Elektronische tong genereren Continuous Erkenning Patronen voor Protein Analysis

Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Hou, Y., Genua, M., Garçon, L. A., Buhot, A., Calemczuk, R., Bonnaffé, D., Lortat-Jacob, H., Livache, T. Electronic Tongue Generating Continuous Recognition Patterns for Protein Analysis. J. Vis. Exp. (91), e51901, doi:10.3791/51901 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Precieze en snelle eiwit detectie methoden zijn zeer belangrijk in de medische diagnostiek en proteomics. Klassieke-eiwit detecteren arrays, zoals biochips, zijn gebaseerd op het "lock-and-key" opnameprincipe en vereisen specifieke receptoren zoals aptameren, antilichamen of mimetica.

In de afgelopen jaren, heeft differentiële detectie geïnspireerd door de menselijke reukzin en gustation voren als alternatief 1. Deze elektronische neus / veer (eN / eT) benadering is gebaseerd op differentiële binding van analyten een array kruisreactieve receptoren (CRRs), die niet nodig zeer specifiek of selectief voor de doelmoleculen te laten dan het moeizame overwinnen ontwikkelingsproces zeer selectief receptoren. Het is de gecombineerde respons van de receptoren die zorgt voor een duidelijk patroon voor elk monster, zoals een vingerafdruk, identificatiemiddel.

De twee belangrijkste uitdagingen voor de ontwikkeling van elektronic neus / tong doeltreffende eiwit sensing zijn de productie van sensorelementen die het vermogen om onderscheid te maken tussen structureel vergelijkbare analyten en passende transductie stelsel binding evenement. Tot nu toe hebben studies over verschillende benaderingen matrix ontwikkeling 2. Bijvoorbeeld in een studie een array-gebaseerde identificatie van eiwitten werd ontwikkeld met CRRs bereid uit tetra-carboxyphenylporphyrin derivaten door het koppelen van de carboxylgroepen van verschillende aminozuren of dipeptiden differentiële receptoren bezitten een hydrofobe kern voor affiniteit voor eiwitten en onderscheiden gebracht periferieën voor zorgen meegeven differentieel bindend. Met dit systeem werden verschillende eiwitten en mengsels geïdentificeerd door het meten van fluorescentie uitdoving van de receptoren na interactie met de analyten 3,4. In een andere studie werd een bibliotheek van 29 CRRs bevattende tripeptide en boronzuur groepen gesynthetiseerd op een combinatorische wijze op een hexasubstistitueerde benzeen steiger is ontwikkeld voor het meten van eiwitten met een indicator-opname colorimetrische detectie 5,6. Met een dergelijk ontwerp, elke receptor toonde differentieel bindingscapaciteit eiwitten op basis van de variantie in de peptide armen, en boorzuren geholpen bij differentiatie van eiwitten uit glycoproteïnen. Meer recent heeft een serie samengesteld uit verschillende kationische gefunctionaliseerde goud nanodeeltjes geconjugeerd met een anionische fluorescerende polymeer poly (p-phenyleneethynylene) (PPE) werd om te detecteren en identificeren eiwitten 7. De competitieve binding tussen eiwitten te analyseren en geblust PPE / goud nanodeeltjes complexen geregenereerd fluorescentie, het produceren van verschillende patronen erkenning voor eiwitten. In dit onderzoek werden de gefunctionaliseerde nanodeeltjes-eiwitinteracties afgestemd door het variëren van fysicochemische eigenschappen van nanodeeltjes eindgroepen. Verder werd aangetoond dat deze benadering effectief voor eiwit analyse complex en eiwit-rijk medium zoalszoals humaan serum bij fysiologisch relevante concentraties, daarmee aangevend het potentieel van eT profileren echte steekproeven voor de diagnose ziektetoestanden 8.

Hoewel veelbelovend, deze systemen hebben een aantal inherente beperkingen. Ze vereisen het ontwerpen en synthetiseren 5-29 CRRs met vrij ingewikkeld structuren. In tegenstelling tot het olfactorische systeem wordt gereset na elke meting proteïne detectie vereist het bereiden van een matrix per monster. Tenslotte monitoren real-time bindinggebeurtenissen bijzonder moeilijk.

In dit verband werd een combinatoriële benadering voorgesteld door een klein aantal eenvoudige en gemakkelijk toegankelijk moleculen met verschillende fysisch-chemische eigenschappen (hydrofiel, hydrofoob, positief geladen, negatief geladen, neutrale, etc.) Als bouwstenen (BBs) 9. Door het mengen BBs in variërende verhoudingen en gecontroleerd en waarbij de mengsels zelf-assembleren op het goud oppervlak van eenprisma, een reeks van combinatorische oppervlakken met de juiste eigenschappen voor het bindende eiwit is gemaakt. Met name de zelf-geassembleerde monolagen op dit systeem toe gemakkelijk afstemmen van verschillende oppervlakte-eigenschappen op zeer uiteenlopende wijze, waardoor diverse combinatorische kruisreactief receptoren (CoCRRs) om snel en efficiënt geproduceerd. Eiwit sensing werd uitgevoerd met behulp van een optisch detectiesysteem, surface plasmon resonance imaging (SPRI). Kortom, een brede bundel monochromatisch gepolariseerd licht van een LED verlicht de gehele matrix CoCRR gebied op het oppervlak van het prisma. Een hoge resolutie CCD-videocamera biedt real-time verschil van beelden over alle plekken van de CoCRR array. Het vangt alle lokale veranderingen op het oppervlak van de CoCRR scala verstrekken van gedetailleerde informatie over de binding evenementen en kinetische processen 10. Ondertussen, met de hulp van imaging software, SPR beelden die overeenkomen met plekken worden automatisch omgezet naar variaties van reflectiviteit versus tijd, het genereren van een reeks van kinetische bindingscurven genoemd sensorgrammen. Aldus kan een spri labelvrije, synchroon, parallel en real-time waargenomen bindingsgebeurtenissen. Bovendien, de verkregen CoCRR array regenereerbaar en herbruikbaar eiwitanalyse.

Dit protocol beschrijft de bouw van de elektronische tong met behulp van slechts twee kleine moleculen als bouwstenen en illustreert de toepassing ervan voor de analyse van algemene eiwitten gebaseerd op continue patronen erkenning verkregen met SPRI.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1 Voorbereiding van de verschillende oplossingen en Eiwitmonsters

  1. Bereid 100 ml fosfaatbufferoplossing (PBS-G) bevattende 50 mM NaH 2PO 4, 50 mM NaCl en 10% glycerol bij pH 6.8.
  2. Bereid 250 ml HEPES bufferoplossing met 10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 0,005% Tween 20 bij pH 7,4.
  3. Bereid voorraadoplossing bouwsteen 1 (BB1) lactose en bouwsteen 2 (BB2) gesulfateerde lactose (figuur 1) 0.2 mM in PBS-G.
  4. Bereid 1 ml eiwitoplossingen in HEPES: A spil hypogaea lectine (AHL) 500 nM, 1 uM myoglobine, lysozym en 500 nM.
  5. Bereid 20 ml van 1% SDS in ultrapuur water.

2 Voorbereiding van de CoCRR Array

  1. Reinig het goud oppervlak van het prisma 48 uur voorafgaand aan het gebruik van een plasma reiniger voor 3 min onder deze omstandigheden: 75% zuurstof, 25% Argon, 0,6 mbar, vermogen 40 W.
  2. Bereid elf zuivere en gemengde solutions BB1 BB2 en met [BB1] / ([BB1] + [BB2]) verhoudingen tussen 0 en 100% in stappen van 10% bij een totale BB concentratie van 0,1 mM in PBS-G.
  3. Deposit 8 nl druppels van deze zuivere en gemengde oplossingen op het prisma oppervlak met een contactloos spotter in viervoud voor elke verhouding met 44 plekken in totaal (figuur 2).
    OPMERKING: 10% glycerol toegevoegd in PBS-G is zeer belangrijk solvent evaporatie en de verandering BB concentratie na afzetting te verminderen.
  4. Plaats het prisma in een petrischaal met 1 ml ultrapuur water en laat het O / N bij RT voor zelf-assemblage van BB1 en BB2 op de gouden oppervlak. Hierbij wordt aangenomen dat de gemiddelde samenstelling van het oppervlak in de gemengde monolagen weerspiegelt de samenstelling van de depositie gemengde oplossing (figuur 3) 11.
  5. Grondig wassen het prisma met ultrapuur water en droog hem vervolgens onder een stroom van argon.

3 Eiwit Sensing door spri

  1. Stel de incubator waarin het de l inrichting wordt geplaatst op 25 ° C tot brekingsindex veranderingen bij temperatuurvariatie tijdens eiwit detectie vermijden.
  2. Plaats een niet-gefunctionaliseerd spoelen prisma in de 10 ul polyether ether ketone (PEEK) stroom cel aangesloten op een computer gestuurde spuitpomp, een ontgasser en een 6-port middeldruk injectieventiel (figuur 4). Vul de stroom systeem met vers gefilterd en ontgast lopende buffer HEPES.
  3. Verwijder de spoelen prisma en steek het prisma met de CoCRR array in de stroom cel. Run HEPES bij 100 pl / min stroomsnelheid. Met de hulp van de CCD-camera verwijder eventuele luchtbelletjes aanwezig zijn op het prisma oppervlak door het passeren van lopende buffer snel.
  4. Definieer studiegebied voor elke plek door het tekenen van een cirkel met dezelfde diameter voor het gebied van belang op basis van een goed contrast beeld van de reeks en met de hulp van de geïntegreerde software in spri systeem.
  5. Trace plasmon curves, die bestrijkenivity krommen in functie van de invalshoek voor alle spots.
  6. Kies de werkhoek (positie waarop kinetische curves zullen worden opgenomen) op de hoogste helling van de reflectiviteit rondingen. Draai het scannen spiegel om de geselecteerde werken hoek voor kinetische metingen op te lossen.
  7. Blijven HEPES lopen door de stroom-systeem tot reflectie signaal voor alle plekken is stabiel en constant.
  8. Injecteer 1 ml AHL-oplossing met een injectiespuit in de sample loop (500 pl) met de injectie klep op stand "load". Dan zet de injectie klep naar "injectie" te positioneren. De stroomsnelheid voor alle eiwit injectie was 100 ul / min.
  9. Begin kinetische metingen door het monitoren van de reflectiviteit variaties tegen de tijd gelijktijdig op alle plekken.
  10. Eind eiwit injectie spoel de array met loopbuffer gedurende 8 minuten. Tenslotte Injecteer 1 ml 1% SDS te regenereren.
  11. Herhaal dezelfde procedure voor de andere proteins.

4 Data Processing and Analysis

  1. Na binnenkomst eiwitoplossing in de stroomcel, moleculaire binding optreedt en induceert een verschuiving van de plasmon bochten en een variatie van reflectiviteit. De beeldacquisitie software zet de gemeten lichtintensiteit waarden schaalniveaus grijs, waardoor SPR afbeeldingen Figuur 5A, en genereert de variatie van reflectiviteit versus tijd, die sensorgrammen (Figuur 5B).
  2. Gebruik een wiskundige computerprogrammatuur om de reflectiecoëfficiënt (R%) plot eind van elk eiwit injectie versus [BB1] / ([BB1] + [BB2]) verhouding 2D voortdurende ontwikkeling (LMP) voor elk monster genereren (Figuur 5C).
  3. Voeg de [BB1] / ([BB1] + [BB2]) verhouding in sensorgrammen (figuur 5B) naar 3D continue evolutie landschap (CEL) voor elk eiwit (Figuur 5D) te genereren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Om het vermogen van de elektronische tong gemeenschappelijke eiwitanalyse onderzoeken, werden drie eiwitten gebruikt: AHL, myoglobine en lysozym. Voor elk eiwit, een afzonderlijke 2D continue evolutie profiel CEP, werd gegenereerd door de eT, zie figuur 6.

Verder dankzij de l, die kunnen volgen de real-time adsorptie en desorptie, voor elk eiwit een tijdsafhankelijke patroon continue herkenningsmachine, genaamd 3D continue evolutie landscape (CEL), werd gegenereerd. In figuur 7, zijn kenmerkend CEL's van deze drie eiwitten getoond.

Figuur 1
Figuur 1 Chemische structuren van de twee bouwstenen gebruikt in dit protocol naar de CoCRR scala bereiden.51901 / 51901fig1highres.jpg "target =" _blank "> Klik hier om een ​​grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 2
Figuur 2 een foto van een prisma na afzetten de 44 druppeltjes van de zuivere en gemengde oplossingen BB1 BB2 en een niet-contact piëzo spotter met elke verhouding in viervoud. Het prisma is geplaatst naast een Eppendorf buis van 1,5 ml.

Figuur 3
Figuur 3 Schematische illustratie van de CoCRR array met 11 differentieel receptoren die werden bereid met zuivere en gemengde oplossingen BB1 BB2 en bij verschillende verhoudingen en waarbij de mengsels zelf-assembleren op het goud survlak van het prisma.

Figuur 4
Figuur 4: Schematische weergave van de spri detectie systeem gecombineerd met een microfluïdische systeem.

Figuur 5
Figuur 5 Schematische weergave van data behandeling voor het genereren van twee vormen van permanente patroonherkenning met ontwikkelde elektronische tong: 2D continue evolutie profiel en 3D continue evolutie landschap.

Figuur 6
Figuur 6 Continuous evolution profielen voor drie zuivere eiwit:. AHL (500 nM), myoglobine (1 uM), en lysozyme (500 nM) werden zij gegenereerd door het uitzetten van de variatie van reflectiviteit (R%) eind eiwit injectie versus [BB1 ] / ([BB1] + [BB2]) verhouding.

Figuur 7
Figuur 7 Landschap van de smaak: karakteristieke 3D CEL's van AHL, myoglobine en lysozym gegenereerd door de elektronische tong.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De meest kritische stappen voor de constructie van deze eT zijn toegewijd aan een goede reproduceerbaarheid van het systeem. Bijvoorbeeld, het reinigen van de gouden oppervlak van het prisma met een gestandaardiseerde procedure voor gebruik, toevoegen van 10% glycerol in de elf zuivere en gemengde oplossingen BB1 en BB2 om oplosmiddelverdamping te elimineren tijdens BBs zelfassemblerende op het goud oppervlak van het prisma, deponeren van meerdere herhalingen voor elke [BB1] / ([BB1] + [BB2]) ratio, etc. Voor eiwit detectie door de l, de keuze van de werkhoek kritisch. Meestal wordt vastgesteld op het hoogste helling van de reflectiviteit curves. Bovendien is het zeer belangrijk gestandaardiseerde experimentele omstandigheden voor elk eiwit sensing, zoals werktemperatuur, stroomsnelheid, etc gebruiken. Na elk eiwit injectie moet de CoCRR matrix worden geregenereerd voor hergebruik met een geschikte oplossing die volledige regeneratie van het systeem kan zonder schade aan receptoren.

e_content "> aan te tonen dat de ontwikkelde eT is niet alleen effectief voor de studie van suiker-bindende eiwitten zoals eerder gemeld 9, maar ook voor algemene eiwitten, een lectine AHL samen met twee niet-suiker-bindende eiwitten myoglobine en lysozyme gebruikt. Ze werden gekozen om verschillende kosten hebben HEPES (pH 7.4). AHL (iso-elektrisch punt (pI) 6,0), myoglobine (pI 7,2) en lysozyme (pI 11) Met name, zoals getoond in figuur 6, elk eiwit bezit een unieke reactiepatroon. AHL enigszins negatief geladen in HEPES. Het CEP blijkt dat het sterkere interactie met de negatief geladen BB2-rijke CoCRRs. Hoogstwaarschijnlijk komt dit door de interactie tussen het positief geladen domein van het eiwit en BB2-rijke CoCRRs . Voor myoglobine, die globaal neutraal HEPES, is er niet veel verschil tussen de signalen verkregen met CoCRRs. Bij vergelijking myoglobine in CEP de LMP van AHL en lysozym, zelfs bij een hogere concentratie het signaal veel lower. Zoals voor lysozym, die positief geladen is in HEPES, werd de maximale signaal verkregen met de CoCRR met pure BB2.

Dankzij de voordelen van lent voor de controle van de real-time adsorptie en desorptie, voor elk eiwit een 3D voortdurende ontwikkeling landschap gegenereerd. Dit soort tijdsafhankelijke opname patroon bevat aanvullende differentiatie parameters voor eiwitanalyse. In het bijzonder zou het zeer nuttig voor het analyseren van twee analyten presenteren de vergelijkbare affiniteit voor een aantal CoCRRs maar verschillen in de kinetiek van interactie. Zoals getoond in figuur 7, de CEL's zijn gemakkelijk te onderscheiden. Deze resultaten tonen dat de interactie van de drie eiwitten met de CoCRRs is afhankelijk van hun oppervlakte-eigenschappen zoals de verdeling van hydrofobe, neutrale en geladen aminozuurresten. Zowel CEP en CEL kan gebruikt worden als "vingerafdrukken" voor de discriminatie en prospec eiwittieve identificatie. Aldus, de eT effectief voor de analyse van algemene eiwitten.

De hierin beschreven protocol gebruikt een combinatoriële benadering van de eT construeren voor eiwitanalyse. In tegenstelling tot andere benaderingen die een aantal moleculen die structureel ingewikkeld en moeizaam te synthetiseren zijn gebruikt, waren slechts twee kleine moleculen gebruikt om de cross-reactieve receptor matrix kunnen differentiëren eiwitten met goede resolutie in deze studie bereiden. Bovendien, volgens het vorige onderzoek, de eT is stabiel, reproduceerbaar en herbruikbaar 9. Bovendien spri zorgt voor de opvolging bindende gebeurtenissen in real-time en het genereren van nieuwe doorlopende patronen erkenning met ongekende betrouwbaarheid. In de nabije toekomst zullen extra BB's met aanvullende fysisch-chemische eigenschappen worden ingevoerd om de diversiteit van de CoCRR in de arrays te verhogen voor de analyse van complexe mengsels van vloeistof of gas.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
SPRi apparatus  Horiba Scientific-GenOptics SPRi apparatus is placed in a temperature regulated incubator at 25 °C.
Incubator Memmert
Syringe pump  Cavro scientific instruments Cavro XLP 6000
Micro Elite Degasser  Alltech AT590507
6-port medium pressure injection valve Upchurch Scientific The volume of injection loop used is 500 µl.
Femto plasma cleaner (version 7) Diener Electronic On-line degassing system with 2 channel.
Spotter Siliflow It is a non-contact piezoelectric spotter.
SPRi-Biochip Horiba Scientific-GenOptics 36000067 The prism is made of a high refractive index glass prism coated with a thin gold film (45 nm) and specially developed for imaging purposes.
Erythrina cristagalli lectin  Sigma-Aldrich L5390
Arachis hypogaea lectin  Sigma-Aldrich L0881
Myoglobin Sigma-Aldrich M1882
Lysozyme Sigma-Aldrich L6876
CXCL12α Provided by Dr. Hugues Lortat-Jacob; for preparation details, see supporting information in reference 9
CXCL12γ  Provided by Dr. Hugues Lortat-Jacob; for preparation details, see supporting information in reference 9
Lactose Provided by Prof. David Bonnaffé; for preparation details, see supporting information in reference 9
Sulfated lactose Provided by Prof. David Bonnaffé; for preparation details, see supporting information in reference 9
Glycerol Sigma-Aldrich G5150
SDS Sigma-Aldrich L4509
Tween 20 Sigma-Aldrich 274348
HEPES Sigma-Aldrich H3375
Sodium phosphate monobasic Sigma-Aldrich S0751
Sodium chloride Sigma-Aldrich S3014

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Margulies, D., Hamilton, A. D. Combinatorial protein recognition as an alternative approach to antibody-mimetics. Current Opinion in Chemical Biology. 14, 705-712 (2010).
  2. Umali, A. P., Anslyn, E. V. A general approach to differential sensing using synthetic molecular receptors. Current Opinion in Chemical Biology. 14, 685-692 (2010).
  3. Baldini, L., Wilson, A. J., Hong, J., Hamilton, A. D. Pattern-based detection of different proteins using an array of fluorescent protein surface receptors. J. Am. Chem. Soc. 126, 5656-5657 (2004).
  4. Zhou, H. C., Baldini, L., Hong, J., Wilson, A. J., Hamilton, A. D. Pattern recognition of proteins based on an array of functionalized porphyrins. J. Am. Chem. Soc. 128, 2421-2425 (2006).
  5. Wright, A. T., Griffin, M. J., Zhong, Z., McCleskey, S. C., Anslyn, E. V., McDevitt, J. T. Differential receptors create patterns that distinguish various proteins. Angew. Chem. Int. Ed. 44, 6375-6378 (2005).
  6. Wright, A. T., Anslyn, E. V. Differential receptor arrays and assays for solution-based molecular recognition. Chem. Soc. Rev. 35, 14-28 (2006).
  7. You, C. C., et al. Detection and identification of proteins using nanoparticle–fluorescent polymer ‘chemical nose’ sensors. Nature Nanotechnology. 2, 318-323 (2007).
  8. De, M., et al. Sensing of proteins in human serum using conjugates of nanoparticles and green fluorescent protein. Nature Chemistry. 1, 461-465 (2009).
  9. Hou, Y., et al. Continuous evolution profiles for electronic-tongue-based analysis. Angew. Chem. Int. Ed. 51, 10394-10398 (2012).
  10. Campbell, C. T., Kim, G. SPR microscopy and its applications to high-throughput analyses of biomolecular binding events and their kinetics. Biomaterials. 28, 2380-2392 (2007).
  11. Stranick, S. J., et al. Nanometer-scale phase separation in mixed composition self-assembled monolayers. Nanotechnology. 7, 438-442 (1996).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics