Beställa enskilda celler och Single Embryon i 3D Förlossning: En ny enhet för hög halt Screening

Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Vi rapporterar en anordning och en ny metod för att studera celler och embryon. Enstaka celler exakt beställas i mikrokavitet matriser. Deras 3D förlossning är ett steg mot 3D-miljöer förekommer i fysiologiska förhållanden och tillåter organell orientering. Genom att kontrollera cellens form, minimerar denna inställning variabilitet redovisas i standardanalyser.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Wollrab, V., Caballero, D., Thiagarajan, R., Riveline, D. Ordering Single Cells and Single Embryos in 3D Confinement: A New Device for High Content Screening. J. Vis. Exp. (115), e51880, doi:10.3791/51880 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Biologiska celler visar sig vanligtvis på platta (2D) ytor. Detta villkor inte är fysiologiska, och fenotyper och former är mycket variabla. Screening baserad på celler i sådana miljöer har därför allvarliga begränsningar: cellorganeller visar extrema fenotyper, cell morfologier och storlekar är heterogena och / eller specifika cellorganeller kan inte ordentligt. Dessutom är celler in vivo som ligger i en 3D-miljö; i denna situation, celler visar olika fenotyper främst på grund av deras interaktion med den omgivande extracellulära matrix av vävnaden. För att standardisera och skapa ordning av enskilda celler i en fysiologiskt relevant 3D-miljö för cellbaserade analyser, rapporterar vi här mikro och applikationer av en anordning för in vitro 3D cellkultur. Denna anordning består av en 2D matris med mikrokaviteter (typiskt 10 5 håligheter / cm 2), var och en fylld med enskilda celler eller embryon. cell posining, form, polaritet och intern cell organisation blir då normaliserade visar en 3D-arkitektur. Vi använde replik gjutning mönster en rad mikrokaviteter, "äggkoppar", på ett tunt polydimetylsiloxan (PDMS) skikt vidhäftat på ett täckglas. Karies täcktes med fibronektin för att underlätta vidhäftning. Celler infördes genom centrifugering. Fyllnings procentsats optimeras för varje system som möjliggör upp till 80%. Celler och embryon viabilitet bekräftades. Vi tillämpade denna metod för visualisering av cellulära organeller, såsom kärnan och Golgi-apparaten, och för att studera aktiva processer, såsom stängningen av cytokinetic ringen under celldelning. Denna anordning tillät identifiering av nya funktioner, såsom periodiska ansamlingar och inhomogeniteter av myosin och aktin under cytokinetic ringslutning och kompakterade fenotyper för Golgi och kärnan anpassning. Vi kännetecknas metoden för däggdjursceller, fission jäst, knoppande jäst, C. elegans wed särskild anpassning i varje enskilt fall. Slutligen egenskaperna hos denna enhet gör det särskilt intressant för läkemedelsscreeningsanalyser och personlig medicin.

Introduction

Ström in vitro cellbaserade analyser är två-dimensionell (2D). Denna konfiguration är inte naturligt för däggdjursceller och därför inte är fysiologiskt relevant en; celler visar en mångfald av former, storlekar och heterogena fenotyper. De presenterar ytterligare allvarliga begränsningar när det tillämpas på screeningsapplikationer, såsom en oordnad fördelning inom planet och extrema fenotyper av cellulära organeller (stress fibrer, i synnerhet). Detta är särskilt viktigt i kliniska försök för drogtestning, där höga budgetar spenderas varje år. De flesta av dessa läkemedel men misslyckas när de tillämpas på djurmodeller på grund av den konstgjorda 2D odlingsbetingelser i tidiga skeden av läkemedelsscreening. Dessutom, genom att använda detta tillvägagångssätt, specifika cellorganeller kan inte vara korrekt visualiseras, såsom cytokinetic aktomyosin ringen under cellmitos, och i allmänhet strukturer som utvecklas i planet vinkelrätt mot planet för observation. Någranya 2D-analyser har föreslagits för att övervinna de ovan nämnda nackdelarna och viktiga insikter om cytoskelettet organisation har observerats 2,3. Dessa analyser fortfarande finns en allvarlig begränsning: celler visar en mycket spritt fenotyp i motsats till vad som observerats in vivo, där celler presenterar en 3D-arkitektur. Dessa artefakter i samband med odlingsmetoden kan utlösa icke-fysiologiska funktioner såsom förbättrade spänningsfibrer 1,4,5.

Tredimensionella cellodlingsanalyser ge flera fördelar jämfört med 2D-miljöer 6,7. De är fysiologiskt mer relevant, och resultaten är därför meningsfulla. Som ett exempel kan celler inbäddade i hydrogeler visar 3D-liknande strukturer men deras morfologier skiljer sig från en cell till en annan 8,9. Men deras morfologier skiljer sig från en cell till en annan, vilket försvårar screening program. En alternativ strategi är att bädda endaceller i mikrofabricerade hålrum 10,11. Cell läge, form, polaritet och intern cell organisation kan då bli normaliseras. Förutom att ge 3D-liknande arkitektur till celler, mikrokaviteter möjliggör också hög innehåll screeningstudier 10,12-14; enskilda celler kan beställas till mikromatriser och cellulära organeller och deras utvecklingar kan observeras parallellt. Denna regelbundenhet ger bra statistik med lågt antal celler och bättre tids / rumsliga upplösningar. Användbara föreningar är lättare att identifiera ett tillförlitligt sätt.

I denna studie visar vi tillverkning och tillämpning av en ny 3D-liknande enda celler odlingssystem för hög halt screening program 10,12,13. Anordningen består av en uppsättning av elastomer mikrokaviteter (10 5 håligheter / cm2), myntade "äggkoppar" (EG). Dimensioner och totala volymen av EG i detta arbete är optimerade för den typiska volym av enskilda NIH3T3 och HeLa-cellerunder celldelning. Morfologin hos håligheterna - cylindriska - väljs för att på rätt sätt orientera cellform för visualisering av aktiva processer. Replik gjutning används för att mönstra en rad EG på ett tunt polydimetylsiloxan (PDMS) skikt vidhäftat på ett täckglas 15,16. Cellerna införs i EG genom centrifugering. Vi rapporterar här observation och normalisering av cellorganeller (aktin spänningsfibrer, Golgiapparaten och nucleus) i 3D (EG) i jämförelse med samma celler på 2D (flat) ytor. Vi rapporterar också observation av aktiva dynamiska processer såsom stängningen av cytokinetic aktomyosin ringen under celldelning 17. Slutligen visar vi resultatet av denna metod på andra system med stela väggar, såsom knoppande jäst, fissionsjäst och C. elegans embryon som bekräftar tillämpligheten av vår metodik för ett brett spektrum av modellsystem.

Vi presenterar nästa en detaljerad och uttömmande protocol i syfte att tillverka och tillämpa "äggkoppar" för 3D mikro. Vår inställning är enkel och inte behöver ett rent rum. Vi räknar med att denna nya metod kommer att vara särskilt intressant för läkemedelsscreeningsanalyser och personlig medicin, i utbyte av petriskålar. Slutligen kommer vår anordning att vara användbara för att studera fördelningen av celler svar på yttre stimuli, exempelvis i cancer 18 eller i grundforskning 19.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Mikro av "äggkoppar"

  1. Tillverkning av Master: mikrokaviteter Array
    1. Värma en 3 '' kiselskiva upp till 200 ° C för att förånga varje närvaro av fuktighet.
    2. Spin-coat ett tunt skikt av SU-8 fotoresist. Justera volymen av harts och spinnhastighet beroende på önskad tjocklek och fotoresist typ. Denna tjocklek kommer att diktera djupet av de "eggcups" (EG). För en 30 pm tjockt skikt och SU-8 2025 spin-coat vid 2800 rpm.
    3. Pre-baka rånet vid 65 ° C under 1 min (steg 1 av 2) för en 30 ^ m tjock SU-8 2025-skiktet. Anpassa tiden beroende på fotoresist typ och tjocklek önskas. Kontrollera tillverkarens datablad för mer information.
    4. Pre-baka rånet vid 95 ° C under 3 min (steg 2 av 2) för en 30 ^ m tjock SU-8 2025-skiktet. Anpassa tiden beroende på fotoresist typ och tjocklek önskas. Kontrollera tillverkarens datablad för mer information.
    5. laddawafer på masken riktaren för UV-exponering. Placera fotolitografi mask på det. Masken visar ett mönster av cirkulära egenskaper (diskar) av 20 | j, m i diameter. Säkerställa en perfekt kontakt mellan varandra.
      OBS: Olika tillverkare erbjuder fotolitografiska masker. Den rumsliga upplösning bestämmer den slutliga kostnaden. Acetat masker ge godtagbar lösning (≈10 um) till låg kostnad. Krommasker ger bättre upplösning men är dyrare. Anpassa diametrar skivor (från fotolitografi mask) till volymen av celler. Dimensioner av skivor på masken bestämmer diametern av kaviteter i anordningen. Små diametrar kommer att leda till en låg fyllning; alltför stor diameter inte kommer att begränsa cellerna. För HeLa och NIH3T3-celler, är diametrar på 20 nm till 25 nm föreslås.
    6. Kontrollera kraften i UV-lampan före utläggning och optimera exponeringstiden därefter. Bestråla (våglängd = 365 nm) för 41,5 sek (eller den optimerade exponeringstiden) vid250 mJ / cm2.
      OBS: SU-8 2025 är en negativ fotoresist, vilket innebär att exponerade områden för UV kommer att botas. I detta fall, de cirkulära funktioner var svart och resten öppet. Positiv fotoresist arbete på motsatt sätt: oexponerade områden härdas. Välj fotoresisten i enlighet därmed, beroende på utformningen och fotomasken.
      OBS: Skydda ögonen mot UV-ljus med lämpliga skyddsglasögon.
    7. Ta försiktigt masken från fotoresistskiktet.
    8. Post-baka rånet vid 65 ° C under 1 min (steg 1 av 2) för en 30 ^ m tjock SU-8 2025-skiktet. Post-baka rånet vid 95 ° C under 3 min (steg 2 av 2) för en 30 ^ m tjock SU-8 2025-skiktet. Anpassa tiden beroende på fotoresist typ och tjocklek önskas. Kontrollera tillverkarens datablad för mer information. Efter post-bakning, kyla skivan till rumstemperatur på bänken för cirka 1 minut.
    9. Placera skivan i spinnbeläggnings och släppa några mm SU-8 utvecklare att täckahela underlagsområdet. Utvecklas under två minuter och sedan spin-coat vid 1000 rpm under 30 sek. Upprepa proceduren tre gånger.
    10. Skölj med 2-propanol för att säkerställa fullständigt avlägsnande av outvecklade SU-8. Uppkomsten av vita regioner är en indikation på ofullständig utveckling. Om så är fallet, upprepa framkallningssteget en ytterligare tid.
    11. Hård-baka rånet vid 200 ° C för att säkerställa robusthet de tillverkade mikrostrukturer. Detta steg är valfritt.
    12. Förvara 3 '' wafer med mikro inuti en 94 mm x 15 mm polystyren petriskål.
      OBS: Det finns inget behov av ytbehandling, särskilt silanisering, för nästa steg.
  2. Tillverkning av Polydimetylsiloxan (PDMS) Replica: Pelare Array
    1. Blandas omsorgsfullt i ett 01:10 förhållande (vikt / vikt) tvärbindaren och pre-polymeren under totalt 30 g inuti ett 50 ml rör.
      OBS: Med hjälp av en 01:10 (v / v) förhållandet arbetar också.
    2. Centrifugera röret vid 1800 xg under 5 min tillta bort luftbubblor.
    3. Släpp försiktigt PDMS på toppen av mikrostrukturer.
      OBS: Om luftbubblor visas under detta steg Degas provet med en vakuumpump för 15-20 min.
    4. Placera provet i en ugn vid 65 ° C under 4 h.
      OBS: Härdningstiden varierar mellan användarna och, tillsammans med tvärbindningsmedlet: pre-polymer proportion. Denna tid kommer att diktera den stela PDMS. Det rekommenderas att bota mer än två timmar och att hålla sig till en fast härdningstiden.
    5. Använd en skalpell för att försiktigt skära område av intresse (stämpel) på ca 1 cm 2 som omfattar cirka 10 5 mikrokaviteter eller "äggkoppar".
      OBS: Skär först PDMS och sedan dra bort det försiktigt. Kontrollera kvaliteten på PDMS replik med ett optiskt mikroskop.
  3. Tillverkning av 'eggcups' genom replika formning. I det följande visas två alternativa strategier för tillverkning av 'eggcups' beskrivas. Båda protokollen är similar och ge identiska resultat:
    1. strategi 1
      1. Aktivera fabricerade PDMS stämpel med syre plasmabehandling under 30 sekunder. Lagra temporärt aktiverade stämplar i en stängd petriskål för att förhindra avsättning av damm.
        OBS: Ställ in exponeringstid om andra gaser för plasma används.
      2. Placera de aktiverade PDMS stamp upp och upp (sidan med strukturerna) i en petriskål intill en 15 ml rör cap. Fyll locket med 200 ul trimetylklorsilan (TMCS). Stänga petriskål och låt stämpeln silaniseras under 7 min.
        OBS! Vissa tillfälliga deformation på stämpeln och / eller förändringar i färg (vit) kan observeras. Stämpeln kommer att återhämta sin ursprungliga form på kort tid och de strukturer kommer inte att påverkas.
        OBS: TMCS producerar akut inandning och dermal toxicitet, och är mycket brandfarligt (med tändtillbakablick kan förekomma över stora avstånd). Följaktligen bör det användas i ett dragskåp bort från källans för antändning.
      3. Placera PDMS stämpel på spinnbeläggnings med de strukturer upp upp. Sätt en liten droppe av få mikroliter (cirka 20 l) av flytande PDMS (01:10 vikt / vikt tvärbindare: pre-polymer) på toppen av strukturerna. Spin-coat vid 1500 varv per minut under 30 sek för att avsätta ett tunt skikt av PDMS på toppen av strukturerna.
        OBS: Om stämpel inte passar spinnbeläggnings chuck plats stämpeln ovanpå en petriskål lock med ett litet hål i mitten.
      4. Placera stämpel i ugnen vid 65 ° C under 4 timmar för att härda den deponerade spinnbelades PDMS skikt.
      5. Aktivera den tunna PDMS skiktet genom att placera PDMS stämpeln upp och upp, tillsammans med ett täckglas # 0 av 25 mm i diameter, med användning av syreplasma rengöringsmedel för 30 sek. Gå snabbt till nästa steg.
        OBS: täckglas med andra tjocklekar, former och dimensioner kan användas. Emellertid kan vissa cellulära strukturer vara svårt att visualisera beroende på det valda täckglas tjocklek och objektivförstoring och / eller NA och / eller arbetsavstånd. Kontrollera målet bladet.
      6. Placera i kontakt stämpeln (sidan med tunna spinnbelagda skiktet) med glastäck. Tryck försiktigt runt ytan av stämpeln med pincett för att göra "bonding". Slutligen, hålla ett konstant tryck på toppen av stämpeln för cirka 10 sekunder.
      7. Efter 30 minuter försiktigt "skal" stämpel från täck för att "befria" "äggkoppar" (se figur 1). Skölj noga med etanol och torr. Om PDMS 'eggcups "inte är väl vidhäftar på glastäck (dvs. de lossnar under" unpeeling "steg) genom att justera inställningarna för plasma renare och starta på steg 1.3.1.5.
        OBS: Detta steg är känslig. Var uppmärksam för att undvika brott på täckglas och / eller lossnar det tunna PDMS lagret.
      8. Limma en liten bit (handtag) av härdade PDMS av 1 mm x 1mm x 3 mm i volym vid kanten av täckglas med en liten droppe av vätskeformiga PDMS och bota PDMS som tidigare. Detta kommer att underlätta manipulering av provet efteråt (se figur 1). Detta steg är valfritt.
    2. strategi 2
      1. Hydrofilisera de tillverkade PDMS frimärken med syre plasmabehandling under 30 sekunder. Lagra temporärt aktiverade stämplar i en stängd petriskål för att förhindra avsättning av damm.
        OBS: Ställ in exponeringstid om andra gaser för plasma används.
      2. Hydrofilisera 25 mm diameter glastäck # 0 syreplasmabehandling vid 15 W under 30 sekunder. Gå snabbt till nästa steg.
        OBS: täckglas med andra tjocklekar, former och dimensioner kan användas. Dock kommer cellstrukturer att bli svårt att visualisera beroende på vald täck tjocklek och objektiva egenskaper (se not ovan).
      3. Spin-coat en liten droppe av PDMS (01:10 vikt / vikt tvärbindare: pre-polYmer) av några mikroliter på glaset täck. Spin-coat vid 1500 varv per minut under 30 sek för en slutlig tjocklek av cirka 50 um.
      4. Limma en liten bit (handtag) för härdade PDMS av en mm x 1 mm x 3 mm i volym vid kanten av täckglas med en liten droppe av vätskeformiga PDMS och bota PDMS som tidigare. Detta kommer att underlätta manipulering av provet efteråt (se figur 1). Detta steg är valfritt.
      5. Förvara tillfälligt PDMS-belagda täck på en ren torka i en petriskål för att skydda mot damm nedfall.
      6. Sätt en droppe silanisering reagens på toppen av varje stämpel och låt det avdunsta i 1-2 minuter. Sedan torka dem under en ström av N2.
        OBS: I detta steg, kan observeras en tillfällig deformation av stämpeln under avdunstning. Stämpeln kommer att återhämta sin ursprungliga form efter torkning med N 2 utan någon permanent deformation av mikrostrukturer.
      7. Släpp mycket försiktigt silaniserad stämpel på toppen avPDMS-spinnbelades glastäckglas förvaras i petriskålen. Se till att båda sidor är helt parallella under kontakten. Undvik att trycka eller flytta stämpeln efter att placera den på PDMS-belagda täckglas.
      8. Placera petriskål med prover i vakuum under 1-2 h för att avlägsna luftbubblor.
        OBS: Se till att proven är helt horisontellt för att undvika stämpelförskjutning. Undviker också vibrationer potentiellt orsakas av vakuumpumpen.
      9. Placera proverna i ugn vid 65 ° C under 4 h.
      10. Försiktigt, dra av stämpeln för att avslöja "äggkoppar". Skölj noga med etanol och torr.
        Det behövs Practice på denna punkt: OBS. Var uppmärksam på att undvika brott på täckglas och / eller lossnar det tunna PDMS lagret.

2. Presentation Celler in i de 'eggcups'

För att införa däggdjursceller inuti "äggkoppar", PDMS yta needs som skall funktionaliseras med vidhäftningsproteiner av den extracellulära matrisen. I detta exempel används fibronektin men andra proteiner av intresse, såsom kollagen, kan användas.

  1. Hydrofilisera de "äggkoppar" i syreplasma rengöringsmedel för 30 sek.
    OBS: Optimera parametrarna om det behövs.
  2. Bered en lösning i PBS 1x 20 mikrogram ml -1 fibronektin från nötkreatur källor.
  3. Sterilisera "äggkoppar" med UV under 5 min. Deponera en liten droppe (omkring 20 till 50 | j, l) av fibronektin lösning för att täcka hela "eggcups" område och inkubera i 1 timme vid RT. Skydda provet från att torka.
  4. Skölj försiktigt de "äggkoppar" med PBS 1x. Upprepa 3 ggr.
    OBS: Provet är klar att användas omedelbart eller lagras vid 4 ° C i mörker under flera veckor.
  5. Införa ett cylindriskt skräddarsydd plast bit av 63 mm i höjd, 26 mm i yttre radie och 7 mm av interna radie dimensioner in i ett 50 ml rör (seFigur 2) 20
    VARNING: Använd UV-steriliserade föremål eller sterilisera dem innan användning.
    OBS: Denna del kan lätt tillverkas i labbet. eller genom någon tillgänglig verkstad.
  6. Sätta 13 ml cellodlingsmedium inuti röret (se tabell 1). Mediet bör fylla åtminstone 2 cm ovanför cylinderformat för att säkerställa fullständig nedsänkning av provet.
    OBS: För mer information om specifika celltyper och andra modellsystem, såsom jäst eller C. elegans embryon, och motsvarande medium som används, se avsnitt 5 och tabell 1. Den beskrivna protokollet var optimerad för HeLa, NIH3T3-celler, och andra cellinjer (se tabell 1).
  7. Införa mycket försiktigt de "eggcups 'inuti röret och parallellt med den övre sidan av plaststycket. Använd skarpa pincett för att hålla provet med hjälp av PDMS handtaget. Tryck försiktigt täck tills den ligger på toppen av den övre sidan av plaststycket, until det är helt nedsänkt (se figur 2).
    OBS: Det rekommenderas att använda skarpa och raka pincett. Med böjda pincett, är manipulation av provet svår och kan orsaka brott.
  8. Kultur celler tills 80-100% konfluens i en P60 petriskål och samlar dem genom trypsinisering.
    OBS: Celler kan vara av vildtyp, transfekterad eller behandlas med någon drog av intresse.
    OBS: Undvik bildning av cellaggregat som kommer att undvika enskilda celler att gå in i "äggkoppar". För att optimera detta steg, pipett upp och ner ordentligt efter trypsinisering.
  9. Återsuspendera celler i 5 ml odlingsmedium. Pipettera 200 | il av celler på toppen av de "eggcups '.
    OBS: Drop-celler såsom centrerat som möjligt på toppen av de "eggcups 'men undviker fysisk kontakt. Detta kommer att förhindra brott och / eller skada av provet.
  10. Centrifugera vid 1800 x g under 2 min.
    OBS: Efter den första centrifugeringen, checka in en mikrofonroscope fyllningsprocentandelen av de "eggcups '.
  11. Pipettera igen 200 | il av celler på toppen av "eggcups 'och centrifugera vid 1800 xg under 2 minuter. Upprepa för totalt tre gånger för att optimera fyllningen procentsats.
    OBS: Efter den sista centrifugeringen, kontrollera med ett mikroskop fyllnings andelen "äggkoppar". Om nödvändigt, upprepa fyll + centrifugeringsstegen tills de når önskad fyllning procent.
  12. Ta bort provet från röret med hjälp av vassa pincett håller PDMS handtaget. Se till att vara försiktig i inte "störande" celler som hålls i "äggkoppar" (se figur 2).
  13. Placera provet i en petriskål med medium. Skölj för att avlägsna överskottet av celler som inte är i de "eggcups 'genom att pipettera upp och ned tre gånger försiktigt intill varje sida (totalt 4 sidor) av mikrostrukturen array.
    OBS: Pipettering alltför starkt kan frigöravissa celler ut från "äggkoppar.
  14. Ersätta mediet med färskt medium för att avlägsna nonattached celler.
    OBS: I detta steg kan läggas till ett läkemedel av intresse.
  15. Fix celler eller förbereda dem för time-lapse imaging.See steg 4,1.

3. Observation av aktiva Cellular Dynamics i "äggkoppar": Cytokinetic ringslutning

OBS: Det här exemplet använder HeLa-celler som transfekteras med MYH10-GFP och Lifeact-mCherry för myosin och aktin respektive nyckel aktiva molekyler som är involverade i cytokinetic ringslutningen under celldelning. Enheten är förberedd med mikrokaviteter av 25 mikrometer i diameter. För deras iakttagelse var en epifluorescence inverterat mikroskop används, utrustad med en 60X olja mål (1,40 NA, DIC, Plan Apo) och GFP (myosin) och TxRed (aktin) filter. Alternativt en upprätt konfokalmikroskop användes, utrustad med en 25X eller 63X HCX IR APO L vatten mål (0,95 NA). För denna example, är det starkt rekommenderat att synkronisera celler genom att använda dubbel tymidin blocket, mitotiska block eller mitotisk skaka avstängt 21-24.
OBS: Tjockleken på PDMS som används för "äggkoppar" tillåter användning av en mängd olika mål både i inverterade och upprätt placerade mikroskop.

  1. Place "äggkoppar" i ett mikroskop hållare och fylla den med 1 ml 10% FCS L-15 observations medium. För att undvika avdunstning, placera ett lock glas ovanpå hållaren eller applicera ett tunt lager av mineralolja ovanpå medium.Select olje mål 60X.
    OBS: L-15-medium är tillräcklig för icke-CO 2 atmosfärer. Observera också att vissa föreningar DMEM är auto-fluorescerande. Vid användning av detta medium, är det rekommenderat att photobleach de fluorescerande föreningarna genom att belysa det med en högintensitetslampa under 1-2 timmar.
    OBS: Undvik att använda plastlock när man arbetar med DIC imaging.
  2. Placera hållaren med "äggkoppar" och observation medium i mikroskopet. Fokus försiktigt med bright ljus tills "äggkoppar", och celler är i samma plan för observation.
  3. Öppna mjukvaran och justera parametrar. Välj filtren TxRed och GFP för aktin och myosin, justera exponeringstid för varje kanal. En typisk upptagningshastigheten är 5 sek för båda kanalerna.
    OBS: Den exponeringstid kan behöva justeras beroende på uppspänning, färg eller andra cellulära organeller av intresse.
  4. Välj regionen av intresse och söka en cytokinetic ring med antingen GFP eller TxRed kanal. Fokusera exakt.
    OBS: Ringen är skarpare i myosin och lättare att känna igen.
  5. Kör automatisk förvärv i båda kanalerna tills ringen är helt stängd.
    OBS: Vissa fotoblekning kan observeras. Justera mikroskopet parametrar för att minska den.

4. Observation av fasta cellulära organ i "äggkoppar"

Detta steg kan utföras före eller efter steg # 3. Celler kan direkt fastställas efter centrifugeringssteget och färgas för organell av intresse eller efter observation i mikroskop. Detta exempel visar färgningen av golgiapparaten, nucleus och aktinfibrer på NIH3T3 fibroblaster i "äggkoppar".

  1. Fixering av celler i "äggkoppar"
    1. Förbereda 3% paraformaldehyd (PFA) och varm vid 37 ° C. Ta bort "äggkoppar i urvalet från 50 ml rör (eller mikroskopet hållaren) och placera den i en P35 petriskål. Skölj en gång med PBS 1x.
      NOT: Protokoll för framställning av 3% paraformaldehyd är allmänt tillgängliga på annat håll.
      VARNING: Använd nitril och ögonskydd under utarbetandet av PFA.
    2. Ta bort fullständigt PBS och släppa 1 ml av 3% PFA och inkubera i 17 min. Ta bort PFA och skölj två gånger med 1 ml PBS 1X. Permeabilisera celler med användning av 1 ml av 0,5% Tritpå under 3 min och tvätta två gånger med PBS 1 x för 5 min.
  2. Färgning av celler i "äggkoppar"
    1. Inkubera celler för Golgi-apparaten färgning med den primära antikroppen polyklonal kanin-anti-Giantin i en 1: 500 spädning i PBS. Placera en 100 | il droppe av antikroppslösningen på en plastfilm arket och inkubera cellerna inuti de "eggcups 'upp och ned under 45 min.
      OBS: Skydda provet med ett lock för att förhindra uttorkning.
    2. Släpp noga "äggkoppar" och placera dem i en P35 petriskål. Skölj 3 gånger, 5 min vardera med PBS 1x.
    3. Förbereda en cocktail i PBS med den sekundära antikroppen Cy3-get-anti-kanin (1: 1000) och med Phalloidin Alexa Fluor 488 (1: 200) för färgning aktin spänningsfibrer.
    4. Inkubera celler med en 100 | il droppe av antikroppslösningen på en plastfilm arket och inkubera cellerna inuti de "eggcups 'upp och ned under 45 min.
    5. Släpp försiktigt "eggcups "och placera dem i en P35 petriskål. Skölj 3 gånger, 5 min vardera med PBS 1x.
    6. Inkubera celler för nukleär färgning placera ett 100 | il droppe av 1 | j, g ml -1 DAPI i PBS på en plastfilm arket och inkubera cellerna inuti de "eggcups 'upp och ned under 45 min. Detta steg kan utföras med steg 4.2.3.
    7. Släpp noga "äggkoppar" och placera dem i en P35 petriskål. Skölj 3 gånger, 5 min vardera med PBS 1x.
    8. Mount celler med användning av en 15 | j, l Glycerol: PBS (1: 1 v / v) på en standardmikroskopobjektglas och försegla provet med nagellack för att undvika uttorkning.
      OBS: Beroende på "äggkoppar 'tjocklek, kan montering vara svårt. Det rekommenderas att lagra sedan provet i en P35 petriskål i PBS, skyddad från torkning.
  3. mikroskop Observation
    OBS: I detta exempel en upprätt konfokalmikroskop används, utrustad med PMT och Hybrid detektorer. En 25X eller 63 X HCX IR APO L vatten mål (0,95 NA) valdes för att ge ett brett fält av provet och visar tillämpligheten av anordningen för hög innehålls screening program.
    1. Välj 25X eller 63x vatten mål.
      OBS: Olika mål kan användas beroende på tillämpningen och signalen. Men användningen av höga numeriska mål öppning rekommenderas.
    2. Placera det fasta provet med de "eggcups 'och fokus försiktigt med bright ljus (faskontrast eller DIC) tills de" eggcups' och celler är i planet för observation.
    3. Öppna mjukvaran och justera parametrar. Välj filtren GFP, Cy3 och DAPI för aktin, Golgi och kärnan observation, respektive; justera exponeringstid för alla kanaler.
      OBS: Den exponeringstid kan behöva justeras beroende på installationen.
    4. Välj och fokusera regionen av intresse; börja ta bilder (se figur 3).
TLE "> 5. Anpassning för observation av jästceller och C. elegans Embryo

  1. Fission och spirande Jästceller
    OBS: Det här exemplet använder klyvningsjästceller som är märkta med RLC1-mCherry och CHD-GFP för myosin och aktin, respektive. Den spirande jästcellerna inte fluorescensmärkt här. För fissionsjäst observation en inverterad snurrande skiva konfokalmikroskop användes. En 100X HCX PL APO CS olja mål (1,4 NA) användes för samtliga förvärv. Alternativt celler observerades även med ett inverterat faskontrastmikroskop utrustad med en 20X faskontrast luft mål LCPlanFl (0,4 NA). I detta exempel, är det protokoll identisk för båda celltyper.
    1. Förbered 'eggcups' yta, såsom beskrivits ovan. För fission och spirande jästceller, förbereda håligheterna hos 5 pm i diameter (se tabell 1). I detta fall blir ytan behöver inte vara funktionaliseras med adhesionsproteiner.
      OBS: Fyllnings can optimeras genom att använda koniska "äggkoppar. Denna form fångar och behåller cellerna undvika att släppa under sköljningssteg efter centrifugering. Påfyllning procent är optimalt vid ca 80%. Dessa koniska "äggkoppar" kan tillverkas med hjälp av djup reaktiv jonetsning 13.
    2. Kultur jästceller i rätt odlingsmedia (se tabell 1) fram till att nå en optisk densitet (OD) i intervallet 0,2 och 0,8. Sonikera den kultur av jästceller för att avlägsna aggregat.
    3. Infoga jästceller i 'eggcups' genom centrifugering. För centrifugering 4 ml odlade celler i lämpligt OD läggas på röret med "äggkoppar". Efter den första centrifugeringen försiktigt skaka röret för att återsuspendera celler som inte befinner sig i de "äggkoppar", medan celler i "äggkoppar" inte störs. Utan att öppna röret, centrifugera igen och upprepa detta steg två gånger. Detta säkerställer avsättningenav celler från kulturen in i de tomma mikrohålrummen och kommer att öka fyllningsprocenten.
      OBS: När du arbetar med jäst, är det rekommenderat att förvärma centrifugen till arbetstemperatur under experiment
      OBS: Protokollet kan pausas här och fortsatte upp till 12 timmar senare. I detta fall, förvara provet vid arbetstemperatur och täck den för att förhindra avdunstning.
    4. Placera "äggkoppar" i ett mikroskop hållare och fylla hållaren med filter steriliserat medium för avbildning. Skölj nu cellerna med samma media tills de flytande jästcellerna avlägsnas effektivt. Se till att inte störa celler i "äggkoppar" under sköljningsprocessen.
    5. Välja oljeobjektiv 100X och fokusera noggrant. Öppna mjukvaran och justera parametrar. För fissionsjäst, välj filter GFP och TxRed för aktin och myosin och justera exponeringstid för båda kanalerna. En typisk upptagningshastigheten är 3 sek.
      OBS! Beroende påfluoroforen, typ av märkning och set-up, exponeringstiden varierar för andra system.
  2. C. elegans Embryo
    OBS: Det här exemplet använder C. elegans embryon 25-30 um breda och 50-55 pm långa. Embryon odlades såsom indikeras i 25. En enkel visuell protokoll för hur man manipulerar C. elegans kan hittas i 26. Observationen utfördes med användning av ett inverterat faskontrast mikroskop utrustat med ett 40X luft mål 0,55 NA.
    1. Förbered 'eggcups' yta såsom beskrivits ovan och 25 | j, m i diameter (se tabell 1). I detta fall blir ytan behöver inte vara funktionaliseras med adhesionsproteiner.
    2. Kultur C. elegans embryon i rätt odlingsmedia (se tabell 1).
    3. Infoga embryon i "eggcups 'genom centrifugering såsom beskrivits ovan (se avsnitt 2,6-2,12) med användning av ultrarent vatten som odlingsmedium.
      OBS: Embryon 'beter "normalt i ultrarent vatten under hela experimentet. Alternativt kan du använda en fysiologisk M9 buffert för långtidsförsök.
    4. Skölj provet som beskrivs ovan (se avsnitt 2.14). Placera de "eggcups 'in i ett mikroskop hållare. Välj 40X luft målet och fokusera noggrant. Öppna mjukvaran och justera parametrar. Välj en förvärvstakt på 3 sek.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De "eggcups '(EG) är en ny hög halt-screening metod som tillåter visualisering av orienterade celler och embryon i en 3D-miljö. Dessutom kan vissa cellulära processer, som är svåra att observera i standard 2D (platt) kulturer, kan observeras av den nya metoden. Figur 1a visar en sammanfattning av förfarandet för EG-mikro (se även avsnitt 1 i den ovan beskrivna protokoll ). Metoden är enkel, snabb, effektiv och utan krav på speciell utrustning. Figur 1b och 1c visar en storskalig bild och en förstorad svepelektronmikroskopbild av 'eggcups', respektive. Som det kan observeras, deras form och storlek är mycket vanliga. Denna metod är mycket flexibel; olika former och storlekar kan lätt tillverkas och anpassas för olika modellsystem. Måtten på'eggcups' valdes på följande sätt: dimensionerav celler som genomgår delning mättes på 2D-ytor: de har en sfärisk form och deras diameter togs som en bra indikation för EG diameter. Celler i'eggcups' långsträckt och orientera längs sin längdaxel under celldelning till exempel. Denna dimension beror på systemet - celler och embryon - så denna dimension bör utvärderas i varje enskilt fall.

Figur 2 visar det material som behövs (figur 2a) och ett steg-för-steg-protokoll (figur 2b) om hur man använder de "eggcups '(se även avsnitt 2 i det ovan beskrivna protokollet). Fyllningen av EG med celler av intresse (eller andra modellsystem) är mycket enkel och snabb. Normalt tar det mindre än 20-30 minuter, vilket även omfattar tiden för cell trypsinering. Efter fyllningen, kan prover användas för att studera aktiva processer (levande imaging) eller kan fixeras och färgas för visualisering av organeller av interest (se även avsnitt 3 och 4 i det protokoll som beskrivs ovan).

På plana ytor, celler visar heterogena svar och extrema fenotyper av cellulära organeller. I själva verket har det föreslagits att aktin spänningsfibrer (och andra cellulära organeller) är artefakter av odlingsbetingelsema 1. För att bevisa denna hypotes odlades vi NIH3T3-celler både på 3D "äggkoppar" och på plana ytor och jämförde fenotyper av olika cellorganeller, nämligen aktin spänningsfibrer, Golgiapparaten och kärnor. Figur 3 visar ett exempel på hur celler organiseras på båda konfigurationer. I EG, celler fördelade i en ordnad array visar en homogen sfärisk liknande fenotyp (figur 3a). På plana ytor, celler visar den typiska oordnade, spridning och heterogen morfologi (figur 3b). Det finns också betydande skillnader i cytoskelettsystemen strukturer. I synnerhet celler på R16, äggkoppar "visar en minskning av antalet stressfibrer jämfört med plana ytor. Detta bekräftas ytterligare i 3D rekonstruerade bilder där inga klara spännings fibrer är synliga (se figur 3c - d). Detta bekräftar att vissa cellulära strukturer förstoras i 2D kulturer. Detta är också i överensstämmelse med observationer som utförs in vivo där spännings fibrer inte kan identifieras.

Golgi-apparaten visar också en betydande variation i deras fenotyp beroende på odlingsbetingelser (se figur 4). Golgiapparaten på 2D kulturer visar typiskt en förlängd fenotyp "omfamna" kärnan periferin medan "äggkoppar" det visar en mer sammanpressad fenotyp (se figur 4a - b). För att simulera en läkemedelsscreening manipulation, utvärderade vi också effekten av läkemedel på celler odlade på båda miljöerna. Vi valt Blebbistatin mainly eftersom det stör aktin spänningsfibrer och kan ha en effekt på Golgi morfologi (se figur 3c - d). Eftersom Golgi ligger intill cellkärnan, kan denna drog också ha en effekt på dess arkitektur. Vi observerade först att celler som behandlats med detta läkemedel uppvisade en mindre regelbunden och enhetlig morfologi jämfört med vild typ (WT) celler (se figur 3c - d). Vi jämförde sedan och kvantifieras Golgi fenotypen observerats på "äggkoppar" och på plana ytor (se figur 4c). Vi observerade att på 2D ytor celler visade mestadels en utvidgad fenotyp medan på "äggkoppar 'celler visade en mer sammanpressad fenotyp. Vi har inte observera om en slående skillnad mellan WT och Blebbistatin-behandlade celler.

Slutligen, den 2D ytorna cellkärnan är slumpmässigt orienterade, medan för celler i EG den är ortogonalt orienterade i förhållande till XY-planet i bådeWT och Blebbistatin behandlade celler (se figur 5a - c). Detta belyser styrkan av anordningen för att orientera cellulära organeller, liknande en tidigare tillämpning av metoden för orientering planet för observation av cytokinetic ring i jäst och däggdjursceller 10,12,13. Studerade vi slutligen hur kärnan sfäriskhet (definierad som ψ = [π 1/3 6V n 2/3] / A n, där V n är volymen av kärnan och A n dess ytarea) påverkades beroende på odlings villkoret och vid behandling av celler med Blebbistatin. Figur 5d visar motsvarande fördelningarna av ψ. Vi har inte observera en skillnad för WT platt vs WT EG, som avslöjar att EG inte påverkar den normala sfärisk av celler. Men observerade vi enskillnad när man jämför WT EG Blebb EG tyder på att EG avslöjar en verklig effekt av läkemedlet som är maskerad i 2D.

Levande cellstudier med användning av 'eggcups' tillåter också identifiering av nya aktiva processer som inte är synliga i standardkulturer. Vi pläterade celler i EG och visualiseras celldelning. Figur 6 visar en sekvens av bilder av cytokinetic ringslutning under cellmitos. Den "äggkoppar" enhet tillåter en fullständig visualisering av ringen, medan vanliga 2D kulturer visar endast två områden som motsvarar en enda plan 10. Rekonstruktion av ringen från en sekvens av z-stack bilder med hjälp av 2D-kulturer kan göras 27, men viktig information går förlorad. Kvaliteten är nedsatt på grund av låg z upplösning och dynamiska processer kan inte lösas. Aktin och myosin är viktiga proteiner i kraft generationen celldelning. Deras dynamik kan inte be avbildas och studerade i 2D kultur (Figur 6a), medan med "äggkoppar" det omedelbart avslöjas. Vi har identifierat nya strukturer och processer: i HeLa-celler hittar vi återkommande ansamlingar av myosin 17. Dessa ansamlingar förflyttas radiellt som ringen avslutas (figur 6b). I fissionsjäst finner vi även inhomogeniteter i myosin och aktin (Figur 6c, höger) 17. I motsats till vad vi ser i HeLa-celler, de roterar på ringen under stängningen. Hastigheten är i intervallet fim min -1 och skulle inte vara upplöslig genom z rekonstruktion med standardmikroskop. Slutligen cytokinetic ringen kan studeras ytterligare genom färgning för dess komponenter. Vi finner att det finns en ansamling av fosfotyrosin i närheten av ringen (figur 6d). Vi kan också visa att anillin är colocalizing i ringen (figur 6e). Genom färgning av cellerna i denna orientering, we visar att anillin visar också en inhomogen fördelning.

De "eggcups" också tillämpas på olika modellsystem: vi rapporterade däggdjursceller, fission jäst, men vi testade även knoppande jäst och C. elegans (se figur 7a - e). I detta fall var det protokoll som anpassats för varje specifikt system i form av odlingsmedier, håligheter storlek och morfologi (se tabell 1). Som ett exempel, konisk V -formad 'eggcups "var den optimala morfologin för immobilisering fissionsjäst effektivt 12, i stället för att helt cylindrisk (eller U-formade) form som används för däggdjursceller 13. Detta gjorde det möjligt att testa effekten av olika cytoskelettsystemen läkemedel med potentiell tillämpning inom biovetenskaplig forskning. Detta visar på flexibilitet och tillförlitlighet av den utvecklade metoden.

Dessutom tillåter den mycket ordnat arrangemang av celler enenkel, automatiserad avläsning av fluorescensen av enskilda celler. Vi illustrerar detta genom att sätta in NIH3T3-celler som uttrycker GFP i 'eggcups' (figur 8a). Cellen position kan lätt igen och motsvarande expressionsnivå mäts. Figur 8b visar fördelningen av fluorescenssignaler. Detta kan tillämpas på alla utläsning (immunfluorescens, fluorescerande reportrar i celler till exempel).

Figur 1
Figur 1: Tillverkning av "äggkoppar" (a) Schematisk beskrivning av tillverkningsförfarandet av "äggkoppar" av replika gjutning. (I) Häll flytande PDMS på SU-8 mögel och bota den. (Ii) Klipp ut stämpeln och ta bort det försiktigt från ytan, då plasma aktivera det att silaniseras det. (Iii) Häll flytande PDMS på silaniserad stämpel end centrifugera den för att få ett tunt PDMS skikt. (Iv) Efter härdning av PDMS lagret, plasma aktivera både PDMS täckt stämpel och ett täckglas. (V) Plasma binda både genom att tillämpa en mild, homogen tryck. (Vi) Efter plasma bindning, avlägsna försiktigt stämpeln att avslöja "eggcups" yta. (Vii) För att förenkla hanteringen i nästa steg, tillsätt en liten PDMS handtagsdel. Binda PDMS bit till täckglas genom limning det med flytande PDMS och (viii) bota den sedan i ugnen. (B) Bild på en 25 mm täck med PDMS 'eggcups "och ett handtag. (C) svepelektronmikroskop bilder av PDMS 'äggkoppar ". Avståndet mellan centra för "äggkoppar" är 30 nm, och deras diameter ungefär 25 nm. (Vänster) Ovanifrån. (Höger) "äggkoppar" skärs att avbilda inre delen. Klicka här för att tävla wa större version av denna siffra.

figur 2
Figur 2: (a) element som behövs för EG-fyllning. (1) 50 ml rör; (2) cylindriskt stycke (topp och sidovy); (3) cellkulturmedium; (4) 'eggcups'; (5) vassa pincett. (B) Schematisk bild av fyllningsproceduren EG. (I) En cylindriskt stycke först införts i ett 50 ml rör och fylldes med 13 ml cellodlingsmedium. Därefter (ii) "äggkoppar" försiktigt deponeras ovanpå den cylindriska stycket med vassa pincett för att manipulera EG med hjälp av små PDMS bit. (Iii) Celler vid den korrekta densiteten pipetteras ovanpå den EG. (Iv) Celler införs i de 'eggcups' genom centrifugering. (V) slutligen provet försiktigt släpptes ut från röret och det är klar att använda. m / filer / ftp_upload / 51880 / 51880fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3
Figur 3: Jämförelse av cell fenotyper på 3D "äggkoppar" och 2D plana ytor. Konfokalmikroskopi (25X vatten objektiv, 0,95 NA, Leica) bild av NIH3T3 celler på (a) EG utgör en ordnad array, och visar en homogen sfärisk fenotyp, och om (b) standard 2D platta kultur, slumpmässigt fördelade med heterogena fenotyper. Cellerna färgades för aktin (grön), Golgi (orange) och kärnan (i blått). Skalstrecken = 100 ^ m. (C) 3D-rekonstruktion av celler på EG och (d) på plana ytor för WT och Blebbistatin-behandlade celler. Skalstrecken = 20 | im.880 / 51880fig3large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 4
Figur 4: Studie av NIH3T3 Golgiapparaten fenotyp Schematisk och exempelbild av Golgi fenotyp klassificering för celler på (a) platt och (b) EG.. Celler klassificerades som kompakterad, utökad eller fragmenterad beroende på α-värdet. (C) Kvantifiering av Golgi fenotyper. Skalstrecken = 10 nm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 5
Figur 5: (a) (vänster) Konfokalmikroskopi bild av en NIH3T3 cell i ett EG och färgas för aktin (grön), Golgi (orange) och kärnan (i blått). (höger) Scheme of kärnor orientering i EG. (B) vinkelfördelning av kärnor inuti EG för WT och (c) Blebbistatin-behandlade celler. (D) Nucleus sfärisk värden för WT och Blebbistatin-behandlade celler både för EG och plana ytor (P [WT EG -Blebb EG] <0,001, P [Blebb platt -Blebb EG] <000,1; n WT platt = 47, n WT EG = 94, n Blebb platt = 59, n Blebb EC = 141 celler). Skala bar = 10 mikrometer. Klicka god här för att se en större version av denna siffra.


Figur 6: Detaljerad studie av cytokinetic ring i levande och fasta prover och i två system som använder "äggkoppar" (a) tidssekvens av cytokinetic ring med standard 2D in vitro-kultur.. Endast två ljuspunkter i aktin (Lifeact-mCherry, röd) och myosin (GFP taggade, grön) är synliga i klyvnings fåran av HeLa-celler (Skalstreck = 10 | im). (B) tidssekvens av stängningen för cytokinetic ringen i HeLa-celler under mitos använder "äggkoppar". Bilderna visar aktin (i rött) och myosin (grön). "Äggkoppar" möjliggöra identifiering av fortfarande myosin ansamlingar. Ett exempel är markerad med en pilspets. (Skalstreck = 5 | j, m). (C) cytokinetic ringen kan också visualiseras i fissionsjäst. (Vänster) Celler ligga på en plan yta, CYTO kinetisk ring syns bara som två punkter (höger) Celler i "eggcups":. hela stängningen kan fångas. Aktin märkt med CHD-GFP (Skalstrecken = 2 pm). Tid i min: sek. (D - e) Exempel på färgade cytokinetic ringar. (D) Actin-GFP-uttryckande HeLa-celler färgas för fosfotyrosin (PY) som även visar signalen i ringen (Skalstreck = 5 | j, m). (E) HeLa-celler som uttrycker GFP taggade myosin och Lifeact-mCherry (aktin) färgas för anillin. Anillin avslöjas att lokalisera i cytokinetic ringen och mindre koncentrerad i cortex. Det visar samlokalisering med aktin och myosin (Skalstreck = 5 mikrometer). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

80 / 51880fig7.jpg "/>
Figur 7:. Tillämpning av de "eggcups 'till andra celltyper och modellsystem (a) U2OS (humant osteosarkom). Den infällda bilden visar en delningscell. (Skalstreck = 20 | im). (B) NIH3T3-celler som uttrycker GFP. Skillnaden i expressionsnivåer kan lätt avläsas (Skala bar = 20 pm). (C) SW480-celler (Skalstreck = 20 | im). (D) Knoppande jäst; deras cykeltiden är oförändrad. (Skalstreck = 10 | im). (E) C. elegans maskar;. (vänster) på en plan yta (höger) "äggkoppar" är embryo sett från en annars dolda perspektiv. (Skalstrecken = 10 ^ m). Tid i min. Sek klicka god här för att se en större version av denna siffra.

Figur 8 Figur 8: Organisationen i en rad "äggkoppar" tillåter en automatiserad analys av cellpopulation (a) NIH3T3-celler i EG (Skala bar = 20 pm).. De har olika expressionsnivåer av GFP. (B) Automatiserad erkännande av cell läge gör en individuell analys av expressionsnivån. Det sammanfattas i histogram över GFP uttryck av cellpopulationen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

modell System Typ Kultur Medium observation Medium 'eggcups' diameter (μ; M) Kommentarer / Beskrivning
däggdjursceller NIH3T3 10% BCS hög glukos DMEM 10% BCS L-15 20 Andra stabila cellinjer, såsom REF52 eller MDCK, liksom primära cellinjer, cancerceller och / eller stamceller kan också föras in i "äggkoppar".
HeLa 10% FCS hög glukos DMEM 10% FCS L-15 25 Tillgängliga från många olika källor.
U2OS 10% FCS hög glukos DMEM 10% FCS L-15 20-25 Tillgängliga från många olika källor.
SW480 10% FCS hög glukos DMEM 10% FCS L-15 17-20 Tillgängliga från många olika källor.
Jäst fissionsjäst agarplatta (YE5S) och flytande medier (YE5S och EMM5S) Filtersteriliserad EMM media (se listan över material) 5 Ytan behöver inte vara funktionaliseras med självhäftande proteiner.
knoppande jäst Agarplatta (YPD) och flytande medier (YEPD och SD) SD-media 5 Ytan behöver inte vara funktionaliseras med självhäftande proteiner.
Embryo C. elegans NGM plattan ultrarent vatten 25 Alternativt M9-medium kan användas för långtidsförsök. Receptet för detta saltat lösning kan hittas här: http://cshprotocols.cshlp.org/content/2009/5/pdb.rec11798.full?text_only=true

Tabell 1: Kultur villkor "äggkoppar" för olika modellsystem. Den ovan tillhörande protokoll kan enkelt anpassasgenom att bara byta ut de beskrivna odlingsbetingelser och storleken på 'eggcups'.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Replika gjutning användes för att fabricera de "eggcups '. Tillverkningsprocessen behöver inte ett rent rum; det är snabbt och enkelt, även om vissa metoder kan behövas. I synnerhet släppa PDMS stämpel är det mest kritiska steget för att producera ett stort område med hög kvalitet "äggkoppar". Av denna anledning har särskild omsorg som skall vidtas i detta steg. Om det här steget upprepade gånger misslyckas, anser att optimera plasma renare parametrar före den silanisering och bindning till plasmaproteiner. Otillräcklig silanisering kommer att leda till en stark vidhäftning av stämpeln till PDMS filmen. Om detta observeras, kan ökas inkubationstiden med silanisering reagens. Observera att andra tekniker och material kan användas för att tillverka de "eggcups", som kan funktionaliseras med ett stort intervall av ligander (fibronektin, gelatin, kollagen, etc.). I synnerhet, kan mikrokaviteter i polystyren lätt tillverkas genom cusTom tillverkade varmpräglingsteknik. Detta säkerställer biokompatibilitet och direkt jämförelse med resultaten erhållna i standardodlingsskålar. På liknande sätt är särskild omsorg och praxis som krävs för att optimera fyllningen procentsats. I synnerhet, är sköljningssteget kritisk för att säkerställa en lämplig fyllning med något överskott av celler, som bidrar till brus och bakgrund i signalen. Om celler avlägsnas lätt från håligheter, anser att ändra storlek eller djup håligheter.

"Äggkoppar" ger 3D-liknande arkitektur celler och hög innehåll screeningsanalyser med hjälp av ett enkelt protokoll. Cellulära organeller och aktiva processer okända med hjälp av vanliga kulturanalyser kan lätt visualiseras genom att sätta in enskilda celler på enskilda mikrokaviteter ( "eggcups"). Beroende på modellsystemet, kan storleken, formen och dimensionerna lätt anpassas. På detta sätt kan däggdjursceller, fissionsjäst, knoppande jäst och C. elegans cen manipuleras och studeras, liksom alla embryon såsom Drosophila, möss eller mänskliga embryon vid provrörsbefruktning, eller stamceller till exempel.

Med den här inställningen enstaka celler fångas. Detta är i motsats till epiteliala vävnader som påträffas in vivo. Detta kan dock miljö reproduceras i våra "äggkoppar" genom att belägga sidoväggarna med cadheriner att efterlikna cell-cell kontakter med mer flexibla elastomerer. Fokala kontakter kommer att främjas genom avsättning av fibronektin på botten av brunnarna. Dessa respektive fördelningar av adhesionsmolekyler bör göra det möjligt att reproducera de cellulära miljöer stött in vivo. Genom denna metod en skulle närma sig fysiologiska betingelser.

Mediumutbyte i vår analys är säkerställd. Celler i EG visar inte någon försämring när de utför både kort- och långtidsförsök på grund av bristande medel utbyte. Observera också att celler i EG can odlas till konfluens även om den huvudsakliga intresse är när enskilda celler eller embryon isoleras i hålrummen.

Orientering av organ eller hela organismer avslöjar ny information. Vi visar olika dynamiken i aktin och myosin i cytokinetic ringen. Även om cytokinetic ringen i fissionsjäst och däggdjursceller består av liknande nyckelkomponenter visar vi med denna inställning, att deras specifika dynamik är annorlunda 17. Detta stöder det resultat, att förslutningsmekanismen i de två systemen skiljer sig också. Att utveckla och undersöka en sådan hypotes, är orienteringen av cellen oumbärlig. I framtida studier kan denna enhet också användas för att undersöka andra händelser relaterade till organell organisation i celler.

Utöver detta, kan denna teknik vara till stor nytta i utvecklingsbiologi. Långsträckta embryon kan lätt orienteras, observeras eller behandlas ytterligare i en definierad orientering.Förmodligen vår analys inte skulle innebära polariteten av embryon, men hög fyllnadsprocent skulle göra det möjligt att extrahera den önskade utläsning på ett tillförlitligt sätt. Sammanlagt "äggkoppar" skulle kunna vara en bra enhet för hög innehålls visningar.

Andra kulturanalyser har föreslagits. Dessa metoder sträcker sig från flera celler i 2D dimensioner i flerbrunnsplattor, till enstaka celler deponeras i micropatterned klister motiv med identisk form. Dock är ingen av dem lämpliga för att övervinna de begränsningar som anges ovan på observation av cellulära organeller och dynamiska processer 1.

Framtida förbättringar av vårt system gör det möjligt för tillämpligheten av "äggkoppar" till industriinriktade ändamål. Som ett exempel, drog screening tillämpningar inom läkemedelsföretag kräver användning av flerbrunnsplattor 14,28; genomföra "äggkoppar" i sådana plattformar kommer potentiellt förbättra tillförlitlighetentester och resultat. Som sådan, höga innehållsscreeningsanalyser kommer att utföras med hjälp av de vanligaste automatiserade processer för läkemedelsföretag (och akademiska forskningslaboratorier) med hjälp av robotar. Detta kommer att säkerställa repeterbarhet och tillförlitlighet med låg variabilitet. Vissa kommersiella produkter baserade på 3D-cell odlade analyser har redan dykt upp på marknaden betonar vikten av denna typ av analyser. Slutligen, dessa enheter öppnar nya perspektiv för personlig medicin: celler från patienten kan placeras i "äggkoppar", och behandlings drinkar skulle kunna testas i en fysiologisk miljö; den biomarker utläsningen kommer att tillåta att förutse en optimal behandling som skall ges till patienten 29. Sammantaget den fysiska formen av cellerna och embryona styra arkitekturen i hålrummen, och vi hoppas att enheten och denna metod kommer att spridda i framtiden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Vi har inget att lämna ut.

Acknowledgments

Vi erkänner L. Brino (IGBMC hög halt Screening anläggning, Illkirch, Frankrike) för att förse oss med den anti-Giantin antikropp, M. Labouesse Lab. för C. elegans (IGBMC) och B. Séraphin Lab. för knoppande jäst (IGBMC), E. Paluch och A. Hyman för fluorescerande HeLa-celler (MPI-CBG, Dresden), J. Moseley (Dartmouth Medical School) och JQ Wu (Ohio State University) för fission jästceller; A. Hoel och F. Evenou för experimentell hjälp, C. Rick (IBMC, Strasbourg, Frankrike) för teknisk hjälp, och JC Jeannot (Femto-st, Frankrike) för att få hjälp i mikro. Detta arbete stöddes av medel från CNRS, universitetet i Strasbourg, Conectus, La Fondation pour la Recherche Médicale och ci-FRC i Strasbourg.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ddH20 (ultrapure) Millipore - Use always fresh water.
Parafilm (plastic film) Bemis PM-999 Adhere Parafilm to the lab bench using some water droplets and ensure a perfect surface flatness.
Photo-mask Selba - http://www.selba.ch
Silicon wafer Siltronix - http://www.siltronix.com/
SU-8 photoresist MicroChem 2000 series http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm 
working in a fumehood is required; check the data sheet from the manufacturer for more information.
SU-8 developer MicroChem - http://microchem.com/Prod-Ancillaries.htm 
working in a fumehood is required; check the data sheet from the manufacturer for more information
2-propanol Sigma-Aldrich 19030 http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/i9030?lang=en&region=CA
Available from multiple companies.
Sigmacote (siliconizing reagent ) Sigma-Aldrich SL2-25ML http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/sl2?lang=fr&region=FR 
harmful, working in a fumehood is required; check the data sheet from the manufacturer for more information. 
Chlorotrimethylsilane (TMCS) Sigma-Aldrich 386529-100ML http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/386529?lang=fr&region=FR  
TMCS produces acute inhalation and dermal toxicity, and is highly flammable (with ignition flashback able to occur across considerable distances), consequently it should be used in a fume cupboard away from sources of ignition
Nitrile gloves Kleenguard 57372 http://www.kcprofessional.com/products/ppe/hand-gloves/thin-mil-/57372-kleenguard-g10-blue-nitrile-gloves-m
Available from multiple companies.
Glass coverslips #0 Knittel glass KN00010022593 http://www.knittelglass.com/index_e.htm
Very fragile. Manipulate gently.
Sharp straight tweezers SPI 0WSSS-XD http://www.2spi.com/catalog/tweezers/t/elec7
50 ml tube BD Falcon 352070 http://www.bdbiosciences.com/cellculture/tubes/features/index.jsp
Available from multiple companies.
PDMS Dow Corning Sylgard 184 kit http://www.dowcorning.com/applications/search/default.aspx?R=131EN 
The package contains both PDMS base and curing agent. Similar elastomers are available from multiple companies.
Microscope glass slides Dutscher 100001 http://www.dutscher.com/frontoffice/search
Available from multiple companies.
DMEM high-glucose medium Fisher Scientific 41965-039 http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?LBCID=12301479&keyWord=41965-039&store=Scientific&nav=0&offSet=0&storeId=10652&langId=-1&fromSearchPage=1&searchType=PROD
Bovine calf serum Sigma-Aldrich C8056-500ML http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/c8056?lang=en&region=CA
0.25% Trypsin-EDTA Fisher Scientific 25200-072 http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=25200-072&store=Scientific&nav=0&offSet=0&storeId=10652&langId=-1&fromSearchPage=1&searchType=PROD
PBS 1x Fisher Scientific 14200-067 http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=14200-067&store=Scientific&nav=0&offSet=0&storeId=10652&langId=-1&fromSearchPage=1&searchType=PROD
PBS is at 10x and should be diluted to 1x using ddH2O
L-15 medium Fisher Scientific 21083-027 http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=21083-027&store=Scientific&nav=0&offSet=0&storeId=10652&langId=-1&fromSearchPage=1&searchType=PROD
Medium for atmospheres without CO2 control
Fibronectin  Sigma-Aldrich F1141-5MG http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&term=F1141-5MG&lang=en&region=CA&focus=product&N=0+220003048+219853082+219853286&mode=match%20partialmax
Penicillin & Streptomycin Fisher Scientific 15140-122 http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=15140-122&store=Scientific&nav=0&offSet=0&storeId=10652&langId=-1&fromSearchPage=1&searchType=CHEM
Petri dish P35 Greiner 627102 http://www.greinerbioone.com/en/row/articles/catalogue/article/144_11/12885/
Petri dish P60 Greiner 628163 http://www.greinerbioone.com/nl/belgium/articles/catalogue/article/145_8_bl/24872/
Petri dish P94 Greiner 633179 http://www.greinerbioone.com/nl/belgium/articles/catalogue/article/146_8_bl/24882/
Paraformaldehyde 3 % Sigma-Aldrich P6148-500G http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/p6148?lang=fr&region=FR 
Harmful in-particular for the eyes, working in a fumehood is required; check the data sheet from the manufacturer for more information.
Triton 0.5 % Sigma-Aldrich 93443-100ML http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&term=93443-100ML&lang=en&region=CA&focus=product&N=0+220003048+219853082+219853286&mode=match%20partialmax
Phallodin-Green Fluorescent Alexa Fluor 488 InVitrogen A12379 http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/A12379?CID=search-a12379 
dissolve powder in 1.5 ml methanol
Alexa Fluor 647 InVitrogen A21245 1:200 dilution in PBS 1x
rabbit polyclonal anti-Giantin Abcam ab24586 1:500 dilution in PBS 1x
http://www.abcam.com/giantin-antibody-ab24586.html 
rabbit anti-anillin Courtesy of M. Glotzer, Published in Piekny, A. J. & Glotzer, M. Anillin is a scaffold protein that links RhoA, actin, and myosin during cytokinesis. Current biology 18, 30–6 (2008). 1:500 dilution in PBS 1x
Anti-phosphotyrosine Transduction Lab 610000 http://www.bdbiosciences.com/ptProduct.jsp?ccn=610000
Cy3 goat anti-rabbit  Jackson Immunoresearch 111-166-047 http://www.jacksonimmuno.com/catalog/catpages/fab-rab.asp 
1:1,000 dilution in PBS 1x
DAPI Sigma-Aldrich D8417  http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d8417?lang=fr&region=FR 
1 mg/ml for 1 min
Glycerol Sigma-Aldrich G2025 http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&term=G2025&lang=en&region=CA&focus=product&N=0+220003048+219853082+219853286&mode=match%20partialmax
Mineral oil Sigma-Aldrich M8410-500ML http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&term=M8410-500ML&lang=en&region=CA&focus=product&N=0+220003048+219853082+219853286&mode=match%20partialmax
HeLa cells - - Mammalian cells are available from many companies. See also Table 1
NIH3T3 cells ATCC - Mammalian cells are available from many companies. See also Table 1
Fission yeast  - - For details on strains, contact the corresponding author.  See also Table 1
C. elegans worms - - For details, contact the corresponding author.  See also Table 1
YES (Agar) + 5 Supplements included MP Biomedicals 4101-732 http://www.mpbio.com/search.php?q=4101-732&s=Search 
For preparation: follow  instructions as given on the box
YES (Media) + 5 Supplements included MP Biomedicals 4101-522 http://www.mpbio.com/search.php?q=4101-522&s=Search 
For preparation: follow the instructions as given on the box
EMM (Media) MP Biomedicals 4110-012 http://www.mpbio.com/search.php?q=4110-012&s=Search 
For preparation: follow  instructions as given on the box
Filter sterilized EMM (Media) - Only for imaging MP Biomedicals 4110-012 For preparation: follow instructions as given on the box. Filter sterilize the media using a 0.22 µm filter instead of autoclaving. This gives transparency to the media and reduces the autofluorescence.
Supplements (for EMM) MP Biomedicals 4104-012 http://www.mpbio.com/search.php?q=4104-012&s=Search
 (Add 225 mg/L into the EMM media before autoclaving or filtering)
Stericup and Steritop Vaccum driven sterile filters Millipore - http://www.millipore.com/cellbiology/flx4/cellculture_prepare&tab1=2&tab2=1#tab2=1:tab1=2

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. Taking Cell-Matrix Adhesions to the Third Dimension. Science. 294, 1708-1712 (2001).
  2. Azioune, A., Storch, M., Bornens, M., Thery, M., Piel, M. Simple and rapid process for single cell micro-patterning. Lab Chip. 9, 1640-1642 (2009).
  3. Mandal, K., Balland, M., Bureau, L. Thermoresponsive Micropatterned Substrates for Single Cell Studies. PLoS ONE. 7, e37548 (2012).
  4. Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nat Rev Mol Cell Biol. 8, 839-845 (2007).
  5. Baker, B. M., Chen, C. S. Deconstructing the third dimension: how 3D culture microenvironments alter cellular cues. J Cell Sci. (2012).
  6. Ghibaudo, M., Di Meglio, J. M., Hersen, P., Ladoux, B. Mechanics of cell spreading within 3D-micropatterned environments. Lab Chip. 11, 805-812 (2010).
  7. Greiner, A. M., Richter, B., Bastmeyer, M. Micro-Engineered 3D Scaffolds for Cell Culture Studies. Macromol Biosci. 12, 1301-1314 (2012).
  8. Khetan, S., et al. Degradation-mediated cellular traction directs stem cell fate in covalently crosslinked three-dimensional hydrogels. Nat Mater. 12, 458-465 (2013).
  9. Legant, W. R., et al. Measurement of mechanical tractions exerted by cells in three-dimensional matrices. Nat Meth. 7, 969-971 (2010).
  10. Devices and methods for observing the cell division. Riveline, D., Buguin, A. WO/2010/092116 (2010).
  11. Ochsner, M., et al. Micro-well arrays for 3D shape control and high resolution analysis of single cells. Lab Chip. 7, 1074-1077 (2007).
  12. Devices and methods for observing cells with cell wall or invertebrate embryos with oblong eggshell . Riveline, D. WO2013144302 (2012).
  13. Devices and methods for observing eukaryotic cells without cell wall. Riveline, D., Wollrab, V. WO2013135809 (2012).
  14. Zanella, F., Lorens, J. B., Link, W. High content screening: seeing is believing. Trends Biotech. 28, 237-245 (2010).
  15. Wolfe, D., Qin, D., Whitesides, G. Microengineering in Biotechnology, Ch 3. Methods in Molecular Biology. Hughes, M. P., Hoettges, K. F. 583, Humana Press. 81-107 (2010).
  16. Mehling, M., Tay, S. Microfluidic cell culture. Curr Op Biotech. 25, 95-102 (2014).
  17. Wollrab, V., Thiagarajan, R., Wald, A., Kruse, K., Riveline, D. Still and rotating myosin clusters determine cytokinetic ring constriction. Nat Commun. 7, 11860-11869 (2016).
  18. Yao, X., et al. Functional analysis of single cells identifies a rare subset of circulating tumor cells with malignant traits. Integr Biol. 6, 388-398 (2014).
  19. Eberwine, J., Sul, J. Y., Bartfai, T., Kim, J. The promise of single-cell sequencing. Nat Meth. 11, 25-27 (2014).
  20. Allen, T. D., et al. Generation of cell-free extracts of Xenopus eggs and demembranated sperm chromatin for the assembly and isolation of in vitro-formed nuclei for Western blotting and scanning electron microscopy (SEM). Nat. Protocols. 2, 1173-1179 (2007).
  21. Robbins, E., Marcus, P. I. Mitotically Synchronized Mammalian Cells: a Simple Method for Obtaining Large Populations. Science. 144, (1964).
  22. Whitfield, M. L., et al. Stem-loop binding protein, the protein that binds the 3" end of histone mRNA, is cell cycle regulated by both translational and posttranslational mechanisms. Molecular and Cellular Biology. 20, (2000).
  23. Straight, A. F., et al. Dissecting Temporal and Spatial Control of Cytokinesis with a Myosin II Inhibitor. Science. 299, 1743-1747 (2003).
  24. Tang, J., Erikson, R. L., Liu, X. Checkpoint kinase 1 (Chk1) is required for mitotic progression through negative regulation of polo-like kinase 1 (Plk1). Proc Natl Acad Sci. 103, 11964-11969 (2006).
  25. Zahreddine, H., Zhang, H., Diogon, M., Nagamatsu, Y., Labouesse, M. CRT-1/Calreticulin and the E3 Ligase EEL-1/HUWE1 Control Hemidesmosome Maturation in C. elegans Development. Curr Biol. 20, 322-327 (2010).
  26. Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation. JoVE. e4019 (2012).
  27. Saha, S., Pollard, T. D. Anillin-related protein Mid1p coordinates the assembly of the cytokinetic contractile ring in fission yeast. Mol Biol Cell. 23, 3982-3992 (2012).
  28. Prestwich, G. D. Evaluating Drug Efficacy and Toxicology in Three Dimensions: Using Synthetic Extracellular Matrices in Drug Discovery. Acc Chem Res. 41, 139-148 (2007).
  29. Futamura, Y., et al. Morphobase, an Encyclopedic Cell Morphology Database, and Its Use for Drug Target Identification. Chem Biol. 19, 1620-1630 (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics