Detectie van alternatieve splicing Tijdens-mesenchymale transitie

* These authors contributed equally
Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Huang, H., Xu, Y., Cheng, C. Detection of Alternative Splicing During Epithelial-Mesenchymal Transition. J. Vis. Exp. (92), e51845, doi:10.3791/51845 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

De epitheliale-mesenchymale transitie (EMT) is een ontwikkelings-programma dat orgaan morfogenese en weefselremodellering rijdt tijdens de embryogenese. Bij abnormaal geactiveerd, EMT bevordert tumor uitzaaiingen en orgaanfibrose 1,2. Overtuigend studies hebben het belang van transcriptionele regulatie beschreven tijdens het proces van EMT, bepaald door verscheidene transcriptiefactoren, zoals Twist, Slak en ZEB, die de expressie van de adherens junction eiwit E-cadherine onderdrukken, wat resulteert in verlies van klinkers steenachtige epitheliale morfologie en winst van een spoelvormige mesenchymale fenotype 3-8. Recente studies door genoom-brede analyse van RNA bleek dat er een groep genen waarvan splicing patronen tezamen met epitheliale en mesenchymale fenotypen 9,10. Werk van onze labo functioneel verbonden alternatieve splicing en EMT. Door het bestuderen van het celoppervlak adhesie molecuul CD44, we dat CD44 altern aangetoondtieve splicing wordt strak gereguleerd tijdens EMT, en nog belangrijker, dat CD44 splice isovorm causaal schakelen bijdraagt ​​aan EMT 11.

Alternatieve splicing is een wijdverspreide en geconserveerde model van genregulatie, zoals tot 95% van menselijke multi-exon genen alternatief gesplitste 12-14. Door het genereren van meerdere eiwitproducten uit een enkel gen, alternatieve splicing een essentieel mechanisme voor diversiteit eiwit, het toevoegen van een laag van complexiteit aan het menselijk genoom. Als zodanig kan ontregeling van alternatieve splicing kunnen leiden tot ernstige biologische effecten veroorzaken menselijke ziekten. Inderdaad, heeft afwijkende alternatieve splicing in ziekten gedocumenteerd voor meer dan een decennium 15-25, met inbegrip van recente bevindingen dat mutaties in genen die coderen voor de spliceosome machines gewoonlijk worden aangetroffen in myelodysplastisch syndroom 26-28. Derhalve ontwikkeling van betrouwbare methoden voor de detectie van alternatief gesplitste isoforms is van groot belang in de studie van diverse biologische processen zoals EMT.

Hier bieden we een protocol om veranderingen in alternatieve splicing met een induceerbare EMT model detecteren. De werkwijzen voor het ontwerpen van PCR primers en het detecteren splice isovormen zijn niet alleen geschikt voor de studie van alternatieve splicing gedurende EMT, maar ook voor de studie van alternatieve splicing in andere biologische processen. Het onderzoeken van alternatieve splicing tijdens EMT is noodzakelijk met het oog op een beter begrip van de mechanismen van EMT en tumor metastase, waardoor de ontwikkeling van effectieve strategieën om de uitzaaiing van kanker te behandelen vergemakkelijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1 Cel Cultuur van EMT Inductie

Opmerking: EMT kan worden geïnduceerd door behandeling van TGFB of ectopische expressie van transcriptiefactoren Twist, slak of Zeb1 / 2 in epitheelcellen. Beschreven in dit protocol een induceerbare EMT systeem via de expressie van de Twist-ER fusie-eiwit in vereeuwigd menselijke borstklier epitheelcellen (HMLE / Twist-ER, een geschenk van Dr J Yang, UCSD) 9,11,29. Bij 4-hydroxytamoxifen (TAM) behandeling, het fusie-eiwit Twist-ER naar de kern om transcriptie en resultaten leiden in een volledig EMT overgang in 12-14 dagen 9,11,29. Extra EMT induceerbare systemen, zoals HMLE / Slak-ER, HMLE / TGF en MCF10A / TGFß, kan worden gevonden in onze eerdere publicaties 11,30.

  1. Aanvullen HMLE / Twist-ER-cellen in serumvrij mammaire epitheliale groei celmedium (MEGM) in een 37 ° C incubator met 5% CO2. Passage de cellen om de 2-3 dagen wanneer ze 80% confluentie bereikt. Incubeer de cellen met 0,15% trypsine bij 37 ° C gedurende 5-10 min, en vervolgens inactiveren trypsine met 5% kalfsserum / DMEM. Spin down cellen en mengen ze in MEGM. Plaat cellen in een nieuwe weefselkweekplaat in een verhouding van 1 tot 4.
  2. Los op in ethanol TAM een 200 pM oplossing. Bescherm TAM van licht en bewaar bij -20 ° C. Voor het gebruik, TAM vers toe te voegen in MEGM media op een 1: 10.000 te verdunnen tot een uiteindelijke concentratie van 20 nM TAM te maken.
  3. Voor de inductie van EMT, plaat 1,6 x 10 6 HMLE / Twist-ER cellen in een 10 cm weefselkweek schotel in tweevoud. Cultuur cellen met 20 nM TAM-bevattend MEGM media.
  4. Plate 1.6 x 10 6 HMLE / Twist ER-cellen in een 10 cm schaal in tweevoud behandelen cellen met 0,01% ethanol als niet-TAM-behandelde controle.
  5. Twee dagen na incubatie, beelden onder een lichtmicroscoop opbrengst bij 10x vergroting morfologische veranderingen van de cellen nemen.
  6. Zuig het medium van een gerecht van de controle of TAM-behandeldecellen. Was de cellen met koude PBS en oogst cellen door sloop helft van de plaat in RNA lysisbuffer voor RNA isolatie en de andere helft in RIPA buffer voor eiwitanalyse.
  7. Passage cellen van de controle of de TAM-behandelde gerechten door re-plating 1,6 x 10 6 cellen in een 10 cm schotel in tweevoud. Continu behandelen van de cellen met 20 nM TAM of voertuig.
  8. Herhaal stappen 5-7 eenmaal per dag tot dag 14, waarna, TAM-behandelde Twist ER-cellen een spoelvormige mesenchymale morfologie, terwijl met hulpmiddel behandelde controlecellen houden de geplaveide-achtige epitheliale morfologie.

2 Karakterisering van EMT

Opmerking: Een voltooiing van EMT wordt aangegeven: (1) Cell morfologische veranderingen van een geplaveide-achtige epitheliale morfologie een spoelvormige fibroblast-achtige verschijning; (2) Verlies van E-cadherine lokalisatie bij cel-cel contacten; en (3) geschakelde expressie van EMT merkers, bepaald door het verliesvan epitheliale merkers en winst van mesenchymale markers.

Cell morfologische veranderingen weergegeven door lichtmicroscoop bij 10x vergroting in het tijdsverloop van inductie EMT, in hoofdstuk 1 Immuno-fluorescentie detectie van E-cadherine bij cel-juncties beschreven in dit hoofdstuk. De expressie van EMT merkers gedetecteerd door immunoblotting. Gemeenschappelijke epitheliale markers E-cadherine, γ-catenine en occludin en mesenchymale markers omvatten fibronectine, N-cadherine en vimentine. Algemene procedures van immunoblotting worden beschreven in hoofdstuk 4.

  1. Op dag 12 van TAM behandeling zaad 1 x 10 5 cellen op een 12 mm glazen cirkelvormige dekglaasje geplaatst in een putje van een 24-well plaat.
  2. 48 uur na het uitzaaien, aspireren medium en wassen cellen met voorverwarmd PBS.
  3. Bevestig cellen met voorverwarmd 4% paraformaldehyde gedurende 15 minuten.
  4. Was de cellen drie keer met PBS.
  5. Incubeer de cellen met 0,2% Triton X-100 in PBS gedurende 15min bij kamertemperatuur.
  6. Was de cellen drie keer met PBS.
  7. Incubeer cellen in 5% BSA / PBS gedurende 1 uur bij kamertemperatuur om niet-specifieke binding te blokkeren.
  8. Incubeer de cellen met het primaire antilichaam E-cadherine bij een 1:50 verdunning in 1% BSA / PBS in een bevochtigde kamer O / N bij 4 ° C. OPMERKING: Het bereik voor de primaire antilichaamverdunning is normaal tussen 1:50 en 1: 200, en de optimale verdunning voor elk antilichaam moet experimenteel bepaald worden.
  9. Giet het primaire antilichaam en wassen cellen driemaal met PBS.
  10. Incubeer de cellen met fluorescent-gelabeld secundair antilichaam in een 1: 500 verdunning gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Vanaf deze stap over, cellen beschermen tegen licht.
  11. Giet het secondaire antilichaam en was driemaal met PBS.
  12. Stain cellen met 0,1-1 g / ml DAPI of Hoechst gedurende 10 minuten.
  13. Spoel de cellen met PBS driemaal.
  14. Mount coverslips met een daling van de montage medium, en afdichting dekglaasjes met nagellak.
  15. Observeer cellen en nemenbeelden onder een 63X fluorescentiemicroscoop.

Kleuring met extra antilichamen kunnen worden uitgevoerd om de EMT fenotype bevestigen. Bijvoorbeeld kunnen N-cadherin en α-gladde spier actine worden gekleurd voor een mesenchymale fenotype 29,31,32. Reorganisatie van het cytoskelet structuur kan worden gevolgd door kleuren van cellen met falloïdine voor F-actine 11. Bovendien kunnen assays voor celbeweeglijkheid en celdood resistentie worden uitgevoerd om de eigenschappen van EMT 11 onderzocht.

3 Detectie van Splice isovormen Met behulp van qRT-PCR-tests

  1. Primer Ontwerp
    OPMERKING: Primerparen moeten zorgvuldig worden ontworpen om verschillende splice isovormen versterken. Exon skipping, de meest voorkomende alternatieve splicing gebeurtenis, wordt hier getoond als een voorbeeld voor de strategie van de primer ontwerp te illustreren. Figuur 1A toont een vier-exon pre-mRNA, met de derde exon als een variabele exon. Opname van exon 3 resultaten inde productie van een langere splice isovorm, dat het overslaan van exon 3 genereert een kortere splice isovorm. Primers moeten worden ontworpen om de exon-3-inbegrepen isovorm en exon-3-isovorm overgeslagen onderscheiden, en de totale transcript van dit mRNA te detecteren.
    1. Voor detectie van exon opneming zorgvuldig ontwerpen van een voorwaartse primer in de variabele exon 3, en een reverse primer in de nabije constitutieve exon 4, waardoor de specifieke amplificatie van het variabele isoform-exon inbegrepen. Zorg ervoor dat u zowel vooruit en terugdraait primers binnen dezelfde variabele exon om PCR producten geamplificeerd van genoom-DNA of pre-mRNA te voorkomen.
    2. Specifiek amplificeren exon skipping evenementen, ontwerp een van de primers verspreid over de kruising van de constitutieve exon 2 en exon 4, die anders zouden worden vernietigd als variabele exon 3 is opgenomen. Ontwerp van de andere primer in de constitutieve exon 4 Als zodanig zijn PCR-producten gegenereerd wanneer de variabele exon 3 exclued en de constitutieve exon 2 en exon 4 worden vervolgens samengevoegd.
    3. Om de totale transcripten van het gen te detecteren, het ontwerp van de primers in twee constitutieve exons 1 en 2 aldus worden PCR producten geamplificeerd uit alle isovormen.
    4. Controleer de smelttemperatuur (Tm) voor alle primers ongeveer 55 ° C, de lengte van elke primer is ongeveer 18-22 nucleotiden, en de grootte van PCR producten is tussen 80 en 150 basenparen.
  2. RNA-extractie: Uittreksel RNA met behulp van een totaal RNA isolatie kit (zie tabel van Materialen).
    1. Verzamel cellen in 350 ul RNA lysisbuffer.
    2. Voeg 350 ul van 70% ethanol aan het lysaat en meng.
    3. Breng het monster op de kolom RNA zuivering.
    4. Centrifugeer bij 10.000 xg gedurende 1 min en gooi doorstroom.
    5. Was de kolom eenmaal met 500 ui wasbuffer RNA I en tweemaal met RNA wasbuffer II.
    6. Verwijder resterende RNA wasbufferII uit de kolom door centrifugatie bij maximale snelheid gedurende 2 minuten.
    7. Breng de kolom in een nieuwe buis van 1,5 ml, voeg 50 ul nuclease-vrij water in het midden van de kolom en elueer matrix RNA door centrifugatie bij maximale snelheid.
  3. Synthese van eerste streng cDNA
    1. Bepaal de concentratie en kwaliteit van RNA door UV absorptie gemeten. OPMERKING: Goede kwaliteit RNA moet een 260 nm / 280 nm absorptie-ratio van ongeveer 2,0 te hebben.
    2. Stel reverse transcriptase (RT) reacties die 250 ng totaal RNA, 0,05 ug willekeurige hexameerprimers, 50 pmol MgCl2, 10 pmol dNTP, 2 gl 5 × GoScript buffer en 1 ui RT enzym in een eindvolume van 20 pl bevatten.
    3. Voer RT reacties bij 42 ° C gedurende 1 uur, gevolgd door incubatie bij 70 ° C gedurende 5 min aan de RT enzym inactiveren.
  4. Real-time PCR
    1. Opgericht 20 ul reacties die bestaan ​​uit 10 ul SYBR groene master mix,0,1-1,0 pl cDNA template en 5 pmol voorwaartse en omgekeerde primers.
    2. Run real-time PCR met 40 cycli van de volgende stappen: 95 ° C denaturatie gedurende 10 seconden, 58 ° C hybridisatie gedurende 10 seconden en 60 ° C extensie gedurende 30 sec. Voer PCR reacties in drievoud.
    3. Controleer dissociatie bochten en ervoor te zorgen dat een enkele piek wordt waargenomen voor elke primer set.
    4. Haal de kwantificering cyclus (Cq) waarden berekenen van de tweede afgeleide waarden van amplificatiecurven.
    5. Bereken de relatieve hoeveelheid (RQ) van doelwit mRNA geïnduceerd in monsters in vergelijking met de niet-geïnduceerde voorbeeld met de "delta delta Cq (ΔΔCq) methode zoals blijkt uit de volgende formule. Gebruik housekeeping genen, zoals GAPDH of TBP, als referentie.

Vergelijking 1
Om meer nauwkeurig te berekenen relatieve waarden van splice isovormen, thij gebruik van verschillende referentie-genen moet worden beschouwd. De resultaten kunnen worden geanalyseerd met een gemodificeerde absolute waarde kwantificatie beschreven door Pfaffl e.a. 33,34.

4 Onderzoek van Splice isovormen op eiwitniveau

  1. Verzamel cellen in 100 pl ijskoude RIPA buffer.
  2. Stel lysaten op ijs voor ongeveer 10 minuten.
  3. Centrifugeer bij 14.000 xg gedurende 10 min bij 4 ° C en verzamel de bovenstaande vloeistof.
  4. Meet eiwitconcentratie door Bradford assays.
  5. Verdun eiwitmonsters in SDS laadbuffer en laad 20-40 ug van eiwitten in 10% SDS-PAGE gels.
  6. Run SDS-PAGE gels bij 20 mA gedurende 1,5 uur.
  7. Transfer eiwitten op PVDF-membranen in een natte transfersysteem bij 4 ° C gedurende 3 uur bij 85 V. Stel de transfer volgens de molecuulgewicht van doeleiwitten.
  8. Blok membraan in 5% vetvrije melk gedurende 30 minuten tot 1 uur bij kamertemperatuur.
  9. Incubeer membraan with een primair antilichaam bij 4 ° CO / N. De range voor de primaire antilichaamverdunning is normaal tussen 1: 200 en 1: 5000, bepalen de optimale verdunning voor elk antilichaam experimenteel. De verdunning van antilichamen die bij dit protocol is te vinden in de "Tabel van specifieke reagentia en apparatuur".
    1. Om splice isovormen herkent, kunt u specifieke antilichamen die een bepaalde isovorm herkennen. U kunt ook gebruik maken van een antilichaam dat het epitoop in de constitutieve exon coderende gebied erkent en detecteren splice isovormen tegelijkertijd op basis van hun verschillende eiwitten maten.
    2. Tegelijkertijd, bewaken EMT door immunoblotting voor EMT markers. Gebruik E-cadherine, γ-catenine en occludin als epitheliale markers, en fibronectine, N-cadherine en vimentine als mesenchymale markers.
  10. Wash membraan driemaal met TBS-T (50 mM Tris, 150 mM NaCl, 0,05% Tween 20, pH 7,4) bij een 5-minuten interval.
  11. Incubeer het membraan met een HRP-geconjugeerd secundair antibody in een 1: 10.000 verdunning gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
  12. Was de membraan drie keer met TBS-T bij een 5-minuten interval.
  13. Zichtbaar eiwit met een chemiluminescentie detectiesysteem en het membraan bloot aan autoradiografie film.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De hierboven beschreven werkzaamheden een robuuste methode om alternatieve splicing detecteren tijdens EMT. Representatieve resultaten van CD44 splice isovorm schakelen tijdens-Twist geïnduceerde EMT worden hieronder als voorbeeld gegeven.

Twist-geïnduceerde EMT in HMLE / Twist-ER-cellen gekenmerkt door een overgang van een kasseien achtige epitheliale fenotype naar een langwerpige fibroblasten fenotype (Figuur 2A), het ontbreken van epitheliale merkers E-cadherine, γ-catenine en occludin en opregulatie van mesenchymale markers fibronectine, N-cadherine, en vimentine (Figuur 2B). Voorts EMT werd bepaald door het verlies van E-cadherine lokalisatie van cel-cel contacten (figuur 2C).

De geschakelde expressie van CD44 splice isovormen tijdens EMT werd onderzocht door qRT-PCR en immunoblot. De humane CD44 gen omvat negen variabele exons. Alternatieve splicing van CD44 maakt cellen produce CD44 varianten (CD44v) dat ten minste een variabel exon en CD44 standaard (CD44s) die mist alle variabele exons omvatten. Figuur 3A toont de strategie van primer ontwerp voor de detectie van verschillende CD44 splice isovormen. Voor de detectie van de exon-overgeslagen product CD44s, wordt de voorwaartse primer gelegen in de constitutieve exon 5, terwijl het omgekeerde primer zich uitstrekt over de kruising tussen constitutieve exons 5 en 6 Voor de detectie van CD44v splice isovormen met de v5 en v6 variabele exons, de voorwaartse en reverse primers zijn ontworpen in de v5 en v6, respectievelijk. Primers voor de detectie van andere CD44 variabele exon bevattende isovormen kunnen worden ontworpen met dezelfde strategie. Bovendien wordt de totale CD44 transcript gedetecteerd middels voorwaartse en omgekeerde primers in de constitutieve exon 2 en exon 3, respectievelijk (Figuur 3A). Zoals getoond in figuur 3B, analyses qRT-PCR gebruik van deze primer sets van een significante afname CD44v mRNA en verhoging CD44s mRNA na 14 dagen van behandeling in de TAM-Twist-ER tot expressie HMLE cellen. Daarentegen, de totale transcript van CD44 bleef in EMT (figuur 3C) ongewijzigd. Consistent met de resultaten van qRT-PCR, het eiwitgehalte van CD44v opmerkelijk afgenomen, terwijl de expressie van het eiwit sterk CD44s werd opgereguleerd (figuur 3D). Daarom is de belangrijkste isovorm van CD44 werd verschoven van CD44v tot CD44s tijdens het EMT proces.

Figuur 1
Figuur 1 Primer ontwerp. Schematische diagrammen van de locatie van primers voor het detecteren splicing isovormen per-exon skipping model. De grijze vakken vertegenwoordigen constitutieve exons, de oranje dozen vertegenwoordigen variabele exons, en de dunne lijnen verbinden dozen duiden introns. De primer locaties zijn indicated door pijlen: zwarte pijlen geven primer sets voor het opsporen van het totaal mRNA, oranje pijlen geven primer sets voor het versterken-exon inbegrepen isovormen, en blauwe pijlen geven primer sets voor de detectie-exon skipping isovormen.

Figuur 2
Figuur 2 Inductie van EMT. (A) Fasecontrast afbeeldingen (10X) illustreren morfologische veranderingen in HMLE / Twist-ER-cellen vóór (onbehandeld) en na 14 dagen van behandeling TAM. (B) Immunoblotanalyse van EMT markers in HMLE / Twist-ER-cellen vóór (onbehandeld) en na 14 dagen van TAM behandeling. Bij TAM behandeling, epitheliale markers E-cadherine, γ-catenine en occludin werden neerwaarts gereguleerd, en mesenchymale markers fibronectine, N-cadherine, en vimentine werden gereguleerd. (C) Immune fluorescentiebeelden (63X) met vermelding van het verlies van E-cadherinelokalisatie bij cel-cel contacten na 14 dagen van TAM behandeling. Groene vlekken geeft aan E-cadherine, en DAPI kleuring (blauw) geeft kernen. Schaal bar = 10 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 3
Figuur 3 Switch van CD44 splice isovormen tijdens EMT. (A) Primer ontwerp voor de detectie van CD44 splice isovormen. De grijze vakken vertegenwoordigen constitutieve exons, de oranje dozen vertegenwoordigen variabele exons, en de dunne lijnen verbinden dozen duiden introns. De primer locaties zijn aangegeven met pijlen: zwarte pijlen geven primer sets voor het opsporen van CD44 totaal mRNA, oranje pijlen geven primer sets voor het versterken CD44v5-6 en blauwe pijlen geven primer sets voordetecteren CD44s. (B, C) ​​qRT-PCR analyse van de niveaus van CD44 isovormen EMT gebruikmaking van primers die specifiek detecteren CD44v met variabele exons v5 en v6 (v5 / 6) en CD44s (B) en CD44 totaal mRNA (C) . Relatieve expressie van mRNA in Dag 14 cellen werden genormaliseerd tot overeenkomstige dag 0 cellen TAM behandelde en niet-behandelde groepen. Error bars geven SEM; n = 3 (D) Immunoblotanalyse van CD44-isovormen tijdens TAM-geïnduceerde EMT in HMLE / Twist-ER-cellen. Niveaus van E-cadherine en N-cadherine werd gecontroleerd om EMT toestand identificeren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De hier beschreven werkwijze maakt de detectie van alternatieve splicing van een induceerbare EMT model. Als zodanig dynamische veranderingen van splice isovorm expressie kan worden ingenomen gedurende het tijdsverloop van EMT. Deze werkwijze heeft voordelen boven het gebruik van verschillende epithelial- of mesenchymale cellijnen die voor vergelijking van alternatieve splicing omdat verschillende genetische achtergronden van un-gerelateerde cellijnen onrechtmatig kunnen beïnvloeden alternatieve splicing. Wel moet de succesvolle inductie van EMT zorgvuldig worden bevestigd met behulp van verschillende EMT markers alvorens conclusies over veranderingen in de alternatieve splicing kunnen worden getrokken. Bovendien, naast de Twist-ER-induceerbare EMT systeem beschreven, EMT andere systemen zoals geïnduceerd door Snail-ER of TGFp worden aanbevolen voor validering van experimentele bevindingen 11,30.

Het schakelen van splice isovormen EMT kunnen worden gedetecteerd in zowel RNA en eiwitgehalte. Splice isovorm-specifieke antilichamen de voorkeur voor eiwitanalyse. Wanneer isovorm-specifieke antilichamen beschikbaar zijn, kunnen eiwitniveaus van splice isovormen worden bepaald op basis van hun molecuulgewicht op SDS-PAGE door immunoblotting. Het RNA van elk isovorm kunnen worden met isoform-specifieke primers. Met behulp van qRT-PCR-tests, kan de vouw verandering van elke isovorm zijn gevoelig en nauwkeurig bepaald. Vooral wanneer experimentele materialen beperkt, zoals het analyseren van de expressie van een bepaald splice isovorm in klinische monsters, qRT-PCR analyse een kwantitatieve maat die zou compenseren voor het gebrek aan isovorm-specifieke antilichamen voor immunohistochemie.

De hier genoemde werkwijze is geschikt voor de detectie van bekende splice isovorm veranderingen tijdens EMT. Bovendien kan deze methode worden uitgebreid voor de studie van genoom-brede alternatieve splicing en voor de identificatie van nieuwe splice isovorm schakelen tijdens EMT. Om dit te bereiken,gebruik van een grootschalige technieken zoals RNA deep-sequentiebepaling of splicing gevoelige microarray platforms kan worden uitgevoerd met RNA geïsoleerd uit de induceerbare EMT model hierboven beschreven. Toch wordt qRT-PCR validatie van isovorm veranderingen nodig na elke analyse op grote schaal.

Concluderend wordt alternatieve splicing dynamisch gereguleerd tijdens EMT, een proces dat essentieel is voor embryonale ontwikkeling en tumor metastase. Gezien de hoge frequentie van alternatieve splicing in het menselijk genoom, is het waarschijnlijk dat de regulatie van alternatieve splicing een belangrijke rol in vele andere biologische en pathologische processen zoals celdifferentiatie, weefselontwikkeling en geprogrammeerde celdood 35-41 speelt. De hierin beschreven voor de detectie van splice isovormen protocol voor deze andere systemen ook.

Extra experimentele modaliteiten, zoals splicing reporterminigen assays, kunnen be gebruikt om verder te onderzoeken van de regelgeving van cis-werkende elementen en trans-werkende factoren die alternatieve splicing 30,42,43 beheersen. Bovendien kan de functionele rol van een specifieke isovorm splice tijdens EMT onderzocht worden silencing of ectopisch tot expressie specifieke isovorm en controle EMT inductie in de beschreven EMT-induceerbare systeem 11.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4-hydroxytamoxifen Sigma H7904 Make stock solution by dissolving 4-hydroxytamoxifen in ethanol to 200 μM. Keep the solution at -20 °C protected from light.
E.Z.N.A. Total RNA Isolation kit Omega Bio-Tek R6731 Total RNA isolation kit
GoScript Reverse Transcription System Promega A5001 Reagent for qRT-PCR assay
GoTaq qPCR Master Mix Promega A6002 Reagent for qRT-PCR assay
LightCycler 480 Real-Time PCR System Roche Equipment for qRT-PCR assay
CD44 antibody R&D Systems BBA10 1:1,000 dilution
E-cadherin antibody Cell Signaling Technology 4065 1:2,500 dilution for immunoblotting; 1:50 dilution for immunofluorescence
γ-Catenin antibody Cell Signaling Technology 2309 1:1,000 dilution
Occludin antibody Santa Cruz Biotechnology Inc. sc-5562 1:500 dilution
Fibronectin antibody BD Transduction Laboratories 610077 1:5,000 dilution
N-cadherin antibody BD Transduction Laboratories 610920 1:2,000 dilution
Vimentin antibody NeoMarkers MS-129-p1 1:500 dilution
GAPDH antibody Millipore Corporation MAB374 1:10,000 dilution
Amasham ECL Western blotting detection reagent GE Health Life Science RPN2209 Chemiluminescence system

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Thiery, J. P., Sleeman, J. P. Complex networks orchestrate epithelial-mesenchymal transitions. Nat Rev Mol Cell Biol. 7, 131-142 (2006).
  2. Yang, J., Weinberg, R. A. Epithelial-mesenchymal transition at the crossroads of development and tumor metastasis. Dev Cell. 14, 818-829 (2008).
  3. Yang, J., et al. a master regulator of morphogenesis, plays an essential role in tumor metastasis. Cell. 117, 927-939 (2004).
  4. Batlle, E., et al. The transcription factor snail is a repressor of E-cadherin gene expression in epithelial tumour cells. Nat Cell Biol. 2, 84-89 (2000).
  5. Cano, A., et al. The transcription factor snail controls epithelial-mesenchymal transitions by repressing E-cadherin expression. Nat Cell Biol. 2, 76-83 (2000).
  6. Comijn, J., et al. The two-handed E box binding zinc finger protein SIP1 downregulates E-cadherin and induces invasion. Mol Cell. 7, 1267-1278 (2001).
  7. Bolos, V., et al. The transcription factor Slug represses E-cadherin expression and induces epithelial to mesenchymal transitions: a comparison with Snail and E47 repressors. J Cell Sci. 116, 499-511 (2003).
  8. Eger, A., et al. DeltaEF1 is a transcriptional repressor of E-cadherin and regulates epithelial plasticity in breast cancer cells. Oncogene. 24, 2375-2385 (2005).
  9. Shapiro, I. M., et al. An EMT-driven alternative splicing program occurs in human breast cancer and modulates cellular phenotype. PLoS Genet. 7, e1002218 (2011).
  10. Warzecha, C. C., et al. An ESRP-regulated splicing programme is abrogated during the epithelial-mesenchymal transition. EMBO J. 29, 3286-3300 (2010).
  11. Brown, R. L., et al. CD44 splice isoform switching in human and mouse epithelium is essential for epithelial-mesenchymal transition and breast cancer progression. J Clin Invest. 121, 1064-1074 (2011).
  12. Wang, E. T., et al. Alternative isoform regulation in human tissue transcriptomes. Nature. 456, 470-476 (2008).
  13. Pan, Q., Shai, O., Lee, L. J., Frey, B. J., Blencowe, B. J. Deep surveying of alternative splicing complexity in the human transcriptome by high-throughput sequencing. Nat Genet. 40, 1413-1415 (2008).
  14. Liu, S., Cheng, C. Alternative RNA splicing and cancer. Wiley Interdiscip Rev RNA. 4, 547-566 (2013).
  15. Shtivelman, E., Lifshitz, B., Gale, R. P., Roe, B. A., Canaani, E. Alternative splicing of RNAs transcribed from the human abl gene and from the bcr-abl fused gene. Cell. 47, 277-284 (1986).
  16. Krangel, M. S. Secretion of HLA-A and -B antigens via an alternative RNA splicing pathway. J Exp Med. 163, 1173-1190 (1986).
  17. Brickell, P. M., Latchman, D. S., Murphy, D., Willison, K., Rigby, P. W. Activation of a Qa/Tla class I major histocompatibility antigen gene is a general feature of oncogenesis in the mouse. Nature. 306, 756-760 (1983).
  18. Barbaux, S., et al. Donor splice-site mutations in WT1 are responsible for Frasier syndrome. Nat Genet. 17, 467-470 (1997).
  19. Charlet, B. N., et al. Loss of the muscle-specific chloride channel in type 1 myotonic dystrophy due to misregulated alternative splicing. Mol Cell. 10, 45-53 (2002).
  20. Hutton, M., et al. Association of missense and 5'-splice-site mutations in tau with the inherited dementia FTDP-17. Nature. 393, 702-705 (1998).
  21. Kohsaka, T., et al. Exon 9 mutations in the WT1 gene, without influencing KTS splice isoforms, are also responsible for Frasier syndrome. Hum Mutat. 14, 466-470 (1999).
  22. Philips, A. V., Timchenko, L. T., Cooper, T. A. Disruption of splicing regulated by a CUG-binding protein in myotonic dystrophy. Science. 280, 737-741 (1998).
  23. Savkur, R. S., Philips, A. V., Cooper, T. A. Aberrant regulation of insulin receptor alternative splicing is associated with insulin resistance in myotonic dystrophy. Nat Genet. 29, 40-47 (2001).
  24. Spillantini, M. G., et al. Mutation in the tau gene in familial multiple system tauopathy with presenile dementia. Proc Natl Acad Sci USA. 95, 7737-7741 (1998).
  25. Wang, J., et al. Myotonic dystrophy evidence for a possible dominant-negative RNA mutation. Hum Mol Genet. 4, 599-606 (1995).
  26. Graubert, T. A., et al. Recurrent mutations in the U2AF1 splicing factor in myelodysplastic syndromes. Nat Genet. 44, 53-57 (2012).
  27. Papaemmanuil, E., et al. Somatic SF3B1 mutation in myelodysplasia with ring sideroblasts. N Engl J Med. 365, 1384-1395 (2011).
  28. Yoshida, K., et al. Frequent pathway mutations of splicing machinery in myelodysplasia. Nature. 478, 64-69 (2011).
  29. Mani, S. A., et al. The epithelial-mesenchymal transition generates cells with properties of stem cells. Cell. 133, 704-715 (2008).
  30. Reinke, L. M., Xu, Y., Cheng, C. Snail represses the splicing regulator epithelial splicing regulatory protein 1 to promote epithelial-mesenchymal transition. J Biol Chem. 287, 36435-36442 (2012).
  31. Serini, G., Gabbiani, G. Mechanisms of myofibroblast activity and phenotypic modulation. Exp Cell Res. 250, 273-283 (1999).
  32. Zavadil, J., Bottinger, E. P. TGF-beta and epithelial-to-mesenchymal transitions. Oncogene. 24, 5764-5774 (2005).
  33. Pfaffl, M. W. A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR. Nucleic Acids Res. 29, e45 (2001).
  34. Hellemans, J., Mortier, G., De Paepe, A., Speleman, F., Vandesompele, J. qBase relative quantification framework and software for management and automated analysis of real-time quantitative PCR data. Genome Biol. 8, R19 (2007).
  35. Boutz, P. L., et al. A post-transcriptional regulatory switch in polypyrimidine tract-binding proteins reprograms alternative splicing in developing neurons. Genes Dev. 21, 1636-1652 (2007).
  36. Salomonis, N., et al. Alternative splicing regulates mouse embryonic stem cell pluripotency and differentiation. Proc Natl Acad Sci USA. 107, 10514-10519 (2010).
  37. Calarco, J. A., et al. Regulation of vertebrate nervous system alternative splicing and development by an SR-related protein. Cell. 138, 898-910 (2009).
  38. Grabowski, P. Alternative splicing takes shape during neuronal development. Curr Opin Genet Dev. 21, 388-394 (2011).
  39. Seol, D. W., Billiar, T. R. A caspase-9 variant missing the catalytic site is an endogenous inhibitor of apoptosis. J Biol Chem. 274, 2072-2076 (1999).
  40. Srinivasula, S. M., et al. Identification of an endogenous dominant-negative short isoform of caspase-9 that can regulate apoptosis. Cancer Res. 59, 999-1002 (1999).
  41. Akgul, C., Moulding, D. A., Edwards, S. W. Alternative splicing of Bcl-2-related genes functional consequences and potential therapeutic applications. Cell Mol Life Sci. 61, 2189-2199 (2004).
  42. Cooper, T. A. Use of minigene systems to dissect alternative splicing elements. Methods. 37, 331-340 (2005).
  43. Cheng, C., Sharp, P. A. Regulation of CD44 alternative splicing by SRm160 and its potential role in tumor cell invasion. Mol Cell Biol. 26, 362-370 (2006).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics