상피 - 간엽 전환시 선택적 스 플라이 싱 (alternative splicing)의 검출

* These authors contributed equally
Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Huang, H., Xu, Y., Cheng, C. Detection of Alternative Splicing During Epithelial-Mesenchymal Transition. J. Vis. Exp. (92), e51845, doi:10.3791/51845 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

상피 - 간엽 전환 (EMT)의 배 발생시 기관의 형태 형성 및 조직 리모델링을 구동하는 발달 프로그램입니다. 비정상적으로 활성화되면, EMT는 종양 전이 및 장기 섬유화 1,2를 촉진한다. 강제적 인 연구 cobble-의 유실있는 adherens 접합 단백질 E-카드 헤린의 발현을 억제 그러한 트위스트, 달팽이 및 ZEB 여러 전사 인자,,,로 정의, EMT 과정에서 전사 조절의 중요성을 설명 하였다 상피 형태와 스핀들 모양의 중간 엽 표현형 3-8의 이득과 같은 돌. RNA를 게놈 차원의 분석을 통해 최근의 연구 접합 패턴 상피 또는 중간 엽 표현형 9, 10 중 하나와 관련된 유전자의 그룹이 존재하는 것으로 나타났습니다. 우리가 실험실에서 작업 기능적 선택적 스 플라이 싱 (alternative splicing)와 EMT 연결. 세포 표면 부착 분자 CD44을 연구함으로써 CD44의 altern 시연극상의 접합이 긴밀하게 EMT 동안 규제하고, 더 중요한 것은, 인과 적으로 전환하는 CD44 스플 라이스 이소 11 EMT에 기여한다.

대안 12-14을 접합하는 인간의 다중 엑손 유전자의 95 %까지로 대체 접합은 유전자 조절의 광범위하고 보존 모델을 나타냅니다. 단일 유전자로부터 다중 단백질 제품을 생성함으로써, 대안적인 스 플라이 싱은 인간 게놈에 또 다른 층의 복잡성을 추가 단백질 다양성 필수기구를 구성한다. 따라서, 선택적 스 플라이 싱 (alternative splicing)의 조절 이상이 잠재적으로 인간의 질병을 일으키는 원인이 심오한 생물학적 효과가 발생할 수 있습니다. 사실, 질병에서 벗어난 대안으로 연결할 수는 spliceosome 기계를 코딩하는 유전자의 돌연변이는 일반적으로 골수 형성 이상 증후군 26 ~ 28에서 발견되는 최근의 연구 결과를 포함, 10 년 이상 15 ~ 25에 설명되어 있습니다. 따라서, 다르게 스 플라이 싱 된 난의 검출을위한 신뢰성있는 방법을 개발soforms는 EMT 등 다양한 생물학적 과정의 연구에 매우 중요하다.

여기서 우리는 유도 EMT 모델을 사용하여 대체 스 플라이 싱의 변화를 검출하는 프로토콜을 제공한다. 스플 라이스 이소 폼을 PCR 프라이머를 설계 및 검출하기위한 방법이 EMT 대체 스 플라이 싱 동안의 연구뿐만 아니라 다른 생물학적 과정에서 대체 스 플라이 싱의 연구뿐만 아니라 적합하다. EMT 동안 대체 스 플라이 싱을 더 조사하면, 따라서 암 전이를 치료하기위한 효과적인 전략의 개발을 촉진 EMT 및 종양 전이의 메커니즘을 이해하기 위해 필수적이다.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

EMT 유도의 1 세포 배양

참고 : EMT는 TGFβ의 치료 또는 상피 세포에서 전사 인자 트위스트, 달팽이, 또는 Zeb1 / 2의 이소성 발현에 의해 유도 될 수있다. 불후의 인간의 유방 상피 세포 (HMLE / 트위스트 - ER 박사는 J 양의 선물, UCSD) 9,11,29의 트위스트 - ER 융합 단백질의 발현을 통해 유도 EMT 시스템은이 프로토콜에 설명한다. 4 hydroxytamoxifen (TAM) 처리시, 융합 단백질 트위스트-ER은 12-14일 9,11,29에 전체 EMT 전환에 전사 및 성과를 위해 핵 옭. 같은 HMLE / 달팽이-ER, HMLE / TGFβ 및 MCF10A / TGFβ 등의 추가 EMT 유도 시스템은 이전 출판물 11,30에서 찾을 수 있습니다.

  1. 5 % CO 2와 37 ° C 배양기에서 무 혈청 유방 상피 세포 성장 매체 (MEGM)에서 HMLE / 트위스트 - ER 세포를 유지한다. 통로 세포는 2-3 일마다 그들은 80 %의 합류에 도달하면. 5 % 혈청 / DMEM과 트립신을 비활성화 한 후 5 ~ 10 분 동안 37 ° C에서 0.15 % 트립신으로 세포를 품어합니다. 세포를 스핀 다운 및 MEGM에서 그들을 재현 탁. 1 내지 4의 비율로 새로운 조직 배양 접시에 접시 세포.
  2. 200 μM 솔루션을 만들기 위해 에탄올에 TAM을 녹인다. -20 ° C에서 빛과 상점에서 TAM를 보호합니다. 20 nM의 TAM의 최종 농도를 희석하기 위해 10,000 : 사용 전에 갓 1에서 MEGM 매체를 추가로 TAM.
  3. EMT의 유도를 들어, 중복에 10cm 조직 배양 접시에 1.6 × 10 6 HMLE / 트위스트 - ER 세포를 접시. 20 nM의 TAM 함유 MEGM 미디어와 문화 세포.
  4. 중복에 10cm 접시에 플레이트 1.6 × 10 6 HMLE / 트위스트 - ER 세포와 비 TAM 처리 제어와 같은 0.01 % 에탄올로 치료 세포.
  5. 두 일 배양 한 후, 세포의 형태 학적 변화를 기록하기 위해 10 배 배율의 광학 현미경 사진을 찍을.
  6. 제어 또는 TAM 처리의 한 접시에서 매체를 기음세포. RNA 분리 및 단백질 분석 RIPA 버퍼 내의 다른 절반 RNA 용해 완충액 플레이트의 절반을 폐기하여 차가운 PBS와 세포 및 세포 수확을 씻는다.
  7. 중복에 10cm 접시에 재 도금 1.6 × 10 6 세포에 의한 제어 또는 TAM 처리 된 요리에서 통과 세포. 연속 20 nM의 TAM 또는 차량 세포를 취급합니다.
  8. 반복 차량 처리 된 대조군 세포는 조약돌 모양의 상피 세포 형태를 유지하는 반면, 어떤 시간에, TAM 처리 트위스트 - ER 세포, 방추형 중간 엽 형태를 보여, 14 일까지 5 회 매일 7 단계를 반복합니다.

EMT의 2 특성

참고 : EMT의 완료가로 표시됩니다 : 스핀들 모양의 섬유 모세포와 같은 외관 조약돌 모양의 상피 형태에서 (1) 셀 형태 학적 변화; (2) 세포 - 세포 접합에서 E-cadherin의 현지화 패, 손실에 의해 정의 EMT 마커 및 (3) 식 스위치,상피 마커 및 중간 엽 마커의 이득.

세포 형태 학적 변화는이 절에 설명되어 세포 접합부에서 E-cadherin의 제 1 면역 형광 검출에 설명, EMT 유도의 시간 경과시 10 배 배율의 광학 현미경에 의해 캡처됩니다. EMT 마커의 발현은 발현 수준에 의해 검출된다. 일반적인 상피 마커는 E-cadherin의, γ-catenin이, 그리고 occludin, 그리고 중간 엽 마커 피브로넥틴, N-cadherin의 및 멘틴을 포함한다. 면역 블로의 일반 절차는 4 절에 설명되어 있습니다.

  1. TAM 처리, 시드 24 - 웰 플레이트에 넣고 잘 12mm 원형 유리 커버 슬립에 1 × 105 세포에서 12 일.
  2. 미리 예열 PBS와 시드, 흡인 매체 및 세척 세포 후 48 시간.
  3. 15 분 동안 미리 예열 4 % 파라 포름 알데히드로 세포를 고정합니다.
  4. PBS로 세포를 세 번 씻으십시오.
  5. 15 PBS에서 0.2 % 트리톤 X-100으로 세포를 부화RT에서 분.
  6. PBS로 세포를 세 번 씻으십시오.
  7. 비특이적 결합 차단 RT에서 1 시간 동안 5 % BSA / PBS에서 세포를 배양한다.
  8. 4 ° C에서 1:50 희석 1 %의 BSA / 가습 챔버 O에서 PBS / N에 차 항체 E-cadherin의와 세포를 품어. 참고 : 차 항체의 희석 범위는 1:50 일 사이에 일반적입니다 : 200, 각 항체에 대한 최적의 희석은 실험적으로 결정되어야한다.
  9. 차 항체를 가만히 따르다하고 PBS로 세포를 세 번 씻는다.
  10. 실온에서 1 시간 동안 500 희석 : 1에 형광 표지 된 이차 항체와 세포를 품어. 에서이 단계에서 빛으로부터 세포를 보호합니다.
  11. 차 항체를 가만히 따르다하고 PBS로 3 회 씻는다.
  12. 를 10 분 동안 0.1 g / ㎖ DAPI 또는 훽스트와 얼룩 셀.
  13. PBS로 3 회 세포를 씻어.
  14. 마운트 매니큐어와 장착 매체의 드롭 및 밀봉 된 커버로 된 커버.
  15. 세포를 관찰하고 수행63X 형광 현미경 이미지.

추가 항체로 염색하는 EMT 표현형을 확인하기 위해 수행 할 수 있습니다. 예를 들어, N-cadherin의 및 α-평활근 액틴은 중간 엽 표현형 29,31,32 스테인드 할 수 있습니다. 골격 구조의 개편은 F-액틴 11 phalloidin으로 세포를 염색하여 모니터링 할 수 있습니다. 또한, 세포 운동성 및 세포 사멸에 대한 저항성 분석법 EMT (11)의 특성을 조사하기 위해 수행 될 수있다.

QRT-PCR 분석 실험을 사용하여 검출 스플 라이스 동종의 3

  1. 프라이머 디자인
    NOTE : 프라이머 쌍은 신중 구별 동종 접합을 증폭하도록 설계되어야한다. 스킵 엑손, 가장 일반적으로 관찰 대안 접합 이벤트, 프라이머 디자인 전략을 설명하기 위해 예로서 여기에 도시되어있다.도 1a는 가변 엑손로서 제 엑손으로, 네 엑손 사전의 mRNA를 도시한다. 엑손의 포함 3 결과엑손 3의 스킵 반면 긴 스플 라이스 이소 형의 생산은, 스플 라이스 짧은 이소 형을 생성한다. 프라이머는 엑손-3-이소 포함하고 엑손-3-이소 스킵를 구별하고,이 전체의 mRNA 전 사체를 검출하도록 설계 될 필요가있다.
    1. 엑손 개재물의 검출을 위해, 신중하게 가변 엑손 포함 이소 형의 비 증폭을 허용 변수 엑손 3 및 인근 항시 엑손 4 내부 역방향 프라이머 안에 순방향 프라이머를 설계한다. 순방향 설계 및 게놈 DNA 또는 전-mRNA의 PCR 증폭에서 제품을 피하기 위하여 동일한 변수 엑손 내의 역방향 프라이머하지 않도록주의.
    2. 특히 엑손 건너 뛰는 이벤트, 디자인을 증폭하려면 변수 엑손 3가 포함 된 경우, 그렇지 않으면 파괴 될 것이다 구성 적 엑손 2 엑손 4의 교차점에 걸쳐 프라이머 중 하나. 이와 같이 항시 적 엑손 4 안에 다른 프라이머를 설계, PCR 제품 변수 엑손 3 exclud 때만 생성된다ED 및 엑손 2, 엑손 사이어서 서로 결합 항시.
    3. , 유전자의 전체 전 사체를 검출이 항시 엑손 1 및 2에서 프라이머를 설계하기 때문에, PCR 생성물은 모든 아형에서 증폭된다.
    4. 반드시 모든 프라이머에 대한 융해 온도 (TM)는 약 55 ° C, 각 프라이머의 길이는 약 18-22 뉴클레오타이드이다 확인하고, PCR 생성물의 크기는 80 내지 150 염기쌍이다.
  2. RNA 추출 (재료의 표 참조) 총 RNA 분리 키트를 사용하여 RNA를 추출합니다.
    1. 350 ㎕의 RNA의 용해 완충액에 세포를 수집한다.
    2. 해물을 70 % 에탄올 350 μl를 첨가하고 잘 섞는다.
    3. RNA 정제 컬럼에 샘플을 전송합니다.
    4. 1 분 및 폐기의 흐름을 통해 10,000 XG에 원심 분리기.
    5. RNA의 세척 버퍼 II 회 RNA 세척 버퍼 I의 500 μL와 배의 열을 씻으십시오.
    6. 잔류 RNA 세척 버퍼를 제거2 분 동안 최대 속도에서 원심 분리에 의해 컬럼으로부터 II.
    7. , 새로운 1.5 ㎖의 튜브에 열을 이동시켜 열 행렬의 중심에 50 μL 클레아없는 물을 첨가하고 최대 속도로 원심 분리하여 RNA를 용출시킨다.
  3. 첫 번째 가닥의 cDNA 합성
    1. UV 흡수 측정에 의한 농도와 RNA의 품질을 결정합니다. 참고 : 좋은 품질의 RNA는 약 2.0의 260 나노 미터 / 280 nm의 흡광도 비율을 가지고 있어야합니다.
    2. 20 μL의 최종 볼륨에서 250 NG 총 RNA, 0.05 μg 랜덤 헥사 머 프라이머, 50 pmol의 MgCl2를, 10 pmol의의의 dNTP, 2 ㎕의 5 × GoScript 버퍼, 1 μL RT 효소를 포함하는 역전사 효소 (RT) 반응을 설정합니다.
    3. RT 효소를 불 활성화하기 위해 5 분 동안 70 ° C에서 배양 한 다음 1 시간, 42 ° C에서 RT 반응을 수행합니다.
  4. 실시간 PCR
    1. 10 μL의 SYBR 녹색 마스터 믹스로 구성되어 20 ㎕의 반응을 설정,0.1 ~ 1.0 ㎕의 cDNA를 템플릿, 5 pmol의 앞으로 및 역방향 프라이머.
    2. 다음 단계의 40주기 실시간 PCR을 실행하여 95 ° C 변성을 10 초, 10 초 동안 58 ° C 어닐링, 30 초 동안 60 ° C의 확장을 위해. 세중에서 PCR 반응을 수행합니다.
    3. 해리 곡선을 확인하고 하나의 피크가 각각의 프라이머 세트에 대한 관찰되어 있는지 확인합니다.
    4. 증폭 곡선의 이차 미분 값을 계산하여 정량화 사이클 (Cq와) 값을 얻습니다.
    5. '델타 델타 Cq와 (ΔΔCq)'다음의 화학식으로 나타낸 바와 같이 방법을 사용하여 유도되지 않은 샘플과 비교하여 샘플에서 유도 된 대상의 mRNA의 상대적 양 (RQ)를 계산한다. 참고로, 같은 GAPDH 또는 TBP 등의 하우스 키핑 유전자를 사용합니다.

식 (1)
더 정확하게 스플 라이스 동종의 상대 값을 계산하려면 t그는 고려되어야 여러 참조 유전자의 사용합니다. 결과 Pfaffl 33,34 설명 변성 절대치 정량 방법을 사용하여 분석 할 수있다.

단백질 수준에서 스플 라이스 동종의 4 시험

  1. 100 ㎕의 얼음처럼 차가운 RIPA 버퍼에 세포를 수집합니다.
  2. 약 10 분 동안 얼음에 해물을 설정합니다.
  3. 4 ° C에서 10 분 동안 14,000 XG에 원심 분리하고, 상층 액을 수집합니다.
  4. 브래드 포드 분석에 의해 단백질 농도를 측정한다.
  5. SDS 로딩 버퍼에 단백질 시료를 희석하고 10 % SDS-PAGE 젤에 단백질의 20 ~ 40 μg을로드합니다.
  6. 1.5 시간 동안 20mA에서 SDS-PAGE 젤을 실행합니다.
  7. 85 V.에서 3 시간 동안 4 ° C에서 젖은 전송 시스템에서 PVDF 멤브레인에 전송 단백질은 목적 단백질의 분자량에 따라 전송 시간을 조정합니다.
  8. 30 분 실온에서 1 시간에 5 % 무 지방 우유에 차단 막.
  9. 막 위스콘신 품어4 ° CO / N에 차 항체를 일. (200)와 1 : 5000, 실험적 각 항체에 대한 최적의 희석을 결정 차 항체 희석의 범위는 일반적으로 (1) 사이에있다. 이 프로토콜에서 사용되는 항체의 희석은 "특정 시약 및 장비의 테이블"에서 찾을 수있다.
    1. 스플 라이스 아형을 검출하기 위해, 특히 특정한 이소 형을 인식하는 항체를 사용한다. 대안 적으로, 구성 적 코딩 엑손 영역의 에피토프를 인식하는 항체를 사용하여 서로 다른 크기의 단백질을 기반으로 동시에 접합 아형을 검출한다.
    2. 동시에, EMT 마커에 대한 발현 수준에 의해 EMT를 모니터링 할 수 있습니다. 중간 엽 마커로 사용하여 E-cadherin의, γ-catenin이, 상피 마커로 occludin 및 피브로넥틴, N-cadherin의 및 멘틴.
  10. 5 분 간격으로 TBS-T (50 mM 트리스, 150 mM의 염화나트륨, 0.05 % 트윈 20, 산도 7.4)로 세척 막 세 번.
  11. HRP-결합 된 보조 개미와 멤브레인을 품어실온에서 1 시간 동안 만 희석 : 1 ibody.
  12. 5 분 간격으로 TBS-T로 세척 막 세 번.
  13. 화학 발광 검출 계와 단백질을 시각화하고 오토 라디오 그래피 막에 막을 노출.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

상술 한 절차는 EMT 동안 대체 스 플라이 싱을 검출하는 강력한 방법을 제공한다. 트위스트에 의한 EMT 동안 CD44 스플 라이스 이소 전환의 대표적인 결과는 예를 들어 다음과 같습니다.

HMLE / 트위스트 - ER 세포에서 트위스트에 의한 EMT는 가늘고 긴 섬유 모세포 표현형 상피 표현형 같은 자갈 돌에서 전환 (그림 2A), 상피 마커 E-cadherin의, γ-catenin이와 occludin과의 부재에 의해 특징했다 중간 엽 마커 피브로넥틴, N-cadherin의 및 멘틴 (그림 2B)의 상향 조절. 또한, EMT는 세포 - 세포 접합 (그림 2C)에서 E-cadherin의 현지화의 손실에 의해 평가되었다.

EMT 동안 CD44 스플 라이스 동종의 전환 표현은 QRT-PCR과 면역 블로에 의해 조사 하였다. 인간 CD44 유전자는 구 변수 엑손으로 구성되어 있습니다. CD44의 대체 접합 프로에 셀 수 있습니다적어도 하나의 가변 엑손, 모든 변수 엑손의 결여이다 CD44 표준 (CD44s)를 포함 줄 이도록 CD44 변이체 (CD44v는).도 3a는 다양한 CD44 클로우 동종의 검출을위한 프라이머 디자인 전략을 도시한다. 역방향 프라이머는 V5 및 V6 변수를 함유 CD44v 클로우 아형을 검출하기위한 구성 적 엑손 5와 6 사이의 접합부에 걸쳐있는 동안 엑손 - 스킵 제품 CD44s의 검출을 위해, 정방향 프라이머는 항시 엑손 5에 위치하고 엑손, 정방향 및 역방향 프라이머 각각 V5 및 V6 내에 설계된다. 다른 CD44 가변 엑손 - 함유 동종의 검출을위한 프라이머가 동일한 전략을 사용하여 설계 될 수있다. 또한, 총 CD44 성적 증명서 앞으로의 사용과 구성 적 엑손 2 엑손 3 각각 (그림 3A)에있는 역방향 프라이머를 검출한다. 도 3b에 도시 된 바와 같이, QRT-PCR을 다음의 프라이머 세트를 이용하여 CD의 유의 한 감소를 나타 분석44V의 mRNA와 트위스트 - ER 발현 HMLE 세포에서 TAM 치료 14 일 후 CD44s mRNA의 증가. 대조적으로, CD44의 전체 성적은 EMT (그림 3C) 동안 변화가 없었다. CD44s 단백질의 발현이 크게 (도 3d)를 상향 조절 하였다 반면 QRT-PCR의 결과와 일치, CD44v 단백질의 수준은 현저하게 감소 하였다. 따라서, CD44의 주요 이소 형이 EMT 과정에서 CD44s에 CD44v 어긋나 있었다.

그림 1
그림 1 프라이머 디자인. 엑손 스키핑 모델에서 스 플라이 싱 이소 검출 용 프라이머의 위치를 설명하기위한 개략도. 회색 상자는 오렌지 박스 변수 엑손을 표현, 구성 적 엑손을 나타내고, 상자를 연결하는 얇은 선은 인트론을 나타낸다. 프라이머 위치는 indicat 아르화살표로 에드 : 검은 색 화살표는 전체의 mRNA를 검출하기위한 프라이머 세트를 표시, 주황색 화살표는 엑손 포함 이소을 증폭하기위한 프라이머 세트를 나타내며, 파란색 화살표는 엑손 스키핑 동종를 검출하기위한 프라이머 세트를 나타냅니다.

그림이
EMT의 2 유도 그림. (A) 위상 콘트라스트 이미지 (10 배)이 전 (치료) HMLE / 트위스트 - ER 세포의 형태 학적 변화를 설명하고 TAM 치료 14 일 후. (B) 면역 블롯 전에 HMLE / 트위스트 - ER 세포에서 EMT 마커 분석 (치료) 및 TAM 치료 14 일 후. TAM 처리, 하향 조절 하였다 상피 마커 E-카드 헤린, γ-카테닌, 및 occludin 및 간엽 마커 피브로넥틴, N-카드 헤린 및 멘틴에 상향 조절되었다. (C) 면역 형광 이미지 (63X) E-카드 헤린의 손실을 나타내는TAM 치료 14 일 후 세포 - 세포 접합에서 현지화. 그린 염색은 E-cadherin의를 표시하고, DAPI 염색 (파란색) 핵을 나타냅니다. 스케일 바 = 10 μm의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3
EMT 동안 CD44 스플 라이스 동종의 그림 3 스위치. (A) CD44 클로우 동종의 검출을위한 프라이머 디자인. 회색 상자는 오렌지 박스 변수 엑손을 표현, 구성 적 엑손을 나타내고, 상자를 연결하는 얇은 선은 인트론을 나타낸다. 프라이머 위치를 화살표로 표시됩니다 : 검은 색 화살표가 CD44 총 mRNA의 검출을위한 프라이머 세트를 표시, 주황색 화살표는 CD44v5-6을 증폭 프라이머 세트를 표시하고 파란색 화살표를위한 프라이머 세트를 나타냅니다CD44s 검출. (B, C) ​​즉 CD44v 가변 엑손의 V5 및 V6 (V5가 / 6) 및 CD44s (B), 및 CD44 전체의 mRNA를 함유하는 검출 EMT는 프라이머를 사용하는 동안 CD44 이소 형의 수준 QRT-PCR 분석 (C) . 일에서의 mRNA의 상대적 발현 수준은 14 세포는 TAM의 공 세포 치료 해당 일 및 처리하지 않은 그룹에 정상화되었다. 오차 막대는 SEM을 나타냅니다; N = HMLE / 트위스트 - ER 세포에서 TAM에 의한 EMT 동안 CD44 이소 형의 3 (D) 면역 블롯 분석. E-카드 헤린 및 N-카드 헤린의 수준은 EMT 상태를 파악하기 위해 모니터링되었다.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

여기에 설명 된 절차를 유도 EMT 모델에서 스 플라이 싱의 검출을 가능하게한다. 스플 라이스 이소 형의 발현의 이러한 동적 변화가 EMT의 시간 경과에 걸쳐 캡처 할 수있다. UN 관련 세포주 구별 유전 배경 부당 대체 스 플라이 싱에 영향을 미칠 수 있기 때문에이 방법은 다른 스 플라이 싱의 비교를위한 상이한 epithelial- 또는 간엽-나타내는 세포주의 사용에 이점을 갖는다. 그러나, EMT의 성공적인 유도 신중하게 선택적 스 플라이 싱 (alternative splicing)의 변화에​​ 어떤 결론을하기 전에 다양한 EMT 마커를 그릴 수 있습니다 사용하여 확인해야합니다. 또한, 여기에 설명 된 트위스트 - ER-유도 EMT 시스템에 추가하여, 이러한 달팽이-ER 또는 TGFβ에 의해 유도 된 것과 같은 다른 EMT 시스템은 실험 결과 11,30의 검증을 위해 사용하는 것이 좋습니다.

EMT 동안 동종 접합의 스위칭 모두 RNA 및 단백질 수준에서 검출 할 수있다. 스플 라이스 이소형태 - 특이 항체는 단백질 분석을 위해 바람직하다. 이소 형 - 특이 항체를 사용할 수없는 경우에는, 스플 라이스 동종의 단백질 수준을 면역 블 롯팅에 의해 SDS-PAGE에 자신의 분자량에 기초하여 결정될 수있다. 각각의 이소 형의 RNA 수준은 이소 형 - 특이 적 프라이머로 정량화 될 수있다. QRT-PCR 분석을 사용하여 각 이소 형의 배 변화는 민감하고 정확하게 측정 할 수 있습니다. 실험 재료와 같은 임상 검체에서 특정 스플 라이스 이소 형의 발현을 분석하기로 한정 될 때, 특히, QRT-PCR 분석은 면역 조직 화학에 대한 이소 형 - 특이 항체의 부족을 보상 할 정량적 측정 값을 제공한다.

여기에 언급 된 방법은 EMT 동안 공지 스플 라이스 이소 변화의 검출에 적합하다. 또한,이 방법은 게놈 전체의 대체 스 플라이 싱의 연구 및 EMT 동안 신규 한 접합 이소 스위칭의 식별을 위해 확장 될 수있다. 이를 위해서는그러한 깊은 시퀀싱 RNA 스 플라이 싱 또는 민감한 마이크로 어레이 플랫폼으로서 대규모 기법의 사용은, 상기 유도 EMT 모델로부터 분리 RNA를 사용하여 수행 될 수있다. 그럼에도 불구하고, 이소 변경 QRT-PCR 유효성 검사는 대규모 분석 다음이 필요합니다.

결론적으로, 대안적인 스 플라이 싱은 동적 EMT, 배아 발생 및 종양 전이를위한 중요한 과정 중에 조절된다. 인간 게놈에서 대체 스 플라이 싱의 고주파를 고려할 때 대체 스 플라이 싱의 조절은 세포 분화, 조직 개발, 프로그램 된 세포 사멸 35-41 포함하여 많은 다른 생물학적, 병리학 적 과정에서 중요한 역할을하는 것으로 보인다. 스플 라이스 동종의 검출을 위해 본원에 기재된 프로토콜뿐만 아니라 이러한 다른 시스템에 적용 할 수있을 것이다.

이러한 접합 기자 minigene 분석 등의 추가 실험 양식, 수 b전자는 더 시스 행동 요소와 선택적 스 플라이 싱 (alternative splicing) 30,42,43를 제어 트랜스 작용 요인의 규제 메커니즘을 조사하는 데 사용됩니다. 또한, EMT 동안 특정 스플 라이스 이소의 기능적 역할은 침묵 또는 ectopically 특정 이소을 표현하고 설명 EMT 유도 시스템 (11)에 EMT 유도를 모니터링하여 조사 할 수있다.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4-hydroxytamoxifen Sigma H7904 Make stock solution by dissolving 4-hydroxytamoxifen in ethanol to 200 μM. Keep the solution at -20 °C protected from light.
E.Z.N.A. Total RNA Isolation kit Omega Bio-Tek R6731 Total RNA isolation kit
GoScript Reverse Transcription System Promega A5001 Reagent for qRT-PCR assay
GoTaq qPCR Master Mix Promega A6002 Reagent for qRT-PCR assay
LightCycler 480 Real-Time PCR System Roche Equipment for qRT-PCR assay
CD44 antibody R&D Systems BBA10 1:1,000 dilution
E-cadherin antibody Cell Signaling Technology 4065 1:2,500 dilution for immunoblotting; 1:50 dilution for immunofluorescence
γ-Catenin antibody Cell Signaling Technology 2309 1:1,000 dilution
Occludin antibody Santa Cruz Biotechnology Inc. sc-5562 1:500 dilution
Fibronectin antibody BD Transduction Laboratories 610077 1:5,000 dilution
N-cadherin antibody BD Transduction Laboratories 610920 1:2,000 dilution
Vimentin antibody NeoMarkers MS-129-p1 1:500 dilution
GAPDH antibody Millipore Corporation MAB374 1:10,000 dilution
Amasham ECL Western blotting detection reagent GE Health Life Science RPN2209 Chemiluminescence system

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Thiery, J. P., Sleeman, J. P. Complex networks orchestrate epithelial-mesenchymal transitions. Nat Rev Mol Cell Biol. 7, 131-142 (2006).
  2. Yang, J., Weinberg, R. A. Epithelial-mesenchymal transition at the crossroads of development and tumor metastasis. Dev Cell. 14, 818-829 (2008).
  3. Yang, J., et al. a master regulator of morphogenesis, plays an essential role in tumor metastasis. Cell. 117, 927-939 (2004).
  4. Batlle, E., et al. The transcription factor snail is a repressor of E-cadherin gene expression in epithelial tumour cells. Nat Cell Biol. 2, 84-89 (2000).
  5. Cano, A., et al. The transcription factor snail controls epithelial-mesenchymal transitions by repressing E-cadherin expression. Nat Cell Biol. 2, 76-83 (2000).
  6. Comijn, J., et al. The two-handed E box binding zinc finger protein SIP1 downregulates E-cadherin and induces invasion. Mol Cell. 7, 1267-1278 (2001).
  7. Bolos, V., et al. The transcription factor Slug represses E-cadherin expression and induces epithelial to mesenchymal transitions: a comparison with Snail and E47 repressors. J Cell Sci. 116, 499-511 (2003).
  8. Eger, A., et al. DeltaEF1 is a transcriptional repressor of E-cadherin and regulates epithelial plasticity in breast cancer cells. Oncogene. 24, 2375-2385 (2005).
  9. Shapiro, I. M., et al. An EMT-driven alternative splicing program occurs in human breast cancer and modulates cellular phenotype. PLoS Genet. 7, e1002218 (2011).
  10. Warzecha, C. C., et al. An ESRP-regulated splicing programme is abrogated during the epithelial-mesenchymal transition. EMBO J. 29, 3286-3300 (2010).
  11. Brown, R. L., et al. CD44 splice isoform switching in human and mouse epithelium is essential for epithelial-mesenchymal transition and breast cancer progression. J Clin Invest. 121, 1064-1074 (2011).
  12. Wang, E. T., et al. Alternative isoform regulation in human tissue transcriptomes. Nature. 456, 470-476 (2008).
  13. Pan, Q., Shai, O., Lee, L. J., Frey, B. J., Blencowe, B. J. Deep surveying of alternative splicing complexity in the human transcriptome by high-throughput sequencing. Nat Genet. 40, 1413-1415 (2008).
  14. Liu, S., Cheng, C. Alternative RNA splicing and cancer. Wiley Interdiscip Rev RNA. 4, 547-566 (2013).
  15. Shtivelman, E., Lifshitz, B., Gale, R. P., Roe, B. A., Canaani, E. Alternative splicing of RNAs transcribed from the human abl gene and from the bcr-abl fused gene. Cell. 47, 277-284 (1986).
  16. Krangel, M. S. Secretion of HLA-A and -B antigens via an alternative RNA splicing pathway. J Exp Med. 163, 1173-1190 (1986).
  17. Brickell, P. M., Latchman, D. S., Murphy, D., Willison, K., Rigby, P. W. Activation of a Qa/Tla class I major histocompatibility antigen gene is a general feature of oncogenesis in the mouse. Nature. 306, 756-760 (1983).
  18. Barbaux, S., et al. Donor splice-site mutations in WT1 are responsible for Frasier syndrome. Nat Genet. 17, 467-470 (1997).
  19. Charlet, B. N., et al. Loss of the muscle-specific chloride channel in type 1 myotonic dystrophy due to misregulated alternative splicing. Mol Cell. 10, 45-53 (2002).
  20. Hutton, M., et al. Association of missense and 5'-splice-site mutations in tau with the inherited dementia FTDP-17. Nature. 393, 702-705 (1998).
  21. Kohsaka, T., et al. Exon 9 mutations in the WT1 gene, without influencing KTS splice isoforms, are also responsible for Frasier syndrome. Hum Mutat. 14, 466-470 (1999).
  22. Philips, A. V., Timchenko, L. T., Cooper, T. A. Disruption of splicing regulated by a CUG-binding protein in myotonic dystrophy. Science. 280, 737-741 (1998).
  23. Savkur, R. S., Philips, A. V., Cooper, T. A. Aberrant regulation of insulin receptor alternative splicing is associated with insulin resistance in myotonic dystrophy. Nat Genet. 29, 40-47 (2001).
  24. Spillantini, M. G., et al. Mutation in the tau gene in familial multiple system tauopathy with presenile dementia. Proc Natl Acad Sci USA. 95, 7737-7741 (1998).
  25. Wang, J., et al. Myotonic dystrophy evidence for a possible dominant-negative RNA mutation. Hum Mol Genet. 4, 599-606 (1995).
  26. Graubert, T. A., et al. Recurrent mutations in the U2AF1 splicing factor in myelodysplastic syndromes. Nat Genet. 44, 53-57 (2012).
  27. Papaemmanuil, E., et al. Somatic SF3B1 mutation in myelodysplasia with ring sideroblasts. N Engl J Med. 365, 1384-1395 (2011).
  28. Yoshida, K., et al. Frequent pathway mutations of splicing machinery in myelodysplasia. Nature. 478, 64-69 (2011).
  29. Mani, S. A., et al. The epithelial-mesenchymal transition generates cells with properties of stem cells. Cell. 133, 704-715 (2008).
  30. Reinke, L. M., Xu, Y., Cheng, C. Snail represses the splicing regulator epithelial splicing regulatory protein 1 to promote epithelial-mesenchymal transition. J Biol Chem. 287, 36435-36442 (2012).
  31. Serini, G., Gabbiani, G. Mechanisms of myofibroblast activity and phenotypic modulation. Exp Cell Res. 250, 273-283 (1999).
  32. Zavadil, J., Bottinger, E. P. TGF-beta and epithelial-to-mesenchymal transitions. Oncogene. 24, 5764-5774 (2005).
  33. Pfaffl, M. W. A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR. Nucleic Acids Res. 29, e45 (2001).
  34. Hellemans, J., Mortier, G., De Paepe, A., Speleman, F., Vandesompele, J. qBase relative quantification framework and software for management and automated analysis of real-time quantitative PCR data. Genome Biol. 8, R19 (2007).
  35. Boutz, P. L., et al. A post-transcriptional regulatory switch in polypyrimidine tract-binding proteins reprograms alternative splicing in developing neurons. Genes Dev. 21, 1636-1652 (2007).
  36. Salomonis, N., et al. Alternative splicing regulates mouse embryonic stem cell pluripotency and differentiation. Proc Natl Acad Sci USA. 107, 10514-10519 (2010).
  37. Calarco, J. A., et al. Regulation of vertebrate nervous system alternative splicing and development by an SR-related protein. Cell. 138, 898-910 (2009).
  38. Grabowski, P. Alternative splicing takes shape during neuronal development. Curr Opin Genet Dev. 21, 388-394 (2011).
  39. Seol, D. W., Billiar, T. R. A caspase-9 variant missing the catalytic site is an endogenous inhibitor of apoptosis. J Biol Chem. 274, 2072-2076 (1999).
  40. Srinivasula, S. M., et al. Identification of an endogenous dominant-negative short isoform of caspase-9 that can regulate apoptosis. Cancer Res. 59, 999-1002 (1999).
  41. Akgul, C., Moulding, D. A., Edwards, S. W. Alternative splicing of Bcl-2-related genes functional consequences and potential therapeutic applications. Cell Mol Life Sci. 61, 2189-2199 (2004).
  42. Cooper, T. A. Use of minigene systems to dissect alternative splicing elements. Methods. 37, 331-340 (2005).
  43. Cheng, C., Sharp, P. A. Regulation of CD44 alternative splicing by SRm160 and its potential role in tumor cell invasion. Mol Cell Biol. 26, 362-370 (2006).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics