपयोग QFS चैंबर के बाहर हटा लिया जाना चाहिए.

HPF निकोटियाना benthamiana पत्तियों और Arabidopsis पत्ते और भ्रूण सहित विभिन्न संयंत्र के ऊतकों को ठीक करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. यह कारण सबसे अधिक कोशिकाओं के बड़े केंद्रीय रिक्तिकाएं को परिपक्व पत्तियों से नमूने ठीक करने के लिए चुनौतीपूर्ण है. छोटी पत्तियों छोटे रिक्तिकाएं होते हैं लेकिन ट्राईकोम्स आम तौर पर काफी घनी पैक कर रहे हैं. ट्राईकोम्स की उपस्थिति यह मुश्किल खमीर पेस्ट के साथ नमूने पैक करने के लिए बना है, लेकिन यह ठीक से पत्ती की सतह और पेस्ट के बीच फँस हवा की मात्रा को कम करने के लिए किया जाता है कि यह सुनिश्चित करने के लिए लिया जाना चाहिए देखभाल कर सकते हैं. फंस हवा HPF दौरान गर्मी हस्तांतरण में बाधा और निर्धारण की गुणवत्ता कम हो जाएगा. यह किसी भी नमूने के लिए सच है.

HPF और QFS नमूने छठी के लिए तैयार किया जा सकता है के बादघुसपैठ और राल के साथ embedding द्वारा मंदिर के नीचे Ewing. 65-100 एनएम की पतली वर्गों फिर सेक्शनिंग द्वारा तैयार किया जा सकता है. ठेठ परिणाम चित्रा 4 में दिखाया गया है. दिखाया छवियों Arabidopsis पत्ता नमूने से सभी कर रहे हैं. प्लाज्मा झिल्ली आम तौर पर चिकनी और सेल की दीवार के खिलाफ लगाए हैं, अच्छा निर्धारण का संकेत (चित्रा -4 ए, सी और ई). क्लोरोप्लास्ट (चित्रा -4 ए, डी, एफ और एच) और thylakoids (चित्रा 4 बी), माइटोकांड्रिया (चित्रा 4D और एफ), Golgi (चित्रा 4 जी), सूक्ष्मनलिकाएं (चित्रा 4E) और राइबोसोम (विशेष रूप से चित्रा 4C) सहित अन्य अंगों में भी कर रहे हैं स्पष्ट रूप से दिखाई और बड़े केंद्रीय रिक्तिकाएं बरकरार (चित्रा -4 ए) रहते हैं. बर्फ क्रिस्टल प्रेरित क्षति (चित्रा 4D) और plasmolysis (चित्रा 4H) सहित कलाकृतियों में HPF-QFS परिणाम के दौरान गरीब हैंडलिंग. लीड वेग भी खंड के धुंधला के दौरान हो सकता है फार्मएस (चित्रा 4F).

चित्रा 1
चित्रा 1: Wohlwend कॉम्पैक्ट 02 उच्च दबाव फ्रीज़र (ए) संलग्न कंप्यूटर टर्मिनल के साथ cryofixation के लिए इस्तेमाल किया Wohlwend कॉम्पैक्ट 02 HPF मशीन.. नमूने ठंड के लिए मशीन (छोटे वृत्त) के सामने में डाला जाता है. उपयोगकर्ता द्वारा वांछित के रूप में एक तापमान वक्र, प्रत्येक रन के लिए कंप्यूटर स्क्रीन पर उत्पन्न किया जा सकता है. (बी) एक HPF चलाने के लिए एक ठेठ temperature- दबाव वक्र. पीले और बैंगनी लाइनों क्रमशः, तापमान और दबाव का प्रतिनिधित्व करते हैं. दोनों घटता की खड़ी ढलान पर ध्यान दें. उच्च दबाव के बारे में 400 मिसे के लिए बनाए रखा है. एक्स अक्ष पर प्रत्येक अंतराल 50 मिसे का प्रतिनिधित्व करता है. डाटा DSIM12 सॉफ्टवेयर के लिए EasyScopeII साथ एकत्र किया गया था. (सी) अछूता बॉक्स और कवर भंडारण ओ के लिए इस्तेमाल कियातुरंत ठंड के बाद च जमी नमूने सुविधापूर्वक शीर्ष HPF मशीन पर रखा जा सकता है. यह तरल नाइट्रोजन से भर जाता है. दौर एल्यूमीनियम कंटेनर cryovials पकड़.

चित्रा 2
चित्रा 2: HPF के लिए तैयारी ऊतक नमूना. (ए) ने अपने बंद विन्यास में कॉम्पैक्ट 02 HPF मशीन के लिए नमूना धारक. (बी) नमूना धारक खुला है. (सी) एक प्रकार एक नमूना वाहक के 0.2 मिमी अच्छी तरह से में एक पत्ता नमूना. इस वाहक के दूसरी ओर 0.1 मिमी गहरी है. (डी) खमीर पेस्ट में शामिल पत्ती नमूना. वाहक पूर्ण लेकिन बह निकला नहीं है कि ध्यान दें. (ई) नमूना धारक में नमूना वाहक. (एफ) नमूना प्रकार बी वाहक के साथ कवर किया जाता है. इस वाहक एक फ्लैट सतह और दूसरी तरफ एक अच्छी तरह से है कि0.3 मिमी गहरी है. यहां फ्लैट सतह सैंडविच के लिए प्रयोग किया जाता है नमूना. (जी) नमूना धारक HPF मशीन में सम्मिलन के लिए बंद कर दिया और तैयार है. (एच) HPF साधन के मोर्चे पर छिद्र नमूना धारक ठंड के लिए डाला जाएगा जो में HPF मशीन में डाला. (आई) तापमान और दबाव जांच / धारक. (जे) के एक QFS चलाने के लिए एक ठेठ तापमान वक्र (EasyLog सॉफ्टवेयर के साथ एकत्र डेटा). तापमान एक दूसरे दर्ज की गई थी. जांच के इलेक्ट्रॉनिक्स इस्तेमाल किया और एक वास्तविक तापमान माप को प्रतिबिंबित नहीं करता रन की शुरुआत में कील की वजह से है.

चित्रा 3
चित्रा 3:. QFS में प्रयुक्त उपकरण QFS इस तरह के एक स्टायरोफोम बॉक्स या एक बर्फ बाल्टी के रूप में किसी भी अछूता कंटेनर में किया जा सकता है (ए) <./ Strong> सूखी बर्फ 1-2 सेमी गहरा की एक परत यहाँ QFS कक्ष के नीचे, एक स्टायरोफोम बॉक्स को शामिल किया गया. (बी) 13 मिमी छेद के साथ एक हीटर ब्लॉक QFS दौरान घर के नमूने लिए प्रयोग किया जाता है. डिजिटल डेटा लकड़हारा साथ तापमान जांच हीटर ब्लॉक में रखा गया है. (सी) के नमूने ब्लॉक में रखा जाता है तरल नाइट्रोजन में हीटर ब्लॉक ठंडा करने के बाद, तरल नाइट्रोजन बाहर फेंक दिया जाता है, और पूरे विधानसभा QFS कक्ष में रखा गया है . सूखी बर्फ (डी) के साथ QFS कक्ष नमूने शामिल किया जाता है तो उस सूखी बर्फ से भर जाता है; सूखी बर्फ के साथ पूरे हीटर ब्लॉक को कवर करने के लिए कोई नुकसान नहीं है. (ई) बॉक्स कवर किया और फिर नमूने QFS प्रक्रिया के दौरान उत्तेजित कर रहे हैं, जहां एक धूआं हुड में रोटरी प्रकार के बरतन पर ले जाया जाता है.

चित्रा 4
चित्रा4:.. Arabidopsis HPF-QFS द्वारा तैयार पत्ते एक जीस तुला 200 एचटी FE एम सी पर मंदिर से HPF-QFS द्वारा तैयार और imaged नमूने के लिए प्राप्त परिणामों (ए) सेल दीवारों के साथ एक क्लोरोप्लास्ट (सीएच) दिखा एक मध्यम उच्च बढ़ाई छवि और आसन्न कोशिकाओं की कोशिका द्रव्य. रिक्तिकाएं (वी) इलेक्ट्रॉन घने सामग्री होते हैं. स्केल बार एक क्लोरोप्लास्ट के = 0.5 माइक्रोन. (बी) के एक उच्च बढ़ाई छवि. स्केल बार = 100 एनएम. (सी) आसन्न कोशिकाओं के बीच सेल की दीवार के एक उच्च बढ़ाई छवि. एक branched plasmodesma दिखाई (तीर) है. रिक्तिका द्वारा कोशिका दीवार के खिलाफ लगाए चिकनी प्लाज्मा झिल्ली ध्यान दें. कोशिका द्रव्य घनी राइबोसोम के साथ पैक किया जाता है. वी रिक्तिका है. tonoplast चिकनी और सतत है. स्केल बार = 200 एनएम. (डी) बर्फ क्षति (तारांकन) के क्षेत्रों के पास क्लोरोप्लास्ट (सीएच) में अच्छा निर्धारण के क्षेत्रों दिखा एक कम बढ़ाई छवि. स्केल बार = 0.5 माइक्रोन. (ई) एक सेल वाल का एक उच्च बढ़ाई देखेंएल और सूक्ष्मनलिकाएं. क्लोरोप्लास्ट (सीएच) और माइटोकांड्रिया (एम) का अच्छा संरक्षण दिखा स्केल बार = 100 एनएम. (एफ) छवि. बड़े काले वेग नेतृत्व साइट्रेट के साथ वर्गों धुंधला से है. स्केल बार = 1 माइक्रोन. Golgi (जीए) (G) उच्च बढ़ाई देखें. स्केल बार = 200 एनएम. (एच) खराब क्लोरोप्लास्ट और plasmolysis (काला तीर) में विवरण का अभाव दिखा नमूना संरक्षित. स्केल बार = 1 माइक्रोन.

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Discussion

यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल की सफलता उपयोगकर्ता पर काफी निर्भर करता है. सबसे पहले, उन्नत तैयारी के लिए सभी आवश्यक सामग्री आसानी से उपलब्ध है और एक पूरी HPF-QFS रन पूरा करने के लिए पर्याप्त मात्रा में कर रहे हैं कि यह सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक है. दूसरा, उपयोगकर्ता इस प्रकार के ऊतकों के देशी राज्य में परिवर्तन को कम करने, नमूना हैंडलिंग कि कम से कम एक कुशल तरीके से कदम करने वाली कदम से चलती है, जल्दी से काम करना चाहिए. नमूने जमे हुए हैं और वे निर्जलित हैं पहले देखभाल अनजाने उदाहरण के लिए, नमूना गर्म कर सकते हैं कि किसी भी निपटने से बचने के लिए लिया जाना चाहिए ताकि यह एक दस्ताने हाथ के बजाय पूर्व ठंडा संदंश के साथ निपटने, वे ठंड रखा जाना जरूरी है कि एक बार. स्पीड और प्रोटोकॉल के साथ परिचित के साथ दक्षता वृद्धि हुई है, इसलिए अभ्यास रन ब्याज में से एक के नमूने को ठीक करने के लिए प्रयास करने से पहले की सिफारिश की है. तीसरा, उपयोगकर्ता एफएस माध्यम के रूप में अच्छी तरह से तरल नाइट्रोजन और सूखी बर्फ के साथ काम करने के खतरों में प्रयुक्त रसायनों के खतरों के बारे में पता रहना चाहिए. एक धूआं हुड एफएस माध्यम की तैयारी के लिए और QFS प्रक्रिया के लिए आवश्यक है. अन्य सभी चरणों के लिए, दस्ताने, प्रयोगशाला कोट सहित आवश्यक व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण, बंद पैर के जूते और चश्मे की सिफारिश की है.

पौधों, मंदिर के लिए नमूने तैयार करने सहित के लिए कमरे के तापमान पर रासायनिक fixatives के बजाय cryofixation उपयोग कर के लाभ, लंबे समय तक 10 ज्ञात किया गया है. HPF या रासायनिक fixatives द्वारा तय निकोटियाना और Arabidopsis की जड़ सुझावों के फैटी की तुलना एक अध्ययन HPF-FS विधि कहीं बेहतर परिणाम 5 दिया पाया. HPF-एफएस द्वारा तैयार ऊतक में plasmalemma और अन्य सेलुलर झिल्ली plasmalemma सेल की दीवार के खिलाफ फ्लश था, चिकनी थे, और आम तौर सहित organelles सूक्ष्मनलिकाएं बेहतर नमूने परंपरागत तरीके से तय किया गया है जब से संरक्षित किया गया. सोयाबीन जड़ पिंड के एक अन्य अध्ययन में बफर glutaraldehyde से कि "रासायनिक निर्धारण निष्कर्ष निकालासंरचना और समारोह. के सहसंबंध है कि परमिट एक राज्य में सोयाबीन जड़ पिंड के फैटी की रक्षा नहीं करता है "और यह केवल उपलब्ध वैकल्पिक HPF-FS है कि कहने के लिए जारी 2. Plasmodesmata अपने पड़ोसियों के लिए संयंत्र कोशिकाओं कनेक्ट कि झिल्ली ही सीमित चैनल हैं, लेकिन जिनकी बुनियाद भी मंदिर के तहत हल करने के लिए मुश्किल है. HPF द्वारा या एफएस के बाद प्रोपेन जेट फ्रीजर साथ Cryofixation plasmodesmal संरचना 18 का ठीक विवरण elucidating के उद्देश्य से पढ़ाई में रासायनिक निर्धारण पर चुना गया था. इन प्रारंभिक निष्कर्षों के बावजूद, पारंपरिक तय ऊतकों पर मंदिर अध्ययन अभी भी संयंत्र विज्ञान में आदर्श रहे हैं. इस वजह से पारंपरिक तरीकों के लिए या वर्तमान में इस्तेमाल किया एफएस प्रोटोकॉल के लिए लंबे समय से प्रारंभिक समय के लिए युग्मित HPF-FS उपकरण के लगने अत्यधिक लागत के लिए एक सरल पालन करने के लिए हो सकता है.

QFS के लिए प्रक्रिया मंदिर 15 के लिए नमूना तैयार करने को तेज में हाल ही में एक नवीनता है. QFS किया गया हैपूरे सी तैयार किया एलिगेंस और एन benthamiana cryofixation 15 के बाद छोड़ देता है. ये HPF द्वारा तय होने की अपेक्षाकृत मोटी नमूने हैं, और HPF-एफएस द्वारा निकोटियाना नमूनों की तैयारी परंपरागत बार 12, 13, 14 बहुत लंबे एफएस इस्तेमाल किया गया है. इस प्रोटोकॉल के लिए हम मॉडल संयंत्र Arabidopsis से पत्तियों का इस्तेमाल किया है. निकोटियाना और अन्य संयंत्र के नमूने के लिए लंबे एफएस बार के लिए तर्क सॉल्वैंट्स और पानी की विनिमय संभावना कोशिकाओं की बड़ी रिक्तिकाएं से धीमा हो जाएगा. हालांकि, यह एक अच्छी तरह से जमे हुए नमूने के विकांचीकरण कोशिकाओं को कम से कम नुकसान में परिणाम चाहिए उम्मीद है कि (15 और refs. उसमें). बर्फ की क्षति होती है, तो यह सबसे अधिक संभावना ठंड ही नहीं QFS के कारण होता है. एफएस के लिए एक भी कम प्रोटोकॉल 15 सूचित किया गया है. इस सुपर त्वरित एफएस (SQFS) एफएस के लिए केवल 90 मिनट का उपयोग करता है. इस प्रोटोकॉल में, हीटर ब्लॉक में नमूने ड्राई मैं के अभाव में 100 rpm पर घुमाया जाता हैSQFS चैम्बर कवर के बिना CE. इस नमूने -80 डिग्री को तेजी से पहुँचने के लिए अनुमति देता है. नमूने तो हीटर ब्लॉक से हटा दिया है और घुमाव पर कमरे के तापमान तक पहुँचने के लिए अनुमति दी जाती है. SQFS सफलतापूर्वक संस्कृति और में विकसित कोशिकाओं निर्जलीकरण के लिए इस्तेमाल किया गया है कोलाई कोशिकाओं. हम अभी तक कारण संयंत्र के ऊतकों की मोटाई के लिए संयंत्र के नमूनों के साथ SQFS उपयोग करने का प्रयास नहीं किया है.

cryofixing और फिर मिलकर HPF और QFS द्वारा संयंत्र के नमूने dehydrating के लिए प्रोटोकॉल मौजूदा प्रोटोकॉल पर एक महत्वपूर्ण सुधार का प्रतिनिधित्व करता है. राल घुसपैठ से पहले नमूना तैयार करने के लिए समय के बजाय अब कई दिनों के कुछ ही घंटों के लिए कम है. QFS विधि 15 के विकास के अलावा, मैकडॉनल्ड्स ने भी हाल ही सूखी बर्फ 19 बिना राल निम्नलिखित SQFS साथ संयंत्र के ऊतकों का तेजी से घुसपैठ के लिए प्रोटोकॉल प्रकाशित किया है. संयंत्र के ऊतकों आमतौर पर धीरे धीरे रातोंरात सहित कई लंबी incubations ने राल के साथ घुसपैठ कर रहे हैं. इन नए आद्यसेक्शनिंग को ठंड से 6 घंटा: कर्नल भी कम नमूना प्रसंस्करण बार में परिणाम. इस तरह भविष्य में, HPF-QFS और तेजी से घुसपैठ का संयोजन मंदिर के लिए संयंत्र नमूना तैयार करने के लिए मौजूदा प्रोटोकॉल की जगह चाहिए. एक वाणिज्यिक QFS किट (http://www.emsdiasum.com) इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी विज्ञान के माध्यम से वर्तमान में उपलब्ध है, हालांकि इसके अलावा, QFS प्रक्रिया, सस्ती है और कई उद्देश्यों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि आम प्रयोगशाला उपकरणों का उपयोग करता है. या तो विकल्प को अच्छी तरह से 50,000 डॉलर से अधिक खर्च कर सकते हैं कि एक समर्पित फ्रीज प्रतिस्थापन यूनिट खरीदने की लागत पर एक भारी बचत का प्रतिनिधित्व करता है.

यह HPF द्वारा तैयार नमूनों के अनुप्रयोगों और एफएस दिनचर्या मंदिर विश्लेषण से परे का विस्तार किया जाना चाहिए. इस तरीके से तैयार नमूनों उनके प्रतिजनकता बनाए रखने और इसलिए immunogold लेबलिंग 17, 19 सहित, एंटीबॉडी आधारित दृष्टिकोण में इस्तेमाल किया जा सकता है. इन नमूनों को भी उन्नत तीन आयामी संरचनात्मक विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता हैइलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी 20 के माध्यम से. HPF-FS नमूने भी correlative प्रकाश और ईएम 21, 22 के साथ प्रयोग किया जा सकता है. इस प्रकार, cryofixing और फिर dehydrating नमूने विविध सिस्टम में काम कर रहे जांचकर्ताओं की एक विस्तृत विविधता के लिए लाभप्रद होगा के लिए प्रक्रियाओं में सुधार जारी रखा.

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Acknowledgments

यूसी बर्कले के डॉ केंट मैकडॉनल्ड्स की दया और उदारता काफी सराहना की है. हम बहुत उपयोगी सुझाव के लिए एक गुमनाम समीक्षक धन्यवाद. Burch स्मिथ प्रयोगशाला टेनेसी विश्वविद्यालय से शुरू हुआ धन के द्वारा समर्थित है.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Wohlwend HPF Compact 02 High Pressure Freezing Machine Technotrade International, Inc HPF02 With integrated oscilloscope to display freezing and pressure curves; PC (not included) is required for display  of freezing parameters
Holder for DN 3 x 0.5 mm aluminum apecimen carriers Technotrade International, Inc 290
Specimen carriers, P=1,000, DN 3 x 0.5 aluminum, type A Technotrade International, Inc 241-200
Specimen carriers, P=1,000, DN 3 x 0.5 aluminum, type B Technotrade International, Inc 242-200
Storage Dewar 20.5 L, MVE Millennium 2000 XC20 Chart
Baker's yeast The older the better, to avoid excessive gas (CO2) production
Tooth picks
Thermocouple data logger EL-USB-TC OMEGA Engineering Inc. OM-EL-USB-TC  Replacement battery purchased separately
Temperature probe Electron Microscopy Sciences 34505
Heater block 12/13 mm
Rotary shaker Fisher Scientific 11-402-10
Leaf punch - Harris Uni-core 2.00 Ted-Pella Inc. 15076
Pink dental wax Electron Microscopy Sciences 72660
Cryogenic vials 2 ml Electron Microscopy Sciences 61802-02
Methanol
Blow dryer
Dry ice
Liquid nitrogen
Acetone
Forceps Several pairs

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References

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