Метод микроинъекции

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Методы, которые производят morphant эмбрионов необходимы для изучения механизмов развития и генных регуляторных сетей. Морская звезда Patiria miniata является новым модельной системой для этих исследований. Здесь мы приводим протокол для получения гаметы, производство культур эмбрионов, и быстрое микроинъекции зигот от этого вида.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Cheatle Jarvela, A. M., Hinman, V. A Method for Microinjection of Patiria minata Zygotes. J. Vis. Exp. (91), e51913, doi:10.3791/51913 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Иглокожие уже давно любимая модель системы для исследований воспроизводства и развития, а в последнее время для изучения регуляции генов и эволюции процессов развития. Морская звезда, Patiria miniata, набирает распространенность в качестве модельной системы для этих типов исследований, которые ранее выполнялись почти исключительно в морских ежей, Strongylocentrotus purpuratus и Lytechinus variegatus. Преимущество этих модельных систем является простота получения модифицированных эмбрионов, в которых определенный ген вверх или подавляется, назвав группу клеток, или введения гена-репортера. Один метод микроинъекции способен создавать большое разнообразие таких модифицированных эмбрионов. Здесь мы представляем метод для получения гаметы из P. miniata, производя зиготы, и введения возмущающие реагентов через микроинъекции. Здоровые morphant эмбрионы затем выделяют для количественных и качественных исследований общеФункция пе. Получение геномных и транскриптом данных для этого организма возросла типы исследований, которые выполняются и легкости их выполнения.

Introduction

Морская звезда, Patiria miniata, (широко известный как летучая мышь звезды) становится как интересный и универсальный модельной системы для различных сотовой 1- 3, развития 4,5, эволюционной 6 8 и экологических исследований 9- 11. Взрослый П. miniata распределены вдоль тихоокеанского побережья от Ситка, штат Аляска в Baja, Калифорния 12 и легко поддерживается в морских аквариумах. Яйцеклетки могут быть получены круглый год и каждая самка может пролить десятки тысяч яиц. Яйцеклетки легко созрел и оплодотворенная внешне 13. Полученные эмбрионы являются прозрачными позволяет легко наблюдения; они развиваются синхронно, и требуют только морскую воду для развития. Всего в сборе генома и несколько transcriptomes также доступны для P. miniata ( Echinobase.org ). Такие преимущества делают их идеальными для диапазона исследованийи учебных целей.

В последние годы П. miniata стала модель системы для генной развития регулирующей сети анализирует 14-16. Цель таких исследований является выявление весь комплимент регуляторных генов и определения сети их взаимодействий. Большая часть этой работы влечет за собой возмущающее экспрессию генов путем внедрения антисмысловых олигонуклеотидов или в пробирке синтезированы мРНК. Кроме того, цис нормативные анализы используются для характеристики функции регулирующего ДНК 15. Эти анализы требуют введение возмущения реагентов и / или репортер конструкции ДНК в эмбрионы. Кроме того, для характеристики вниз по течению этих возмущений, необходимо анализе много эмбрионов изменения в экспрессии генов потенциальных мишеней. Методы микроинъекции многих сотен зиготы являются центральными для этой работы.

Иглокожие, в том числе P. miniata заново через микроинъекции. Микроинъекция предлагает возможность изменять эмбрионов с реагентами, которые не проникающий в клетку. Следующий протокол описывает способ для введения ДНК, мРНК, сотовые индикаторов и морфолино антисмысловых олигонуклеотидов в сотни оплодотворенных яиц в одной 2-3 ч сидит через микроинъекции. Это дает достаточно материала для различных последующих экспериментах в том числе, но не ограничиваясь этим, количественной ПЦР, гибридизация, РНК-Seq, и вестерн-блоттинга.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Храните все с морской водой или искусственный морской воды (SW), взрослых животных, и культуры при 15 ° С, насколько это практично. Обеспечить яйца и зиготы которые погружают в SW.

Коммерчески подготовленные морские соли восстановленные дистиллированной или обратного осмоса вода служит также источником SW. Проверьте соленость, используя ареометр и настроить соли или воды для достижения оптимальных уровней. Держите определенные уровни гравитации между 1,020 до 1,025. Храните все изделия из стекла и Пластик отдельно от всех других лабораторного оборудования, чтобы избежать любого загрязнения химическими веществами. Чистый эмбриона класса лабораторное промывкой деионизированной водой или случайного замачивания в разбавленной гипохлорита натрия с последующей промывкой несколько раз в воде.

1 Получение и созревания Половые клетки от Patiria miniata взрослых

  1. Выберите животное акцизным половые железы. Определите секс после удаления, глядя на наличие яичников или яичек, потому что P. miniata не себеxually диморфизм.
  2. Вырезать небольшое отверстие, размером не более 1 см, вдоль стороне морской звезды руку с лезвием скальпеля (Рисунок 1А). Использование малых затупляли щипцы отступить края разреза для доступа к гонад ткани и потяните гонад ткани через разрез.
    Примечание: Избегайте вытягивания ткани кишечника, которая является свободным серый или коричневый ткани (Фигура 1В). Яичники, как правило, оранжевый, желтый, или светло-коричневый (Рисунок 1C), в то время как яички белые или бежевые и когда нарушается вызовет морскую воду, чтобы стать молочно или облачно с виду (Рисунок 1D).
  3. Вернуться самок к аквариумах. Изолировать самцов в течение часа или два в емкость с SW с напряжением от обработки может вызвать нерест. Животные исцелить вдоль разреза и впредь оказывать гаметы в течение нескольких месяцев.
  4. Собирают семенники в 1,5 мл пробирку Эппендорфа с минимальным SW, насколько это возможно, и не хранить на льду до использования. Храните все яички не будемред в день сбора при 4 ° С на срок до недели.
  5. Соберите яичники в маленьком стакане блюдо культуры через несколько миллилитров SW. Чтобы освободить ооциты из яичников ткани, дразнить друг от друга ткани с двумя парами щипцов до никаких больших листа не остались.
    Примечание: Оптимально, большинство ооцитов полностью развит. Такие ооциты большие, круглые, и прозрачный желтый или светло-коричневый с отчетливым зародышевого пузырька в ооцитов (фиг.2А), по сравнению с подмножеством неразвитые ооцитов, которые меньше, коричневый, зернистым, и непрозрачные (фиг.2В). Если больше, чем около 25% ооцитов имеют неразвитого разнообразия, выберите другую самку, чтобы получить ооциты.
  6. Налейте ооциты и оставшиеся ткани через чашку фильтра сетка с размером пор 200 мкм и собирать течь через. Это будет содержать все разновидности ооцитов, но удалить ткани яичника. Выбить оставшиеся ооцитов из ткани улавливаются фильтром путем распыления жIth SW из бутылки шприц. Фильтр чашки выполнены с использованием 50 мл коническую трубку (3А-A ').
  7. Налейте поток через 1,6 с шага через сетчатый фильтр чашки 100 мкм. Откажитесь небольшие ооцитов в проточной. Большие полностью разработанные ооциты, которые готовы к созревания останется на фильтре. Промыть ооциты в чистую 200 мл химический стакан.
  8. Добавить 95 мл SW в стеклянный стакан 200 мл ооцитов. Добавляют 5 мл 200 мкМ 1-метиладенина для конечной концентрации 10 мкМ.
  9. Перенесите ооциты в большой мелкой тарелки культуры и месте при температуре 15 ° C. Высокой площади поверхности к объему чашки для культивирования позволяет кислородного обмена. Яйцеклетки не созревают или не может хорошо развиваться, если они переполнены в течение этого созревания фазы. Разделить на несколько блюд SW плюс 10 мкМ 1-methlyadenine пока культура не меньше 200 ооциты / мл.
  10. Разрешить ооциты, чтобы созреть для 45-90 мин, но не более, так как это будет оказывать ооциты не в состоянии быть еertilized. Чтобы определить, созревание завершено, посмотрите на ооцитов под рассекает сферу. Зародышевого пузырька движется к и сливается с клеточной мембраной во время созревания. Затем он ломается, и поэтому больше не видны в зрелых ооцитов (Рисунок 2C).

2 Оплодотворение зрелых ооцитов

  1. Выбрал небольшую группу ткани яичка, примерно с горошину, и фарш в небольшом стекло блюдо культуры с примерно 1 мл SW.
  2. С помощью пипетки Пастера перенести 2-3 капли полученного молочного морской воды примерно до 100 мл зрелых ооцитов и вихревой культуры блюдо перемешать. Избегайте передачи части ткани яичка. Избегайте добавления большего количества спермы, так как это может привести к полиспермии и последующего плохого развития.
  3. Через несколько минут наблюдать ооциты с помощью препаровальной лупы. Оплодотворенные яйца, или зиготы, есть оплодотворения конверт, который является прозрачным плафоном, который поднимается от КВЖДл мембрана (Рисунок 2D).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не приступайте к культуре, если меньше около 90% яиц оплодотворить поскольку бедные частота оплодотворения являются показателем нездоровой культуры, которые также могут не развиваться хорошо.
  4. После оплодотворения завершена, изменить SW на зиготы путем заливки через сетчатый фильтр 100 мкм и промывки в культуральной чашке со свежим SW. Важно, чтобы удалить лишнюю сперму, чтобы предотвратить кислородное голодание. Место культуры блюдо в 15 ° С в течение 15-30 мин.

3 Де-jellying и гребли оплодотворенных яйцеклеток

  1. Подготовка инъекций блюда, принимая крышку от 60 х 15 мм чашки Петри из полистирола.
    1. Нарисуйте постоянную линию маркером пера на задней панели блюдо, вокруг области, которая соответствует поле зрения на микроинъекции микроскопом. Это гарантирует, что все эмбрионы гребли в поле зрения микроскопа.
    2. Используйте стекло пипетки Пастера забить линию через круг, рreferably в стороне от круга (фиг.3В). Используйте эту линию позже сломать инъекционных игл (шаг 4,5).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Реагенты обычно используется придерживаться эмбрионов ежа на море, например, протамин сульфат или поли-L лизин, являются необходимыми. Де-холодец П. miniata зиготы придерживаться очень хорошо, чтобы без покрытия пластика. Обратите внимание, что они не прилипают и к стеклянной посуды.
  2. Добавить приблизительно 10 мл SW в каждую чашку таким образом, что поверхность покрыта, но вода не будет чрезмерно всплеск в чашке, так как это может возмущать гребли эмбрионов.
  3. Снимите P. miniata зигота желе пальто с кислотой SW до гребле. Это желе пальто является более обширным, чем это наблюдается для модели морских видов ежей.
    1. Подготовьте кислоты SW в диапазоне рН 4,0-4,2. РН имеет решающее значение для обеспечения эффективного удаления студенистой оболочки, разрешая нормальное развитие.
    2. Однодневное капель 1 N (1 М) HCl в юго-запада на 1 л запаса SW. Разрешить каждая капля смешивать полностьюи контролировать рН перед добавлением больше HCl.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Один в нескольких мл результатов HCl в соответствующем рН, но не добавляйте весь объем сразу.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовка 1 N HCl в вытяжной шкаф с ПО и 12 N (12 М) HCl.
    3. Удалить SW на зигот при заливке их на сетчатый фильтр 100 мкм. Промыть в мл химический стакан в наименьшее количество возможных SW (примерно 10 мл) 200. Заполните мензурку до 150 мл с кислой SW (рН 4,0) и позволяют зиготы сидеть в кислой SW в течение 3 мин.
  4. Полоса желе слой от зиготы путем заливки их назад и вперед между двумя 200 мл стаканы, каждый раз, проходя зиготы через сетчатый фильтр 200 мкм. Вылейте зиготы через фильтр вокруг 5-10 раз над о временном окне 2 мин.
  5. Удалить кислоты SW путем заливки зигот на сетчатый фильтр 100 мкм. Промыть зиготы в небольшой стеклянной блюдо культуры с SW. Де-заливные зиготы может прилипнуть к пластиковой посуды. Эмбрионы строка, расположенная непосредственно; они начинают производить больше JЭлли пальто, которое приводит к плохой адгезии к пластиковой посуды в течение долгого времени.
  6. Используйте рот пипеткой (3С-С '), чтобы забрать зиготы из культуральной блюдо стекла и поместить их в прямых на инжекторных блюд. Расплава в центр тонкой стороне пипетки Пастера над пламенем, пока стекло не является мягким. Быстро потяните за концы стекло на части, чтобы произвести очень тонкую участок стекла. Как только стекло прохладно, разорвать маленький конец пипетки Пастера (для получения дополнительной информации по подготовке рот пипеткой см Вессель и др. 2004 17 или Сладкий и др. 2004 18).
    1. Сделать гребной пипетки так, что диаметр просто больше, чем диаметр эмбрионов, так что только один зиготы будет входить и выходить из пипетки в то время. Это позволит однорядные с образованием. Пипетки меньшего диаметра могут лишить оплодотворения конверт и сорвать зиготы как P. miniata зиготы не имеют гиалиновых мембран Aй довольно мягкая.
    2. Если зиготы не прилипают к пластиковой блюдо, сохранить их для дополнительного времени в кислой SW (до более нескольких минут). В качестве альтернативы меньше диаметра пипетки может помочь в удалении желе слой, чтобы позволить зиготы, чтобы более эффективно придерживаться.
    3. В зиготы слегка положительную плавучесть, и, как правило, плавать или зависать чуть выше дна тарелки. В этом случае, установите гребной пипетку так, чтобы зиготы мягко прижимается к поверхности чашки, как они выходят из пипетки (Рисунок 3D).
      ПРИМЕЧАНИЕ:. Допускается, чтобы соответствовать много строк на этих блюд П. miniata эмбриональные мембраны не станет более трудно проникнуть в течение долгого времени и, следовательно, можно вводить сотни зигот на одной тарелке.

4 Инъекция зиготы

  1. Подготовьте инъекционные растворы с соответствующими концентрациями морфолино антисмысловых олигонуклеотидов (мазо), мРНК, или ДНК в конечном концentration 200 мМ KCl. 400-800 мкМ MASO и 2,5 нг / мкл ДНК имеют тенденцию производить morphant фенотипы при минимизации токсичности. Конечная концентрация в яйце будет 1/125-й начальной концентрации 14. Для инъекционных растворов, содержащих Masos, тепла до 65 ° С в течение 5 мин, непосредственно перед использованием, а затем хранить при комнатной температуре.
    1. Для простоты сортировки инъекционные эмбрионов, добавить родамин декстран Tracer в инъекционного раствора, чтобы получить концентрацию 0,1%.
  2. Подготовка инъекционных игл, потянув стеклянной капиллярной трубки (1,0 мм OD х 0,75 мм ID, 100 мм длина) в игле потянув инструмент в соответствии с инструкциями изготовителя. Иглы, пригодные для инъекций в морских ежей также хорошо работать для морских звезд, так что используйте аналогичные показатели 19.
  3. Загрузите около 2 мкл раствора для инъекций в инъекционной иглой с использованием чаевые microloader пипетки.
  4. Вставьте тупой конец иглы в мanipulator. Установите picospritzer до 100 мс импульса и давление воздуха 40 PSI.
  5. Поставьте блюдо Погреб эмбрионов на столике микроскопа и получить эмбрионы в поле зрения. Ориентировать антенну таким образом, что набрал линии на стороне, ближайшей к игле. Поместите иглу при приблизительно 60 ° углом, таким образом наконечник находится вблизи середины линии, и как раз над поверхностью воды.
  6. Сосредоточьтесь на отмеченной линии и опустить иглу пока наконечник находится в фокусе. Опустите кончик немного больше и разорвать его открытым, запустив его нежно в хребтах надреза. Поднимите носок от поверхности чашки и расположить его в верхней части первой строке зиготы и сосредоточиться на зиготы.
  7. Опустите кончик таким образом, что это будет пронзить центр зиготы, поступающие из вокруг углом 60 °. Игла легко проникает P. miniata зиготы. Шаг на педаль (или других средств вынуждает материал из инъекционной иглы) ввести болюс Injeводств решение в эмбрион.
  8. Стремитесь к болюса, что на 20-30% диаметр эмбриона, или между 25 и 80 пл. Если болюс больше или меньше, чем это, настроить длительность впрыска на picospritzer и ввести следующий эмбрион. Продолжайте регулировать продолжительность, чтобы получить нужный размер болюса. Начало в 100 мсек. Re-сломать иглу, если больше, чем около 200 мс необходимо ввести соответствующий болюс. Выбросьте иглу и подготовить новый, если менее 15-20 мсек требуется получить этот размер болюса как размер иглы слишком велик и может нарушить нормальное развитие.
  9. Продолжать вводить оставшиеся зиготы впрыска блюдо. Эмбрионы легко не может быть введен, пока не начнется расщепления и в отдельных бластомеров после первого деления дробления. Периодически поднимать иглу над поверхностью воды, чтобы удалить зиготы, которые торчат на иглу. При необходимости повторно сломать кончик иглы или загрузить новую иглу, если блокировка происходит.

  1. Разрешить эмбрионы развивать при 15 ° С в SW. Поддержание высокой площади поверхности к объему в культурах, чтобы обеспечить обмен кислорода. Убедитесь, эмбрионы не переполнены; держать культур на уровне или ниже 200 эмбрионов / мл. В зависимости от желаемой стадии эмбриона, планируют собрать инъекционные эмбрионов в пределах 20-24 ч после оплодотворения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это часто идеальное время для сортировки и сбора и потому обычно развивающиеся эмбрионы легко отличить морфологически, но еще не плавание.
  2. Если эмбрионы вылупились, мягко соль шок для предотвращения плавание. Добавить 200 мкл 5 М NaCl в 10 мл SW в инъекции блюдо, осторожно вращая SW. Через несколько минут, эмбрионы упадет на дно тарелки. Соберите их и переместить их в нормальном солености SW.
  3. Сбор инъекционные эмбрионов в рамках соответствующего флуоресцентного источника света, совместимом с индикатора, используемого в injectiна решения. Если не использовали трассирующими, вроде эмбрионы, чтобы выбрать для нормальной морфологией.
  4. Использование рот пипеткой, рисовать флуоресцирующих эмбрионов с минимальным количеством SW и удар их в небольшую чашку для культивирования, наполненной SW. Идеальное пипетки рот есть достаточно большое отверстие для эмбрионов потянуться в и не повреждая их, но не настолько большой, что нежелательные эмбрионы и посторонний SW также подъехал.
  5. После того, как все желаемые эмбрионов были собраны в новую посуду, соблюдать эмбрионов под флуоресцентным светом и удалить все ип впрыском эмбрионов или плохо разработанных эмбрионов.
  6. Культура сортируются эмбрионов в желаемых этапов в инкубаторе и заполните изображений или других желаемых протоколов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Целью этого протокола является введение реагентов в эмбрионы. Показана эффективность протокола путем введения ДНК репортерной конструкцией, что запускает экспрессию зеленого флуоресцентного белка (GFP). Введенный эмбрионы выразить GFP в клоновых патчей (Рисунок 4A-B), как включает ДНК в начале расщепления. Многие реагенты, желательно ввести в эмбрионы являются токсичными в больших количествах и в неоптимальных партий эмбрионов. Токсичность проявляется, задерживая развитие, арестовав развитие в начале расщепления или в оплодотворенной стадии яйца, или путем наложения аберрантное развития (5А-С).

Рисунок 1
Рисунок 1 Получение гаметы из P. miniata взрослых. A) Чтобы вырезать гонады сделать надрез на стороне кронштейна проксимальныхк середине животного. б) темно-коричневого материала тянут из этого разреза ткани внутренностей. Избегайте потянув ткани кишечника, как это будет травмировать животных. С) Яичник ткани, как правило, оранжевого цвета, как показано здесь, но также может быть желтый или светло-коричневый. D) Семенники белые или бежевого цвета, как показано. Все масштабные линейки обозначают 1 см.

Рисунок 2
Рисунок 2 созревания и оплодотворения ооцитов. A) Здоровые ооциты, которые готовы к созревания большие и ясно с видимым зародышевого пузырька. B) ооцитов, которые не готовы для созревания которые меньше, коричневый, и зернистым на вид. C) яйцеклетки, которая была созрел с 1-метиладенина . Зародышевого пузырька сломался. D) зиготы, окруженный FERTilization конверт. д) не культур с большими ооцитов, которые не могут быть созревших ооцитов, потому что эти не будут удалены путем фильтрации. Такие ооциты немного меньше, чем в А. и темнее коричневого и зернистым текстурированные. Бар шкала в Л означает 50 мкм и представляет собой шкалу для изображений AE.

Рисунок 3
Рисунок 3. Аппараты для сборки. АА ') сетчатый фильтр крепится к 50 мл коническую трубку. Коническая-конец трубки и в середине крышки вырезаны, чтобы позволить культуры, чтобы вылить через трубку и фильтр. Б) инжекции блюдо, построенной по стороне крышки 60 х 15 мм чашки для культивирования полистирола. Окружность, проведенная вокруг центра очерчивает поле зрения впрыска микроскопом и служит в качестве руководства для эмбрионов гребных. Линия забил Intо блюдо полезно для взлома инъекционных игл. CC ') рот пипеткой настройки. Установите мундштук в одном конце несколько футов длиной резиновой трубки. Установите другой конец к пипетки Пастера, который был сформирован кратко плавления и потянув узкий конец стекла. D) Схема демонстрируя идеальную гребной Пастера форму пипетки и ширину по продвижению придерживаться, не повреждая эмбрионов. При нарушении конец прочь тушеной пипетки, это полезно, если конец сужается для предотвращения возникающих зиготы от плавающей от тарелки. Все масштабные линейки обозначения 3 см.

Рисунок 4
Рисунок 4 Реагенты успешно внедрена на микроинъекции. А) DIC из стадии бластулы эмбрион вводят с помощью GFP репортера плазмиды. Эмбрион имеет нормальную морфологию. B) GFP Expreделения в зародыше, показанном на А. С) DIC изображение двух морфологически нормальных эмбрионов на стадии бластулы. D) одного эмбриона от C испускает красную флуоресценцию от внедрения Texas Red декстрана. Другой эмбрион ООН впрыском и не обнаруживает флуоресценцию. Масштабные полосы обозначают 50 мкм. Бар Шкала в А обозначает масштаб для бара шкале и Б. в C представляет собой шкалу для C и D.

Рисунок 5
Рисунок 5 Overinjection и реагент результат токсичность в арестовано или аномальным развитием. Все изображения являются эмбрионов 24 часа после инъекции из той же партии инъекции. AA ') Ан overinjected зиготы арестованного на стадии одной клетки. BB') эмбрион арестован в начале расщепления. Здоровый эмбрион будет делить симметрично, в то время как этот эмбрион арестованв связи с аномальными клеточных делений. CC ') эмбриона с дико аномальным развитием в связи с токсичностью. В то время как этот эмбрион формируется примерно как бластулы эмбриона (D), это асимметричный и аномально утолщенной. DD ') правильно развивающихся вводят бластулы стадии эмбриона. Бар масштаба в обозначает 50 мкм и представляет собой шкалу для всех панелей.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Есть два важных шагов, которые трудно для начинающих пользователей этой техники, но имеют важное значение для успешного создания morphant эмбрионов. Первый заключается в выборе здорового ооцитов, что созреет и оплодотворяют правильно. Процент нормального развития в культуре, в зависимости от сезона, здоровье животного, и количество раз, что ооциты были собраны от одного индивидуума. Яйцеклетки, как правило, более высокого качества с апреля по октябрь. Важно внимательно смотреть на ооцитов, прежде чем приступить к тому, чтобы большинство, как на рисунке 2А, а не рисунке 2B. Это допустимо, чтобы иметь небольшое количество ооцитов, которые не зрелый, особенно, если они достаточно малы, чтобы отфильтровать как ооциты обрабатываются. Иногда, ооциты, которые неразвитой почти столь же большим как полностью развитых яйцеклеток, готовых к созреванию. Они различимы по зернистой, коричневый Colorinг (Рисунок 2E). Не используйте партии ооцитов этого типа, потому что фильтрация не будет изолировать полностью разработанные ооцитов из неразвитых ооцитов и они часто приводят к аномальных культур эмбриональных, которые более склонны выставлять дефекты показано на рисунке 5.

Другой важный шаг является размер болюсное. Ввести количество возмущающего реагентом, который является достаточно большим, чтобы оказать воздействие, но не настолько велики, чтобы вызвать неспецифические эффекты. В первый раз возмущающее реагент используется, полезно выполнить титрование, в котором несколько концентрации реагента пытался. Выполните последующие микроинъекции с самой высокой концентрацией, который не вызывает аномалий развития, которые не связаны с ожидаемым фенотипа, или развития задержки (Рисунок 5А). Избегать инъекций болюса, которое больше, чем на 30% диаметр эмбриона, как это может нарушить нормальное развитие. Чрезмерно малые размеры болюсные, СОntrast, трудно визуально проверьте последовательной размеров, которые могут привести к чрезмерному диапазоне возмущений фенотипов всей повторах.

Возмущающих реагенты могут вызвать задержки в развитии или неспецифические фенотипы на эффективных диапазонах концентраций. Это очень важно, поэтому, чтобы придать управления одноуровневые с доброкачественной реагентом, таким как стандартный контроль мазо, стандартных конструкций ДНК, или родамин индикатора. Аналитические эмбрионы morphant только если эти элементы управления показывают нормальное развитие. Введенный эмбрионы, в том числе управления, иногда проявляют морщинистой фенотип бластулы но они будут часто проходить через остальной развития нормально. Кроме того, если тот или иной реагент последовательно вызывает задержки в развитии в результате morphant эмбрионов, сравнить эти эмбрионы контролировать эмбрионов чтобы определить, сколько часов задержки они испытывают.

Есть несколько признаков этого метода, которые могут ограничить свою полезность в сpecific экспериментальные сценарии. Одним из таких вопросов является то, что можно только представить реагентов при оплодотворенной яйцеклетки или ранних стадиях дробления. Это особенно проблематично, если ген или путь интерес особенно важно в начале развития и, как следствие эмбрионов morphant которые нежизнеспособны или слишком умственно ненормальным для содержательного исследования. Иногда этот вопрос решается путем введения меньше копий возмущающего реагента, в результате чего более мягким, неполной нокдаун. Если соответствующая ячейка проницаемый препарат для гена-мишени или пути существует, было бы полезно сравнить фенотип эмбрионов, которым инъецировали реагентов на стадии оплодотворенной яиц с эмбрионами, получавших препарат в более поздний, более соответствующей стадии. Потому что инъекция Masos или мРНК обеспечивает большую специфику, он более мощный, чтобы использовать этот метод в сочетании с изучения наркотиков лечения в отличие от отказа от микроинъекции в пользу медикаментозного лечения.

Наконец, хотя этого микроСпособ впрыска будет производить достаточное количество зародышей для широкого круга применений ниже по течению, это в лучшем случае получения нескольких сотен до тысяча здоровых, успешно инъекционные эмбрионов. Некоторые желаемые эксперименты могут потребовать значительно больше материала, чем это. Другие методы успешно используемые в системе ежа моря, может быть модифицирован, чтобы создать еще большее количество morphant морской звезды эмбрионов, таких как ретровирусы pantropic 20, хотя этот метод является новым и еще не получила широкое применение.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Нет конфликта интересов объявлены авторами.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана Национальным научным фондом IOS 0844948 и IOS 1024811

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-Methyladenine Acros Organics (Fisher Scientific) AC20131-1000
190 micron nitex nylon filter Small Parts (originally Sefar) CMN-0185-C/5PK-05
100 micron nitex nylon filter Small Parts (originally Sefar) CMN-0105-C/5PK-05
Polystyrene Petri dishes, 60 mm x 15 mm Fisher Scientific FB0875713A
Capillary tubing FHC, Inc 30-30-0 For pulling microinjection needles
Model P-97 Needle Puller Sutter Instruments P-97
Dextran, Rhodamine Green Life Technologies D7163 If injecting a GFP expression reporter, it is helpful to substitute Texas Red dextran as an injection tracer
Instant Ocean Sea Salt Doctors Foster and Smith CD-116528 Also available in many pet stores
Microloader tips Eppendorf 5242 956.003

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Terasaki, M. Quantification of fluorescence in thick specimens, with an application to cyclin B-GFP expression in starfish oocytes. Biol. Cell Auspices Eur. Cell Biol. Organ. 98, 245-252 (2006).
  2. Terasaki, M., Runft, L. Two-stage dependence for 1-methyladenine induced reinitiation of meiotic maturation in starfish oocytes. Exp. Cell Res. 316, 2654-2663 (2010).
  3. O'Neill, F. J., Gillett, J., Foltz, K. R. Distinct roles for multiple Src family kinases at fertilization. J. Cell Sci. 117, 6227-6238 (2004).
  4. McCauley, B. S., Akyar, E., Filliger, L., Hinman, V. F. Expression of wnt and frizzled genes during early sea star development. Gene Expr. Patterns GEP. 13, 437-444 (2013).
  5. Yankura, K. A., Koechlein, C. S., Cryan, A. F., Cheatle, A., Hinman, V. F. Gene regulatory network for neurogenesis in a sea star embryo connects broad neural specification and localized patterning. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110, 8591-8596 (2013).
  6. McCauley, B. S., Wright, E. P., Exner, C., Kitazawa, C., Hinman, V. F. Development of an embryonic skeletogenic mesenchyme lineage in a sea cucumber reveals the trajectory of change for the evolution of novel structures in echinoderms. EvoDevo. 3, 17 (2012).
  7. Annunziata, R., Martinez, P., Arnone, M. I. Intact cluster and chordate-like expression of ParaHox genes in a sea star. BMC Biol. 11, 68 (2013).
  8. Morino, Y., et al. Heterochronic activation of VEGF signaling and the evolution of the skeleton in echinoderm pluteus larvae. Evol. Dev. 14, 428-436 (2012).
  9. Hart, M. W. Structure and evolution of the sea star egg receptor for sperm bindin. Mol. Ecol. 22, 2143-2156 (2013).
  10. McGovern, T. M., Keever, C. C., Saski, C. A., Hart, M. W., Marko, P. B. Divergence genetics analysis reveals historical population genetic processes leading to contrasting phylogeographic patterns in co-distributed species. Mol. Ecol. 19, 5043-5060 (2010).
  11. Keever, C. C., et al. Discordant distribution of populations and genetic variation in a sea star with high dispersal potential. Evol. Int. J. Org. Evol. 63, 3214-3227 (2009).
  12. Lambert, P. Sea Stars of British Columbia, Southeast Alaska, and Puget Sound. UBC Press. (2000).
  13. Dorée, M., Guerrier, P., Leonard, N. J. Hormonal control of meiosis: specificity of the 1-methyladenine receptors in starfish oocytes. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 73, 1669-1673 (1976).
  14. Hinman, V. F., Nguyen, A. T., Cameron, R. A., Davidson, E. H. Developmental gene regulatory network architecture across 500 million years of echinoderm evolution. Proc. Natl. Acad. Sci. 100, 13356-13361 (2003).
  15. Hinman, V. F., Nguyen, A., Davidson, E. H. Caught in the evolutionary act: precise cis-regulatory basis of difference in the organization of gene networks of sea stars and sea urchins. Dev. Biol. 312, 584-595 (2007).
  16. McCauley, B. S., Weideman, E. P., Hinman, V. F. A conserved gene regulatory network subcircuit drives different developmental fates in the vegetal pole of highly divergent echinoderm embryos. Dev. Biol. 340, 200-208 (2010).
  17. Wessel, G. M., Voronina, E., Brooks, J. M. Obtaining and handling echinoderm oocytes. Methods Cell Biol. 74, 87-114 (2004).
  18. Sweet, H., et al. Blastomere isolation and transplantation. Methods Cell Biol. 74, 243-271 (2004).
  19. Cheers, M. S., Ettensohn, C. A. Rapid microinjection of fertilized eggs. Methods Cell Biol. 74, 287-310 (2004).
  20. Core, A. B., Reyna, A. E., Conaway, E. A., Bradham, C. A. Pantropic retroviruses as a transduction tool for sea urchin embryos. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, 5334-5339 (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics