Bestilling av enkeltceller og enkelt Embryoet i 3D Confinement: En ny enhet for høyt innhold Screening

Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Vi rapporterer en anordning og en ny metode for å studere celler og embryoer. Enkeltceller er nettopp bestilt i microcavity arrays. Deres 3D innesperring er et skritt mot 3D-miljøer oppstått i fysiologiske forhold og lar organelle orientering. Ved å kontrollere celleform, minimerer dette oppsettet variasjonen rapportert i standardtester.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Wollrab, V., Caballero, D., Thiagarajan, R., Riveline, D. Ordering Single Cells and Single Embryos in 3D Confinement: A New Device for High Content Screening. J. Vis. Exp. (115), e51880, doi:10.3791/51880 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Biologiske celler er vanligvis observeres på flate (2D) overflater. Denne tilstanden er ikke fysiologisk, og fenotyper og former er svært variabel. Screening basert på celler i slike miljøer har derfor alvorlige begrensninger: celleorgan viser ekstreme fenotyper, celle morfologi og størrelser er heterogene og / eller spesifikke celleorganeller kan ikke være riktig visualisert. I tillegg er celler in vivo som ligger i et 3D-miljø; i denne situasjon, vil celler viser forskjellige fenotyper hovedsakelig på grunn av deres interaksjon med det omgivende ekstracellulær matriks av vevet. For å standardisere og generere ordre av enkeltceller i et fysiologisk relevant 3D-miljø for cellebaserte analyser, rapporterer vi her den microfabrication og anvendelser av en anordning for in vitro-3D-cellekultur. Denne anordning består av en 2D-matrise av mikrohulrom (typisk 10 5 hulrom / cm 2), hver fylt med enkle celler eller embryoer. Cell posisjon, form, polaritet og intern celle organisasjon blir deretter normalisert viser en 3D-arkitektur. Vi brukte replica molding til mønsteret en rekke mikrohulrom, 'eggcups', mot en tynn polydimethylsiloxane (PDMS) sjikt festet på et dekkglass. Hulrom ble dekket med fibronektin å lette adhesjon. Celler ble innsatt ved sentrifugering. Fylling prosent var optimalisert for hvert system som tillater opp til 80%. Celler og embryoer levedyktighet ble bekreftet. Vi har anvendt denne metode for visualisering av cellulære organeller, slik som nucleus og Golgi-apparatet, og for å studere aktive prosesser, slik som lukking av cytokinetic ringen under celle mitose. Denne enheten tillot identifisering av nye funksjoner, for eksempel periodiske ansamlinger og inhomogeniteter av myosin og aktin under cytokinetic ring nedleggelse og kompakt fenotyper for Golgi og kjernen justering. Vi karakteriserte fremgangsmåte for pattedyrceller, gjær, spalting spirende gjær, C. elegans with spesifikk tilpasning i hvert enkelt tilfelle. Til slutt, hva som kjennetegner denne enheten gjør den spesielt interessant for narkotika screening-analyser og personlig medisin.

Introduction

Current in vitro celle-baserte analyser er to-dimensjonale (2D). Denne konfigurasjonen er ikke naturlig for pattedyrceller, og derfor er ikke fysiologisk relevant 1; celler viser et mangfold av former, størrelser og heterogene fenotyper. De presenterer flere alvorlige begrensninger når den brukes til screening applikasjoner, slik som en uordnet fordeling innenfor planet og ekstreme fenotyper av cellulære organeller (stress-fibre, spesielt). Dette er spesielt viktig i kliniske studier for narkotika testing, der høye budsjetter er brukt hvert år. De fleste av disse stoffene selv svikter når den anvendes på dyremodeller på grunn av den kunstige 2D kulturen tilstand i tidlige stadier av legemiddelscreening. I tillegg, ved å bruke denne tilnærmingen, spesifikke celleorganeller kan ikke være riktig visualisert, slik som cytokinetic actomyosin ring under celle mitose, og generelt strukturer som er under utvikling i planet vinkelrett på planet for observasjon. Noennye 2D-analyser er blitt foreslått for å overvinne de ovennevnte ulemper og viktige innsikter for cytoskjelettet organisasjon har blitt observert 2,3. Men disse analysene fortsatt er tilstede en alvorlig begrensning:-celler viser en meget spredt fenotype i motsetning til hva som er observert in vivo, hvor celler som presenterer en 3D-arkitektur. Disse gjenstander knyttet til kultur metoden kan utløse ikke-fysiologiske funksjoner som forbedret stresset fiber 1,4,5.

Tredimensjonal cellekulturanalyser gir flere fordeler sammenlignet med 2D-miljøer 6,7. De er fysiologisk mer relevant, og resultatene er derfor meningsfylt. Som et eksempel kan celler som er innleiret i hydrogeler vise 3D-lignende strukturer, men deres morfologi avvike fra en celle til en annen 8,9. Men deres morfologi avvike fra en celle til en annen, noe som kompliserer screening applikasjoner. En alternativ strategi er å legge ned enkeltceller i microfabricated hulrom 10,11. Cell posisjon, form, polaritet og intern celle organisasjon kan da bli normalisert. Foruten 3D-lignende arkitektur til celler, mikrohulrom gir også mulighet for høy innhold screeningstudier 10,12-14; enkeltceller kan bestilles til mikromatriser og cellulære organeller og deres videreutviklinger kan observeres i parallell. Denne regularitet gir god statistikk med lavt antall celler og bedre time / romlig oppløsning. Nyttige forbindelser er enklere å identifisere en pålitelig måte.

I denne studien viser vi fremstillingen og anvendelse av en ny 3D-lignende enkeltceller kultursystem for høyt innhold-screening applikasjoner 10,12,13. Enheten består av en rekke elastiske mikrohulrom (10 5 hulrom / cm 2), som ble skapt 'eggcups' (EF) nr. Mål og totalvolumet av EU i dette arbeidet er optimalisert til den typiske volum av individuelle NIH3T3 og HeLa-cellerunder celledeling. Morfologi av hulrommene - sylindriske - er valgt å riktig orientere celleform for visualisering av aktive prosesser. Replika støping brukes for å mønster en oppstilling av EC på en tynn polydimetylsiloksan (PDMS) sjikt klebet på et dekkglass 15,16. Celler blir innført i EF ved sentrifugering. Vi rapporterer her observasjon og normalisering av cellulære organeller (aktin spennings fibre, Golgi-apparatet og nucleus) i 3D (EC) sammenlignet med de samme celler på 2D (flat) overflater. Vi rapporterer også observasjon av aktive dynamiske prosesser som for eksempel stenging av cytokinetic actomyosin ring under celle mitose 17. Til slutt viser vi Resultatene av denne metoden for andre systemer med stive vegger, slik som spirende gjær, gjær og fisjons C. elegans embryoer som bekrefter anvendeligheten av vår metode for et bredt spekter av modellsystemer.

Vi neste presentere en detaljert og uttømmende protocol for å dikte og anvende 'eggcups "for 3D microfabrication. Vår tilnærming er enkel og trenger ikke et rent rom. Vi forventer at denne nye metodikken vil være spesielt interessant for narkotika screening-analyser og personlig medisin, til erstatning for petriskåler. Til slutt vil vår enhet kan være nyttige for å studere fordelingen av cellene respons på ytre stimuli, for eksempel i kreft 18 eller i 19 grunnleggende forskning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. microfabrication av 'eggcups'

  1. Fabrikasjon av Master: mikrohulrom Array
    1. Varm en 3 '' silikonplaten opp til 200 ° C for å fordampe ethvert nærvær av fuktighet.
    2. Spin-coat et tynt lag av SU-8 fotoresist. Juster volumet av harpiks og sentrifugehastighet avhengig av ønsket tykkelse og fotoresist type. Denne tykkelse vil diktere dybden av 'eggcups' (EC). For en 30 mikrometer tykt lag og SU-8 2025, spin-coat på 2800 rpm.
    3. Pre-bake skiven ved 65 ° C i 1 minutt (trinn 1 av 2) for en 30 mikrometer tykk SU-8 2025 laget. Tilpasse den tid, avhengig av fotoresist type og tykkelse ønsket. Sjekk produsentens datablad for detaljer.
    4. Pre-bake skiven ved 95 ° C i 3 minutter (trinn 2 av 2) for en 30 mikrometer tykk SU-8 2025 laget. Tilpasse den tid, avhengig av fotoresist type og tykkelse ønsket. Sjekk produsentens datablad for detaljer.
    5. Last innwafer på masken aligner for UV-eksponering. Plasser fotolitografi maske på den. Masken viser et mønster av sirkelfunksjoner (disker) på 20 um i diameter. Sikre et perfekt kontakt mellom hverandre.
      MERK: Ulike produsenter tilbyr fotolitografi masker. Den romlige oppløsning avgjør den endelige kostnaden. Acetat masker gi akseptabel oppløsning (≈10 um) til lave kostnader. Krom-masker gi bedre oppløsning, men er dyrere. Tilpasse diametrene av disker (fra fotolitografi masken) til volumet av cellene. Dimensjoner på disker på masken vil bestemme diameteren av hulrom i enheten. Liten diameter vil føre til en lav fyllings; for stor diameter vil ikke begrense cellene. For HeLa og NIH3T3-celler, er en diameter av 20 um til 25 um foreslått.
    6. Sjekk strøm av UV-lampe før utstilling og optimalisere eksponeringstiden tilsvarende. Bestråle (bølgelengde = 365 nm) til 41,5 sek (eller den optimaliserte eksponeringstid) hos250 mJ / cm 2.
      MERK: SU-8 2025 er en negativ fotoresist, noe som betyr at eksponerte områdene for UV vil bli kurert. I dette tilfellet er de sirkulære funksjonene var svart og resten gjennomsiktig. Positiv fotoresist arbeid i motsatt måte: ikke-eksponerte områder er kurert. Velg fotoresist tilsvarende, avhengig av design og foto-maske.
      MERK: Beskytt øynene mot UV-lys med passende vernebriller.
    7. Fjern forsiktig masken fra fotoresist laget.
    8. Post-bake skiven ved 65 ° C i 1 minutt (trinn 1 av 2) for en 30 mikrometer tykk SU-8 2025 laget. Post-bake skiven ved 95 ° C i 3 minutter (trinn 2 av 2) for en 30 mikrometer tykk SU-8 2025 laget. Tilpasse den tid, avhengig av fotoresist type og tykkelse ønsket. Sjekk produsentens datablad for detaljer. Etter post-baking, kjøle wafer til romtemperatur på benken for rundt 1 min.
    9. Plasser wafer i spin-coater og slippe noen mm av SU-8 utvikleren å dekkehele wafer-området. Utvikle for 2 min og deretter spinne-coat på 1000 rpm i 30 sek. Gjenta prosedyren tre ganger.
    10. Skyll med 2-propanol for å sikre fullstendig fjerning av ubebygd SU-8. Utseende av hvite områder er en indikasjon på mangelfull utvikling. I så fall gjentar utviklingstrinn en ekstra gang.
    11. Hard-bake wafer ved 200 ° C for å sikre robusthet av de fabrikkerte mikrostrukturer. Dette trinnet er valgfritt.
    12. Oppbevar 3 '' wafer med mikrostrukturer inne i en 94 mm x 15 mm polystyren petriskål.
      MERK: Det er ikke behov for overflatebehandling, spesielt silanisering, for de neste trinnene.
  2. Fabrikasjon av Polydimethylsiloxane (PDMS) Replica: Pillars Array
    1. Bland i et 01:10 forhold (w / w) tverrbindingsmidlet og den pre-polymer for en total av 30 g inne i et 50 ml rør.
      MERK: Ved hjelp av en 01:10 (v / v) ratio arbeider også.
    2. Sentrifuger røret i 1800 xg i 5 min tilfjerne luftbobler.
    3. Slipp forsiktig de PDMS på toppen av mikrostrukturer.
      MERK: Hvis luftbobler vises i dette trinnet, Degas prøven ved hjelp av en vakuumpumpe for 15-20 min.
    4. Plasser prøven i en ovn ved 65 ° C i 4 timer.
      MERK: Herdetiden varierer mellom brukerne og, sammen med det tverrbindingsmiddel: pre-polymer proporsjon. Denne gangen vil diktere stivheten til PDMS. Det anbefales å kurere mer enn 2 timer, og å holde seg til en fast herdetid.
    5. Bruk en skalpell til å forsiktig skjære området av interesse (stempel) på ca 1 cm 2, som omfatter rundt 10 5 mikrohulrom eller "eggeglass".
      MERK: Skjær først de PDMS og da, skrelle den av forsiktig. Kontrollere kvaliteten av PDMS replika med et optisk mikroskop.
  3. Fabrikasjon av 'eggcups' ved kopi støping. I det følgende blir to alternative strategier for fremstilling av 'eggcups' beskrevet. Begge protokollene er simiLAR og gi identiske resultater:
    1. strategi 1
      1. Aktiver fabrikkert PDMS stempel av oksygen plasma behandling i 30 sek. Oppbevar midlertidig de aktiverte stempler inn i en lukket petriskål for å hindre nedfall av støv.
        MERK: Juster utstilling tid hvis andre gasser for plasma brukes.
      2. Plasser de aktiverte PDMS stemple oppside opp (siden med strukturene) i en petriskål ved siden av et 15 ml rør cap. Fyll cap med 200 ul trimetylklorsilan (TMCs). Lukk petriskål og la stempel silanize for 7 min.
        MERK: Det er midlertidig deformasjon på stempel og / eller endring i farge (hvit) kan observeres. Frimerket vil gjenopprette sin opprinnelige form i løpet av kort tid, og strukturene vil ikke bli berørt.
        MERK: TMCS produserer akutt innånding og giftighet, og er meget brannfarlig (med tenning flashback i stand til å forekomme over store avstander). Derfor bør den brukes i et avtrekksskap bort fra kildens for antennelse.
      3. Plasser PDMS stempel på spin-belegger med strukturene oppside opp. Sette en liten dråpe av noen få mikroliter (ca. 20 ul) av flytende PDMS (01:10 vekt / vekt tverrbindingsmiddel: pre-polymer) på toppen av strukturene. Spin-belegg ved 1500 rpm i 30 sekunder for å avsette et tynt lag av PDMS på toppen av strukturene.
        MERK: Hvis stempel ikke passer i spin-belegger chuck sted stempel på toppen av en petriskål lokk med et lite hull i midten.
      4. Sett stempel i ovnen ved 65 ° C i fire timer for å kurere avsatt spin-belagt PDMS lag.
      5. Aktiver tynne PDMS lag ved å plassere den PDMS stempel oppsiden opp, sammen med et glass dekkglass # 0 av 25 mm i diameter, ved hjelp av oksygen plasmarenser i 30 sek. Fortsett raskt til neste trinn.
        MERK: Dekk med andre tykkelser, former og dimensjoner kan brukes i tillegg. Imidlertid kan noen cellulære strukturer være vanskelig å visualisere avhengig av den valgte dekktykkelse og objektivforstørrelse og / eller NA og / eller arbeidsavstand. Kontroller objektivet datablad.
      6. Sett i kontakt stempel (siden med den tynne spin-belagt lag) med dekkglass. Trykk forsiktig over hele overflaten av stempelet med pinsett for å gjøre den "bonding". Til slutt, holde et konstant trykk på toppen av stempel for rundt 10 sek.
      7. Etter 30 min forsiktig 'skall' stempel ut av dekkglass for å 'frigjøre' 'eggcups' (se figur 1). Skyll grundig med etanol og tørr. Hvis PDMS 'eggcups' ikke er godt levd på dekkglass (dvs. de løsner under 'unpeeling' trinn), bør du vurdere å justere innstillingene for plasma renere og start på trinn 1.3.1.5.
        MERK: Dette trinnet er delikat. Ta hensyn for å unngå brekkasje av dekkglass og / eller løsgjøring av det tynne lag PDMS.
      8. Lim en liten bit (håndtak) av herdet PDMS av 1 mm x 1mm x 3 mm i volum ved kanten av dekkglasset med en liten dråpe av flytende PDMS og kurere PDMS som før. Dette vil lette manipulering av prøven etterpå (se figur 1). Dette trinnet er valgfritt.
    2. strategi 2
      1. Hydrophilize de fabrikkerte PDMS frimerker med oksygen plasma behandling i 30 sek. Oppbevar midlertidig de aktiverte stempler i en lukket petriskål for å hindre nedfall av støv.
        MERK: Juster utstilling tid hvis andre gasser for plasma brukes.
      2. Hydrophilize den 25 mm diameter dekkglass # 0 oksygenplasma behandling ved 15 V i 30 sek. Fortsett raskt til neste trinn.
        MERK: Dekk med andre tykkelser, former og dimensjoner kan brukes i tillegg. Imidlertid vil cellulære strukturer være vanskelig å visualisere avhengig av den valgte dekktykkelse og objektive egenskaper (se note ovenfor).
      3. Spin-coat en liten dråpe av PDMS (01:10 vekt / vekt tverrbindingsmiddel: pre-polYmer) av få mikroliter på dekkglass. Spin-coat på 1500 rpm i 30 sek for en endelig tykkelse på rundt 50 mikrometer.
      4. Lim et lite stykke (håndtak) av herdede PDMS av 1 mm x 1 mm x 3 mm i volum på kanten av dekkglasset med en liten dråpe av flytende PDMS og kurere PDMS som før. Dette vil lette manipulering av prøven etterpå (se figur 1). Dette trinnet er valgfritt.
      5. Oppbevar midlertidig PDMS-belagt dekkglass på en ren tørke inne i en petriskål for å beskytte mot støv deponering.
      6. Sett en dråpe silanizing reagens på toppen av hver stempel og la det fordampe i 1-2 min. Deretter, tørke dem under en strøm av N2.
        MERK: I dette trinnet, kan en midlertidig deformasjon av stempel bli observert under fordampning. Stempelet vil gjenvinne sin opprinnelige form etter tørking med N2 uten noen permanent deformasjon av mikrostrukturer.
      7. Slipp veldig forsiktig silanert stempel på toppen avPDMS-spin-belagt glass dekk lagret i petriskål. Pass på at begge sider er helt parallell under kontakten. Unngå å trykke eller bevege stempelet etter å plassere den på PDMS-belagte dekkglass.
      8. Sett petriskål med prøver i vakuum for 1-2 timer for å fjerne luftbobler.
        MERK: Pass på at prøvene er helt vannrett for å unngå stempelet forskyvning. Unngå også vibrasjon potensielt forårsaket av vakuumpumpen.
      9. Plassere prøvene i ovnen ved 65 ° C i 4 timer.
      10. Forsiktig, skrelle av stempel for å avsløre 'eggcups'. Skyll grundig med etanol og tørr.
        MERK: Øv på dette punktet er nødvendig. Vær oppmerksom på å unngå brudd på dekkglass og / eller avløsning av det tynne PDMS lag.

2. Vi presenterer Celler inn i 'eggcups'

For å innføre pattedyrceller inne 'eggcups', PDMS overflaten needs å bli funksjonalisert med adhesjonsproteiner av den ekstracellulære matriks. Dette eksempelet bruker fibronektin, men andre proteiner av interesse, for eksempel kollagen, kan benyttes.

  1. Hydrophilize de "eggcups" i oksygen plasma renere for 30 sek.
    MERK: optimalisere parametrene hvis nødvendig.
  2. Forbered en løsning i PBS 1x 20 ng ml -1 fibronektin fra storfe kilder.
  3. Steriliser 'eggcups' med UV i 5 min. Sette inn en liten dråpe (ca. 20-50 pl) av fibronektin oppløsning for å dekke hele 'eggcups "område og inkuberes i 1 time ved RT. Beskytt prøven fra tørking.
  4. Skyll forsiktig de "eggcups 'med PBS 1x. Dette gjentas 3 ganger.
    MERK: Prøven er klar til bruk umiddelbart eller lagret ved 4 ° C i mørke i flere uker.
  5. Innføre en sylindrisk skreddersydd plaststykke av 63 mm i høyde, 26 mm ytre radius og 7 mm indre radius dimensjoner i et 50 ml rør (seFigur 2) 20
    FORSIKTIG: Bruk UV-sterilisert elementer eller sterilisere dem før bruk.
    MERK: Dette stykket kan lett fabrikkert i laboratoriet. eller av noen tilgjengelige maskinverksted.
  6. Satt 13 ml cellekulturmedium inne i røret (se tabell 1). Mediet bør fylle minst 2 cm over den sylindriske stykke for å sikre fullstendig nedsenking av prøven.
    MERK: For mer informasjon om spesifikke celletyper og andre modellsystemer som gjær eller C. elegans embryoer, og tilsvarende medium som brukes, se avsnitt 5 og tabell 1. Det beskrevne protokollen ble optimalisert for HeLa, NIH3T3 celler, og andre cellelinjer (se tabell 1).
  7. Innføre meget forsiktig de "eggcups 'inne i røret og parallelt med oversiden av plastdelen. Bruk skarpe pinsett til å holde prøven ved bruk av PDMS håndtaket. Trykk forsiktig dekkglass til det ligger på toppen av den øvre side av plastdelen, until det er helt nedsenket (se figur 2).
    MERK: Det anbefales å bruke skarpe og rette pinsett. Med buet pinsett, er manipuleringen av prøven vanskelig og kan føre til brekkasje.
  8. Kultur cellene inntil 80-100% samløpet i en P60 petriskål og samle dem ved trypsinering.
    MERK: Celler kan være vill-type, transfektert eller behandlet med noe narkotika av interesse.
    MERK: Unngå dannelse av celleaggregater som vil unngå enkeltceller for å gå inn i "eggeglass". For å optimalisere dette trinnet, pipette opp og ned grundig etter trypsinering.
  9. Re-suspendere celler i 5 ml kulturmedium. Pipetter 200 mL av celler på toppen av "eggeglass".
    MERK: Slipp celler som sentrert som mulig på toppen av 'eggcups ", men å unngå fysisk kontakt. Dette vil forhindre brudd og / eller skade på prøven.
  10. Sentrifuger ved 1800 xg i 2 min.
    MERK: Etter den første sentrifugering, sjekke inn en mikrofonroscope fylling prosentandelen av "eggcups '.
  11. Pipetter igjen 200 mL av celler på toppen av 'eggcups' og sentrifuger ved 1800 xg i 2 min. Gjenta til totalt tre ganger for å optimalisere fylleprosent.
    MERK: Etter den siste sentrifugeringen, sjekk med et mikroskop fylling andelen 'eggcups'. Gjenta om nødvendig fylle + sentrifugeringstrinn inntil nå ønsket oppfyllingsprosent.
  12. Fjern prøven fra røret ved hjelp av skarpe pinsett holder PDMS håndtaket. Sørg for å være forsiktig i ikke "forstyrrende" celler som holdes i 'eggcups' (se figur 2).
  13. Plasser prøven i en petriskål med medium. Skyll for å fjerne overskuddet av celler som ikke er i 'eggcups' ved å pipettere opp og ned tre ganger for forsiktig ved siden av hver side (totalt 4 sider) av mikro matrisen.
    MERK: Pipettering for sterkt kan friginoen celler ut fra 'eggcups'.
  14. Erstatt medium med frisk medium for å fjerne nonattached celler.
    MERK: I dette trinnet kan legges et stoff av interesse.
  15. Fix celler eller forberede dem for time-lapse imaging.See trinn 4.1.

3. Observasjon av Active Cellular Dynamics i 'eggcups': Cytokinetic Ring Closure

MERK: Dette eksemplet bruker HeLa-celler som er transfektert med MYH10-GFP og Lifeact-mcherry for myosin og aktin henholdsvis nøkkel aktive molekyler som er involvert i cytokinetic ringslutning under celle mitose. Anordningen blir fremstilt med mikrohulrom på 25 um i diameter. For deres observasjon, ble en epifluorescence invertert mikroskop, utstyrt med en 60X olje objektiv (1,40 NA, DIC, Plan Apo) og GFP (myosin) og TxRed (aktin) filtre. Alternativt kan en opprettstående konfokalt mikroskop ble anvendt, som er utstyrt med en 25X eller 63X HCX IR APO l vann objektiv (0,95 NA). For dette example, er det sterkt anbefalt å synkronisere cellene ved hjelp av dobbel tymidin blokken, mitotisk blokk eller mitotisk shake-off metode 21-24.
MERK: Tykkelsen på PDMS brukes for 'eggcups' tillater bruk av en rekke formål både i inverterte og oppreist plassert mikroskoper.

  1. Plasser 'eggcups' i et mikroskop holderen og fylle det med 1 ml 10% FCS L-15 observasjon medium. For å unngå fordampning, plasserer et glass lokket på toppen av holderen eller bruke et tynt lag med mineral olje på toppen av medium.Select den 60X olje målet.
    MERK: L-15 medium er tilstrekkelig for ikke-CO 2 atmosfærer. Merk også at noen forbindelser av DMEM er auto-fluorescerende. Ved bruk av dette medium, er det anbefalt å photobleach de fluorescerende forbindelsene ved å belyse det med en høy intensitet lampe i 1-2 timer.
    MERK: Unngå å bruke plastlokk når du arbeider med DIC bildebehandling.
  2. Plasser holderen med "eggeglass" og dialektikkenvasjon medium i mikroskopet. Fokus forsiktig med lysfelt lys inntil 'eggcups', og cellene er i samme plan for observasjon.
  3. Åpne programvaren og justere parametere. Velg filtrene TxRed og GFP for aktin og myosin; justere utstilling tid for hver kanal. En typisk oppkjøpet rate er 5 sek for begge kanaler.
    MERK: Håndboken tid kan måtte justeres avhengig av oppsettet som brukes, fargestoff eller andre cellulære organeller av interesse.
  4. Velg den regionen av interesse og søke etter en cytokinetic ring ved hjelp av enten GFP eller TxRed kanal. Fokusere nøyaktig.
    MERK: Ringen er skarpere i myosin og lettere å gjenkjenne.
  5. Kjør den automatiske oppkjøpet i begge kanaler til ringen er helt lukket.
    MERK: Noen fotobleking kan observeres. Juster objektparametre for å redusere den.

4. Observasjon av Fast cellulære organ inn i 'eggcups'

Dette trinnet kan utføres før eller etter trinn # 3. Celler kan være direkte fast etter sentrifugeringstrinnet og farget for organeller av interesse eller etter observasjon i mikroskop. Dette eksempel viser farging av Golgi-apparatet, nucleus og aktin fibre på NIH3T3 fibroblaster i 'eggcups'.

  1. Fiksering av celler i 'eggcups'
    1. Forbered 3% paraformaldehyde (PFA) og varm ved 37 ° C. Fjern 'eggcups' prøve fra 50 ml tube (eller mikroskop holder) og plassere den i en P35 petriskål. Skyll en gang med PBS 1x.
      MERK: Protokoller for utarbeidelse av 3% paraformaldehyde er allment tilgjengelig andre steder.
      FORSIKTIG: Bruk nitrilhansker og vernebriller under utarbeidelsen av PFA.
    2. Fjern fullstendig PBS og slippe 1 ml 3% PFA og inkuberes i 17 min. Fjern det PFA og skylles to ganger med 1 ml PBS 1X. Permeabilisere cellene ved anvendelse av 1 ml 0,5% Tritpå i 3 minutter og vaskes to ganger med PBS 1x i 5 minutter.
  2. Farging av celler i 'eggcups'
    1. Inkuber cellene for Golgi-apparatet farging med det primære antistoff kanin polyklonalt anti-Giantin i en 1: 500 fortynning i PBS. Plasser en 100 ul dråpe av antistoffløsning på en plastfilm ark og inkuberes cellene inne i 'eggcups' opp ned i 45 min.
      MERK: Beskytt prøven med et dekke for å hindre uttørking.
    2. Slipp nøye 'eggcups' og plassere dem i en P35 petriskål. Skyll 3 ganger, 5 min hver, med PBS 1x.
    3. Forbered en cocktail i PBS med det sekundære antistoff Cy3 geit anti-kanin (1: 1000) og med Phalloidin Alexa Fluor 488 (1: 200) for farging aktin stress-fibre.
    4. Inkuber cellene med 100 ul dråpe av antistoffløsning på en plastfilm ark og inkuberes cellene inne i 'eggcups' opp ned i 45 min.
    5. Slipp forsiktig 'eggcups "og plassere dem i en P35 petriskål. Skyll 3 ganger, 5 min hver, med PBS 1x.
    6. Inkuber cellene for kjernen farging plassere en 100 ul dråpe av 1 ug ml -1 DAPI i PBS på en plastfilm ark og inkuberes cellene inne i 'eggcups' opp ned i 45 min. Dette trinnet kan utføres med trinn 4.2.3.
    7. Slipp nøye 'eggcups' og plassere dem i en P35 petriskål. Skyll 3 ganger, 5 min hver, med PBS 1x.
    8. Mount celler ved anvendelse av en 15 mL Glycerol: PBS (1: 1 v / v) på et standard mikroskop objektglass og forsegle prøven med neglelakk for å unngå tørking.
      MERK: Avhengig av 'eggcups' tykkelse, kan montering være vanskelig. Det er anbefalt å lagre og deretter ble prøven inn i en petriskål P35 i PBS, beskyttet mot uttørking.
  3. mikroskop Observasjon
    MERK: For dette eksemplet en oppreist konfokalmikroskop brukes, utstyrt med PMT og Hybrid detektorer. 25x eller 63 X HCX IR APO l vann objektiv (0,95 NA) ble valgt for å tilveiebringe et bredt felt av prøven, og viser anvendelsen av innretningen for høyt innhold screening-applikasjoner.
    1. Velg 25X eller 63X vann objektiv.
      MERK: Ulike mål kan brukes avhengig av programmet og signal. Men bruk av høye numerisk apertur mål anbefales.
    2. Plasser den fikserte prøve med 'eggeglass og er fokus nøye ved hjelp av lysfelt lys (fasekontrast eller DIC) inntil den "eggcups' og celler er i planet for observasjon.
    3. Åpne programvaren og justere parametere. Velg filtrene GFP, Cy3 og DAPI for aktin, Golgi og kjernen observasjon, henholdsvis; justere utstilling gang for alle kanaler.
      MERK: Håndboken tid må kanskje justeres avhengig av oppsettet.
    4. Velg og fokus regionen av interesse; starte bildeopptak (se figur 3).
tle "> 5. Tilpasning for Observasjon av gjærceller og C. elegans Embryo

  1. Fisjon og spirende Gjærceller
    MERK: Dette eksemplet bruker fisjonsgjærceller som er merket med RLC1-mcherry og CHD-GFP for myosin og aktin, henholdsvis. De spirende gjærcellene er ikke fluorescensmerkede her. For fisjon gjær observasjon en omvendt spinnende disk confocal mikroskop ble brukt. En 100X HCX PL APO CS olje objektiv (1,4 NA) ble brukt for alle anskaffelser. Alternativt kan celler ble også observert ved anvendelse av et invertert fasekontrastmikroskop utstyrt med et 20X objektiv fasekontrast luft LCPlanFl (0,4 NA). I dette eksemplet er protokollen identisk for begge celletyper.
    1. Klargjør 'eggcups' overflate som beskrevet ovenfor. For fisjon og spirende gjærceller, fremstille hulrom av 5 pm i diameter (se tabell 1). I dette tilfellet har den overflate ikke trenger å bli funksjonalisert med adhesjonsproteiner.
      MERK: fylling can optimaliseres ved hjelp av koniske 'eggcups'. Denne formen fanger opp og holder cellene unngå frigjøring i løpet av rensetrinnet etter sentrifugering. Fylling prosentandelen er optimal ved ca. 80%. Disse koniske 'eggcups' kan være fabrikkert ved hjelp av Deep ioneetsning 13.
    2. Kultur gjærceller i den riktige kulturmedium (se tabell 1) til n en optisk tetthet (OD) i området 0,2 og 0,8. Sonikere kultur av gjærceller for å fjerne aggregater.
    3. Sett gjærceller i '' eggeglass ved sentrifugering. For sentrifugering blir 4 ml av dyrkede celler i den passende OD lagt på røret med "eggeglass". Etter den første sentrifugering, rist forsiktig på røret for å re-suspendere celler som ikke er i 'eggcups', mens cellene i 'eggcups' ikke blir forstyrret. Uten å åpne røret, sentrifuger igjen og gjenta dette trinnet to ganger. Dette sikrer at avsetningenav celler fra kulturen inn i de tomme mikrohulrom, og vil øke fyllingen prosent.
      MERK: Når du arbeider med gjær, anbefales det å forvarme sentrifugen til arbeidstemperatur under eksperimenter
      MERK: Protokollen kan bli stanset her og fortsatte opp til 12 timer senere. I dette tilfellet, lagre prøven ved arbeidstemperaturen og dekke den for å forhindre fordampning.
    4. Plasser 'eggcups' i et mikroskop holderen og fyll holderen med filter sterilisert medium for bildebehandling. Nå skylle cellene med det samme medium inntil de flytende gjærcellene fjernes effektivt. Pass på å ikke forstyrre celler i 'eggcups' under skyllingen.
    5. Velg 100X olje objektiv og fokusere nøye. Åpne programvaren og justere parametere. For fisjon gjær, velg filtre GFP og TxRed for aktin og myosin og juster utstilling tid for begge kanaler. En typisk oppkjøpet rate er 3 sek.
      MERK: Avhengig avfluoroforen, type av merking og den set-up, eksponeringstiden varierer for andre systemer.
  2. C. elegans Embryo
    MERK: Dette eksemplet bruker C. elegans embryoer 25-30 mikrometer brede og 50-55 mikrometer lang. Embryoet ble dyrket som angitt i 25. En enkel visuell protokoll på hvordan å manipulere C. elegans kan bli funnet i 26. Observasjon ble utført ved anvendelse av et invertert fasekontrastmikroskop utstyrt med et 40X objektiv luft 0.55 NA.
    1. Klargjør 'eggcups' overflate som beskrevet ovenfor og 25 mikrometer i diameter (se tabell 1). I dette tilfellet har den overflate ikke trenger å bli funksjonalisert med adhesjonsproteiner.
    2. Kultur C. elegans embryoene i riktig kulturmedium (se tabell 1).
    3. Sett embryoer i '' eggeglass ved sentrifugering som beskrevet ovenfor (se avsnitt 2.6 til 2.12) ved hjelp av ultrarent vann som kulturmedium.
      MERK: Embryoer ble 'oppfører' normalt i ultrarent vann for varigheten av forsøket. Alternativt kan du bruke en fysiologisk M9 buffer for langsiktige eksperimenter.
    4. Skyll den prøven som er beskrevet ovenfor (se kapittel 2.14). Plasser 'eggcups' inn i et mikroskop holderen. Velg 40X luft objektiv og fokusere nøye. Åpne programvaren og justere parametere. Velg et oppkjøp sats på 3 sek.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De "eggcups '(EC) er en ny høyt innhold screening-metode som tillater visualisering av orienterte celler og embryoer i et 3D-miljø. I tillegg har noen cellulære prosesser, noe som er vanskelig å observere i standard 2D (flat) kulturer, kan iakttas ved denne nye fremgangsmåte. Figur 1a viser en oppsummering av fremgangsmåten for EC microfabrication (se også punkt 1 i den ovenfor beskrevne protokoll ). Metoden er enkel, rask, effektiv og uten krav om spesialutstyr. Figur 1b og 1c viser en stor-skala bilde og et forstørret skanning-elektronmikroskop bilde av 'eggcups', henholdsvis. Som det kan observeres, deres form og størrelse er svært vanlig. Denne fremgangsmåten er meget fleksibel; forskjellige former og størrelser kan lett fremstilles og tilpasses for forskjellige modellsystemer. Dimensjonene på'eggcups' ble valgt på følgende måte: dimensjonerav celler som gjennomgår inndeling ble målt på 2D-overflater: de har en kuleform, og deres diameter ble tatt som en god indikasjon for EC diameter. Celler i'eggcups' langstrakte og orientere langs sin lengdeakse under celledeling for eksempel. Denne dimensjonen er avhengig av systemet - celler og embryoer - så denne dimensjonen bør vurderes i hvert enkelt tilfelle.

Figur 2 viser materialet som trengs (figur 2a) og en steg-for-steg-protokollen (figur 2b) om hvordan du bruker 'eggcups' (se også punkt 2 i den ovennevnte protokoll). Fylling av EF med celler av interesse (eller andre modellsystemer) er veldig enkel og rask. Vanligvis tar det mindre enn 20-30 min, som også omfatter tiden for celle trypsinering. Etter fylling, kan prøvene brukes til å studere aktive prosesser (live imaging) eller kan festes og farget for visualisering av organeller av interest (se også §§ 3 og 4 i protokollen beskrevet ovenfor).

På flatt underlag, cellene vise heterogene reaksjoner og ekstreme fenotyper av cellulære organeller. Faktisk har det blitt foreslått at aktin spennings fibrer (og andre cellulære organ) er gjenstander av dyrkningsforholdene 1. For å bevise denne hypotesen, vi cultured NIH3T3-celler både for 3D 'eggcups' og på flate overflater, og i forhold fenotypene av forskjellige cellulære organeller, nemlig aktin spennings fibre, Golgi-apparatet og kjerner. Figur 3 viser et eksempel på hvordan cellene er organisert på begge konfigurasjoner. I EC blir cellene fordelt i et ordnet matrise som viser en homogen sfærisk-lignende fenotype (figur 3a). På flatt underlag, cellene vise den typiske uordnede, spredning og heterogen morfologi (figur 3b). Det er også betydelige forskjeller i cytoskjelett strukturer. Spesielt celler på R16, eggcups 'viser en reduksjon i antallet av stress fiber sammenlignet med flate overflater. Dette blir ytterligere bekreftet i 3D rekonstruerte bilder hvor ingen klare spennings fibre er synlige (se figur 3c - d). Dette bekrefter at noen cellulære strukturer blir foredlet i 2D kulturer. Dette er også i samsvar med observasjoner utført in vivo hvor stresset fiber ikke kan identifiseres.

Golgi-apparatet viser også signifikant variasjon i deres fenotype, avhengig av dyrkningsbetingelsene (se figur 4). Golgi-apparatet på 2D kulturer viser vanligvis en utvidet fenotype "omfavner" kjernen periferien mens i 'eggcups' det viser en mer komprimert fenotype (se Figur 4a - b). For å simulere et medikament screening manipulasjon, evaluerte vi også effekten av medikamenter på celler dyrket på begge miljøer. Vi valgte Blebbistatin mainly fordi det forstyrrer aktin spennings fibrene, og kan ha en effekt på Golgi-morfologi (se figur 3c - d). Siden Golgi ligger ved siden av cellekjernen, kan dette stoffet også har en effekt på sin arkitektur. Vi først observert at celler behandlet med dette stoffet viste en mindre regelmessig og ensartet morfologi sammenlignet med (WT) celler av vill type (se figur 3c - d). Vi deretter sammenlignet og kvantifisert Golgi fenotype observert på 'eggcups' og på flatt underlag (se figur 4c). Vi observerte at på 2D overflater celler viste stort sett en utvidet fenotype mens på "eggeglass" celler viste en mer komprimert fenotype. Vi observerte ikke om en slående forskjell mellom WT og Blebbistatin-behandlede celler.

Til slutt, på 2D overflater cellekjernen er tilfeldig orientert, mens det for celler i EC det er ortogonalt orientert i forhold til XY-planet i beggeWT og Blebbistatin behandlede celler (se figur 5a - c). Dette understreker styrken av innretningen for å orientere cellulære organeller, tilsvarende en tidligere anvendelse av fremgangsmåten for å orientere planet for observasjon av cytokinetic ring i gjær og pattedyrceller 10,12,13. Vi endelig studert hvordan kjernen sphericity (definert som ψ = [π 1/3 6V n 2/3] / A n, hvor V n er volumet av kjernen og A n dens overflateareal) ble påvirket avhengig av dyrknings betingelse og ved behandling av celler med Blebbistatin. Figur 5d viser de tilsvarende fordelinger av ψ. Vi har ikke observere en forskjell for WT flat vs WT EF, som avslører at EF ikke påvirker den normale sphericity av celler. Men vi har observert enforskjell når man sammenligner WT EC til Blebb EC som tyder på at EU er avslørende en reell effekt av medikamentet som er maskert i 2D.

Live-celle studier med 'eggcups' tillater også identifisering av nye aktive prosesser som ikke er synlige i standard kulturer. Vi belagt celler i EC og visualisert celledeling. Figur 6 viser en sekvens av bilder av cytokinetic ringlukking under celle mitose. Den 'eggcups' enheten tillater en fullstendig visualisering av ringen, mens standard 2D kulturene bare viser to områder som tilsvarer en enkelt plan 10. Rekonstruksjon av ringen fra en sekvens av z-stack bilder ved hjelp av 2D kulturer kan gjøres 27, men viktig informasjon går tapt. Kvaliteten er redusert på grunn av lav z oppløsning og dynamiske prosesser ikke kan løses. Aktin og myosin er viktige proteiner i kraft generering av celledeling. Deres dynamikk kan ikke be fotografert og studert i 2D kultur (figur 6a), mens med 'eggcups' det er umiddelbart avslørt. Vi har identifisert nye strukturer og prosesser: i HeLa celler finner vi periodiske ansamlinger av myosin 17. Disse ansamlinger bevege seg radielt i ringen avsluttes (figur 6b). I fisjon gjær finner vi også inhomogeniteter i myosin og aktin (figur 6c, høyre) 17. I motsetning til det vi ser i HeLa-celler, de roterer på ringen under nedleggelse. Hastigheten er i området fra um min -1 og ville ikke kunne løses ved z rekonstruksjon med standard mikroskop. Endelig cytokinetic ringen kan være ytterligere undersøkt ved farging for komponentene. Vi finner at det er en akkumulering av fosfotyrosin i nærheten av ringen (figur 6d). Vi kan også vise at anillin er colocalizing i ringen (figur 6e). Ved farging av cellene i denne orientering, we viser at anillin viser også en inhomogen fordeling.

The 'eggcups' ble også brukt til ulike modellsystemer: vi rapporterte pattedyrceller, fisjon gjær, men vi har også testet spirende gjær og C. elegans (se figur 7a - e). I dette tilfelle ble den protokoll tilpasset for hvert enkelt system i form av dyrkningsmedier, hulrom størrelse og morfologi (se tabell 1). Som et eksempel, konisk V-formede '' eggcups var optimal morfologi for immobilisering spalting gjær effektivt 12, i stedet for fullstendig sylindrisk (eller U-formet) form som brukes for 13 pattedyrceller. Dette gjorde teste effekten av ulike cytoskjelett medikamenter med potensiell anvendelse i Life Science forskning. Dette viser fleksibiliteten og påliteligheten av den utviklede metodikk.

Videre gir den svært beordret arrangement av celler enlett, automatiske utlesning av fluorescensen av enkeltceller. Vi illustrerer dette ved å sette inn NIH3T3 celler som uttrykker GFP i 'eggcups' (figur 8a). Cellen posisjon lett kan gjenkjennes og tilsvarende uttrykk nivå målt. Figur 8b viser fordelingen av fluorescens signaler. Dette kan anvendes på en hvilken som helst utlesning (immunfluorescens, fluorescerende reportere i celler for eksempel).

Figur 1
Figur 1: Fremstilling av 'eggcups' (a) Skjematisk beskrivelse av fremstillingsfremgangsmåten i 'eggcups' etter replika støping:. (I) Hell væske PDMS på SU-8 mugg og herde den. (Ii) Kutt ut stempelet og fjern den forsiktig fra overflaten, da plasma aktivere den til silanize det. (Iii) Hell flytende PDMS på HSTTanBeTiandlet stempel end sentrifuger det for å oppnå et tynt lag PDMS. (Iv) Etter herding PDMS lag, plasma aktivere begge, de PDMS dekket stempel og et dekkglass. (V) Plasma binde både ved å påføre en svak, homogent trykk. (Vi) Etter plasma bonding, forsiktig fjerne stempelet for å avdekke «eggcups 'overflate. (Vii) å forenkle håndteringen i de neste trinnene, legge til en liten PDMS håndtak stykke. Bind PDMS stykke til dekkglass ved å lime den med flytende PDMS og (viii) kurere den deretter i ovnen. (B) Bilde av en 25 mm dekkglass med PDMS 'eggcups "og et håndtak. (C) scanning elektronmikroskop bilder av PDMS 'eggcups'. Avstanden mellom sentrene i 'eggcups' er 30 mikrometer, og deres diameter på 25 mikrometer. (Venstre) ovenfra. (Høyre) 'eggcups' er kuttet til bilde indre del. Klikk her for å vie wa større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2: (a) Elementer som er nødvendig for EC fylling. (1) 50 ml tube; (2) sylindrisk stykke (ovenfra og fra siden); (3) cellekulturmedium; (4) 'eggcups'; (5) skarpe pinsett. (B) Skjematisk av EF fylling prosedyren. (I) En sylindrisk del som først innføres i et 50 ml rør og fylt med 13 ml cellekulturmedium. Neste, (ii) 'eggcups' er forsiktig avsatt på toppen av den sylindriske stykke ved hjelp av skarpe pinsett til å manipulere EC bruker lite PDMS stykke. (Iii) celler til riktig tetthet blir pipettert på toppen av EC. (Iv) Cellene blir introdusert i 'eggcups' ved sentrifugering. (V) Til slutt blir prøven forsiktig sluppet ut fra røret, og den er klar til bruk. m / filer / ftp_upload / 51880 / 51880fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3: Sammenligning av celle fenotyper på 3D 'eggcups' og 2D flate overflater. Konfokalmikroskopi (25X vann objektiv, 0,95 NA, Leica) bilde av NIH3T3 celler på (a) EF danner en ordnet array, og viser en homogen sfærisk fenotype, og på (b) standard 2D flat kultur, tilfeldig fordelt med heterogene fenotyper. Cellene ble farget for aktin (i grønt), Golgi (oransje) og kjernen (i blått). Skala barer = 100 mikrometer. (C) 3D rekonstruksjon av celler på EC og (d) på flate overflater for WT og Blebbistatin-behandlede celler. Skala barer = 20 mikrometer.880 / 51880fig3large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4
Figur 4: Studie av NIH3T3 Golgi-apparatet fenotype Skjematisk og eksempelbilde av Golgi fenotype klassifisering for celler på (a) flat og (b) EF.. Celler ble klassifisert som komprimeres, utvides eller fragmentert avhengig av α-verdi. (C) Kvantifisering av Golgi fenotyper. Skala barer = 10 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 5
Figur 5: (a) (Venstre) Konfokalmikroskopi bilde av en NIH3T3 celle i et EF og farget for aktin (i grønt), Golgi (oransje) og kjernen (i blått). (Høyre) Scheme av kjerner orientering inne EC. (B) Vinkel fordeling av kjerner inne i EF for WT og (c) Blebbistatin-behandlede celler. (D) Nucleus sphericity verdier for WT og Blebbistatin-behandlede celler både til EU og flate overflater (P [WT EC -Blebb EC] <0,001, P [Blebb flat -Blebb EC] <000,1; n WT flat = 47, n WT EC = 94, n Blebb flat = 59, n Blebb EC = 141 celler). Scale bar = 10 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.


Figur 6: Detaljert undersøkelse av cytokinetic ring i levende og faste prøver og i to systemer som bruker 'eggcups' (a) Tid sekvensen av cytokinetic ring ved hjelp av standard 2D in vitro kultur.. Bare to lyspunkter i aktin (Lifeact-mcherry, rød) og myosin (GFP tagget, grønn) er synlige i spalting fure av HeLa-celler (Scale bar = 10 mikrometer). (B) Tid sekvens av lukningen for de cytokinetic ringen i HeLa-celler i mitose ved hjelp av 'eggcups'. Bildene viser aktin (i rødt) og myosin (grønn). 'Eggcups' tillate identifisering av fortsatt myosin ansamlinger. Et eksempel er markert med en pilspiss. (Scale bar = 5 mikrometer). (C) cytokinetic ring kan også visualiseres i fisjon gjær. (Venstre) Cells ligge på et flatt underlag, CYTO kinetiske ringen er bare synlig som to prikker (Høyre) Celler i 'eggcups':. hele nedleggelsen kan fanges. Actin er merket med CHD-GFP (Scale barer = 2 mm). Tid i min: sek. (D - e) Eksempler på farget cytokinetic ringer. (D) Actin-GFP uttrykk HeLa-cellene er farget for fosfotyrosin (PY), som også viser signal i ringen (Skala bar = 5 um). (E) HeLa-celler som uttrykker GFP tagget myosin og Lifeact-mcherry (aktin) er farget for anillin. Anillin er avslørt for å lokalisere i cytokinetic ring og mindre konsentrert i hjernebarken. Det viser samlokalisering med aktin og myosin (Scale bar = 5 mikrometer). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

80 / 51880fig7.jpg "/>
Figur 7. Anvendelse av 'eggcups' til andre celletyper og modellsystemer (a) U2OS (human osteosarkom). Det innfelte viser en dele celle. (Scale bar = 20 mikrometer). (B) NIH3T3-celler som uttrykker GFP. Forskjell i uttrykk nivåer kan lett leses ut (Scale bar = 20 mikrometer). (C) SW480-celler (Skala bar = 20 um). (D) Spirende gjær; syklusen sin tid er uendret. (Scale bar = 10 mikrometer). (E) C. elegans ormer,. (til venstre) på et flatt underlag (Høyre) i "eggeglass", er embryo sett fra en ellers skjult perspektiv. (Scale barer = 10 mikrometer). Tid i min. Sek Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 8 Figur 8: Organiseringen i en rekke 'eggcups' gir en automatisk analyse av cellepopulasjon (a) NIH3T3 celler i EC (Scale bar = 20 mikrometer).. De har forskjellige ekspresjonsnivåer av GFP. (B) Automatisert gjenkjennelse av celle stilling tillater en individuell analyse av ekspresjonsnivået. Det er oppsummert i histogrammet av GFP uttrykk for cellepopulasjon. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Model System Type kultur Medium observasjon Medium 'eggcups' diameter (μ; M) Kommentarer / beskrivelse
pattedyr~~POS=TRUNC celler~~POS=HEADCOMP NIH3T3 10% BCS høy glukose DMEM 10% BCS L-15 20 Andre stabile cellelinjer, slik som REF52 eller MDCK, så vel som primære cellelinjer, cancerceller og / eller stamceller kan også settes inn i 'eggcups'.
HeLa 10% FCS høy-glucose DMEM 10% FCS L-15 25 Tilgjengelig fra mange forskjellige kilder.
U2OS 10% FCS høy-glucose DMEM 10% FCS L-15 20-25 Tilgjengelig fra mange forskjellige kilder.
SW480 10% FCS høy-glucose DMEM 10% FCS L-15 17-20 Tilgjengelig fra mange forskjellige kilder.
Gjær fisjon Gjær agarplate (YE5S) og flytende medier (YE5S og EMM5S) Filter sterilisert EMM media (se liste over materialer) 5 Overflaten behøver ikke å bli funksjonalisert med klebe-proteiner.
spirende Gjær Agar plate (YPD) og flytende medier (YEPD og SD) SD media 5 Overflaten behøver ikke å bli funksjonalisert med klebe-proteiner.
embryo C. elegans NGM plate ultrarent vann 25 Alternativt M9 medium kan brukes for langvarige forsøk. Oppskriften på dette saltet løsningen finner du her: http://cshprotocols.cshlp.org/content/2009/5/pdb.rec11798.full?text_only=true

Tabell 1: Kultur forholdene i 'eggcups' for ulike modellsystemer. Den ovenfor beslektet protokollen kan lett tilpassesved bare å bytte ut de beskrevne dyrkingsbetingelsene og størrelsen av "eggcups '.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Replika støping ble anvendt for å fremstille 'eggcups'. Fabrikasjon prosessen trenger ikke et rent rom; det er lett og enkelt, selv om noen praksis kan være nødvendig. Spesielt frigjøring av PDMS stempel er den mest kritiske trinnet for å fremstille et stort område av høy kvalitet 'eggcups'. Av denne grunn må tas i dette trinnet spesiell omsorg. Hvis dette trinnet er gjentatte ganger mislykkes, kan du vurdere å optimalisere plasma renere parametere før den silanisering og plasma bindende. Utilstrekkelig silanisering vil føre til sterk stikker av stempel til PDMS film. Hvis dette overholdes, kan økes inkubasjonstiden med silanizing reagens. Legg merke til at andre teknikker og materialer kan anvendes for å fremstille de "eggeglass", som kan være funksjonalisert med et stort utvalg av ligander (fibronektin, gelatin, kollagen, etc.). Spesielt kan mikrohulrom i polystyren er lett å fremstille av custom-laget hot-preging teknikk. Dette sikrer biokompatibilitet og direkte sammenligning med resultatene oppnådd i standard kulturskåler. Tilsvarende er spesiell omsorg og praksis er nødvendig for å optimalisere fylleprosent. Spesielt er det kritisk rensetrinnet for å sikre en passende fylling med noe overskudd av celler, noe som bidrar til støy og bakgrunns i signalet. Hvis cellene fjernes enkelt fra hulrom, vurdere å endre størrelse eller dybde av hulrom.

'Eggcups' gi 3D-lignende arkitektur til celler og høy innhold utvelgelsesassays ved hjelp av en enkel protokoll. Cellulære organ og aktive prosesser ukjente ved hjelp av standard kulturanalyser lett kan visualiseres ved hjelp av å sette enkeltceller på individuelle mikrohulrom ( 'eggcups'). Avhengig av modell-system, kan den størrelse, form og deres dimensjoner kan lett tilpasses. På denne måten pattedyrceller, gjær, spalting spirende gjær og C. elegans cen manipuleres og studeres, samt eventuelle embryoer som Drosophila, mus eller menneskelige embryoer for in vitro befruktning, eller stamceller for eksempel.

I dette oppsettet enkeltceller blir fanget. Dette er i motsetning til epitelvev påtreffes in vivo. Imidlertid kan dette miljøet reproduseres i våre 'eggcups' ved å dekke sideveggene med cadherins å etterligne celle-celle kontakter ved hjelp av mer fleksible elastomerer. Fokale kontakter vil bli fremmet ved avsetning av fibronektin i bunnen av brønnene. Disse respektive fordelinger av adhesjonsmolekyler bør tillate i å reprodusere de cellulære miljøer oppstått in vivo. Ved denne metode vil man nærme seg fysiologiske betingelser.

Medium utveksling i vår analyse er sikret. Celler i EF ikke viser noen degradering når du utfører både kortsiktige og langsiktige eksperimenter grunn av mangel på medium utveksling. Merk også at cellene i EC can dyrkes til samløpet selv om hovedinteressen er når enkeltceller eller embryoer er isolert inne i hulrommene.

Orientering av organeller eller hele organismer er avslørende ny informasjon. Vi viser ulike dynamikken i aktin og myosin i cytokinetic ringen. Selv om cytokinetic ring i fisjon gjær og pattedyrceller er sammensatt av lignende nøkkelkomponenter, viser vi med dette oppsettet, som deres spesifikke dynamikk er annerledes 17. Dette støtter det resultat, at lukkemekanismen i de to systemene er forskjellige, så vel. For å utvikle og undersøke en slik hypotese, orienteringen av cellen er uunnværlig. I fremtidige studier, kan denne enheten også brukes til å undersøke andre hendelser knyttet til organelle organisasjonen i cellene.

Utover det, kan denne teknikken være til stor nytte i utviklingsbiologi. Langstrakte embryoer kan lett orientert, observert eller videre behandlet i en definert retning.Sannsynligvis vår analyse ikke ville innføre polariteten av embryoer, men den høye prosentandel fylling ville tillate å ekstrahere det ønskede utlesning på en pålitelig måte. Tilsammen 'eggcups "kan være en god enhet for high-innhold screenings.

Andre kulturanalyser er blitt foreslått. Disse metodene varierer fra flere celler i 2D dimensjoner i multibrønnplater, til enkeltceller deponert i micropatterned selvklebende motiver med identisk form. Imidlertid er ingen av dem egnet for å overvinne de begrensninger som er beskrevet ovenfor på den observasjon av cellulære organeller og dynamiske prosesser 1.

Fremtidige forbedringer i vårt system vil tillate anvendelse av 'eggcups "til næringsrettede formål. Som et eksempel, narkotika screening programmer i farmasøytiske selskaper krever bruk av multibrønnplater 14,28; implementere 'eggcups' i slike plattformer vil potensielt forbedre påliteligheten avtester og resultater. Som sådan, høye innholdsscreeninganalyser vil bli utført ved hjelp av de mest brukte automatisert prosesser av farmasøytiske selskaper (og akademiske forskningslaboratorier) ved hjelp av roboter. Dette vil sikre repeterbarhet og pålitelighet med lav variabilitet. Enkelte kommersielle produkter basert på 3D-cellekulturanalyser allerede har dukket opp på markedet fremhever betydningen av denne type analyser. Til slutt, disse enhetene åpner nye perspektiver for personlig medisin: celler fra pasienten kan plasseres i 'eggcups', og behandlings cocktails kan bli testet i et fysiologisk miljø; den biomarkør utlesning vil tillate å forutse en optimal behandling som skal gis til pasienten 29. Tilsammen den fysiske formen på cellene og embryo er veiledende arkitekturen i hulrom, og vi håper at enheten og denne metoden vil bli utbredt i fremtiden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Vi har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Vi erkjenner L. Brino (IGBMC høyt innhold Screening anlegget, Illkirch, Frankrike) for å gi oss med anti-Giantin antistoff, M. Labouesse Lab. for C. elegans (IGBMC) og B. Séraphin Lab. for spirende gjær (IGBMC), E. Paluch og A. Hyman for fluorescerende HeLa celler (MPI-CBG, Dresden), J. Moseley (Dartmouth Medical School) og JQ Wu (Ohio State University) for fisjon gjærceller; A. Hoel og F. EVENOU for eksperimentell hjelp, C. Rick (IBMC, Strasbourg, Frankrike) for teknisk hjelp, og JC Jeannot (Femto-st, Frankrike) for å få hjelp i microfabrication. Dette arbeidet ble støttet av midler fra CNRS, Universitetet i Strasbourg, Conectus, La Fondation pour la Recherche MEDICALE og ci-FRC fra Strasbourg.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ddH20 (ultrapure) Millipore - Use always fresh water.
Parafilm (plastic film) Bemis PM-999 Adhere Parafilm to the lab bench using some water droplets and ensure a perfect surface flatness.
Photo-mask Selba - http://www.selba.ch
Silicon wafer Siltronix - http://www.siltronix.com/
SU-8 photoresist MicroChem 2000 series http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm 
working in a fumehood is required; check the data sheet from the manufacturer for more information.
SU-8 developer MicroChem - http://microchem.com/Prod-Ancillaries.htm 
working in a fumehood is required; check the data sheet from the manufacturer for more information
2-propanol Sigma-Aldrich 19030 http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/i9030?lang=en&region=CA
Available from multiple companies.
Sigmacote (siliconizing reagent ) Sigma-Aldrich SL2-25ML http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/sl2?lang=fr&region=FR 
harmful, working in a fumehood is required; check the data sheet from the manufacturer for more information. 
Chlorotrimethylsilane (TMCS) Sigma-Aldrich 386529-100ML http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/386529?lang=fr&region=FR  
TMCS produces acute inhalation and dermal toxicity, and is highly flammable (with ignition flashback able to occur across considerable distances), consequently it should be used in a fume cupboard away from sources of ignition
Nitrile gloves Kleenguard 57372 http://www.kcprofessional.com/products/ppe/hand-gloves/thin-mil-/57372-kleenguard-g10-blue-nitrile-gloves-m
Available from multiple companies.
Glass coverslips #0 Knittel glass KN00010022593 http://www.knittelglass.com/index_e.htm
Very fragile. Manipulate gently.
Sharp straight tweezers SPI 0WSSS-XD http://www.2spi.com/catalog/tweezers/t/elec7
50 ml tube BD Falcon 352070 http://www.bdbiosciences.com/cellculture/tubes/features/index.jsp
Available from multiple companies.
PDMS Dow Corning Sylgard 184 kit http://www.dowcorning.com/applications/search/default.aspx?R=131EN 
The package contains both PDMS base and curing agent. Similar elastomers are available from multiple companies.
Microscope glass slides Dutscher 100001 http://www.dutscher.com/frontoffice/search
Available from multiple companies.
DMEM high-glucose medium Fisher Scientific 41965-039 http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?LBCID=12301479&keyWord=41965-039&store=Scientific&nav=0&offSet=0&storeId=10652&langId=-1&fromSearchPage=1&searchType=PROD
Bovine calf serum Sigma-Aldrich C8056-500ML http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/c8056?lang=en&region=CA
0.25% Trypsin-EDTA Fisher Scientific 25200-072 http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=25200-072&store=Scientific&nav=0&offSet=0&storeId=10652&langId=-1&fromSearchPage=1&searchType=PROD
PBS 1x Fisher Scientific 14200-067 http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=14200-067&store=Scientific&nav=0&offSet=0&storeId=10652&langId=-1&fromSearchPage=1&searchType=PROD
PBS is at 10x and should be diluted to 1x using ddH2O
L-15 medium Fisher Scientific 21083-027 http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=21083-027&store=Scientific&nav=0&offSet=0&storeId=10652&langId=-1&fromSearchPage=1&searchType=PROD
Medium for atmospheres without CO2 control
Fibronectin  Sigma-Aldrich F1141-5MG http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&term=F1141-5MG&lang=en&region=CA&focus=product&N=0+220003048+219853082+219853286&mode=match%20partialmax
Penicillin & Streptomycin Fisher Scientific 15140-122 http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=15140-122&store=Scientific&nav=0&offSet=0&storeId=10652&langId=-1&fromSearchPage=1&searchType=CHEM
Petri dish P35 Greiner 627102 http://www.greinerbioone.com/en/row/articles/catalogue/article/144_11/12885/
Petri dish P60 Greiner 628163 http://www.greinerbioone.com/nl/belgium/articles/catalogue/article/145_8_bl/24872/
Petri dish P94 Greiner 633179 http://www.greinerbioone.com/nl/belgium/articles/catalogue/article/146_8_bl/24882/
Paraformaldehyde 3 % Sigma-Aldrich P6148-500G http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/p6148?lang=fr&region=FR 
Harmful in-particular for the eyes, working in a fumehood is required; check the data sheet from the manufacturer for more information.
Triton 0.5 % Sigma-Aldrich 93443-100ML http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&term=93443-100ML&lang=en&region=CA&focus=product&N=0+220003048+219853082+219853286&mode=match%20partialmax
Phallodin-Green Fluorescent Alexa Fluor 488 InVitrogen A12379 http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/A12379?CID=search-a12379 
dissolve powder in 1.5 ml methanol
Alexa Fluor 647 InVitrogen A21245 1:200 dilution in PBS 1x
rabbit polyclonal anti-Giantin Abcam ab24586 1:500 dilution in PBS 1x
http://www.abcam.com/giantin-antibody-ab24586.html 
rabbit anti-anillin Courtesy of M. Glotzer, Published in Piekny, A. J. & Glotzer, M. Anillin is a scaffold protein that links RhoA, actin, and myosin during cytokinesis. Current biology 18, 30–6 (2008). 1:500 dilution in PBS 1x
Anti-phosphotyrosine Transduction Lab 610000 http://www.bdbiosciences.com/ptProduct.jsp?ccn=610000
Cy3 goat anti-rabbit  Jackson Immunoresearch 111-166-047 http://www.jacksonimmuno.com/catalog/catpages/fab-rab.asp 
1:1,000 dilution in PBS 1x
DAPI Sigma-Aldrich D8417  http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d8417?lang=fr&region=FR 
1 mg/ml for 1 min
Glycerol Sigma-Aldrich G2025 http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&term=G2025&lang=en&region=CA&focus=product&N=0+220003048+219853082+219853286&mode=match%20partialmax
Mineral oil Sigma-Aldrich M8410-500ML http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&term=M8410-500ML&lang=en&region=CA&focus=product&N=0+220003048+219853082+219853286&mode=match%20partialmax
HeLa cells - - Mammalian cells are available from many companies. See also Table 1
NIH3T3 cells ATCC - Mammalian cells are available from many companies. See also Table 1
Fission yeast  - - For details on strains, contact the corresponding author.  See also Table 1
C. elegans worms - - For details, contact the corresponding author.  See also Table 1
YES (Agar) + 5 Supplements included MP Biomedicals 4101-732 http://www.mpbio.com/search.php?q=4101-732&s=Search 
For preparation: follow  instructions as given on the box
YES (Media) + 5 Supplements included MP Biomedicals 4101-522 http://www.mpbio.com/search.php?q=4101-522&s=Search 
For preparation: follow the instructions as given on the box
EMM (Media) MP Biomedicals 4110-012 http://www.mpbio.com/search.php?q=4110-012&s=Search 
For preparation: follow  instructions as given on the box
Filter sterilized EMM (Media) - Only for imaging MP Biomedicals 4110-012 For preparation: follow instructions as given on the box. Filter sterilize the media using a 0.22 µm filter instead of autoclaving. This gives transparency to the media and reduces the autofluorescence.
Supplements (for EMM) MP Biomedicals 4104-012 http://www.mpbio.com/search.php?q=4104-012&s=Search
 (Add 225 mg/L into the EMM media before autoclaving or filtering)
Stericup and Steritop Vaccum driven sterile filters Millipore - http://www.millipore.com/cellbiology/flx4/cellculture_prepare&tab1=2&tab2=1#tab2=1:tab1=2

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. Taking Cell-Matrix Adhesions to the Third Dimension. Science. 294, 1708-1712 (2001).
  2. Azioune, A., Storch, M., Bornens, M., Thery, M., Piel, M. Simple and rapid process for single cell micro-patterning. Lab Chip. 9, 1640-1642 (2009).
  3. Mandal, K., Balland, M., Bureau, L. Thermoresponsive Micropatterned Substrates for Single Cell Studies. PLoS ONE. 7, e37548 (2012).
  4. Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nat Rev Mol Cell Biol. 8, 839-845 (2007).
  5. Baker, B. M., Chen, C. S. Deconstructing the third dimension: how 3D culture microenvironments alter cellular cues. J Cell Sci. (2012).
  6. Ghibaudo, M., Di Meglio, J. M., Hersen, P., Ladoux, B. Mechanics of cell spreading within 3D-micropatterned environments. Lab Chip. 11, 805-812 (2010).
  7. Greiner, A. M., Richter, B., Bastmeyer, M. Micro-Engineered 3D Scaffolds for Cell Culture Studies. Macromol Biosci. 12, 1301-1314 (2012).
  8. Khetan, S., et al. Degradation-mediated cellular traction directs stem cell fate in covalently crosslinked three-dimensional hydrogels. Nat Mater. 12, 458-465 (2013).
  9. Legant, W. R., et al. Measurement of mechanical tractions exerted by cells in three-dimensional matrices. Nat Meth. 7, 969-971 (2010).
  10. Devices and methods for observing the cell division. Riveline, D., Buguin, A. WO/2010/092116 (2010).
  11. Ochsner, M., et al. Micro-well arrays for 3D shape control and high resolution analysis of single cells. Lab Chip. 7, 1074-1077 (2007).
  12. Devices and methods for observing cells with cell wall or invertebrate embryos with oblong eggshell . Riveline, D. WO2013144302 (2012).
  13. Devices and methods for observing eukaryotic cells without cell wall. Riveline, D., Wollrab, V. WO2013135809 (2012).
  14. Zanella, F., Lorens, J. B., Link, W. High content screening: seeing is believing. Trends Biotech. 28, 237-245 (2010).
  15. Wolfe, D., Qin, D., Whitesides, G. Microengineering in Biotechnology, Ch 3. Methods in Molecular Biology. Hughes, M. P., Hoettges, K. F. 583, Humana Press. 81-107 (2010).
  16. Mehling, M., Tay, S. Microfluidic cell culture. Curr Op Biotech. 25, 95-102 (2014).
  17. Wollrab, V., Thiagarajan, R., Wald, A., Kruse, K., Riveline, D. Still and rotating myosin clusters determine cytokinetic ring constriction. Nat Commun. 7, 11860-11869 (2016).
  18. Yao, X., et al. Functional analysis of single cells identifies a rare subset of circulating tumor cells with malignant traits. Integr Biol. 6, 388-398 (2014).
  19. Eberwine, J., Sul, J. Y., Bartfai, T., Kim, J. The promise of single-cell sequencing. Nat Meth. 11, 25-27 (2014).
  20. Allen, T. D., et al. Generation of cell-free extracts of Xenopus eggs and demembranated sperm chromatin for the assembly and isolation of in vitro-formed nuclei for Western blotting and scanning electron microscopy (SEM). Nat. Protocols. 2, 1173-1179 (2007).
  21. Robbins, E., Marcus, P. I. Mitotically Synchronized Mammalian Cells: a Simple Method for Obtaining Large Populations. Science. 144, (1964).
  22. Whitfield, M. L., et al. Stem-loop binding protein, the protein that binds the 3" end of histone mRNA, is cell cycle regulated by both translational and posttranslational mechanisms. Molecular and Cellular Biology. 20, (2000).
  23. Straight, A. F., et al. Dissecting Temporal and Spatial Control of Cytokinesis with a Myosin II Inhibitor. Science. 299, 1743-1747 (2003).
  24. Tang, J., Erikson, R. L., Liu, X. Checkpoint kinase 1 (Chk1) is required for mitotic progression through negative regulation of polo-like kinase 1 (Plk1). Proc Natl Acad Sci. 103, 11964-11969 (2006).
  25. Zahreddine, H., Zhang, H., Diogon, M., Nagamatsu, Y., Labouesse, M. CRT-1/Calreticulin and the E3 Ligase EEL-1/HUWE1 Control Hemidesmosome Maturation in C. elegans Development. Curr Biol. 20, 322-327 (2010).
  26. Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation. JoVE. e4019 (2012).
  27. Saha, S., Pollard, T. D. Anillin-related protein Mid1p coordinates the assembly of the cytokinetic contractile ring in fission yeast. Mol Biol Cell. 23, 3982-3992 (2012).
  28. Prestwich, G. D. Evaluating Drug Efficacy and Toxicology in Three Dimensions: Using Synthetic Extracellular Matrices in Drug Discovery. Acc Chem Res. 41, 139-148 (2007).
  29. Futamura, Y., et al. Morphobase, an Encyclopedic Cell Morphology Database, and Its Use for Drug Target Identification. Chem Biol. 19, 1620-1630 (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics