पृथक माइटोकॉन्ड्रिया के फ्लो द्वारा बाहरी झिल्ली प्रोटीन की Immunodetection

1Department of Biochemistry, Université de Montréal, CRCHUM, 2Department of Neurosciences, Université de Montréal, CRCHUM
Biology

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Summary

यहाँ वर्णित का पता लगाने और प्रवाह cytometry द्वारा कृंतक ऊतक और विश्लेषण से अलग माइटोकॉन्ड्रिया की immunolabeling द्वारा mitochondrial बाहरी झिल्ली प्रोटीन यों एक विधि है. इस विधि mitochondrial subpopulations के कार्यात्मक पहलुओं का आकलन करने के लिए बढ़ाया जा सकता है.

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Pickles, S., Arbour, N., Vande Velde, C. Immunodetection of Outer Membrane Proteins by Flow Cytometry of Isolated Mitochondria. J. Vis. Exp. (91), e51887, doi:10.3791/51887 (2014).

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Abstract

तरीकों का पता लगाने और जानवरों के ऊतकों mitochondrial फिजियोलॉजी और pathophysiology अध्ययन करने के लिए महत्वपूर्ण हैं में mitochondrial बाहरी झिल्ली प्रोटीन घटकों की निगरानी के लिए. इस प्रोटोकॉल कृंतक ऊतक से अलग माइटोकॉन्ड्रिया immunolabeled और फ्लो से विश्लेषण कर रहे हैं, जहां एक तकनीक का वर्णन है. माइटोकॉन्ड्रिया कृंतक स्पाइनल तार से अलग किया और माइलिन, तंत्रिका ऊतक से तैयार mitochondrial भागों का एक प्रमुख contaminant हटाने के लिए एक तेजी से संवर्धन कदम के अधीन हैं. पृथक माइटोकॉन्ड्रिया तो चुनाव के एक एंटीबॉडी और एक fluorescently संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ लेबल रहे हैं. प्रवाह द्वारा cytometry विश्लेषण का पता लगाने और immunolabeled प्रोटीन की मात्रा का ठहराव के बाद mitochondrial विशिष्ट डाई, साथ धुंधला द्वारा mitochondrial तैयारी के रिश्तेदार शुद्धता की पुष्टि. इस तकनीक का नमूना प्रति माइटोकॉन्ड्रिया के हजारों की सैकड़ों के विश्लेषण के लिए अनुमति देता है, तेजी से और quantifiable उच्च throughput है. यह उपन्यास पी का आकलन करने के लिए लागू होता हैसामान्य शारीरिक शर्तों के तहत mitochondrial सतह पर roteins के साथ ही पैथोलॉजी दौरान इस organelle को mislocalized हो सकता है कि प्रोटीन. महत्वपूर्ण बात है, इस विधि mitochondrial subpopulations की कुछ गतिविधियों पर रिपोर्ट करने के लिए फ्लोरोसेंट सूचक रंगों को युग्मित और केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (मस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी) के साथ ही जिगर से माइटोकॉन्ड्रिया के लिए संभव है किया जा सकता है.

Introduction

माइटोकॉन्ड्रिया उच्च ऊर्जा की मांग की साइटों के लिए ले जाया और शारीरिक उत्तेजनाओं 1 के लिए तेजी से प्रतिक्रिया कर रहे हैं, विखंडन और संलयन के कई दौर से गुजरना है कि अत्यधिक गतिशील organelles हैं. यह तेजी से विभिन्न ऊतकों के भीतर कि माइटोकॉन्ड्रिया में मान्यता प्राप्त है, यहां तक ​​कि विभिन्न सेलुलर डिब्बों, नए तरीकों ये अलग mitochondrial सबसेट की पहचान करने के लिए आवश्यक हैं, अलग कार्यात्मक प्रोफाइल है.

माइक्रोस्कोपी व्यक्ति माइटोकॉन्ड्रिया देखे जा सकते हैं जिससे एक साधन और immunofluorescence 2 से निर्धारित किया जा सकता है पर या माइटोकांड्रिया में एक प्रोटीन की उपस्थिति प्रदान करता है. हालांकि, इस पद्धति द्वारा मात्रात्मक विश्लेषण श्रम गहन है और अमर या प्राथमिक सेल लाइनों का उपयोग प्रयोगों के लिए अधिक उपयुक्त है. ऊतक से ली गई व्यक्तिगत माइटोकॉन्ड्रिया का अध्ययन काफी अधिक कठिन है और सबसे तरीकों evalu साथ समवर्ती mitochondrial कैंपेन्स की आसान पहचान के लिए अनुमति नहीं देतेmitochondrial समारोह 3 से समझना.

इस बाधा, फ्लो द्वारा कृंतक ऊतकों से अलग और बाद में विश्लेषण किया माइटोकॉन्ड्रिया immunolabel के लिए एक उपन्यास विधि से निपटने के लिए विकसित किया गया है. यह तेजी से पता लगाने और माइक्रोस्कोपी द्वारा विश्लेषण की तुलना में जो mitochondrial बाहरी झिल्ली, स्थानीयकृत प्रोटीन की मात्रा का ठहराव के लिए अनुमति देता है, बहुत कम श्रम गहन है और एक भी नमूने में माइटोकॉन्ड्रिया के हजारों के विश्लेषण परमिट. इस परख माइटोकॉन्ड्रिया में रचनात्मक रूप में उपस्थित होने के लिए लगा रहे हैं कि mitochondrial बाहरी झिल्ली प्रोटीन के भाग्य और रिश्तेदार राशि पर नजर रखने के लिए लागू किया जा सकता है, mitochondrial सतह के लिए प्रोटीन की भर्ती, या रोग की स्थिति में माइटोकॉन्ड्रिया को mislocalized प्रोटीन का पता लगाने. इसके अलावा, पारंपरिक फ्लोरोसेंट सूचक रंगों का समावेश अलग mitochondrial में mitochondrial समारोह के कुछ पहलुओं के एक साथ मूल्यांकन परमिटsubpopulations.

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Protocol

इस अध्ययन में प्रयुक्त जानवर कैनेडियन द्वारा उल्लिखित के रूप में राष्ट्रीय मानकों का पालन जो पशु के संरक्षण के लिए केंद्र डे Recherche डु केंद्र Hospitalier डे ल Université de मॉन्ट्रियल (CRCHUM) संस्थागत समिति द्वारा अनुमोदित प्रोटोकॉल (N08001CVsr) को सख्त अनुसार इलाज किया गया पशु की देखभाल पर परिषद (CCAC).

इस प्रोटोकॉल (तालिका 1) करने के लिए आवश्यक सभी अभिकर्मकों तैयार करें. उपकरण, सामग्री और आपूर्तिकर्ताओं के बारे में अन्य सभी विवरण माल की सूची में पाया जा सकता है.

तालिका 1
तालिका 1 बफर रचनाएं.

चूहा स्पाइनल कॉर्ड की 1 संग्रह

  1. गहराई से 4% isoflorane साथ चूहे (Sprague Dawley) चतनाशून्य. वें के बन्द रखो पर पलटा की कमी से anaesthetization सत्यापित करेंई forepaw. गिलोटिन के द्वारा कत्ल से चूहा euthanize. इच्छामृत्यु का यह तरीका रीढ़ की हड्डी विकृत हो सकता है, जो दूसरों से अधिक पसंद है.
  2. रीढ़ की हड्डी को बेनकाब करने के लिए वापस की त्वचा में कटौती. बस श्रोणि अस्थि ऊपर हड्डी कैंची से स्पाइनल कॉलम काटें. वर्टिब्रल कॉलम के उद्घाटन कल्पना.
  3. वर्टिब्रल कॉलम में, फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) से भरा एक 200 μl विंदुक टिप (लौ पर थोड़ा पिघलने के माध्यम से संलग्न), के साथ, एक 10 मिलीलीटर सिरिंज डालें.
  4. सवार के लिए दबाव की एक मध्यम राशि लगाने से रीढ़ की हड्डी बाहर निकलवाने.
  5. किसी भी खून रीढ़ की हड्डी पर मौजूद है, तो अगले चरण के लिए आगे बढ़ने से पहले पीबीएस के साथ कुल्ला.
    नोट: इस विधि भी मस्तिष्क और जिगर के लिए मान्य किया गया है. इन ऊतकों सहित, तो आधा euthanized चूहे से मस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी को वजन में बराबर जिगर के एक टुकड़े इकट्ठा. अन्य सभी चरणों समान रहते हैं.

स्पाइनल कॉर्ड एमआईटी के 2 अलगावochondria (वंदे Velde एट अल से अनुकूलित. 4)

  1. 5 संस्करणों (~ 3.25 मिलीग्राम) Homogenization बफर (एचबी) के साथ 5 मिलीलीटर कांच homogenizer में पूरे बरकरार रीढ़ की हड्डी और जगह ले लीजिए. पृथक माइटोकॉन्ड्रिया के इष्टतम वसूली के लिए, बर्फ पर या ठंडे कमरे में सभी चरणों को पूरा. ऊतक का कोई बड़े टुकड़े रहना जब तक हाथ से लगभग आठ स्ट्रोक ऊतक homogenize. दो (2 मिलीलीटर) या तीन (1.7 मिलीलीटर) microcentrifuge ट्यूबों में homogenate रखें. एक benchtop microcentrifuge में 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र 1300 XG.
  2. एक 5 मिलीलीटर ultracentrifuge ट्यूब में सतह पर तैरनेवाला और जगह ठीक हो. गोली युक्त microcentrifuge ट्यूब 750 μl (~ 0.5 संस्करणों) एचबी जोड़ें और धीरे गोली resuspend. दोहराएँ centrifugation और मेजबान दो बार दोहराएँ. पूल के ऊपर एक ही 5 मिलीलीटर ultracentrifuge ट्यूब में सभी supernatants (S1A और S1b). यह कदम छोटे मलबे को हटाने के लिए कार्य करता है.
  3. अपकेंद्रित्र S1 एक झूलते बाल्टी सड़ांध से लैस एक ultracentrifuge का उपयोग कर जमाया और 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 17,000 XG पर अपकेंद्रित्र.
  4. साइटोसोलिक अंश (पश्चिमी धब्बा विश्लेषण के लिए उदाहरण के लिए) ब्याज की है अगर आगे की प्रक्रिया के लिए सतह पर तैरनेवाला (S2) रखें. 4 मिलीलीटर एचबी 50 मिमी KCl में गोली (p2), कच्चे mitochondrial अंश, Resuspend. एक झूलते बाल्टी रोटर में 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र 17,000 XG. सतह पर तैरनेवाला त्यागें और धीरे 800 μl एचबी में गोली (पी 3) resuspend.
    नोट: Mitochondria किसी भी गैर विशिष्ट mitochondrially जुड़े को दूर करने के लिए एचबी 50 मिमी KCl के साथ धो रहे हैं.
  5. एक नए 5 मिलीलीटर ultracentrifuge ट्यूब में resuspended गोली (पी 3) के ठीक 800 μl जोड़ें.
  6. इस ट्यूब जिससे 12% Iodixanol के अंतिम एकाग्रता बनाने, Iodixanol (घनत्व ढाल मध्यम) के 200 μl जोड़ें. धीरे, लेकिन अच्छी तरह से एक P1000 साथ pipetting के माध्यम से ट्यूब की सामग्री मिलाएं. पहले Iodixanol के अलावा, और फिर resuspended गोली (पी 3) पूरी तरह से मिश्रण की सुविधा के लिए बेहतर हो सकता है. एक ULT में अपकेंद्रित्र4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 17,000 XG पर एक झूलते बाल्टी रोटर के साथ सुसज्जित racentrifuge.
  7. नोट: लिवर माइलिन शामिल नहीं है और केवल जिगर कार्रवाई की जा रही है, इसलिए यह कदम आवश्यक नहीं है. जिगर सीएनएस माइटोकॉन्ड्रिया के साथ समवर्ती कार्रवाई की जा रही है हालांकि, अगर, यह भी उतना ही सभी ऊतकों के इलाज के लिए सिफारिश की है.
  8. ट्यूब के शीर्ष पर माइलिन की परत Aspirate और ध्यान से हटाने और सतह पर तैरनेवाला त्यागें. गोली ढीला हो सकता है. 4 मिलीलीटर एचबी में गोली Resuspend. अपकेंद्रित्र फिर से 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 17,000 XG पर. सतह पर तैरनेवाला त्यागें और 4 मिलीलीटर एचबी में गोली resuspend. Centrifugation दोहराएँ और सतह पर तैरनेवाला हटायें.
  9. 100-200 μl एचबी में अंतिम गोली (P7) Resuspend और एक 1.7 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब को हस्तांतरण. यह नमूना अलग माइटोकॉन्ड्रिया में शामिल है.
  10. प्रोटीन मात्रा का ठहराव के लिए आगे बढ़ें. माइटोकॉन्ड्रिया duri की पर्याप्त solubilization सुनिश्चित करने के लिए नमूने और 2% सोडियम dodecyl सल्फेट (एसडीएस) में मानक वक्र पतलाएनजी प्रोटीन मात्रा का ठहराव.

फ्लो के लिए पृथक माइटोकॉन्ड्रिया के 3 immunolabeling

  1. प्रत्येक धुंधला मिश्रण का परीक्षण करने के लिए, पिपेट एक 1.7 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में पृथक माइटोकॉन्ड्रिया की 25 ग्राम. एक प्रयोग में एक बेदाग नमूना शामिल करें; और प्रत्येक एंटीबॉडी के लिए, उचित निर्धारण नियंत्रण के लिए एक नमूना शामिल कर लें.
  2. एक बेंच शीर्ष microcentrifuge में 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट के लिए 17,000 XG पर अपकेंद्रित्र.
  3. सतह पर तैरनेवाला निकालें और 4 डिग्री सेल्सियस (अवरुद्ध कदम) पर 15 मिनट के लिए 10% वसायुक्त एसिड मुक्त बीएसए के साथ पूरक 50 μl Mitochondria बफर (एम बफर) में पृथक माइटोकॉन्ड्रिया resuspend.
    नोट: लेबलिंग के दौरान, 4 डिग्री सेल्सियस पर एक फ्रिज में incubations प्रदर्शन करते हैं.
  4. ट्यूब को प्राथमिक एंटीबॉडी (खरगोश विरोधी Mfn2, एमएल प्रति 20 ग्राम) जोड़ें और 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए सेते हैं.
    नोट: अनुमापन द्वारा empirically प्रत्येक एंटीबॉडी के इष्टतम एकाग्रता का निर्धारण. कारण एकाग्रता और / या पी में परिवर्तनशीलता के लिएurity, एक ही निर्माता से एक ही एंटीबॉडी के विभिन्न बहुत सारे अलग परिणाम हो सकता है; इसलिए अनुमापन एंटीबॉडी के प्रत्येक नए बहुत कुछ के लिए आवश्यक है.
  5. अनबाउंड प्राथमिक एंटीबॉडी बाहर धोने: अपकेंद्रित्र 17,000 XG पर 2 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर. सतह पर तैरनेवाला निकालें और धीरे 200 μl एम बफर में गोली resuspend. 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट के लिए 17,000 XG पर अपकेंद्रित्र. सतह पर तैरनेवाला निकालें और 50 μl एम बफर में गोली resuspend.
  6. ट्यूब माध्यमिक एंटीबॉडी (गधा विरोधी खरगोश आईजीजी phycoerythrin (पीई) मिलीलीटर प्रति, 0.5 ग्राम) जोड़ें और प्रकाश से सुरक्षित 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए नमूने सेते हैं.
  7. अनबाउंड माध्यमिक एंटीबॉडी बाहर धोने: अपकेंद्रित्र 17,000 XG पर 2 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर. सतह पर तैरनेवाला निकालें और 200 μl एम बफर में गोली resuspend. 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट के लिए 17,000 XG पर अपकेंद्रित्र. सतह पर तैरनेवाला निकालें और 500 μl एम बफर में गोली resuspend.
  8. घटनाओं तथ्य माइटोकॉन्ड्रिया में हैं सुनिश्चित करने के लिए एक साथ दाग पृथक माइटोकॉन्ड्रियाप्रकाश से सुरक्षित आरटी पर 15 मिनट के लिए माइटोकॉन्ड्रिया विशिष्ट फ्लोरोसेंट रंजक,. अन्य कार्यात्मक मानकों (mitochondrial transmembrane क्षमता या superoxide उत्पादन) का धुंधला हो जाना वांछित है, यदि नहीं, तो अधिग्रहण के लिए 5 कदम आगे बढ़ना चरण 4 पर आगे बढ़ना.
    नोट: यह माध्यमिक एंटीबॉडी का उत्सर्जन स्पेक्ट्रम कार्यात्मक रंगों के उस के साथ संगत है कि सत्यापित करने के लिए महत्वपूर्ण है. (: पूर्व 650 एनएम / एम 660 एनएम एपीसी) उदाहरण के लिए, Tetramethylrhodamine मिथाइल एस्टर (TMRM) के साथ FITC और transmembrane क्षमता के समान वर्णक्रमीय गुणों के साथ एक वाणिज्यिक डाई के साथ mitochondrial शुद्धता की पुष्टि करते हैं, तो एक व्यवहार्य माध्यमिक एंटीबॉडी allophycocyanin किया जाएगा. मुआवजा नियंत्रण, जोड़ें, यानी एक नमूना immunolabeled या लागू जब एक भी फ्लोरोफोरे, साथ दाग.
  9. कोशिकामापी लोडिंग प्रवाह के लिए उपयुक्त एक ट्यूब पर स्थानांतरण. (. छोटा सा नमूना आकार, एक microtiter ट्यूब मिलीलीटर ट्यूब कोशिकामापी प्रवाह 3 के अंदर रखा गया है की सुविधा के लिए) बर्फ पर नमूने रखें और तुरंत आगे बढ़नाअधिग्रहण के लिए कोशिकामापी प्रवाह.

4 परख Mitochondrial transmembrane क्षमता और फ्लो द्वारा Mitochondrial Superoxide उत्पादन

  1. पृथक माइटोकॉन्ड्रिया प्रकाश से सुरक्षित आरटी पर 15 मिनट के लिए, कदम 3.8 पर, 100 एनएम TMRM (पूर्व 548 एनएम / एम 574 एनएम) 5 के साथ धुंधला द्वारा एक अक्षुण्ण transmembrane क्षमता है कि जाँच करें. नमूने और आबादी, TMRM (1 से 30 एनएम) के निचले / गैर शमन सांद्रता के उपयोग के बीच transmembrane क्षमता की तुलना के लिए, 6 अधिक उपयुक्त हो सकता है.
    1. TMRM धुंधला, 100 माइक्रोन कार्बोनिल साइनाइड एम क्लोरो फिनाइल hydrazine (CCCP) की उपस्थिति में 100 एनएम TMRM साथ दाग पृथक माइटोकॉन्ड्रिया, माइटोकॉन्ड्रिया बिगाड़ना जाएगा कि एक mitochondrial uncoupler के लिए एक नियंत्रण के रूप में. डाई की कम सांद्रता उपयोग किया जाता है यदि माइटोकॉन्ड्रिया बिगाड़ना करने के लिए आवश्यक CCCP की एकाग्रता कम हो सकता है.
  2. पृथक माइटोकॉन्ड्रिया सेंट द्वारा mitochondrial superoxide उत्पादन सत्यापित करें किप्रकाश से सुरक्षित आरटी पर 15 मिनट के लिए, भी कदम 3.8 में, एक उपयुक्त mitochondrial superoxide सूचक 7 के साथ aining.
    1. Mitochondrial superoxide उत्पादन, 10 माइक्रोन Antimycin ए, mitochondrial superoxide उत्पादन में वृद्धि होगी कि सांस की श्रृंखला के जटिल III के एक अवरोध की उपस्थिति में डाई के साथ दाग पृथक माइटोकॉन्ड्रिया के लिए एक नियंत्रण के रूप में.

फ्लो द्वारा Mitochondria पृथक immunolabeled के 5 अधिग्रहण और विश्लेषण

  1. साधन की स्थापना: रैखिक से स्विच voltages अलग माइटोकांड्रिया और सेट voltages के विश्लेषण की सुविधा मोड लॉग इन करने (FSC: 450, एसएससी: 250). घटनाओं FSC-A (क्षेत्र) मोड के साथ ही FSC-W (चौड़ाई) और FSC-एच (ऊंचाई) में एकत्र कर रहे हैं, सुनिश्चित करें कि दोहरी (बाहर करने के लिए सक्षम होने के लिए यानी, एक ही समय में डिटेक्टर से गुजर दो घटनाओं, ) विश्लेषण के बाद डेटा संग्रह में. घटनाओं की निर्धारित संख्या 100,000 के लिए एकत्र होंगे. मुआवजा नियंत्रण मोल, यदि लागू हो.
  2. डाटा अधिग्रहण: डाटा अधिग्रहण से पहले, नमूने vortexing से बचें. इसके बजाय धीरे ट्यूब दोहन से मिश्रण. प्रारंभ में gating के दौरान, एक कम दबाव पर घटनाओं इकट्ठा. कुल जनसंख्या पर गेट. तदनुसार histograms की voltages समायोजित आमतौर पर बेदाग नमूना के शिखर दूसरे दशक (10 2) के अनुरूप होगा. फाटक स्थापित कर रहे हैं, और नमूने संसाधित किया जा रहा है एक बार, दबाव उच्च के लिए बंद किया जा सकता है.
  3. विश्लेषण: FSC-W FSC बनाम साजिश रचने के द्वारा दोहरी कल्पना. Singlets और दोहरी पहचानें. Singlets पर गेट. एक mitochondrial चयनात्मक डाई के साथ सकारात्मक दाग रहे हैं कि घटनाओं पर gating द्वारा mitochondrial जनसंख्या का चयन करें.
  4. निर्धारण नियंत्रण से पृष्ठभूमि लेबलिंग का निर्धारण करते हैं. निर्धारण नियंत्रण नमूना का प्रयोग, Mfn2 एंटीबॉडी के लिए सकारात्मक mitochondrial जनसंख्या लेबलिंग का प्रतिशत निर्धारित करते हैं.

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Representative Results

चूहे रीढ़ की हड्डी डोरियों से व्युत्पन्न माइटोकॉन्ड्रिया Mitofusin2 (Mfn2), माइटोकॉन्ड्रिया 8 की बाहरी झिल्ली के विलय में फंसा एक प्रोटीन को लक्षित एक एंटीबॉडी के साथ immunolabeled किया जा सकता है. एक Mfn2 विशिष्ट एंटीबॉडी और एक fluorescently संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ अलगाव और लेबलिंग के बाद, माइटोकॉन्ड्रिया फ्लो (चित्रा 1) द्वारा कार्रवाई की जाती है. डाटा अधिग्रहण के बाद, नमूने पहले एक डॉट साजिश (2A चित्रा) पर सभी एकत्र घटनाओं visualizing द्वारा, विश्लेषण सॉफ्टवेयर प्रवाह cytometry का उपयोग विश्लेषण कर रहे हैं. घटनाओं FSC, चौड़ाई (डब्ल्यू) बनाम क्षेत्र (ए) (चित्रा 2B) में प्लॉट किए जाते हैं जब दोहरी और singlets भेदभाव कर रहे हैं. Singlets FSC / एसएससी (चित्रा -2) के माध्यम से, गेट mitochondrial जनसंख्या चयनित, और द्वारा माइटोकांड्रिया विशेष डाई के लिए सकारात्मक धुंधला घटनाओं की संख्या की पुष्टि हो जाने के बाद माइटोकॉन्ड्रिया-विशेष के साथ दाग एक नमूने के साथ बेदाग नमूना के एक हिस्टोग्राम सह साजिश रचनेcific डाई. Mitochondrial घटनाओं को निर्धारित करने के लिए, दो चोटियों (चित्रा 2 डी) के चौराहे पर एक गेट जगह है. रीढ़ की हड्डी की तैयारी के लिए, आम तौर पर> घटनाओं का 90% माइटोकॉन्ड्रिया विशेष डाई के लिए सकारात्मक हैं. घटनाओं के 98% डाई के साथ लेबल होगा ~ ऐसे जिगर के रूप में अन्य ऊतकों, के लिए (नहीं दिखाया डेटा). केवल माइटोकॉन्ड्रिया विशेष डाई के लिए सकारात्मक लेबल घटनाओं है कि चयन के बाद, 1% या उससे कम निर्धारण लेबलिंग (बाएं चित्रा 2 ई,) भी शामिल है कि एक गेट (Mfn2 +) का चयन करके निर्धारण नियंत्रण के साथ पृष्ठभूमि लेबलिंग का निर्धारण. बाहरी mitochondrial झिल्ली पर मौजूद Mfn2 साथ माइटोकॉन्ड्रिया का प्रतिशत (चित्रा 2 ई, सही) निर्धारित करने के लिए एंटीबॉडी Mfn2 साथ लेबल सभी नमूनों को समान रूप से इस फाटक को लागू करें. इस प्रयोग में, माइटोकॉन्ड्रिया का 30% Mfn2 के लिए सकारात्मक रीढ़ की हड्डी लेबल से निकाली गई. यह Mfn2 एक सर्वत्र व्यक्त एमआईटी माना जाता है कि हालांकि, यहां नोट करना महत्वपूर्ण हैochondrial बाहरी झिल्ली प्रोटीन, यह पहले से मात्रा निर्धारित नहीं की गई है. इसके अलावा, संवर्धित कोशिकाओं में Mfn2 की एक immunocytochemical विश्लेषण व्यक्ति माइटोकॉन्ड्रिया 9 के एक गैर समरूप लेबलिंग से पता चलता है. यह Mfn2 मिलान के कारण ही साथ बातचीत या अन्य बाध्यकारी भागीदारों के लिए या translational संशोधनों को पोस्ट करने के कारण उपलब्ध नहीं था कि यह भी संभव है. ध्यान से, इस अध्ययन में एंटीबॉडी एन टर्मिनस (अमीनो एसिड 38-55) के लिए एक सिंथेटिक पेप्टाइड का उपयोग कर उत्पन्न किया गया था. इस प्रकार अभी तक प्रयोगात्मक पुष्टि की (UniProt डेटाबेस) होने के लिए हालांकि पहले 302 अमीनो एसिड की कमी Mfn2 की एक भविष्यवाणी ब्याह संस्करण है. इस प्रकार, इस परख इस्तेमाल किया एंटीबॉडी दिया, एन टर्मिनल अनुक्रम कमी वैकल्पिक रूप से spliced ​​Mfn2 पता लगाने में असमर्थ है.

Mitochondrial transmembrane क्षमता (ΔΨ मीटर) और superoxide उत्पादन इस परख में मूल्यांकन किया जा सकता. भीतरी mitochondrial झिल्ली के पार, प्रभारी की एक जुदाई क हैआईसीएच ऑक्सीडेटिव फास्फारिलीकरण के माध्यम से एटीपी उत्पादन ड्राइव. TMRM एक झिल्ली क्षमता निर्भर तरीके 5 में माइटोकॉन्ड्रिया के भीतर जम जाता है कि एक cationic डाई है, और इसलिए mitochondrial transmembrane क्षमता के एक पत्रकार के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है. माइटोकांड्रिया (95%) का बहुमत बेदाग नियंत्रण (चित्रा 3) की तुलना में, धुंधला के बाद TMRM सकारात्मक हैं. हालांकि, uncoupler CCCP जोड़ा जाता है जब TMRM (चित्रा 3A) बनाए रखने में सक्षम माइटोकॉन्ड्रिया की संख्या में उल्लेखनीय कमी आई है. CCCP अनिवार्य रूप से आरोप की जुदाई को नष्ट करने और झिल्ली depolarizing, भीतरी mitochondrial झिल्ली भर आयनों की मुफ्त यात्रा की अनुमति देता है.

जटिल मैं और इलेक्ट्रॉन परिवहन श्रृंखला की तृतीय से ऑक्सीडेटिव फास्फारिलीकरण के एक सामान्य प्रतिफल के रूप में माइटोकॉन्ड्रिया रिहाई superoxide. Mitochondrial superoxide माइटोकॉन्ड्रिया को निशाना बनाया और फ्लोरोसेंट follo हो जाता है कि एक झिल्ली पारगम्य डाई के माध्यम से मापा जा सकता हैविंग superoxide 7 के साथ एक प्रतिक्रिया. कार्यात्मक माइटोकॉन्ड्रिया बेदाग नमूने (3B चित्रा) की तुलना में superoxide की एक बेसल राशि का उत्पादन. जटिल तृतीय अवरोध Antimycin एक के अलावा पुष्पन में एक दाहिनी ओर बदलाव और माइटोकॉन्ड्रिया के एक उच्च संख्या के रूप में देखा, superoxide में वृद्धि पैदावार (आमतौर पर ~ 10%) इस mitochondrial superoxide सूचक डाई (3B चित्रा) के साथ फ्लोरोसेंट हैं.

चित्रा 1
अलगाव, immunolabeling और माइटोकॉन्ड्रिया का विश्लेषण चित्रा 1 योजनाबद्ध. चरण 1: ऊतक लीजिए और homogenize चरण 2:. अलगाव प्रक्रिया आठ centrifugation के चरणों में हैं. मेलिन, केंद्रीय तंत्रिका तंत्र ऊतक का एक प्रमुख रोकथाम Iodixanol (घनत्व ढाल मध्यम) और Centri में माइटोकॉन्ड्रिया गिराए द्वारा हटा दिया जाता हैमाइटोकॉन्ड्रिया pelleted कर रहे हैं, जबकि fuging, ट्यूब के शीर्ष पर चल माइलिन में जिसके परिणामस्वरूप चरण 3:. अलगाव और मात्रा का ठहराव के बाद, माइटोकॉन्ड्रिया प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ लेबल और धोया, अवरुद्ध कर रहे हैं. एक फ्लोरोफोरे संयुग्मित एक माध्यमिक एंटीबॉडी तो जोड़ा जाता है. अनबाउंड एंटीबॉडी बाहर धोया जाता चरण 4:. माइटोकॉन्ड्रियल पवित्रता, या mitochondrial समारोह पर रिपोर्ट है कि फ्लोरोसेंट रंगों जोड़ा जा सकता है इस बिंदु पर 5 कदम:. Mitochondria अब प्रवाह cytometry द्वारा विश्लेषण किया जा करने के लिए तैयार हैं.

चित्रा 2
प्रवाह से अलग माइटोकॉन्ड्रिया के विश्लेषण के लिए चित्रा 2 रणनीति cytometry. आगे तितर बितर (FSC) और पक्ष तितर बितर (एसएससी) voltages लघुगणक मोड में दोनों मापदंडों का उपयोग, छोटी घटनाओं के लिए समायोजित किया जाना चाहिए. FSC चौड़ाई (FSC-W) डेटा होना चाहिएदोहरी बाहर करने के लिए एकत्र की. नोट, सबसे प्रवाह cytometers पर, FSC और एसएससी के लिए डिफ़ॉल्ट सेटिंग रैखिक मोड (बी) दोहरी,. एक डॉट भूखंड पर सभी एकत्र घटनाओं कल्पना (ए). है एक ही समय में लेजर से गुजर दो माइटोकॉन्ड्रिया, से प्रतिष्ठित किया जा सकता FSC-W (रैखिक मोड) बनाम FSC साजिश रचने के द्वारा singlets. FSC-W मूल्य यानी घटनाओं, घने बादल का हिस्सा हैं कि उन के बहुमत के दो बार से अधिक मतलब FSC-W मूल्य अगर घटनाक्रम बाहर रखा गया है. इस सीमा के तहत घटनाक्रम singlets के रूप में gated हैं. (सी) फिर, एक डॉट साजिश में घटनाओं कल्पना, और फाटक शेष घटनाओं पर. (डी) बेदाग नमूना के एक हिस्टोग्राम साजिश (ठोस, भरा, ग्रे) और नमूना के साथ दाग एक mitochondrial विशिष्ट डाई (एमएसडी: ठोस, हरा). गेट एमएसडी (एमएसडी). (ई) निर्धारण नियंत्रण, खरगोश आईजीजी के हिस्टोग्राम के लिए सकारात्मक धुंधला घटनाओं (काले धराशायी) और Mfn2 लेबल नमूना (ठोस, गुलाबी).निर्धारण नियंत्रण शिखर पर ≤ 1% Mfn2 + उपज और Mfn2 (Mfn2 +) के लिए सकारात्मक लेबलिंग घटनाओं का प्रतिशत निर्धारित करने के लिए प्रयोगात्मक नमूने के लिए यह एक ही गेट को लागू करने के रूप में तो गेट सेट करें. इस का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें आंकड़ा.

चित्रा 3
प्रवाह cytometry द्वारा पृथक माइटोकॉन्ड्रिया में चित्रा 3 परख mitochondrial transmembrane क्षमता (ΔΨ मीटर) और superoxide उत्पादन. (ठोस, ग्रे, भरा) डाई एक transmembrane क्षमता के साथ माइटोकॉन्ड्रिया में जम जाता है क्योंकि बेदाग नियंत्रण की तुलना में सभी सक्रिय माइटोकांड्रिया (ठोस, काला) TMRM साथ लेबल होगा बेसल शर्तों के तहत (ए),. आदि (धराशायी, नीला) protonophore CCCP की tion बिगाड़ना और कम बेसल शर्तों की तुलना में डाई बनाए रखने के लिए माइटोकॉन्ड्रिया के कारण transmembrane क्षमता dissipates. डाटा बेसल शर्तों के तहत फ्लोरोसेंट तीव्रता नमूना का मतलब फ्लोरोसेंट तीव्रता से घटाया बेदाग नियंत्रण का मतलब फ्लोरोसेंट तीव्रता है जो (ΔMFI),. (बी) मतलब डेल्टा के रूप में सूचना दी है, माइटोकॉन्ड्रिया ऑक्सीडेटिव के द्वारा एक उत्पाद के रूप में superoxide उत्पादन फास्फारिलीकरण. बेदाग नियंत्रण (ठोस, ग्रे, भरा) की तुलना: superoxide की इस mitochondrial स्रोत एक mitochondrial superoxide सूचक, (ठोस, काले MitoO 2) के साथ assayed किया जा सकता है. जटिल तृतीय अवरोध, Antimycin एक के अतिरिक्त वृद्धि हुई superoxide उत्पादन में (धराशायी, नारंगी) के परिणाम, बेसल स्तर के साथ तुलना. डाटा MitoO 2 सूचक के लिए सकारात्मक धुंधला कोशिकाओं के प्रतिशत के रूप में सूचना दी है.कश्मीर "> इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

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Discussion

यह माइटोकॉन्ड्रिया सामान्य शरीर विज्ञान और रोग दोनों में महत्वपूर्ण खिलाड़ी हैं कि तेजी से स्पष्ट है. Immunoblotting, एक निश्चित स्थिति में माइटोकॉन्ड्रिया के भीतर या mitochondrial सतह पर पूरी आबादी की औसत पर इस विधि में रिपोर्ट पाए जाते हैं, जो प्रोटीन का निर्धारण कर सकते हैं. इस विधि mitochondrial subpopulations या कैंपेन्स के रिश्तेदार abundances के बारे में जानकारी नहीं उपज सकता है. यह किया गया है जबकि पहले सभी माइटोकॉन्ड्रिया समान रूप से, क्षेत्र तेजी से एक कोशिका के भीतर है कि माइटोकॉन्ड्रिया पहचानने है बनाया आकारिकी और / या समारोह 10 के संदर्भ में व्यापक परिवर्तनशीलता हैं कि ग्रहण किया.

फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी दृष्टिकोण को ध्यान में माइटोकॉन्ड्रिया की विविधता लेते हो. हालांकि, डेटा के इस प्रकार की मात्रा का ठहराव श्रम गहन है. इसके अलावा, इस दृष्टिकोण / सीटू के कारण Exces के लिए मुश्किल है विवो में माइटोकॉन्ड्रिया की लेबलिंग के रूप में, संवर्धित कोशिकाओं का उपयोग पढ़ाई के लिए बेहतर अनुकूल है,वर्तमान माइटोकॉन्ड्रिया की निर्णायक संख्या, व्यक्तिगत organelles के भेदभाव स्वाभाविक मुश्किल बना रही है. सबसे immunocytochemistry प्रोटोकॉल में, यह कारण एंटीबॉडी लेबलिंग के लिए आवश्यक सेलुलर permeabilization कदम को भी एक साथ बाहरी mitochondrial झिल्ली प्रोटीन लेबल और mitochondrial समारोह का आकलन करना संभव नहीं है. वर्तमान पद्धति एक permeabilization कदम की आवश्यकता नहीं है, इस प्रकार पृथक माइटोकॉन्ड्रिया के साथ काम करता है, और. इसके अलावा, व्यक्तिगत माइटोकॉन्ड्रिया के दृश्य mitochondrial समारोह का विश्लेषण करने के लिए उत्तरदायी नहीं है जो इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी, के माध्यम से ही संभव है. यही कारण है कि हम ऊतक से माइटोकॉन्ड्रिया के अलगाव mitochondrial नेटवर्क के विघटन की ओर जाता है और इस mitochondrial समारोह के कुछ तत्वों को प्रभावित कर सकता है कि पहचान है, कहा जा रहा है. हालांकि, इसी प्रकार कार्रवाई की जाती है कि ऊतकों से अलग माइटोकॉन्ड्रिया के कार्यात्मक पहलुओं की तुलना वैध रहेगा.

ऊतक व्युत्पन्न ISOLAT की immunolabeling का यह तरीकाप्रवाह से एड माइटोकांड्रिया और बाद cytometry विश्लेषण का पता लगाने और बाहरी झिल्ली पर स्थित एक प्रोटीन की उपस्थिति पर नजर रखने के लिए एक तेजी से और quantifiable विधि के लिए अनुमति देता है. (Mfn2) की तरह एक अत्यधिक प्रचुर मात्रा में mitochondrial प्रोटीन का पता लगाने के लिए इस तकनीक के साथ संभव है. इसी प्रकार, इस विधि केवल Amyotrophic पार्श्व स्केलेरोसिस (ए एल एस) 11 के संदर्भ में misfolded SOD1 की तरह, रोग में mitochondrial झिल्ली पर जमा कर रहे हैं कि कम बहुतायत प्रोटीन का पता लगा सकते हैं. इसके अलावा, इस विधि क्षणिक अपने सामान्य समारोह के हिस्से के रूप में mitochondrial सतह के साथ संबद्ध है कि प्रोटीन की निगरानी के लिए उपयोगी हो सकता है. उदाहरणों में शामिल DYNAMIN से संबंधित प्रोटीन -1 (Drp1), के रूप में mitochondrial प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों बढ़ाने के माइटोकॉन्ड्रिया के लिए translocates जो mitochondrial विखंडन 12 और ट्यूमर परिगलन कारक रिसेप्टर जुड़े कारक 6 (TRAF6), को बढ़ावा देने के माइटोकॉन्ड्रिया के लिए भर्ती किया गया है जो एक साइटोसोलिक प्रोटीन एक सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया 13 का एक हिस्सा.

Intracellular लेबलिंग के लिए मानक permeabilization प्रोटोकॉल माइटोकॉन्ड्रिया की संरचनात्मक अखंडता बाधित कि एक साबुन की आवश्यकता के रूप में वर्तमान में इस तकनीक, केवल mitochondrial सतह पर स्थित प्रोटीन के लिए उत्तरदायी है. संभव अभिकर्मकों के एक नंबर (अप्रकाशित) की कोशिश की गई है, वहीं immunolabeling प्रोटोकॉल के आगे अनुकूलन अभी भी इंट्रा mitochondrial घटकों का पता लगाने के लिए उत्तरदायी इस प्रोटोकॉल बनाने की जरूरत है.

इस तकनीक को व्यापक आवेदन किया है और विभिन्न प्रयोगात्मक मानदंड के तहत माइटोकॉन्ड्रिया के लिए उपस्थिति या एक या एक से अधिक प्रोटीन की भर्ती का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इसके अलावा, माइटोकॉन्ड्रिया दो अलग एंटीबॉडी, साथ ही फ्लोरोसेंट संकेतक 11 के साथ सह लेबल किया जा सकता. अन्य फ्लोरोसेंट जांच भी mitochondrial समारोह के अतिरिक्त पहलुओं को चिह्नित करने के लिए शामिल किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध रंगों mitochondrial पीएच 14 की निगरानी के लिए 15, और एटीपी स्तर 16 के साथ कैल्शियम तेज संभव हो रहे हैं.

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgements

हम प्रवाह के लिए उपयोग के लिए लॉरी Destroismaisons और बकाया तकनीकी सहायता के लिए सारा Peyrard और Dr.Alexandre नितंब धन्यवाद. हम भी तैयारी से माइलिन को हटाने के संबंध में उनके योगदान के लिए डॉ टिमोथी मिलर स्वीकार करना चाहते हैं. इस काम के स्वास्थ्य अनुसंधान (CIHR) Neuromuscular अनुसंधान भागीदारी, अभिनव के लिए कनाडा फाउंडेशन, कनाडा के ए एल एस सोसायटी, ए एल एस अनुसंधान के लिए फ्रिक फाउंडेशन, चम फाउंडेशन और Fonds डी ला Recherche एन Sante डु क्यूबेक (सीवीवी) की कनाडा के संस्थानों द्वारा समर्थित किया गया. दोनों सीवीवी और एनए हैं की रिसर्च स्कॉलर्स Fonds डी ला Recherche एन Sante डु क्यूबेक और CIHR नई जांचकर्ता. सपा कनाडा के ए एल एस सोसायटी की ओर से टिम नोएल छात्रवृत्ति के द्वारा समर्थित है.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Rats Charles River Strain code 400 Adult (9 weeks to 18 weeks) male or female rats can be used for the isolation protocol. Weight of rats is dependent on gender and age (males between 300 to 500 g and females between 200 to 350 g) are typically used.
Dounce homogenizer Kontes Glass Co.  885450-0022 Duall 22
Microcentrifuge Thermo Scientific Sorvall Legend Micro 17 R
Ultra-Clear Ultracentrifuge tubes Beckman Coulter 344057 Transparent, thin walled 
Sorvall Ultracentrifuge Thermo Scientific Sorvall WX UltraSeries
AH-650 rotor and buckets   Thermo Scientific
Opti-prep Axis-Shield 1114542 Iodixanol, density gradient medium
Fatty acid free Bovine Serum Albumin Sigma A8806 Must be fatty acid free for mitochondria
Sodium succinate dibasic hexahydrate   Sigma S9637
Rabbit anti-Mitofusin2 antibody Sigma M6319
Rabbit IgG Jackson Immuno Research  011-000-003
Anti-Rabbit IgG PE eBioscience 12-4739-81
Micro titer tube Bio-Rad 223-9391 For sample acquisition by flow cytometry 
MitoTrackerGreen (MTG) Invitrogen M7514 100 nM: Ex 490 nm/Em 516 nm
TMRM Invitrogen T668 100 nM: Ex 548 nm/Em 574 nm
CCCP Sigma C2759
MitoSOX Red Invitrogen M36008 5 µM: Ex 540 nm/Em 600 nm
Antimycin A Sigma A8874
LSR II flow cytometer BD
BD FACSDiva Software BD
FlowJo TreeStar Inc.  Software used for analysis
BCA protein assay kit   Pierce/Thermo Scientific 23225 Bradford assay is not recomended as it is not compatible with high concentrations of SDS

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References

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