Langue Electronique Génération Schémas de reconnaissance continue pour l'analyse des protéines

Bioengineering

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Hou, Y., Genua, M., Garçon, L. A., Buhot, A., Calemczuk, R., Bonnaffé, D., Lortat-Jacob, H., Livache, T. Electronic Tongue Generating Continuous Recognition Patterns for Protein Analysis. J. Vis. Exp. (91), e51901, doi:10.3791/51901 (2014).

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Abstract

Introduction

Méthodes de détection des protéines précises et rapides sont très importants dans le diagnostic médical et de la protéomique. Puces à protéines de détection classiques, tels que les biopuces, sont basés sur le principe de la reconnaissance "clé lock-et-" et nécessitent des récepteurs spécifiques tels que les aptamères, des anticorps ou mimétiques.

Au cours des dernières années, la détection différentielle inspiré par le olfaction humaine et gustation a émergé comme une alternative 1. Ce nez / langue électronique (fr / eT) approche est basée sur la liaison d'analytes à un réseau de récepteurs à réaction croisée (SDRC), qui n'ont pas besoin d'être très spécifique ou sélective pour les molécules cibles différentielle permet donc de surmonter le laborieux processus de développement de récepteurs hautement sélectifs. Il s'agit de la réponse combinée de tous les récepteurs qui crée un motif distinct pour chaque échantillon, comme une empreinte digitale, permettant son identification.

Les deux principaux défis pour le développement des electronic nez / langue pour la détection de la protéine efficace sont la production d'éléments de détection qui ont la capacité de faire la distinction entre les analytes structurellement similaires et le système de transduction approprié pour l'événement de liaison. Jusqu'à présent, les études ont rapporté diverses approches du développement du tableau 2. Par exemple, dans une étude d'une identification basée sur la baie de protéines a été développé en utilisant CRC qui préparés à partir des dérivés tétra-carboxyphenylporphyrin par couplage de groupes carboxyle de différents acides aminés ou de dipeptides à fournir des récepteurs différentiels possédant un noyau hydrophobe de l'affinité pour les protéines et les périphéries chargées distinctes pour transmettre liaison différentielle. En utilisant ce système, les différentes protéines et des mélanges de protéines ont été identifiées par la mesure de l'extinction de fluorescence des récepteurs de l'interaction avec les analytes 3,4. Dans une autre étude, une bibliothèque de 29 CRC qui tripeptide contenant et fragments d'acide boronique synthétisé d'une manière combinatoire sur un hexasubstil'ar- échafaudage de benzène a été mis au point pour détecter les protéines avec une détection colorimétrique indicateur d'absorption de 5,6. Avec une telle conception, chaque récepteur différentiel a montré une capacité de liaison de protéines sur la base de la variance dans les bras et les peptides, les acides boroniques ont aidé à la différenciation de protéines à partir de glycoprotéines. Plus récemment, un tableau composé de différents cationiques fonctionnalisés nanoparticules d'or conjugués avec un poly anionique polymère fluorescente (p-phénylèneéthynylène) (PPE) a été créé pour détecter et identifier les protéines 7. La liaison de concurrence entre les analytes de protéines et trempé complexes de nanoparticules / or EPI fluorescence régénérées, la production de modèles de reconnaissance distinctes pour les protéines. Dans cette étude, les interactions protéines-nanoparticules fonctionnalisées ont été réglées en faisant varier les propriétés physico-chimiques des groupes terminaux de nanoparticules. En outre, il a été montré que cette approche est efficace pour l'analyse des protéines dans un milieu complexe et riche en protéines telleque le sérum humain à des concentrations physiologiquement pertinents, montrant ainsi le potentiel de eT dans le profilage des échantillons réels pour diagnostiquer des états pathologiques 8.

Bien que très prometteur, ces systèmes ont des limites inhérentes. Ils nécessitent la conception et la synthèse du 5 au 29 CRC qui avec des structures très compliquées. En outre, contrairement au système olfactif qui est remis à zéro après chaque mesure, de la protéine de détection nécessite la préparation d'une matrice par exemple. Enfin, le suivi des événements de liaison en temps réel sont extrêmement difficiles.

Dans ce contexte, une approche combinatoire a été proposée en utilisant un petit nombre de molécules simples et facilement accessibles avec différentes propriétés physico-chimiques (hydrophile, hydrophobe, chargé positivement, chargé négativement, neutre, etc.) En tant que blocs de construction (BBS) 9. En mélangeant les BB en variant et des proportions contrôlées et en permettant aux mélanges à s'auto-assembler sur la surface d'or d'unprisme, un réseau de surfaces combinatoires comportant des propriétés appropriées pour la protéine de liaison a été créé. Notamment, les monocouches auto-assemblées sur ce système permettent le réglage facile d'une gamme de propriétés de surface de manière très divergente, ce qui permet divers récepteurs à réaction croisée combinatoires (CoCRRs) pour être rapidement et efficacement produite. Protéine de détection a été effectuée en utilisant un système de détection optique, la surface d'imagerie par résonance de plasmon (SPRi). En bref, un large faisceau monochromatique de lumière polarisée à partir d'une LED illumine toute la surface de la matrice CoCRR sur la surface du prisme. Une caméra CCD haute résolution de la vidéo fournit des images de différence en temps réel sur tous les spots de la gamme CoCRR. Il saisit toutes les modifications locales à la surface de la matrice CoCRR fournissant des informations détaillées sur les événements de liaison et les processus cinétiques 10. Pendant ce temps, à l'aide de logiciels d'imagerie, images SPR correspondant aux taches sont automatiquement converties en variations de réflectivité versus le temps, générer une série de courbes de liaison cinétiques appelés sensorgrammes. Ainsi, SPRi permet une observation, synchrone, parallèle, sans étiquette et en temps réel des événements de liaison. En outre, le tableau CoCRR obtenu est régénérable et réutilisable pour l'analyse des protéines.

Ce protocole décrit la construction de la langue électronique en utilisant seulement deux petites molécules comme des blocs de construction et illustre son application pour l'analyse des protéines communes basées sur des modèles de reconnaissance continus obtenus avec SPRi.

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Protocol

1 Préparation des différentes solutions et échantillons de protéines

  1. Préparer 100 ml d'une solution tampon phosphate (PBS-G) contenant 50 mM de NaH 2 PO 4, NaCl 50 mM, glycerol à 10% et à un pH de 6,8.
  2. Préparer 250 ml d'une solution tampon HEPES contenant 10 mM d'HEPES, 150 mM de NaCl, 0,005% de Tween 20 à pH 7,4.
  3. Préparer une solution stock de bloc de construction 1 (BB1) lactose et le renforcement bloc 2 (BB2) sulfaté lactose (Figure 1) à 0,2 mM dans du PBS-G.
  4. Préparer 1 ml de solutions de protéines dans HEPES: Une lectine rachis hypogaea (AHL) à 500 nm, la myoglobine à 1 uM, et lysozyme à 500 nM.
  5. Préparer 20 ml de SDS à 1% dans de l'eau ultrapure.

2 Préparation de la matrice CoCRR

  1. Nettoyer la surface d'or du prisme 48 heures avant de l'utiliser avec un nettoyeur à plasma pendant 3 min dans ces conditions: 75% d'oxygène, 25% d'argon, 0,6 mbar, puissance 40 W.
  2. Préparer solutio pur et mixte onzens de BB1 ​​et BB2 avec [BB1] / ([BB1] + [BB2]) rapports entre 0 et 100% par incréments de 10% à une concentration BB total de 0,1 mM dans du PBS-G.
  3. Dépôt 8 gouttelettes nl de ces solutions pures et mixtes sur la surface du prisme à l'aide d'un observateur sans contact en quatre pour chaque rapport avec 44 points au total (figure 2).
    NOTE: 10% de glycerol ajoutée dans du PBS-G est très important pour réduire l'évaporation du solvant et le changement de concentration BB après le dépôt.
  4. Placer le prisme à l'intérieur d'une boîte de Pétri contenant 1 ml d'eau ultra-pure et laisser O / N à la température ambiante pour l'auto-assemblage de BB1 ​​BB2 et sur la surface d'or. Ici, on suppose que la composition de surface moyenne dans le SAM mixte reflète la composition de la solution mixte de dépôt (figure 3) 11.
  5. Laver soigneusement le prisme avec de l'eau ultra pure et puis on sèche sous un flux d'argon.

3 protéines de détection par SPRi

  1. Réglez le incubator dans laquelle l'appareil est placé SPRi à 25 ° C afin d'éviter les changements d'indice de réfraction induits par la variation de température au cours de la détection de protéines.
  2. Insérer un prisme non fonctionnalisé rinçage dans le 10 ul éther cétone de polyéther (PEEK) cellule connectée à une pompe à seringue commandé par ordinateur, un dégazeur et une soupape d'injection de fluide sous pression 6 ports écoulement (figure 4). Remplir dans le système d'écoulement avec fraîchement filtré et dégazé course de tampon HEPES.
  3. Retirer le prisme de rinçage et insérer le prisme contenant le réseau CoCRR dans la cellule d'écoulement. Exécuter HEPES à un débit de 100 ul / min. Avec l'aide de la caméra CCD éliminer les bulles d'air présentes sur la surface du prisme en passant rapidement tampon de migration.
  4. Définir la zone d'étude pour chaque tache en dessinant un cercle de même diamètre pour la zone d'intérêt basé sur une image bien contrastée de la gamme et avec l'aide d'un logiciel intégré dans le système SPRi.
  5. Tracer des courbes de plasmon, qui représentent le refletLes courbes de ivité en fonction de l'angle d'incidence pour tous les spots.
  6. Choisir l'angle (position à laquelle les courbes cinétiques seront enregistrées) de travail au plus haut de la pente des courbes de réflectivité. Tourner le miroir de balayage pour fixer l'angle de travail choisi pour les mesures cinétiques.
  7. Continuez à faire fonctionner HEPES à travers le système d'écoulement jusqu'à ce que le signal de réflectivité pour toutes les taches est stable et constant.
  8. Injecter 1 ml de solution de LAH avec une seringue dans la boucle d'échantillon (500 ul) à la vanne d'injection en position "charge". Ensuite, mettre la soupape d'injection en position "injection". Le débit utilisé pour toutes les injections de la protéine était de 100 pl / min.
  9. Lancer des mesures cinétiques en surveillant les variations de la réflectivité en fonction du temps à la fois sur tous les points.
  10. A la fin de l'injection de la protéine, rincer la matrice avec un tampon en cours d'exécution pendant 8 min. Enfin, injecter 1 ml 1% de SDS pour le régénérer.
  11. Répétez la même procédure pour l'autre proteins.

4 Traitement et analyse des données

  1. Suite à l'entrée de la solution de protéine dans la cellule d'écoulement, moléculaire liaison se produit et induit un décalage des courbes de plasmon et une variation de la réflectivité. Le logiciel d'acquisition d'image convertit les valeurs d'intensité lumineuse mesurées à des niveaux d'échelle de gris, ce qui donne des images SPR Figure 5A, et génère la variation de la réflectivité en fonction du temps, ce qui donne sensorgrammes (Figure 5B).
  2. Utilisation d'un logiciel mathématique de calcul pour tracer la réflectivité (R%) à la fin de chaque injection de la protéine par rapport à la [BB1] / ([BB1] + [BB2]) rapport pour générer 2D profil d'évolution continue (PEC) pour chaque échantillon (Figure 5C).
  3. Ajouter le [BB1] / ([BB1] + [BB2]) dans le rapport sensorgrammes (figure 5B) pour générer paysage 3D continu de l'évolution (CEL) pour chaque protéine (figure 5D).

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Representative Results

Pour sonder la capacité de la languette électronique pour l'analyse des protéines commun, trois protéines ont été utilisées: AHL, la myoglobine et le lysozyme. Pour chaque protéine, un profil 2D distinct continu de l'évolution de la CEP, a été générée par l'ET, comme le montre la figure 6.

En outre, grâce à SPRi, qui est capable de surveiller les adsorption et de désorption cinétique en temps réel, pour chaque protéine un temps de modèle de reconnaissance continue dépendant, appelés paysage évolution continue 3D (CEL), a été généré. Sur la figure 7, CEL caractéristiques de ces trois protéines sont présentés.

Figure 1
Figure 1: structures chimiques des deux blocs de construction utilisés dans ce protocole pour préparer le tableau CoCRR.51901 / 51901fig1highres.jpg "target =" _blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2: Photo d'un prisme après avoir déposé les 44 gouttelettes de solutions pures et mixtes de BB1 BB2 et l'utilisation d'un observateur non-piézo-électrique de contact avec chaque rapport en quatre exemplaires. Le prisme est placé à côté d'un tube Eppendorf de 1,5 ml.

Figure 3
Figure 3 Représentation schématique de la matrice contenant 11 CoCRR récepteurs différentiels qui ont été préparés avec des solutions pures et mixtes de BB1 BB2 et à différents rapports et les mélanges permettant à l'auto-assemblage sur la sur-orface du prisme.

Figure 4
Figure 4 représentation schématique du système de détection SPRi combiné avec un système microfluidique.

Figure 5
Figure 5 Représentation schématique du traitement de données pour la production de deux types de modèle de reconnaissance continue avec la langue électronique développée: 2D profil continu d'évolution et 3D évolution continue du paysage.

Figure 6
Figure 6 Continuous les profils d'évolution de trois protéines pures:. LAH (500 nM), myoglobine (1 uM) et du lysozyme (500 nM) Ils ont été générées en traçant la variation de la réflectivité (R%) à la fin de l'injection de la protéine par rapport à la [BB1 ] / ([BB1] + [BB2]) rapport.

Figure 7
Figure 7 Paysage de goût: AEC 3D caractéristiques de AHL, la myoglobine et le lysozyme générée par la langue électronique.

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Discussion

Les étapes les plus critiques pour la construction de cette eT sont dédiés à assurer une bonne reproductibilité du système. Par exemple, le nettoyage de la surface d'or du prisme avec une procédure normalisée avant utilisation, en ajoutant 10% de glycerol dans les onze solutions pures et mixtes de BB1 ​​et BB2 pour éliminer l'évaporation du solvant pendant BB auto-assemblage sur la surface d'or du prisme, dépôt de plusieurs répétitions pour chaque [BB1] / ([BB1] + [BB2]) Ratio, etc. Comme pour la détection de protéines par SPRi, le choix de l'angle de travail est critique. Habituellement, il est fixé à la plus haute de la pente des courbes de réflectivité. En outre, il est très important d'utiliser des conditions expérimentales standard pour chaque détection de la protéine, comme la température de travail, le débit, etc. Après chaque injection de la protéine, la matrice de CoCRR doit être régénéré pour réutilisation avec une solution appropriée qui permet une régénération complète du système sans aucun dommage pour les récepteurs.

e_content "> Pour démontrer que la eT développé n'est pas seulement efficace pour l'étude des protéines de liaison de sucre comme précédemment rapportés 9, mais aussi pour les protéines communes, un AHL lectine avec deux protéines non-sucre-contraignant la myoglobine et le lysozyme ont été utilisés. Ils ont été choisis pour avoir une variété de charges dans HEPES (pH 7,4):. AHL (point isoélectrique (pI) 6,0), myoglobine (7,2 pi) et le lysozyme (pi 11) En particulier, comme le montre la figure 6, chaque protéine possède un unique, modèle de réponse. AHL est légèrement chargé négativement dans HEPES. Sa CEP montre qu'il a une plus forte interaction avec les CoCRRs de BB2 riche chargés négativement. Très probablement, elle est due à l'interaction entre le domaine chargé positivement de la protéine et CoCRRs BB2-riches . Pour la myoglobine, qui est globalement neutre en HEPES, il n'y a pas beaucoup de différence entre les signaux obtenus avec tous les CoCRRs. Lorsque l'on compare la myoglobine dans les CEP CEP de AHL et le lysozyme, même à une concentration plus élevée du signal est beaucoup plus lower. Comme pour le lysozyme, qui est chargé positivement dans HEPES, le signal maximal est obtenu avec la CoCRR contenant BB2 pur.

Merci aux avantages de SPRi capables de suivre les cinétiques d'adsorption et de désorption, en temps réel, pour chaque protéine une évolution continue paysage 3D a été généré. Ce genre de modèle de reconnaissance en fonction du temps affiche les paramètres de différenciation supplémentaires pour l'analyse des protéines. En particulier, il pourrait être très utile pour l'analyse de deux analytes présentant l'affinité similaire pour un ensemble de CoCRRs mais qui diffèrent par leur cinétique d'interaction. Comme le montre la Figure 7, les AEC sont faciles à distinguer. Ces résultats montrent que l'interaction des protéines avec les trois CoCRRs dépend de leurs caractéristiques de surface telles que la distribution des résidus d'acides aminés hydrophobes, neutres et chargées. Le CPE et CEL peuvent être utilisés comme des «empreintes» pour la discrimination des protéines et prospecidentification tive. Ainsi, l'ET est efficace pour l'analyse des protéines communes.

Le protocole décrit ci-après utilise une approche combinatoire pour construire l'ET pour l'analyse des protéines. Contrairement à d'autres approches qui utilisent un certain nombre de molécules qui sont structurellement complexe et laborieux synthétiser, seulement deux petites molécules ont été utilisées pour préparer le réseau de récepteurs à réaction croisée capables de se différencier des protéines avec une bonne résolution dans cette étude. En outre, selon l'enquête précédente, l'ET est stable, reproductible et réutilisable 9. En outre, SPRi permet le suivi des événements de liaison en temps réel et de générer de nouveaux modèles de reconnaissance en continu avec une fiabilité sans précédent. Dans un futur proche, BB supplémentaires ayant des propriétés physico-chimiques complémentaires seront introduits pour augmenter la diversité de la CoCRR dans les tableaux pour l'analyse de mélanges complexes dans le gaz liquide ou en.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
SPRi apparatus  Horiba Scientific-GenOptics SPRi apparatus is placed in a temperature regulated incubator at 25 °C.
Incubator Memmert
Syringe pump  Cavro scientific instruments Cavro XLP 6000
Micro Elite Degasser  Alltech AT590507
6-port medium pressure injection valve Upchurch Scientific The volume of injection loop used is 500 µl.
Femto plasma cleaner (version 7) Diener Electronic On-line degassing system with 2 channel.
Spotter Siliflow It is a non-contact piezoelectric spotter.
SPRi-Biochip Horiba Scientific-GenOptics 36000067 The prism is made of a high refractive index glass prism coated with a thin gold film (45 nm) and specially developed for imaging purposes.
Erythrina cristagalli lectin  Sigma-Aldrich L5390
Arachis hypogaea lectin  Sigma-Aldrich L0881
Myoglobin Sigma-Aldrich M1882
Lysozyme Sigma-Aldrich L6876
CXCL12α Provided by Dr. Hugues Lortat-Jacob; for preparation details, see supporting information in reference 9
CXCL12γ  Provided by Dr. Hugues Lortat-Jacob; for preparation details, see supporting information in reference 9
Lactose Provided by Prof. David Bonnaffé; for preparation details, see supporting information in reference 9
Sulfated lactose Provided by Prof. David Bonnaffé; for preparation details, see supporting information in reference 9
Glycerol Sigma-Aldrich G5150
SDS Sigma-Aldrich L4509
Tween 20 Sigma-Aldrich 274348
HEPES Sigma-Aldrich H3375
Sodium phosphate monobasic Sigma-Aldrich S0751
Sodium chloride Sigma-Aldrich S3014

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References

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