Detección de splicing alternativo Durante epitelial-mesenquimal de transición

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Huang, H., Xu, Y., Cheng, C. Detection of Alternative Splicing During Epithelial-Mesenchymal Transition. J. Vis. Exp. (92), e51845, doi:10.3791/51845 (2014).

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Abstract

Introduction

La transición epitelial-mesenquimal (EMT) es un programa de desarrollo que impulsa la morfogénesis de órganos y la remodelación de tejidos durante la embriogénesis. Cuando se activa de forma anormal, EMT promueve la metástasis tumoral y la fibrosis de órganos 1,2. Estudios convincentes han descrito la importancia de la regulación transcripcional durante el proceso de la EMT, que se define por varios factores de transcripción, como Twist, Caracol, y ZEB, que reprimen la expresión de la proteína de unión adherens E-cadherina, lo que resulta en la pérdida de un cobble- piedra, como la morfología del epitelio y la ganancia de un fenotipo mesenquimal fusiforme 3-8. Estudios recientes a través del análisis de todo el genoma de ARN revelaron que existe un grupo de genes cuyos patrones de empalme están asociados ya sea con fenotipos epiteliales o mesenquimales 9,10. El trabajo de nuestro laboratorio funcionalmente conectado splicing alternativo y EMT. Mediante el estudio de la superficie celular molécula de adhesión CD44, hemos demostrado que CD44 alternativa empalme está estrechamente regulada durante EMT, y lo más importante, que la isoforma de empalme CD44 conmutación causalmente contribuye a EMT 11.

Splicing alternativo representa un modelo generalizado y conservado de la regulación de genes, ya que hasta el 95% de los genes de varios exones humanos están empalmados alternativamente 12-14. Mediante la generación de múltiples productos de proteína a partir de un único gen, corte y empalme alternativo constituye un mecanismo esencial para la diversidad de proteínas, la adición de otra capa de complejidad al genoma humano. Como tal, la desregulación de splicing alternativo podría dar lugar a profundos efectos biológicos que causan enfermedades humanas. De hecho, el splicing alternativo aberrante en enfermedades se ha documentado desde hace más de una década 15-25, incluyendo los recientes hallazgos de que las mutaciones en los genes que codifican la maquinaria spliceosome se encuentran comúnmente en los síndromes mielodisplásicos 26-28. Por lo tanto, el desarrollo de métodos fiables para la detección de i empalmados alternativamentesoforms es de gran importancia en el estudio de diversos procesos biológicos incluyendo la EMT.

Aquí proporcionamos un protocolo para detectar cambios en el splicing alternativo utilizando un modelo EMT inducible. Los métodos para diseñar cebadores de PCR y la detección de isoformas de empalme son adecuados no sólo para el estudio de corte y empalme alternativo durante la EMT, sino también para el estudio de splicing alternativo en otros procesos biológicos. La investigación de corte y empalme alternativo durante EMT es imperativo con el fin de comprender mejor los mecanismos de la EMT y la metástasis del tumor, facilitando así el desarrollo de estrategias eficaces para tratar la metástasis del cáncer.

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Protocol

1. cultivo celular de EMT Inducción

Nota: EMT puede ser inducida por tratamiento de TGF o la expresión ectópica de factores de transcripción Twist, Snail, o ZEB1 / 2 en las células epiteliales. Se describe en este protocolo es un sistema inducible EMT través de la expresión de la proteína de fusión Twist-ER en las células mamarias humanas inmortalizadas epiteliales (HMLE / Twist-ER, un regalo del Dr. J Yang, UCSD) 9,11,29. Tras 4-hidroxitamoxifeno tratamiento (TAM), la proteína de fusión Twist-ER se transloca al núcleo para conducir la transcripción y los resultados en una transición EMT completa en 12-14 días 9,11,29. Sistemas inducibles EMT adicionales, como HMLE / Caracol-ER, HMLE / TGF, y MCF10A / TGF, se pueden encontrar en nuestras publicaciones anteriores 11,30.

  1. Mantener células HMLE / desenroscables ER en mamaria medio de crecimiento de células epiteliales sin suero (MEGM) en una incubadora a 37 ° con 5% de CO 2. Pasaje de las células cada 2-3 días cuando llegan a 80% de confluencia. Se incuban las células con 0,15% de tripsina a 37 ° C durante 5-10 min, y después inactivar la tripsina con suero de ternera 5% / DMEM. Centrifugar las células y resuspender en MEGM. Células de la placa en una nueva placa de cultivo tisular en una proporción de 1 a 4.
  2. Disolver TAM en etanol para preparar una solución 200 mM. Proteja TAM de la luz y almacenar a -20 ° C. Antes de su uso, recién añadir TAM en medios MEGM a una dilución de 1: 10.000 para hacer una concentración final de 20 nM TAM.
  3. Para la inducción de la EMT, placa células 1,6 x 10 6 HMLE / desenroscables ER en una placa de 10 cm de cultivo de tejidos por duplicado. Células de cultivo con medios 20 nM TAM-que contiene MEGM.
  4. Placa células 1,6 x 10 6 HMLE / desenroscables ER en una placa de 10 cm por duplicado y el tratamiento de las células con etanol 0,01% como control no tratada con TAM.
  5. Dos días después de la incubación, tomar fotografías bajo un microscopio de luz a un aumento de 10X para registrar los cambios morfológicos de las células.
  6. Aspirar el medio de un plato de control o tratados con TAMcélulas. Lavar las células con PBS frío, y las células de la cosecha mediante el desguace de un medio de la placa en tampón de lisis de ARN para el aislamiento de ARN y la otra mitad en tampón RIPA para el análisis de proteínas.
  7. Células pasaje del control o platos tratados con TAM en 1,6 x 10 6 células re-enchapado en una placa de 10 cm por duplicado. Continuamente tratar las células con 20 nM de TAM o vehículo.
  8. Repita los pasos 5 a 7 una vez cada dos días hasta el día 14, momento en el cual, las células Twist-ER tratados con TAM muestran una morfología mesenquimal fusiforme, mientras que las células de control tratados con vehículo mantienen la morfología epitelial-adoquines similares.

2. Caracterización de EMT

Nota: A la finalización de la EMT se indica mediante: (1) celulares cambios morfológicos de una morfología epitelial-adoquines como éste adopte un aspecto fibroblástico en forma de huso; (2) Pérdida de localización E-cadherina en las uniones célula-célula; y (3) La expresión de los marcadores de EMT de conmutación, que se define por la pérdidade marcadores epiteliales y ganancia de marcadores mesenquimales.

Cambios morfológicos celulares son capturados por microscopio de luz a un aumento de 10X durante el curso del tiempo de la inducción de EMT, descrito en la Sección 1.-Immuno fluorescencia detección de E-cadherina en células uniones se describe en esta sección. La expresión de marcadores de EMT se detecta por inmunotransferencia. Marcadores epiteliales comunes son la E-cadherina, γ-catenina, y ocludina y marcadores mesenquimales incluyen fibronectina, N-cadherina y vimentina. Procedimientos generales de inmunotransferencia se describen en la Sección 4.

  1. En el día 12 del tratamiento TAM, semilla de 1 x 10 5 células en un 12 mm de vidrio cubreobjetos circular colocado en un pocillo de una placa de 24 pocillos.
  2. 48 horas después de la siembra de células, medio aspirado y lavado con PBS precalentado.
  3. Fijar las células con pre-calentado paraformaldehído al 4% durante 15 min.
  4. Lavar las células tres veces con PBS.
  5. Se incuban las células con 0,2% de Triton X-100 en PBS durante 15min a TA.
  6. Lavar las células tres veces con PBS.
  7. Se incuban las células en 5% de BSA / PBS durante 1 hora a TA para bloquear la unión no específica.
  8. Se incuban las células con el anticuerpo primario E-cadherina en una dilución 1:50 en 1% de BSA / PBS en una cámara humidificada O / N a 4 ° C. NOTA: El intervalo de dilución de anticuerpo primario es normalmente entre 1:50 y 1: 200, y la dilución óptima para cada anticuerpo debe ser determinado experimentalmente.
  9. Decantar el anticuerpo primario y lavar las células tres veces con PBS.
  10. Se incuban las células con anticuerpo secundario marcado con fluorescencia en una dilución 1: 500 durante 1 hora a RT. Desde este paso en, proteger las células de la luz.
  11. Decantar el anticuerpo secundario y lavar tres veces con PBS.
  12. Las células se tiñen con 0,1-1 g / ml DAPI o Hoechst durante 10 min.
  13. Enjuagar las células con PBS tres veces.
  14. Monte cubreobjetos con una gota de medio de montaje y cubreobjetos sello con esmalte de uñas.
  15. Observar las células y tomarimages bajo un microscopio de fluorescencia 63X.

La tinción con anticuerpos adicionales se puede realizar para confirmar el fenotipo EMT. Por ejemplo, N-cadherina y α-actina de músculo liso se pueden teñir para un 29,31,32 fenotipo mesenquimal. Reorganización de la estructura del citoesqueleto se puede controlar mediante tinción de las células con faloidina para F-actina 11. Además, los ensayos para la motilidad celular y la resistencia a la muerte celular se pueden realizar para examinar las propiedades de EMT 11.

3. Detección de Empalme isoformas utilizando ensayos de qRT-PCR

  1. Diseño Primer
    NOTA: Primer pares deben ser cuidadosamente diseñados para amplificar distintas isoformas de empalme. Omisión de exón, el evento splicing alternativo más comúnmente observado, se muestra aquí como un ejemplo para ilustrar la estrategia de diseño del cebador. Figura 1A representa una de cuatro exón pre-ARNm, con el tercer exón como un exón variable. La inclusión del exón 3 resultados enla producción de una isoforma de empalme más largo, mientras que la omisión del exón 3 genera una isoforma de empalme más corta. Los cebadores deben ser diseñados para distinguir la isoforma exón-3-y-incluido el exón 3-omitido isoforma, y ​​para detectar la transcripción de ARNm total de este.
    1. Para la detección de exón inclusión, diseñar cuidadosamente un cebador directo dentro de la variable de exón 3, y un cebador inverso en el interior del exón constitutiva cerca 4, lo que permite la amplificación específica de la isoforma exón-incluido variable. Asegúrese de no diseñar adelante y atrás primers dentro del mismo exón variable con el fin de evitar los productos de PCR amplificados a partir de ADN genómico o pre-mRNA.
    2. Para amplificar específicamente eventos omisión de exón, diseño uno de los cebadores que abarcan la unión del exón constitutiva 2 y el exón 4 que de otro modo se destruye cuando el exón variable de 3 se incluye. Diseñar el otro cebador dentro del exón constitutiva 4. Como tal, los productos PCR se generan sólo cuando el exón variable de 3 es en excluired y la constitutiva posteriormente se unen exón 2 y el exón 4 juntos.
    3. Para detectar los transcritos totales del gen, el diseño de los cebadores dentro de los dos exones constitutivos 1 y 2 Por lo tanto, los productos de PCR se amplificaron a partir de todas las isoformas.
    4. Asegúrese de que la temperatura de fusión (Tm) para todos los cebadores es de aproximadamente 55 ° C, la longitud de cada cebador es de aproximadamente 18-22 nucleótidos, y el tamaño de los productos de PCR es de entre 80 y 150 pares de bases.
  2. La extracción de RNA: Extracto de ARN utilizando un kit de aislamiento total de ARN (véase la Tabla de Materiales).
    1. Recoger las células en 350 l de tampón de lisis de ARN.
    2. Añadir 350 l de etanol al 70% al lisado y mezclar bien.
    3. Transferir la muestra a la columna de purificación de ARN.
    4. Centrifugar a 10.000 xg durante 1 min y descarte de flujo a través.
    5. Lavar la columna una vez con 500 l de tampón de lavado ARN I y dos veces con tampón de lavado II de ARN.
    6. Retirar el tampón de lavado residual de ARNII de la columna por centrifugación a velocidad máxima durante 2 min.
    7. Transferir la columna en un nuevo tubo de 1,5 ml, añadir 50 l de agua libre de nucleasa en el centro de la matriz de la columna y eluir el ARN por centrifugación a la velocidad máxima.
  3. Síntesis de la primera cadena de ADNc
    1. Determinar la concentración y la calidad del ARN mediante medición de la absorción UV. NOTA: Good ARN de calidad debe tener una relación de absorbancia / 280 nm 260 nm de aproximadamente 2,0.
    2. Configuración de la transcriptasa inversa (RT) reacciones que contienen 250 ng de ARN total 0,05 g cebadores hexámeros al azar, 50 pmol de MgCl 2, 10 pmol dNTP, 2 l 5 x tampón de goscript, y 1 l de la enzima RT en un volumen final de 20 l.
    3. Realizar RT reacciones a 42 º C durante 1 hora, seguido de incubación a 70 ° C durante 5 minutos para inactivar la enzima RT.
  4. PCR en tiempo real
    1. Establezca 20 l reacciones que consisten en 10 l SYBR verde Master Mix,0,1-1,0 l molde de ADNc, y 5 pmol cebadores directo e inverso.
    2. Ejecute PCR en tiempo real con 40 ciclos de los siguientes pasos: 95 ° C desnaturalización durante 10 segundos, 58 ° C recocido durante 10 segundos, y 60 ° C de extensión durante 30 segundos. Lleve a cabo reacciones de PCR por triplicado.
    3. Compruebe curvas de disociación y asegúrese de que un solo pico se observa para cada grupo de cebadores.
    4. Obtener los valores de ciclo de cuantificación (Cq) mediante el cálculo de los segundos valores derivados de curvas de amplificación.
    5. Calcular la cantidad relativa (RQ) de ARNm diana en las muestras inducidas en comparación con la muestra no inducida a través del "delta delta Cq (ΔΔCq) 'método como se muestra por la siguiente fórmula. Utilice los genes de limpieza, tales como GAPDH o PDD, como referencia.

Ecuación 1
Para calcular con mayor precisión los valores relativos de las isoformas de empalme, tl uso de múltiples genes de referencia debe ser considerada. Los resultados pueden ser analizados usando un método de cuantificación valor absoluto modificado descrito por Pfaffl et al 33,34.

4. Examen de Empalme Isoformas a nivel de proteínas

  1. Recoger las células en 100 tampón RIPA helada l.
  2. Conjunto lisados ​​en hielo durante aproximadamente 10 min.
  3. Centrifugar a 14.000 xg durante 10 min a 4 ° C, y recoger el sobrenadante.
  4. Medir la concentración de proteína mediante ensayos de Bradford.
  5. Diluir las muestras de proteína en tampón de carga SDS y cargar 20-40 g de proteínas en 10% geles de SDS-PAGE.
  6. Ejecute geles SDS-PAGE a 20 mA durante 1,5 horas.
  7. Proteínas de transferencia a membranas de PVDF en un sistema de transferencia húmeda a 4 ° C durante 3 horas a 85 V. Ajuste el tiempo de transferencia de acuerdo con el peso molecular de las proteínas diana.
  8. Bloquear la membrana en la leche desnatada al 5% durante 30 min a 1 hora a TA.
  9. Incubar wi membranath un anticuerpo primario a 4 ° CO / N. El rango de dilución de anticuerpo primario es normalmente entre 1: 200 y 1: 5000, determinar la dilución óptima para cada anticuerpo experimentalmente. La dilución de los anticuerpos utilizados en este protocolo se puede encontrar en la "Tabla de reactivos y equipos específicos".
    1. Para detectar isoformas de empalme, utilizar anticuerpos específicos que reconocen una isoforma particular. Alternativamente, utilizar un anticuerpo que reconoce el epítopo en la región de codificación de exón constitutiva y detectar isoformas de empalme de forma simultánea sobre la base de sus diferentes tamaños de proteína.
    2. Al mismo tiempo, controlar EMT por inmunotransferencia para los marcadores de EMT. Utilice E-cadherina, γ-catenina, y ocludina como marcadores epiteliales, y la fibronectina, N-cadherina y vimentina como marcadores mesenquimales.
  10. De membrana de lavado tres veces con TBS-T (Tris 50 mM, NaCl 150 mM, 0,05% de Tween 20, pH 7,4) en un intervalo de 5 min.
  11. Incubar la membrana con una hormiga secundario conjugado con HRPibody en una dilución de 1: 10.000 durante 1 hora a RT.
  12. Membrana Lavar tres veces con TBS-T en un intervalo de 5 min.
  13. Visualizar proteína con un sistema de detección de quimioluminiscencia y exponer la membrana a una película de autorradiografía.

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Representative Results

Los procedimientos descritos anteriormente proporcionan un método robusto para detectar splicing alternativo durante la EMT. Los resultados representativos de empalme isoforma CD44 conmutación durante EMT inducida Twist-A continuación se dan como ejemplo.

EMT inducida Twist-en las células HMLE / Twist-ER se caracteriza por una transición de un adoquín como fenotipo epitelial a un fenotipo fibroblástico alargada (Figura 2A), la ausencia de marcadores epiteliales E-cadherina, γ-catenina y ocludina y la la regulación positiva de los marcadores mesenquimales fibronectina, N-cadherina, y vimentina (Figura 2B). Además, EMT se evaluó por la pérdida de la localización de la E-cadherina en las uniones célula-célula (Figura 2C).

La expresión de CD44 conmutada isoformas de empalme durante la EMT fue examinado por QRT-PCR e inmunotransferencia. El gen CD44 humano está compuesto de nueve exones variables. El empalme alternativo de CD44 permite a las células proDuce variantes de CD44 (CD44v) que incluyen al menos un exón variable y CD44 estándar (CD44s) que carece de todos los exones variables. Figura 3A representa la estrategia de diseño del cebador para la detección de diversas isoformas de empalme CD44. Para la detección de los productos CD44s-exón omitido, el cebador directo se encuentra en el exón 5 constitutiva, mientras que el cebador inverso extiende a través de la unión entre los exones constitutivos 5 y 6 Para la detección de isoformas de empalme CD44v que contiene la variable V5 y V6 exones, el delantero y atrás primers están diseñados dentro de la v5 y v6, respectivamente. Los cebadores para la detección de variables de otras isoformas que contienen el exón-CD44 pueden ser diseñados utilizando la misma estrategia. Además, se detecta transcripción total de CD44 utilizando adelante y cebadores localizados en el exón constitutiva 2 y el exón 3, respectivamente (Figura 3A) revertir. Como se muestra en la Figura 3B, QRT-PCR análisis de la utilización de estos conjuntos de cebadores indica una disminución significativa en CDARNm 44v y el aumento de CD44s mRNA después de 14 días de tratamiento TAM en las células HMLE Twist-ER-expresión. Por el contrario, la transcripción total de CD44 se mantuvo sin cambios durante EMT (Figura 3C). Consistente con los resultados de QRT-PCR, el nivel de proteína de CD44v disminuyó notablemente, mientras que la expresión de la proteína CD44s se upregulated en gran medida (Figura 3D). Por lo tanto, la principal isoforma de CD44 se desplazó de CD44v a CD44s durante el proceso de EMT.

Figura 1
Diseño de la figura 1 Primer. Diagramas esquemáticos que ilustran la ubicación de cebadores para la detección de isoformas de empalme en un modelo de omisión de exón. Las cajas grises representan los exones constitutivos, las cajas de naranjas representan exones variables, y las delgadas líneas que conectan cuadros denotan intrones. Las ubicaciones de cebadores son indicated por flechas: flechas negras indican los conjuntos de cebadores para la detección de mRNA total flechas de color naranja indican conjuntos de cebadores para amplificar isoformas exón-incluido, y las flechas azules indican los conjuntos de cebadores para la detección de isoformas de omisión de exón.

Figura 2
Figura 2. inducción de la EMT. (A) Imágenes de contraste de fase (10X) que ilustra los cambios morfológicos en las células HMLE / Torsión-ER antes (sin tratar) y después de 14 días de tratamiento TAM. (B) El análisis por inmunotransferencia de los marcadores de EMT en células HMLE / Torsión-ER antes (sin tratar) y después de 14 días de tratamiento TAM. Tras el tratamiento de TAM, marcadores epiteliales E-cadherina, γ-catenina, y ocludina fueron downregulated, y mesenquimales marcadores fibronectina, N-cadherina y vimentina se upregulated. (C) imágenes de fluorescencia Inmune (63X) que indica la pérdida de E-cadherinalocalización en las uniones entre células después de 14 días de tratamiento TAM. Tinción verde indica E-cadherina, y DAPI (azul) indica núcleos. Barra de escala = 10 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3
Figura 3 Interruptor de isoformas de empalme CD44 durante la EMT. (A) Diseño de cebadores para la detección de isoformas de empalme CD44. Las cajas grises representan los exones constitutivos, las cajas de naranjas representan exones variables, y las delgadas líneas que conectan cuadros denotan intrones. Las ubicaciones de imprimación se indican con flechas: flechas negras indican los conjuntos de cebadores para la detección de mRNA total de CD44, flechas de color naranja indican conjuntos de cebadores para amplificar CD44v5-6, y las flechas azules indican los conjuntos de cebadores parala detección de CD44s. (B, C) ​​QRT-PCR análisis de los niveles de isoformas de CD44 durante EMT utilizando cebadores que detectan específicamente CD44v que contiene exones variable V5 y V6 (v5 / 6) y CD44s (B), y total de ARNm de CD44 (C) . Niveles relativos de expresión de mRNA en el Día 14 células se normalizaron a día correspondiente 0 células en TAM grupos tratados y no tratados. Las barras de error indican SEM; n = 3 (D) El análisis por inmunotransferencia de las isoformas de CD44 durante la EMT inducida por TAM en células HMLE / desenroscables ER. Los niveles de E-cadherina y N-cadherina se monitorizaron para identificar el estado de la EMT.

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Discussion

El procedimiento descrito aquí permite la detección de corte y empalme alternativo en un modelo inducible EMT. Como tales, las alteraciones dinámicas de empalme isoforma expresión pueden ser capturados durante todo el curso de tiempo de EMT. Este método tiene ventajas sobre el uso de diferentes epithelial- o líneas de células mesenquimales-que representa para la comparación de splicing alternativo debido a antecedentes genéticos distintos de líneas celulares no relacionados, podrían influir indebidamente en el splicing alternativo. Sin embargo, el éxito de la inducción de la EMT debe ser confirmada con cuidado utilizando varios marcadores EMT antes de sacar conclusiones sobre los cambios en el splicing alternativo se pueden extraer. Además, en adición al sistema de EMT Twist-ER-inducible se describe aquí, se recomiendan otros sistemas de EMT tales como los inducidos por Snail-ER o TGF para la validación de los resultados experimentales 11,30.

La conmutación de isoformas de empalme durante EMT se puede detectar en ambos niveles de ARN y proteínas. Iso Spliceanticuerpos específicos de formulario que son los preferidos para el análisis de proteínas. Cuando los anticuerpos isoforma específica no están disponibles, los niveles de proteína de isoformas de empalme se pueden determinar en función de su peso molecular en SDS-PAGE por inmunotransferencia. El nivel de ARN de cada isoforma se puede cuantificar mediante cebadores isoforma específica. El uso de ensayos de qRT-PCR, el pliegue del cambio de cada isoforma puede ser determinado de manera sensible y precisa. En particular, cuando los materiales experimentales se limitan, como el análisis de la expresión de una isoforma de empalme especialmente en muestras clínicas, análisis de QRT-PCR proporciona una medida cuantitativa que compensar la falta de isoforma anticuerpos específicos para inmunohistoquímica.

El método mencionado aquí es adecuado para la detección de cambios de isoformas de empalme conocidos durante EMT. Además, este método se puede ampliar para el estudio de corte y empalme alternativo de todo el genoma y para la identificación de la novela de conmutación isoforma de empalme durante la EMT. Para lograr esto,uso de una técnica a gran escala, tal como ARN profunda-Secuenciación de empalme o plataformas de microarrays sensible, podría llevarse a cabo utilizando ARN aislado a partir del modelo EMT inducible descrito anteriormente. Sin embargo, se requiere la validación qRT-PCR de los cambios de isoforma después de cualquier análisis a gran escala.

En conclusión, corte y empalme alternativo se regula dinámicamente durante EMT, un proceso que es crítico para el desarrollo embrionario y la metástasis del tumor. Teniendo en cuenta la alta frecuencia de corte y empalme alternativo en el genoma humano, es probable que la regulación del splicing alternativo desempeña un papel importante en muchos otros procesos biológicos y patológicos, incluyendo la diferenciación celular, el desarrollo de tejidos, y la muerte celular programada 35-41. El protocolo descrito en el presente documento para la detección de isoformas de empalme será aplicable a estos otros sistemas también.

Modalidades experimentales adicionales, tales como ensayos minigene reportero de empalme, puede be utiliza para investigar más a fondo los mecanismos de regulación de los elementos que actúan en cis-y trans-actuando factores que controlan el splicing alternativo 30,42,43. Además, el papel funcional de una isoforma de empalme particular durante EMT puede ser investigada por silenciar o ectópica que expresa la isoforma específica y el seguimiento de la inducción de EMT en el sistema de EMT-inducible descrito 11.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
4-hydroxytamoxifen Sigma H7904 Make stock solution by dissolving 4-hydroxytamoxifen in ethanol to 200 μM. Keep the solution at -20 °C protected from light.
E.Z.N.A. Total RNA Isolation kit Omega Bio-Tek R6731 Total RNA isolation kit
GoScript Reverse Transcription System Promega A5001 Reagent for qRT-PCR assay
GoTaq qPCR Master Mix Promega A6002 Reagent for qRT-PCR assay
LightCycler 480 Real-Time PCR System Roche Equipment for qRT-PCR assay
CD44 antibody R&D Systems BBA10 1:1,000 dilution
E-cadherin antibody Cell Signaling Technology 4065 1:2,500 dilution for immunoblotting; 1:50 dilution for immunofluorescence
γ-Catenin antibody Cell Signaling Technology 2309 1:1,000 dilution
Occludin antibody Santa Cruz Biotechnology Inc. sc-5562 1:500 dilution
Fibronectin antibody BD Transduction Laboratories 610077 1:5,000 dilution
N-cadherin antibody BD Transduction Laboratories 610920 1:2,000 dilution
Vimentin antibody NeoMarkers MS-129-p1 1:500 dilution
GAPDH antibody Millipore Corporation MAB374 1:10,000 dilution
Amasham ECL Western blotting detection reagent GE Health Life Science RPN2209 Chemiluminescence system

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References

  1. Thiery, J. P., Sleeman, J. P. Complex networks orchestrate epithelial-mesenchymal transitions. Nat Rev Mol Cell Biol. 7, 131-142 (2006).
  2. Yang, J., Weinberg, R. A. Epithelial-mesenchymal transition at the crossroads of development and tumor metastasis. Dev Cell. 14, 818-829 (2008).
  3. Yang, J., et al. a master regulator of morphogenesis, plays an essential role in tumor metastasis. Cell. 117, 927-939 (2004).
  4. Batlle, E., et al. The transcription factor snail is a repressor of E-cadherin gene expression in epithelial tumour cells. Nat Cell Biol. 2, 84-89 (2000).
  5. Cano, A., et al. The transcription factor snail controls epithelial-mesenchymal transitions by repressing E-cadherin expression. Nat Cell Biol. 2, 76-83 (2000).
  6. Comijn, J., et al. The two-handed E box binding zinc finger protein SIP1 downregulates E-cadherin and induces invasion. Mol Cell. 7, 1267-1278 (2001).
  7. Bolos, V., et al. The transcription factor Slug represses E-cadherin expression and induces epithelial to mesenchymal transitions: a comparison with Snail and E47 repressors. J Cell Sci. 116, 499-511 (2003).
  8. Eger, A., et al. DeltaEF1 is a transcriptional repressor of E-cadherin and regulates epithelial plasticity in breast cancer cells. Oncogene. 24, 2375-2385 (2005).
  9. Shapiro, I. M., et al. An EMT-driven alternative splicing program occurs in human breast cancer and modulates cellular phenotype. PLoS Genet. 7, e1002218 (2011).
  10. Warzecha, C. C., et al. An ESRP-regulated splicing programme is abrogated during the epithelial-mesenchymal transition. EMBO J. 29, 3286-3300 (2010).
  11. Brown, R. L., et al. CD44 splice isoform switching in human and mouse epithelium is essential for epithelial-mesenchymal transition and breast cancer progression. J Clin Invest. 121, 1064-1074 (2011).
  12. Wang, E. T., et al. Alternative isoform regulation in human tissue transcriptomes. Nature. 456, 470-476 (2008).
  13. Pan, Q., Shai, O., Lee, L. J., Frey, B. J., Blencowe, B. J. Deep surveying of alternative splicing complexity in the human transcriptome by high-throughput sequencing. Nat Genet. 40, 1413-1415 (2008).
  14. Liu, S., Cheng, C. Alternative RNA splicing and cancer. Wiley Interdiscip Rev RNA. 4, 547-566 (2013).
  15. Shtivelman, E., Lifshitz, B., Gale, R. P., Roe, B. A., Canaani, E. Alternative splicing of RNAs transcribed from the human abl gene and from the bcr-abl fused gene. Cell. 47, 277-284 (1986).
  16. Krangel, M. S. Secretion of HLA-A and -B antigens via an alternative RNA splicing pathway. J Exp Med. 163, 1173-1190 (1986).
  17. Brickell, P. M., Latchman, D. S., Murphy, D., Willison, K., Rigby, P. W. Activation of a Qa/Tla class I major histocompatibility antigen gene is a general feature of oncogenesis in the mouse. Nature. 306, 756-760 (1983).
  18. Barbaux, S., et al. Donor splice-site mutations in WT1 are responsible for Frasier syndrome. Nat Genet. 17, 467-470 (1997).
  19. Charlet, B. N., et al. Loss of the muscle-specific chloride channel in type 1 myotonic dystrophy due to misregulated alternative splicing. Mol Cell. 10, 45-53 (2002).
  20. Hutton, M., et al. Association of missense and 5'-splice-site mutations in tau with the inherited dementia FTDP-17. Nature. 393, 702-705 (1998).
  21. Kohsaka, T., et al. Exon 9 mutations in the WT1 gene, without influencing KTS splice isoforms, are also responsible for Frasier syndrome. Hum Mutat. 14, 466-470 (1999).
  22. Philips, A. V., Timchenko, L. T., Cooper, T. A. Disruption of splicing regulated by a CUG-binding protein in myotonic dystrophy. Science. 280, 737-741 (1998).
  23. Savkur, R. S., Philips, A. V., Cooper, T. A. Aberrant regulation of insulin receptor alternative splicing is associated with insulin resistance in myotonic dystrophy. Nat Genet. 29, 40-47 (2001).
  24. Spillantini, M. G., et al. Mutation in the tau gene in familial multiple system tauopathy with presenile dementia. Proc Natl Acad Sci USA. 95, 7737-7741 (1998).
  25. Wang, J., et al. Myotonic dystrophy evidence for a possible dominant-negative RNA mutation. Hum Mol Genet. 4, 599-606 (1995).
  26. Graubert, T. A., et al. Recurrent mutations in the U2AF1 splicing factor in myelodysplastic syndromes. Nat Genet. 44, 53-57 (2012).
  27. Papaemmanuil, E., et al. Somatic SF3B1 mutation in myelodysplasia with ring sideroblasts. N Engl J Med. 365, 1384-1395 (2011).
  28. Yoshida, K., et al. Frequent pathway mutations of splicing machinery in myelodysplasia. Nature. 478, 64-69 (2011).
  29. Mani, S. A., et al. The epithelial-mesenchymal transition generates cells with properties of stem cells. Cell. 133, 704-715 (2008).
  30. Reinke, L. M., Xu, Y., Cheng, C. Snail represses the splicing regulator epithelial splicing regulatory protein 1 to promote epithelial-mesenchymal transition. J Biol Chem. 287, 36435-36442 (2012).
  31. Serini, G., Gabbiani, G. Mechanisms of myofibroblast activity and phenotypic modulation. Exp Cell Res. 250, 273-283 (1999).
  32. Zavadil, J., Bottinger, E. P. TGF-beta and epithelial-to-mesenchymal transitions. Oncogene. 24, 5764-5774 (2005).
  33. Pfaffl, M. W. A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR. Nucleic Acids Res. 29, e45 (2001).
  34. Hellemans, J., Mortier, G., De Paepe, A., Speleman, F., Vandesompele, J. qBase relative quantification framework and software for management and automated analysis of real-time quantitative PCR data. Genome Biol. 8, R19 (2007).
  35. Boutz, P. L., et al. A post-transcriptional regulatory switch in polypyrimidine tract-binding proteins reprograms alternative splicing in developing neurons. Genes Dev. 21, 1636-1652 (2007).
  36. Salomonis, N., et al. Alternative splicing regulates mouse embryonic stem cell pluripotency and differentiation. Proc Natl Acad Sci USA. 107, 10514-10519 (2010).
  37. Calarco, J. A., et al. Regulation of vertebrate nervous system alternative splicing and development by an SR-related protein. Cell. 138, 898-910 (2009).
  38. Grabowski, P. Alternative splicing takes shape during neuronal development. Curr Opin Genet Dev. 21, 388-394 (2011).
  39. Seol, D. W., Billiar, T. R. A caspase-9 variant missing the catalytic site is an endogenous inhibitor of apoptosis. J Biol Chem. 274, 2072-2076 (1999).
  40. Srinivasula, S. M., et al. Identification of an endogenous dominant-negative short isoform of caspase-9 that can regulate apoptosis. Cancer Res. 59, 999-1002 (1999).
  41. Akgul, C., Moulding, D. A., Edwards, S. W. Alternative splicing of Bcl-2-related genes functional consequences and potential therapeutic applications. Cell Mol Life Sci. 61, 2189-2199 (2004).
  42. Cooper, T. A. Use of minigene systems to dissect alternative splicing elements. Methods. 37, 331-340 (2005).
  43. Cheng, C., Sharp, P. A. Regulation of CD44 alternative splicing by SRm160 and its potential role in tumor cell invasion. Mol Cell Biol. 26, 362-370 (2006).

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