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Summary

Enterobacter सपा. YSU ग्लूकोज न्यूनतम लवण माध्यम में होती है. Auxotrophs बेतरतीब ढंग से मेजबान जीनोम में ही सम्मिलित करता है जो एक transposome साथ यह बदलने से उत्पन्न कर रहे हैं. म्यूटेंट न्यूनतम मध्यम करने के लिए जटिल मध्यम से प्रतिकृति चढ़ाना से पाए जाते हैं. बाधित जीन जीन बचाव और अनुक्रमण द्वारा पहचाने जाते हैं.

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Caguiat, J. J. Generation of Enterobacter sp. YSU Auxotrophs Using Transposon Mutagenesis. J. Vis. Exp. (92), e51934, doi:10.3791/51934 (2014).

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Abstract

Prototrophic बैक्टीरिया एक कार्बन और ऊर्जा स्रोत के रूप में इस्तेमाल किया जाता है जो मध्यम ग्लूकोज (एम -9 मध्यम) के साथ पूरक एम -9 न्यूनतम लवण, पर बढ़ता है. Auxotrophs एक transposome का उपयोग कर उत्पन्न किया जा सकता है. इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल व्यावसायिक रूप से उपलब्ध, तमिलनाडु 5 व्युत्पन्न transposome transposase बाध्यकारी साइटों के रूप में सेवा है, जो एक R6K γ प्रतिकृति मूल, केनामाइसिन प्रतिरोध और दो ​​मोज़ेक अनुक्रम समाप्त होता है के लिए एक जीन युक्त डीएनए के एक रेखीय खंड के होते हैं. एक डीएनए / transposase प्रोटीन परिसर के रूप में प्रदान की transposome, prototrophic तनाव, Enterobacter सपा में electroporation द्वारा शुरू की है. YSU, और बेतरतीब ढंग से इस मेजबान के जीनोम में खुद को शामिल किया. Transformants केनामाइसिन, (लेग-कान) युक्त प्लेटों अगर Luria-Bertani पर चढ़ाया प्रतिकृति और केनामाइसिन (एम-9-कान) युक्त एम -9 मध्यम अगर प्लेटों पर हैं. एम-9-कान प्लेटों पर लेग-कान प्लेटों पर बढ़ने नहीं बल्कि कि transformants auxotrophs माना जाता है. शुद्ध जीनोमिकएक auxotroph से डीएनए आंशिक रूप से पचा एक पीर + Escherichia कोलाई (ई कोलाई) तनाव में ligated और तब्दील हो जाता है. R6Kγ प्रतिकृति मूल प्लाज्मिड पीर + में दोहराने के लिए अनुमति देता है कोलाई उपभेदों, और केनामाइसिन प्रतिरोध मार्कर प्लाज्मिड चयन के लिए अनुमति देता है. प्रत्येक transformant बाधित गुणसूत्र क्षेत्र से घिरे transposon युक्त एक नया प्लाज्मिड के पास. सेंगर अनुक्रमण और बेसिक स्थानीय संरेखण खोज उपकरण (ब्लास्ट) बाधित जीन की एक ख्यात पहचान सुझाव है. इस transposome उत्परिवर्तजनन रणनीति का उपयोग करने के लिए तीन फायदे हैं. सबसे पहले, यह मेजबान द्वारा एक transposase जीन की अभिव्यक्ति पर भरोसा नहीं करता. दूसरा, transposome electroporation द्वारा, बजाय विकार से या पारगमन से लक्ष्य मेजबान में पेश किया है और इसलिए अधिक कुशल है. तीसरा, R6Kγ प्रतिकृति मूल यह आसान उत्परिवर्तित जी की पहचान करने के लिए बनाता हैआंशिक रूप से एक पुनः संयोजक प्लाज्मिड में बरामद किया है जो ईन. इस तकनीक Enterobacter सपा की अन्य विशेषताओं में शामिल जीनों की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. YSU या जीवाणु उपभेदों की एक व्यापक विविधता की.

Introduction

Prototrophic बैक्टीरिया जैवसंश्लेषण 1 के लिए, अमीनो एसिड, न्यूक्लिक एसिड और विटामिन के रूप में व्यापारियों, उत्पन्न करने के लिए केंद्रीय कार्बन चयापचय रास्ते के माध्यम से ग्लूकोज में परिवर्तित करने, मध्यम ग्लूकोज (एम -9 मध्यम) युक्त एम -9 न्यूनतम लवण में हो जाना. एम -9 मध्यम एक कार्बन और ऊर्जा स्रोत के रूप में एक सल्फर स्रोत और ग्लूकोज के रूप में एक बफर और फॉस्फोरस स्रोत, मैग्नीशियम सल्फेट के रूप में एक नाइट्रोजन स्रोत, सोडियम और पोटेशियम फॉस्फेट के रूप में अमोनियम क्लोराइड होता है. Luria-Bertani (पौंड) मध्यम tryptone से और खमीर निकालने से विटामिन और वृद्धि कारकों में अमीनो एसिड में समृद्ध है. यह एम -9 माध्यम पर विकास के लिए आवश्यक अमीनो एसिड, विटामिन और अन्य विकास कारकों को संश्लेषित नहीं कर सकते हैं कि auxotrophs के विकास का समर्थन करता है. Auxotrophs एम -9 माध्यम में लेग माध्यम में नहीं बल्कि बढ़ेगा जबकि इस प्रकार, prototrophs, पौंड और एम -9 माध्यम में विकसित होगा. Auxotrophic phenotypes कारण है कि उत्परिवर्तित जीन बैक्टीरिया की एक prototrophic जनसंख्या में म्यूटेशन शुरू करने और पहचान करके, यह पो हैएक बैक्टीरियल तनाव में चयापचय की एक बेहतर समझ प्राप्त करने के लिए ssible.

Transposon उत्परिवर्तजनन एम -9 मध्यम में ग्लूकोज पर विकास के लिए आवश्यक जीन के कई की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. Transposons मेजबान जीनोम 2 में बेतरतीब ढंग से खुद को डालें. एम -9 मध्यम अगर प्लेटों पर लेग अगर प्लेटों और उन्हें चढ़ाना प्रतिकृति पर transposon transformants खोलना करके, यह auxotrophs लिए स्क्रीन के लिए संभव है. बाधित जीन जीन बचाव के माध्यम से पहचाने जाते हैं. इस अध्ययन के एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध तमिलनाडु 5 transposase प्रोटीन के साथ मिश्रित एक रेखीय transposon डीएनए खंड की एक समाधान के रूप में भेज दिया है जो transposome व्युत्पन्न का उपयोग करता है. डीएनए खंड एक transposase जीन का अभाव है लेकिन केनामाइसिन प्रतिरोध के लिए एक जीन, एक R6K γ प्रतिकृति मूल और खंड 3,4 के प्रत्येक के अंत में बाध्यकारी transposase के लिए डीएनए दृश्यों रहे हैं जो दो मोज़ेक रूपांकनों शामिल हैं. Transposase प्रोटीन डीएनए, अकेले डीएनए खंड को सीधे जोड़ा जाता है के बाद सेtransposon के रूप में परिभाषित किया गया है, और डीएनए / transposase प्रोटीन जटिल transposome के रूप में परिभाषित किया गया है. transposome एक केनामाइसिन संवेदनशील मेजबान (चित्रा 1 ए) में electroporation के 5 से बदल रहा है. केनामाइसिन (लेग-कान) युक्त लेग अगर प्लेटों पर बढ़ने कि कालोनियों केनामाइसिन (एम-9-कान) auxotrophs हैं युक्त एम -9 मध्यम अगर प्लेटों पर विकसित करने के लिए असफल कि transposon सम्मिलित (चित्रा 1 बी), और प्रतिकृति चढ़ाया transformants (Figire है 1 सी). एक उत्परिवर्ती से जीनोमिक डीएनए शुद्ध और आंशिक रूप से 4 आधार काटने प्रतिबंध endonuclease, Bfu सीआई (चित्रा -1) से पच जाता है. ligated डीएनए कि पीर जीन (चित्रा 1E) शामिल Escherichia कोलाई (ई कोलाई) के एक तनाव में तब्दील हो जाता है. इस जीन नई प्लाज्मिड transposon युक्त और में दोहराने के लिए मेजबान गुणसूत्र क्षेत्र flanking की अनुमति देता है कोलाई 6. केनामाइसिन प्रतिरोध जीन के रूप में कार्य करता हैनई प्लाज्मिड के लिए electable मार्कर. अंत में, बाधित जीन की पहचान निर्धारित करने के लिए उपयोग किया जाता है transposon और जिसके परिणामस्वरूप अनुक्रम का बेसिक स्थानीय संरेखण खोज उपकरण (ब्लास्ट) विश्लेषण 7,8 के प्रत्येक के अंत करने के लिए पूरक प्राइमर का उपयोग अनुक्रमण.

इस transposome उत्परिवर्तजनन रणनीति तीन फायदे 3 प्रदान करता है. Transposase प्रोटीन transposon को सीधे ही है, क्योंकि सबसे पहले, प्रविष्टि मेजबान भीतर transposase जीन की अभिव्यक्ति पर निर्भर नहीं करता है. Transposon मेजबान जीनोम में खुद को शामिल करने के बाद, transposase transposon के अतिरिक्त आंदोलन को रोकने, अपमानित किया जाता है. मेजबान एक अंतर्जात तमिलनाडु 5 transpositional तत्व के पास हालांकि, अगर अतिरिक्त आंदोलन रोका नहीं जा सकता. दूसरा, electroporation द्वारा transposome का परिचय यह संभव मेजबानों की एक विस्तृत विविधता में इसका इस्तेमाल करने के लिए बनाता है. यह भी बैक्टीरियल विकार से या छठी से transposon शुरू करने की आवश्यकता समाप्तRAL संक्रमण. दोनों प्रक्रियाओं मेजबान संवेदनशीलता की आवश्यकता है. तीसरा, केनामाइसिन प्रतिरोध जीन और transposome में R6K γ प्रतिकृति मूल के शामिल किए जाने के लिए यह आसान बाधित जीन की पहचान करने के लिए बनाता है. Transposon बाधित क्षेत्रों संग्रहीत और जीन की पहचान के लिए उलटा पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) तकनीक का उपयोग करने की आवश्यकता को समाप्त, प्लास्मिड के रूप में अनुक्रम किया जा सकता है.

इस वीडियो में प्रस्तुत प्रोटोकॉल Enterobacter सपा के transposon mutagenesis के लिए हर कदम का वर्णन करता है. YSU 9 यह बाधित ख्यात जीन की पहचान करने के लिए बैक्टीरियल कोशिकाओं में इसकी शुरूआत से एक transposome का उपयोग. पहले प्रकाशित प्रोटोकॉल 3,4,10 के अलावा, auxotrophs लिए स्क्रीन के लिए प्रतिकृति चढ़ाना प्रयोग करने के लिए विस्तृत तरीकों प्रस्तुत कर रहे हैं. इस उत्परिवर्तजनन तकनीक अध्यक्ष के लिए, बैक्टीरिया के विभिन्न प्रकारों में, इस तरह के एंटीबायोटिक और धातु प्रतिरोध के रूप में अन्य phenotypes, की जांच के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, या एक आनुवंशिकी या सूक्ष्म शरीर क्रिया विज्ञान पाठ्यक्रम की एक प्रयोगशाला घटक को पढ़ाने के लिए सिंथेटिक जीव विज्ञान के अध्ययन में परिभाषित संस्कृति शर्तों के तहत विकास के लिए आवश्यक जीन की न्यूनतम संख्या ifying.

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Protocol

सक्षम कोशिकाओं 5,11 1. Electroporation

  1. Enterobacter सपा के एक हे / एन लेग संस्कृति पतला. ताजा लेग माध्यम के 50 मिलीलीटर में YSU 1/20 और 0.4 और 0.6 के बीच एक आयुध डिपो (600 एनएम) के लिए 30 डिग्री सेल्सियस 120 rpm पर मिलाते हुए और साथ बढ़ता है. वैकल्पिक रूप से, उनके इष्टतम विकास के तापमान पर अन्य जीवाणु उपभेदों हो जाना.
  2. 5 मिनट और अपकेंद्रित्र 4 डिग्री सेल्सियस और 5 मिनट के लिए 7000 XG के लिए बर्फ पर कोशिकाओं टेंशन मत लो.
  3. सतह पर तैरनेवाला त्यागें 4 डिग्री सेल्सियस पर बाँझ बर्फ के ठंडे पानी और अपकेंद्रित्र के 50 मिलीलीटर में कोशिकाओं resuspend और 5 मिनट के लिए 7000 XG. इस चरण को दोहराएँ.
  4. सतह पर तैरनेवाला त्यागें और सेल गोली मात्रा के बराबर बर्फ के ठंडे पानी की मात्रा में कोशिकाओं resuspend. लंबी अवधि के भंडारण के लिए, -80 डिग्री सेल्सियस, और पिघलना पर बर्फ के ठंडे 10% (v / v) ग्लिसरॉल, दुकान के बराबर गोली मात्रा में बर्फ के ठंडे 10% (v / v) ग्लिसरॉल, resuspend के 10 एमएल के साथ कोशिकाओं को धोने electroporation के पहले बर्फ पर.
  5. 40 μl को transposome के 0.5 μl जोड़ेंकोशिकाओं. व्यावसायिक रूप से उपलब्ध transposome समाधान 0.33 माइक्रोग्राम प्रति / μl के डीएनए एकाग्रता में आपूर्ति की है. 0.33 माइक्रोग्राम प्रति सिफारिश की है हालांकि, 0.165 माइक्रोग्राम प्रति डीएनए पर्याप्त है.
  6. एक बर्फ ठंड, 0.2 मिमी, electroporation क्युवेट में सेल / transposome मिश्रण रखें और क्युवेट की तह तक मिश्रण टैप करें. 25 μF में 200 Ω, और 2.5 केवी कोशिकाओं झटका. , कोशिकाओं ठंडा रहने को सुनिश्चित उपयोग करने से पहले एक -20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में electroporation के cuvettes की दुकान.
  7. इसके तत्काल बाद, catabolite दमन (समाज) के माध्यम से सुपर इष्टतम शोरबा निष्फल फिल्टर के 960 μl जोड़ें. नीचे से ऊपर pipetting और से मिलाएं और एक बाँझ 1.5 मिलीलीटर microfuge ट्यूब कोशिकाओं हस्तांतरण.
    नोट: कोशिकाओं के झटके के बाद मरने के लिए शुरू, लेकिन समाज के मध्यम में नमक उन्हें ठीक करने के लिए अनुमति देता है. बचत, यह transposome जोड़ने के लिए या नकारात्मक नियंत्रण कोशिकाओं को झटका करने के लिए आवश्यक नहीं है. बस इसे बाँझ समाज माध्यम के 960 μl जोड़ें.
  8. 30 डिग्री सेल्सियस एफ में कोशिकाओं को सेतेया 120 rpm पर झटकों के साथ 45-60 मिनट. इस केनामाइसिन प्रतिरोध व्यक्त करने transposome कोशिकाओं मेजबान जीनोम के साथ और के लिए recombine करने के लिए समय प्रदान करता है.
  9. एक लेग-कान अगर प्लेट पर कोशिकाओं के 100 μl बिखरा हुआ है और 30 डिग्री सेल्सियस पर थाली ओ / एन सेते हैं. 4 डिग्री सेल्सियस पर फ्रिज में शेष परिवर्तन मिश्रण स्टोर. यदि आवश्यक प्रारंभिक electroporation के बाद 2 सप्ताह के लिए एक बाद की तारीख पर अतिरिक्त मात्रा में बिखरा हुआ है.

Transformants 2. Gridding

  1. टेप एक खाली 100 x 15 मिमी पेट्री डिश के ढक्कन को एक ग्रिड. "बैक्टीरियल जेनेटिक्स में एक संक्षिप्त कोर्स '12 से एक ग्रिड कॉपी करें.
  2. एक लेग-कान अगर थाली के तल पर एक लाइन ड्रा. ग्रिड अगर माध्यम से दिख रहा है कि इतनी gridded ढकने के लिए यह लंगर के लिए टेप का एक छोटा सा टुकड़ा का उपयोग करें. थाली के तल पर लाइन ग्रिड के शीर्ष केंद्र के साथ गठबंधन किया है कि सुनिश्चित करें. टेप के साथ थाली एंकरिंग भी gridding के लिए अनुमति देता है, फिसलने से रहता है. लाइन प्रतिकृति चढ़ाना के बाद कॉलोनी पहचान की सुविधा.
  3. एक बाँझ दन्तखुदनी के साथ एक एकल transformant उठाओ और ग्रिड में एक वर्ग के बीच में यह जगह. बस कॉलोनी और मौके स्पर्श. अगर में दंर्तखोदनी खुदाई न करें. थाली contaminating से बचने के लिए, केवल एक छोर पर दंर्तखोदनी संभाल.
  4. 2.3 कदम के रूप में एक आसन्न वर्ग में एक और transformant हाजिर. थाली भरा हुआ है, जब 30 डिग्री सेल्सियस पर / ओ एन यह सेते हैं. इस मास्टर थाली है.

3. प्रतिकृति चढ़ाना Auxotroph Phenotype 12 निर्धारण करने के लिए

  1. लेग-कान के लिए M-9-कान के लिए लेग-कान के लिए एक, दो और तीन: gridded किया गया था कि प्रत्येक थाली के लिए, एक तीन संख्या एक से तीन ताजा अगर प्लेट का ढेर बना. उपयोग करने से पहले 37 डिग्री सेल्सियस, उल्टा हे / एन प्लेटें सूखी.
  2. कदम 2.2 में के रूप में प्रत्येक थाली के शीर्ष पर एक लाइन ड्रा.
  3. 70% इथेनॉल के साथ प्रतिकृति चढ़ाना उपकरण साफ कर लें प्रतिकृति चढ़ाना के शीर्ष पर एक बाँझ velveteen वर्ग जगहराजभाषा और velveteen वर्ग शिकंजा कसने. हाथ भी उन्हें धोने के बाद रोगाणुओं से भरा हुआ है. इसके किनारे से velveteen वर्ग को संभालने से रोगाणुओं contaminating की शुरूआत को रोकने.
  4. दबाना पर तैयार एक लाइन के साथ मास्टर थाली पर लाइन संरेखित और velveteen वर्ग के शीर्ष पर थाली जगह है. Velveteen वर्ग की थाली से बैक्टीरिया को हस्तांतरण करने की कोमल दबाव लागू करें. बैक्टीरिया धब्बा नहीं सावधान रहो. Velveteen वर्ग से गुरु थाली निकालें.
  5. दबाना पर लाइन के साथ प्लेट नंबर एक पर खींची गई रेखा संरेखित और velveteen वर्ग के शीर्ष पर जगह है. थाली को velveteen वर्ग से बैक्टीरिया को हस्तांतरण करने की कोमल दबाव लागू करें. प्लेट नंबर एक निकालें.
  6. पानी की एक बीकर में velveteen वर्ग त्यागें और कदम 3.3 में के रूप में प्रतिकृति चढ़ाना उपकरण पर एक स्वच्छ, बाँझ velveteen वर्ग जगह है. इस कदम के ऊपर टीका सफलता विकास और झूठी सकारात्मक परिणामों का कारण बनता है जो रोकता है.
  7. संरेखितदबाना पर लाइन के साथ प्लेट नंबर एक पर लाइन और नई velveteen वर्ग के शीर्ष पर जगह है. Velveteen वर्ग के लिए प्लेट नंबर एक से बैक्टीरिया को हस्तांतरण करने की कोमल दबाव लागू करें. प्लेट नंबर एक निकालें.
  8. दबाना पर लाइन के साथ प्लेट नंबर दो पर खींची गई रेखा संरेखित और velveteen वर्ग के शीर्ष पर जगह है. प्लेट नंबर दो को velveteen वर्ग से बैक्टीरिया को हस्तांतरण करने की कोमल दबाव लागू करें. प्लेट नंबर दो निकालें.
  9. प्लेट नंबर तीन के लिए दोहराएँ कदम 3.8. तीसरे प्लेट अन्य दो प्लेटों के लिए मास्टर थाली से पूर्ण हस्तांतरण के लिए एक नियंत्रण है. पानी की एक बीकर में velveteen वर्ग त्यागें. , उन्हें सूखी, उन्हें धोने एल्यूमीनियम पन्नी में उन्हें लपेटो और उन्हें फिर से आटोक्लेव, दूषित velveteen चौकों युक्त बीकर आटोक्लेव, velveteen चौकों पुन: उपयोग करने के लिए.
  10. 30 ° कंपनी / एन प्लेटें सेते हैं. दोनों लेग-कान अगर प्लेटों पर बढ़ने लेकिन एम-9-कान प्लेटों पर विकसित करने के लिए असफल कि कालोनियों auxotrophs (माना जाता है
  11. स्ट्रीक बाहर एक ताजा लेग-कान अगर प्लेट पर प्लेट नंबर एक से auxotrophs, और 30 डिग्री सीओ / एन पर थाली सेते हैं.
  12. अलगाव एक ताजा लेग-कान की थाली पर कदम 3.11 में लकीर थाली से 3 कालोनियों के लिए बाहर स्ट्रीक. 30 ° कंपनी / एन पर थाली सेते हैं. इस उत्परिवर्ती अच्छी तरह से अलग है कि यह सुनिश्चित करता है. एक खंड में प्रत्येक कॉलोनी बाहर तिहाई में थाली और लकीर फूट डालो.
  13. एक ताजा लेग-कान की थाली पर कदम 3.12 से व्युत्पन्न बाहर रेखादार कालोनियों से स्पॉट कालोनियों कदम 2.1-2.4 में के रूप में एक ग्रिड बनाने के लिए. प्रत्येक उत्परिवर्ती तीन प्रतियों में फिर से परीक्षण किया जा रहा है.
  14. Auxotroph फेनोटाइप पुष्टि करने के लिए कदम 3.1-3.10 में के रूप में फिर से थाली पेश करता है.

4. जीन बचाव

  1. 30 डिग्री सेल्सियस पर तरल लेग-कान मध्यम में कदम 3.13 से एक अलग उत्परिवर्ती कॉलोनी के 3 मिलीग्राम हे / एन संस्कृति विकसित. एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध जीनोमिक डीएनए शुद्धि किट का उपयोग संस्कृति के 1 मिलीलीटर से जीनोमिक डीएनए शुद्ध.
  2. 0.025 यू का एक मिश्रण सेट करेंBfu सीआई प्रतिबंध endonuclease और बर्फ पर एक 20 μl प्रतिक्रिया में / μl जीनोमिक डीएनए 1 माइक्रोग्राम प्रति के 14 μl. Bfu सीआई बारह विभिन्न स्थलों पर transposon कटौती के बाद से, यह प्रतिबंध endonuclease, बीएफए मैं या क्रमश: दो और तीन अलग अलग साइटों पर transposon जो कटौती Hae तृतीय, उपयोग करने के लिए और अधिक कुशल हो सकता है.
  3. 25 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर प्रतिक्रिया सेते हैं और फिर 80 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के एंजाइम को निष्क्रिय करने के लिए. एक 0.8% agarose जेल (चित्रा 3) पर आंशिक रूप से पचा डीएनए के 3 μl विश्लेषण. जेल के नीचे करने के लिए नीचे से ऊपर 10 केबी से एक धब्बा में एक सफल आंशिक पाचन परिणाम है.
  4. एक 500 μl प्रतिक्रिया में टी -4 डीएनए ligase की 800 इकाइयों का उपयोग आंशिक रूप से पचा जीनोमिक डीएनए के 15 μl ligate. प्रतिक्रिया हे / एन में 4 डिग्री सेल्सियस सेते हैं. बड़ी प्रतिक्रिया मात्रा खुद को एक टुकड़े के बंधाव अधिकतम और दो या अधिक डीएनए टुकड़े के बीच बातचीत कम करता है.
  5. Precipitaते 3 एम सोडियम एसीटेट, पीएच 5.5, और 1 मिलीलीटर 95% इथेनॉल के 50 μl जोड़ने और 20 मिनट के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर यह incubating द्वारा ligated डीएनए.
  6. 70% इथेनॉल के साथ गोली धोने, 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर डीएनए और 13,500 XG microfuge एक केन्द्रापसारक शून्य concentrator में सूखा, और nuclease मुफ्त पानी के 10 μl में यह resuspend. वैकल्पिक रूप से, डीएनए हवा में 15 मिनट के लिए आरटी पर सूखे की जा सकती है.
  7. परिणत करने resuspended डीएनए के 4 μl का प्रयोग करें खंड 1. R6k γ प्रतिकृति मूल रूप में electroporation द्वारा कोलाई तनाव ECD100D पीर या ECD100D pir116 6 को दोहराने के लिए एक पीर जीन के साथ एक जीवाणु तनाव की आवश्यकता है. कम प्रतिलिपि प्लास्मिड में पीर तनाव परिणाम, और pir116 तनाव उच्च प्रतिलिपि प्लास्मिड में यह परिणाम है कि एक पीर उत्परिवर्ती जीन होता है. प्रत्येक transformant transposon और बाधित गुणसूत्र (चित्रा 1E) के एक क्षेत्र के साथ एक नया प्लाज्मिड शामिल हैं.
  8. Inoculएक ही कॉलोनी के साथ लेग-कान मध्यम के 5 मिलीलीटर खाया, 120 आरपीएम और 37 डिग्री सेल्सियस पर झटकों के साथ / ओ एन यह हो जाना, और एक वाणिज्यिक किट का उपयोग कर पूरे ओ / एन संस्कृति से प्लास्मिड डीएनए शुद्ध.
  9. प्रतिबंध endonuclease Xho मैं का उपयोग प्लाज्मिड के 14 μl डाइजेस्ट प्रतिक्रिया की अंतिम मात्रा 20 μl है सुनिश्चित करें. इस एंजाइम केनामाइसिन प्रतिरोध जीन के 5 'अंत में transposon के बीच में एक साइट को पहचानता है. पचाया के 10 μl विश्लेषण और एक 0.8% agarose जेल (चित्रा 3) पर प्लाज्मिड पच. प्लाज्मिड 2 केबी transposon प्लस flanking मेजबान डीएनए के होते हैं.

5. डीएनए अनुक्रमण

  1. एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध अनुक्रमण किट, transposon के प्रत्येक के अंत करने के मुताबिक़ हैं कि प्राइमरों, और एक केशिका अनुक्रमण विश्लेषण प्रणाली का उपयोग प्लाज्मिड अनुक्रम. वैकल्पिक रूप से, प्लाज्मिड अनुक्रमण के लिए बाहर एक संस्था के लिए भेज दिया जा सकता है.
  2. आणविक वजन मानक (1 केबी सीढ़ी) में प्रयोग करेंजेल प्लाज्मिड के आकार का अनुमान लगाने के लिए. फिर, 50 fmol के लिए आवश्यक है कि प्लाज्मिड के nanograms (एनजी) की संख्या का अनुमान है.
  3. 260 एनएम (ए 260) और 280 एनएम (ए 280) के तरंग दैर्ध्य में एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग प्लास्मिड डीएनए की एकाग्रता उपाय. क्युवेट के माध्यम से प्रकाश मार्ग की लंबाई 1 सेमी है सुनिश्चित करें. 50 एनजी / μl से 260 एनएम पर absorbance गुणा करके एकाग्रता का निर्धारण. उच्च गुणवत्ता प्लास्मिड डीएनए एक ए 260 / 1.8 और 2.0 के बीच एक 280 अनुपात होगा.
  4. प्रत्येक अनुक्रमण प्रतिक्रिया के लिए आवश्यक डीएनए की मात्रा प्लाज्मिड की एकाग्रता से विभाजित 50 fmol के लिए आवश्यक एनजी की संख्या है. 10 μl के लिए कुल मात्रा को लाने के लिए पानी के साथ आवश्यक प्लाज्मिड की मात्रा मिलाई.
  5. 1 मिनट के लिए 96 डिग्री सेल्सियस पर प्लास्मिड डीएनए / पानी के मिश्रण गर्मी और फिर आरटी के लिए यह शांत.
  6. अनुक्रमण किट से मास्टर मिश्रण की 8 μl और अनुक्रमण प्राइमरों में से एक का माइक्रोन 1.6 के 2 μl जोड़ें.
  7. Folथर्मल cycler कार्यक्रम और प्रतिक्रिया सफाई के लिए अनुक्रमण किट से कम प्रोटोकॉल.
  8. एक केशिका डीएनए विश्लेषण प्रणाली का उपयोग करते हुए प्रत्येक नमूने का विश्लेषण.
  9. डीएनए अनुक्रम को देखने के लिए एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सॉफ्टवेयर पैकेज का उपयोग करें. Transposon (चित्रा 4) के पिछले 7 बी.पी. है जो अनुक्रम, "5'-GAGACAG-3 ',' के लिए खोजें. इस 7 बीपी खंड के 5 'अंत से पहले अनुक्रम transposon के अंतर्गत आता है. इस 7 बीपी खंड के 3 'अंत के बाद अनुक्रम बाधित जीन के अंतर्गत आता है.
  10. बेसिक स्थानीय संरेखण खोज उपकरण (ब्लास्ट) 7,8 का उपयोग बाधित जीन के संभावित समारोह का निर्धारण. निम्न का उपयोग link: http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&BLAST_PROGRAMS=megaBlast&PAGE_TYPE=BlastSearch . बाधा के अनुक्रम पेस्ट करेंक्वेरी बॉक्स में एड जीन, डेटाबेस के तहत "दूसरों" का चयन करें और पृष्ठ के निचले भाग में "विस्फोट" पर क्लिक करें. परिणाम दिखाई देता है, संरेखण परिणाम (चित्रा 5) देखने के लिए पृष्ठ नीचे स्क्रॉल.

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Representative Results

Enterobacter सपा का परिवर्तन. Transposome साथ electroporation द्वारा YSU मेजबान जीनोम (चित्रा 1 ए, बी) में यादृच्छिक जीनोम प्रविष्टि शुरू की. एक सफल electroporation के लेग-कान प्लेटों पर हुई जिसमें कई हजार transformants झुकेंगे. 300-400 प्राप्त करने के लिए, प्रति प्लेट कालोनियों अच्छी तरह से स्थान दिया गया है, प्रत्येक लेग-कान अगर प्लेट पर परिवर्तन मिश्रण प्रसार की राशि अनुकूलित किया गया था. प्रत्येक transformant कम से कम एक transposon डालने निहित है, लेकिन एम -9 माध्यम पर विकास के लिए एक महत्वपूर्ण जीन प्रतिकृति चढ़ाना द्वारा स्क्रीनिंग के बिना बाधित किया गया था अगर यह स्पष्ट नहीं था. Transformants एम -9 मध्यम पर चढ़ाया 88 के ग्रिड और प्रतिकृति में ताजा लेग-कान प्लेटों के लिए स्थानांतरित कर दिया गया. Transposon, प्रोटोकॉल अनुभाग एम -9 मध्यम प्लेटों को केनामाइसिन जोड़ने की सिफारिश की transformants में बनाए रखा है कि यह सुनिश्चित करने के लिए, ध्यान दें. एम -9 मध्यम इस मामले में केनामाइसिन के साथ पूरक है, लेकिन यह इसके बिना auxotrophs प्राप्त करने के लिए अभी भी संभव नहीं था. में (चित्रा 1C) में लेग माध्यम में पाया लेकिन नहीं कर रहे हैं जो एक एमिनो एसिड, एक न्यूक्लिक एसिड या विटामिन के संश्लेषण में शामिल जीनों में रुकावट निहित. अन्य 86 कालोनियों एम -9 न्यूनतम माध्यम पर विकास के लिए आवश्यक है कि एक जीन में एक रुकावट नहीं था.

कुछ कालोनियों प्रतिकृति चढ़ाना दौरान आसन्न कालोनियों के साथ दूषित हो गया है. एक शुद्ध संस्कृति के रूप में एक उत्परिवर्ती को अलग करने के लिए, यह एक ताजा लेग-कान अगर प्लेट पर कदम 3.1 में लेग-कान प्लेट नंबर एक से परेशान और 30 डिग्री सेल्सियस पर ओ / एन हो गया था. बढ़ी कि तीन कालोनियों एक दूसरे ताजा लेग-कान की थाली पर बाहर रेखादार और 30 डिग्री सेल्सियस पर ओ / एन बड़े हो रहे थे. फिर, तीन कालोनियों में से प्रत्येक से उठी कि एक कॉलोनी एक तिहाई ताजा लेग-कान की थाली पर देखा गया था. प्रतिकृति एक एम -9 न्यूनतम मेडी पर वापस चढ़ानाउम थाली तीन प्रतियों में चित्रा 2 में मनाया गया कि auxotrophic फेनोटाइप सत्यापित. एक 2013 माइक्रोबियल फिजियोलॉजी कोर्स में जांच 1760 transposon transformants की, 23 auxotrophs थे.

एक auxotroph से बाधित जीन तो जीन बचाव का उपयोग पहचान की थी. ऊपर दूसरा लकीर प्लेट (3.13 चरण) से एक auxotrophic कॉलोनी लेग-कान माध्यम में हे / एन हो गया था, और जीनोमिक डीएनए एक जीनोमिक डीएनए शुद्धि किट का उपयोग संस्कृति से शुद्ध किया गया था. Agarose जेल वैद्युतकणसंचलन शुद्ध डीएनए आकार में बड़ा से 10 केबी (चित्रा 3, लेन 2) था कि पता चला है. Transposon निहित और मेजबान क्षेत्रों (चित्रा -1) बाधित flanking कि छोटे टुकड़ों में जीनोमिक डीएनए को तोड़ने के लिए, यह आंशिक रूप से 37 डिग्री सेल्सियस पर 25 मिनट के लिए Bfu सीआई की 0.025 इकाइयों के साथ पचा गया था. लगभग हर 200-500 आधार जोड़े होते हैं जो 5'-GATC -3 'स्थलों पर यह प्रतिबंध endonuclease कटौती. यहां तक ​​कि वहाँ हालांकिtransposon भीतर बारह 5'-GATC -3 'साइटों रहे हैं, मेजबान जीनोम बरकरार transposon युक्त और flanking टुकड़े की एक बड़ी संख्या अभी भी आंशिक रूप से पचा डीएनए में मौजूद रहेंगे. चित्रा 3 शो के लेन 3 आंशिक रूप से 0.5 केबी नीचे करने के लिए सभी तरह से जेल के नीचे तक, 10 केबी से ऊपर शुरुआत डीएनए का एक धब्बा साथ जीनोमिक डीएनए पचता. डीएनए धब्बा 2 केबी नीचे शुरू होता है, transposon के आकार, तो डीएनए बहुत ज्यादा पचा किया गया है. यह जोड़ा एंजाइम की मात्रा, 37 डिग्री सेल्सियस ऊष्मायन समय, या दोनों को कम करने के लिए आवश्यक हो जाएगा. कोई धब्बा और पचा डीएनए के साथ लेन पचाया डीएनए के साथ डीएनए के रूप में एक ही आकार वहाँ है, तो कोई पाचन हुई. यह 37 डिग्री सेल्सियस ऊष्मायन समय या दोनों जोड़ा एंजाइम की मात्रा में वृद्धि करने के लिए आवश्यक हो जाएगा. इसके बजाय Bfu सीआई का उपयोग कर के, यह प्रतिबंध दो और तीन अलग अलग साइटों पर transposon कटौती जो BFA मैं या Hae तृतीय, endonucleases उपयोग करने के लिए संभव हो सकता हैक्रमशः. इन एंजाइमों से एक का उपयोग वृद्धि हो सकती है जीन बचाव के दौरान कोली पीर + परिवर्तन उपज.

आंशिक रूप से पचता डीएनए एक 500 μl प्रतिक्रिया में ligated था. इस वृद्धि की मात्रा अन्य डीएनए टुकड़े के बीच बातचीत कम से कम और खुद के साथ ligated प्रत्येक टुकड़ा एक परिपत्र अणु के लिए फार्म संभावना है कि अधिकतम. ligated डीएनए उपजी और में electroporation द्वारा तब्दील हो गया था कोलाई तनाव ECD100D pir116. परिवर्तन मिश्रण लेग-कान प्लेटों पर फैल गया था. बढ़ी कि कालोनियों transposon और बाधित मेजबान जीन (चित्रा 1E) के एक क्षेत्र से मिलकर एक नया प्लाज्मिड निहित. कॉलोनी बनाने इकाइयों की संख्या 0 से परिवर्तन मिश्रण के मिलीलीटर प्रति 2,000 तक बताया गया. Flanking गुणसूत्र क्षेत्र को विषाक्त था कि एक प्रोटीन इनकोडिंग हैं कोलाई मेजबान, परिवर्तन दक्षता कम या chromo के केवल एक छोटे से क्षेत्र थाकुछ नया प्लाज्मिड के साथ जुड़े थे. प्लास्मिड डीएनए एक एकल transformant साथ inoculated और केनामाइसिन प्रतिरोध जीन के 5 'अंत निकट transposon के केंद्र में एक भी साइट को मान्यता दी है, जो प्रतिबंध endonuclease, Xho मैं, साथ पचा किया गया था कि एक संस्कृति से शुद्ध किया गया था. चित्रा 3 में 4 लेन पचाया प्लाज्मिड निहित और लेन 5 पचा प्लाज्मिड निहित. शुद्ध प्लास्मिड डीएनए supercoiled हो जाता है, क्योंकि यह रेखीय का एक ही कतरा डीएनए पचा से एक तेज दर से चले गए. इस प्लाज्मिड के सही आकार 3 KB था. यह transposon के 2 KB, प्लस बाधित मेजबान जीन के बारे में 1 केबी निहित. Flanking मेजबान डीएनए एक या अधिक Xho मैं मान्यता साइटों, शामिल हैं दो या अधिक प्लाज्मिड बैंड मैं डीएनए पचा Xho साथ लेन में मनाया जाएगा.

चित्रा 4 एक auxotroph से पृथक किया गया है कि एक प्लाज्मिड के लिए एक अनुक्रमण परिणाम से पता चलता है. थानेदार को हटाने के बादबोल्ड में RT transposon अनुक्रम, मेजबान डीएनए अनुक्रम बेसिक स्थानीय संरेखण खोज उपकरण (ब्लास्ट) विश्लेषण 7,8 के लिए प्रस्तुत किया गया था. बम विस्फोट परिणामों में से एक बाधित अनुक्रम एक Enterobacter cloacae subsp के समान है कि सुझाव दिया. cloacae NCTC 9394 (EMB | FP929040.1 |) एल tyrosine और एल फेनिलएलनिन (चित्रा 5) 13 के जैवसंश्लेषण में शामिल है जो chorismate mutase, के लिए जीन. कभी कभी आंशिक रूप से पचा जीनोमिक डीएनए के बंधाव दौरान, रैखिक transposon एक या अधिक अन्य Bfu सीआई टुकड़े को ligates. एक जीन की पहचान एकाएक परिवर्तन क्योंकि इस विस्फोट भ्रमित परिणाम बना सकते हैं. उदाहरण के लिए, एक और auxotroph के पहले 41 आधार जोड़े प्रोलाइन जैवसंश्लेषण 1 में शामिल है जो ग्लूटामेट-5-semialdehyde डिहाइड्रोजनेज के लिए एक जीन के लिए मिलान. फिर, अगले 219 आधार जोड़े लिपिड-ए-disacc के लिए एक 62 आधार जोड़ी खंड द्वारा पीछा एक ribonucleoside-diphosphate रिडक्टेस सबयूनिट के लिए एक जीन, करने के लिए मिलान haride काइनेज. पिछले 295 आधार जोड़ी खंड फिर ग्लूटामेट-5-semialdehyde डिहाइड्रोजनेज करने के लिए मिलान. Bfu सीआई के लिए 5'-GATC -3 'साइटों की उपस्थिति दो छोटे डीएनए टुकड़े बचाया प्लाज्मिड में ligated का सुझाव दिया. इस प्रकार, बंधाव प्रतिक्रियाओं के लिए आंशिक रूप से पचा डीएनए के कमजोर पड़ने पूरी तरह से छोटे टुकड़ों के बंधाव की वजह से पृष्ठभूमि को खत्म नहीं करता है. इन परिणामों से यह इस जीन के लिए अनुक्रम transposon को तुरंत आसन्न था क्योंकि transposome ग्लूटामेट-5-semialdehyde डिहाइड्रोजनेज के लिए जीन में ही डाला कि निष्कर्ष निकाला गया था. अन्य auxotrophs मेथिओनिन जैवसंश्लेषण में शामिल cystathione बीटा lyase के लिए जीन में रुकावट निहित; हिस्टडीन जैवसंश्लेषण में शामिल histidinol डिहाइड्रोजनेज के लिए; सेरीन, ग्लाइसिन, और सिस्टीन जैवसंश्लेषण में शामिल phosphoserine फॉस्फेट के लिए; और leucine, isoleucine और वेलिन जैवसंश्लेषण 1 में शामिल ketol एसिड reductoisomerase के लिए.

NT "के लिए: रखने together.within पृष्ठ =" हमेशा "> चित्रा 1
चित्रा 1. transposon mutagenesis. (ए) मध्यम ग्लूकोज युक्त एम -9 न्यूनतम लवण पर विकास के लिए आवश्यक है कि एक जीन से युक्त बैक्टीरियल कोशिकाओं. बॉक्सिंग एम -9 एक auxotrophic जीन का प्रतिनिधित्व करता है. (बी) transposome electroporation द्वारा बैक्टीरियल तनाव में पेश किया जाता है, और प्रत्येक मोज़ेक अंत करने के लिए बाध्य transposase प्रोटीन (तीर) बेतरतीब ढंग से मेजबान गुणसूत्र 3,4 में transposon सम्मिलित करता है. केवल transposon युक्त transformants लेग-कान मध्यम प्लेटों पर विकसित होगा. (सी) transformants ग्लूकोज युक्त एम -9 माध्यम पर और लेग-कान माध्यम पर चढ़ाया प्रतिकृति हैं. असफल कि transformants ग्लूकोज auxotrophs हैं युक्त एम -9 माध्यम पर (कटा हुआ) विकसित करने के लिए. (डी) जीनोमिक डीएनए auxotrophs से शुद्ध होता है और आंशिक रूप से 4 आधार cutt साथ पच जाता हैएर, डीएनए साइट पहचानता है जो Bfu सीआई, 5'-GATC -3 '. (ई) आंशिक रूप से पचा डीएनए टी -4 डीएनए ligase के साथ इलाज किया और में electroporation द्वारा तब्दील हो जाता है कोलाई तनाव ECD100D पीर transposon और एम -9 माध्यम पर विकास के लिए आवश्यक है, जो बाधित गुणसूत्र जीन होता है कि एक नई प्लाज्मिड बनाने के लिए. पीर जीन नई प्लाज्मिड 6 में एक प्रतिकृति मूल रूप में सेवा करने transposon में R6K γ प्रतिकृति मूल युक्त परिपत्र डीएनए टुकड़े के लिए अनुमति देता है. केनामाइसिन प्रतिरोध जीन नई प्लाज्मिड के लिए एक चयन मार्कर के रूप में कार्य करता है. प्लाज्मिड शुद्ध होता है, और बाधित जीन की एक ~ 500 बीपी अनुक्रम transposon के प्रत्येक के अंत करने के मुताबिक़ हैं कि प्राइमरों (तीर) का उपयोग करते हुए निर्धारित होता है. यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.


2. प्रतिकृति चढ़ाना चित्रा. एक लेग-कान अगर प्लेट को हस्तांतरित किया गया है कि transformants की (ए) ग्रिड. (बी) के एक एम -9 मध्यम थाली करने के लिए स्थानांतरित कर दिया गया है कि एक ही transformants की ग्रिड. Auxotrophs लेकिन नहीं एम -9 मध्यम प्लेटों पर लेग-कान प्लेटों पर हुई. इन काले वर्गों द्वारा पहचाने जाते हैं. यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 3
चित्रा 3. 0.8% agarose जेल लेन 1:. 1 केबी सीढ़ी. लेन 2: पचाया नहीं जीनोमिक डीएनए. लेन 3: Bfu सी मैं आंशिक रूप से जीनोमिक डीएनए पचता. लेन 4: पचाया नहीं बचाया प्लाज्मआईडी. लेन 5: Xho मैं बचाया पचा ​​प्लाज्मिड.

चित्रा 4
एक प्लाज्मिड 4. आंशिक डीएनए अनुक्रम चित्रा. बोल्ड में अनुक्रम transposon का हिस्सा है और विस्फोट के विश्लेषण के लिए प्रस्तुत नहीं किया गया था. अनुक्रम के बाकी मेजबान से बचाया जीन का एक खंड है.

चित्रा 5
चित्रा 5 ब्लास्ट विश्लेषण 7,8. पहले बेस (क्वेरी) से शुरू, बाधित जीन फेनिलएलनिन और टाइरोसीन जैवसंश्लेषण में शामिल है जो एक Enterobacter cloacae chorismate mutase, सांकेतिक शब्दों में प्रकट होता है.

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Discussion

एक transposome का उपयोग transposon उत्परिवर्तजनन Enterobacter सपा में auxotrophs पैदा करने के लिए एक कुशल उपकरण है. YSU और ग्राम नकारात्मक अन्य प्रकार के और ग्राम सकारात्मक बैक्टीरिया 3,4. प्रक्रिया electroporation द्वारा होस्ट में तमिलनाडु 5 व्युत्पन्न transposome शुरू करने से शुरू किया गया था. आवेषण के साथ कालोनियों की पहचान करने के लिए, untransformed लक्ष्य तनाव transposon द्वारा किए गए प्रतिरोध मार्कर के लिए चयन करने के क्रम में केनामाइसिन के प्रति संवेदनशील होना था. कुछ मेजबान यह मेजबान जीनोम साथ recombine कर सकते हैं पहले transposon डीएनए नीचा जो प्रतिबंध endonucleases उत्पादन. Electroporation के मिश्रण करने के लिए एक प्रतिबंध endonuclease अवरोध के अलावा गिरावट को कम करने और परिवर्तन उपज 3 वृद्धि हो सकती है. Electroporation के सक्षम बैक्टीरिया की तैयारी जबकि नमक की उपस्थिति के कारण बैक्टीरिया को मारता है कि एक इलेक्ट्रिक आर्क या चिंगारी को रोकने के लिए संभव के रूप में, यह के रूप में ज्यादा नमक निकालने के लिए महत्वपूर्ण था. यहां तक ​​की अनुपस्थिति मेंएक इलेक्ट्रिक आर्क, कोशिकाओं उन्हें चौंकाने वाला के बाद तेजी से मरने लगे. समाज मध्यम विकास युक्त नमक जोड़ना तुरंत आसमाटिक संतुलन, कम से कम कोशिका मृत्यु और बढ़ परिवर्तन दक्षता 5 बहाल. Kanamycin प्रतिरोधी transformants तो एम -9 न्यूनतम मध्यम अगर करने पर चढ़ाया एक ताजा लेग-कान प्लेट और प्रतिकृति पर देखा गया था. संभव auxotrophs याद आती है कि झूठी सकारात्मक परिणाम पैदा कर सकता है जिस पर टीका रोकने के लिए, velveteen चौकों प्लेटों के बाकी inoculated थे पहले कदम 3.6 में बंद थे. फिर, प्रतिकृति चढ़ाना दौरान, अभी काफी दबाव आसन्न कालोनियों के बीच smearing या संदूषण के कारण के बिना कालोनियों के हस्तांतरण के लिए लागू किया गया था.

auxotrophs में उत्परिवर्तित जीन जीन बचाव के माध्यम से पहचान की गई. प्रत्येक auxotroph से जीनोमिक डीएनए टीआर कटौती जो BFA मैं या Hae तृतीय का उपयोग Bfu सी आई आंशिक digestions कटर लगातार आधार के साथ एक आंशिक पाचन, का उपयोग sheared गया थाansposon कम बार, transposon परिवर्तन दक्षता में सुधार कर सकते हैं. यह transposon भीतर साइटों की कमी है जो अन्य प्रतिबंध endonucleases, 6-आधार और 8 बेस कटर, के साथ एक पूर्ण पाचन उपयोग करने के लिए भी संभव है. पचा डीएनए तो ligated और के रूप में तब्दील किया गया था कोलाई तनाव ECD100D पीर या ECD100D pir116 6. हालांकि कोलाई pir116 तनाव कदम 4.8 में electroporation द्वारा तब्दील हो गया था, यह रासायनिक सक्षम कोशिकाओं का उपयोग करने के लिए भी संभव है. इस मामले में, पूरी परिवर्तन बचाया plasmids के एक बड़ी सूची प्राप्त करने के लिए प्रसार किया जाना चाहिए. circularized transposon एक कम प्रतिलिपि संख्या प्लाज्मिड के रूप में दोहराने के लिए के लिए पीर जीन की अनुमति देता है, और pir116 उत्परिवर्ती जीन यह एक उच्च प्रतिलिपि प्लाज्मिड के रूप में दोहराने के लिए अनुमति देता है. Pir116 तनाव का उपयोग कम परिवर्तन पैदावार मूल मेजबान से विषाक्त जीन उत्पादों की अभिव्यक्ति के कारण हो सकता है. विषाक्तता कम प्रतिलिपि का उपयोग करके कम किया जा सकता है पीर तनाव से कम प्लाज्मिड उपज अनुक्रमण अधिक चुनौतीपूर्ण बना सकते हैं.

जीनोमिक अनुक्रमण 10 और पीसीआर अनुक्रमण 14 जीन बचाव के लिए वैकल्पिक तरीके हैं. जीनोमिक अनुक्रमण विधि शुद्ध जीनोमिक डीएनए से सीधे flanking गुणसूत्र क्षेत्रों दृश्यों. लक्ष्य जीव के जीनोम पहले से ही अनुक्रम किया गया है जब इस रणनीति उपयोगी है. उत्परिवर्तित क्षेत्र जीनोमिक अनुक्रमण और विस्फोट से पहचान हो जाने के बाद पूरे क्षेत्र पीसीआर द्वारा परिलक्षित और आगे के विश्लेषण के लिए क्लोन किया जा सकता है. पीसीआर विधि दो पीसीआर प्रतिक्रियाओं और चार अलग प्राइमरों का उपयोग करता है. पहली प्रतिक्रिया जोड़े एक छोटी डीएनए, संयोजक अनुक्रम (प्राइमर 2) है जिसमें एक पतित प्राइमर के साथ एक transposon मुताबिक़ प्राइमर (प्राइमर 1). दूसरी पीसीआर प्रतिक्रिया एक मुताबिक़ संयोजक अनुक्रम प्राइमर (प्राइमर 4) के साथ एक नेस्टेड पीसीआर प्रतिक्रिया, एक और transposon मुताबिक़ प्राइमर जोड़ी (प्राइमर 3) है. प्राइमर 3 के लिए भड़काना साइट हैतब प्राइमर 1. के लिए भड़काना साइट के 3 'की ओर स्थित है, दूसरी पीसीआर प्रतिक्रिया से amplicand साफ और अनुक्रम है. यह स्वचालित अनुक्रमण विधि दोनों जीनोमिक डीएनए शुद्धि और प्लाज्मिड बचाव के लिए आवश्यकता को नष्ट करने, उत्परिवर्ती कोशिकाओं से सीधे डीएनए amplifies.

इसके बजाय auxotrophy में शामिल जीनों की पहचान की, transposon उत्परिवर्तजनन भी अन्य आसानी से assayed phenotypes. Enterobacter सपा अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. YSU प्रतिरोधी 100 माइक्रोग्राम प्रति / एमएल एम्पीसिलीन (अप्रकाशित डेटा) भी है कि एक बहु धातु प्रतिरोधी बैक्टीरिया तनाव है. HgCl 2 के लिए अपने न्यूनतम निरोधात्मक एकाग्रता (एमआईसी) Agno 3 80 माइक्रोन है और NaAsO 2 मिमी 9 14 है, ZnCl 2 800 माइक्रोन है, 70 माइक्रोन है. लेग-कान प्लेटों पर transformants इस तनाव में transposome शुरू करने और gridding बाद, gridded कालोनियों प्रतिकृति इस bacte की एमआईसी नीचे सांद्रता में मध्यम युक्त धातुओं पर चढ़ाया जा सकता हैरियाल तनाव. एक कम एमआईसी के साथ बचाव और एक उत्परिवर्ती से एक बाधित जीन का अनुक्रमण इन धातुओं में से एक के लिए प्रतिरोध प्रदान कि एक जीन प्रकट हो सकता है.

पैदा म्यूटेंट के अलावा, transposome ऐसे एंटीबायोटिक या धातु प्रतिरोध के रूप में समारोह जीन का लाभ पहचान करने के लिए इन विट्रो में एक वेक्टर के रूप में या विवो में इस्तेमाल किया जा सकता है. Enterobacter सपा से इन विट्रो रणनीति के लिए, जीनोमिक डीएनए. YSU transposon के बाहर साइटों को पहचानता है कि एक प्रतिबंध endonuclease से पच जाता है. डीएनए ligated और 2 + मिलीग्राम से युक्त एक बफर में transposome के साथ मिलाया जाता है. Transposon और यादृच्छिक जीनोमिक टुकड़े, के बीच पुनर्संयोजन के बाद कोलाई तनाव ECD100D पीर डीएनए के साथ बदल गया है और एम्पीसिलीन या एक धातु नमक युक्त प्लेटों पर फैला हुआ है. बढ़ने कि कालोनियों मेजबान के प्रतिरोध जीन के बगल में स्थित transposon जिसमें एक नया प्लाज्मिड के अधिकारी होंगे. इन विवो अनुसूचित जनजाति के लिएrategy, Enterobacter सपा. YSU transposome के साथ बदल रहा है. फिर, पूरी परिवर्तन प्रतिक्रिया यादृच्छिक transposon आवेषण के साथ एक बड़ी आबादी के लिए चयन करने के लिए लेग-कान तरल माध्यम में उगाया जाता है. जीनोमिक डीएनए, transposome बाहर साइटों को पहचानता है कि एक प्रतिबंध endonuclease के साथ पचा ligated और में तब्दील हो जाता है कोलाई तनाव ECD100D पीर. इन विट्रो विधि के रूप में, transformants एम्पीसिलीन या धातु प्लेट पर फैले हुए हैं. फिर, जिसके परिणामस्वरूप प्लाज्मिड एक प्रतिरोध जीन के बगल में डाला transposon शामिल होंगे. इन दो रणनीतियों लक्ष्य प्रतिरोध जीन व्यक्त किया जा सकता है केवल यदि सफल होना और में सक्रिय है करेगा कोलाई तनाव.

Transposon mutagenesis के एक जीवाणु तनाव विकास 15,16 के लिए आवश्यकता जीन की न्यूनतम संख्या की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. LoxP साइटों और विभिन्न एंटीबायोटिक प्रतिरोध मार्करों वाले दो transposomes इस रणनीति के लिए आवश्यक हैं मैंएक ज्ञात जीनोम अनुक्रम के साथ ना बैक्टीरियल तनाव. दो transposons एकीकृत करने के बाद व्यक्त Cre recombinase transposon सम्मिलन के बीच गुणसूत्र क्षेत्रों को नष्ट करने, दो loxP साइटों के बीच एक पुनर्संयोजन प्रतिक्रिया उत्प्रेरित. जीनोम अनुक्रम का ज्ञान यह संभव समाप्त हो जाते हैं, जो जीन की पहचान करने के लिए बनाता है. विकसित करने की क्षमता का सफाया जीन के विकास के लिए आवश्यक नहीं है कि यह दर्शाता है. इस तकनीक श्रम गहन है, और इस रणनीति का उपयोग विकास के लिए एक न्यूनतम जीनोम अभी तक पूरा नहीं किया गया. हालांकि, पीसीआर अनुक्रमण का उपयोग Pseudomonas aeruginosa की एक स्वचालित transposon mutagenesis के अध्ययन 300-400 जीन अमीर मध्यम 14 में इस जीवाणु के विकास के लिए आवश्यक थे कि अनुमान है. इस अध्ययन loxP / Cre recombinase प्रणाली का उपयोग नहीं किया.

न्यूनतम जीनोम साथ रोगाणुओं सिंथेटिक जीव विज्ञान 17 के लिए उपयोगी होते हैं. कम से कम एक जीनोम के साथ एक बैक्टीरियल तनाव especiall हैअवांछित byproducts के उत्पादन को नष्ट करने के लिए उपयोगी Y. उदाहरण के लिए, क्लोस्ट्रीडियम acetobutylicum (सी acetobutylicum) जैव ईंधन, butanol 18 का उत्पादन किया जाता है. अपने विकास के दौरान, इस तनाव यह स्थिर चरण में प्रवेश करती है बस से पहले अपनी घातीय वृद्धि चरण के अंत में butanol पैदा करता है. इस बिंदु पर, यह butanol और अन्य किण्वन उत्पादों के प्रति संवेदनशील हो जाता है और संघर्ष उत्पाद synthesize करने के लिए जो निष्क्रिय endospores रूपों. Transposomes क्लोस्ट्रीडियम perfringens 3 अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है के बाद से, यह अवांछित किण्वन उत्पादों और sporulation के लिए जीन का अभाव है कि सी acetobutylicum के तनाव के निर्माण के लिए एक समान transposome / loxP / Cre recombinase प्रणाली का उपयोग करने के लिए संभव हो सकता है, लेकिन अधिक से अधिक के लिए जीन शामिल हो सकता है butanol सहिष्णुता. इस तनाव न्यूनतम contaminants के साथ उत्पाद उपज में वृद्धि होगी.

संक्षेप में, इस वीडियो पत्रिका लेख एक पूरा काएं प्रदान करता हैtransposon mutagenesis के द्वारा auxotrophs बनाने के लिए इस्तेमाल प्रक्रियाओं के कदम विवरण द्वारा पी. यह डीएनए अनुक्रमण द्वारा तकनीक और बाधित जीन की पहचान क्लोनिंग द्वारा उत्परिवर्तित जीन बचाव, प्रतिकृति चढ़ाना से म्यूटेशन के लिए स्क्रीनिंग, electroporation द्वारा transposome शुरू करने को शामिल किया गया. इस तकनीक को अज्ञात जीनों के समारोह की पहचान करने के लिए या संभवतः एक औद्योगिक प्रक्रिया में इस्तेमाल किया जा सकता है कि एक जीवाणु तनाव के निर्माण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

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Disclosures

लेखक का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

लेखक 2010-2014 वसंत सेमेस्टर के दौरान मेरे transposon mutagenesis के विचारों का परीक्षण किया जो मेरे माइक्रोबियल फिजियोलॉजी स्नातक छात्रों के मेरे स्नातक स्वतंत्र रिसर्च छात्रों के सभी और सभी को धन्यवाद देना चाहूंगा. इस काम Youngstown राज्य विश्वविद्यालय में जीव विज्ञान विभाग द्वारा वित्त पोषित किया गया.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
EZ-Tn5 R6Kγori/KAN-2 Tnp Transposome Kit Epicentre (Illumina) TSM08KR
EC100D pir+ Electrocompetent E. coli Epicentre (Illumina) ECP09500 Capable of replicating plasmids with an R6Kγ replication origin at a low copy number
EC100D pir-116 Electrocompetent E. coli Epicentre (Illumina) EC6P095H Capable of replicating plasmids with an R6Kγ replication origin at a high copy number
5X M-9 Salts Thermo Fisher DF048517
Lennox LB Broth Thermo Fisher BP1427-2
Agar Amresco, Inc. J637-1KG Solid media contained 1.6% (w/v) agar
Kanamycin Sulfate  Amresco, Inc. 0408-25G When required, media contained 50 μg/ml kanamycin sulfate
D-Glucose Monohydrate Amresco, Inc. 0643-1KG
Yeast Extract Amresco, Inc. J850-500G
Tryptone Amresco, Inc. J859-500G
KCl Sigma-Aldrich P4504-500G
NaCl Amresco, Inc. X190-1KG
MgCl2 Fisher Scientific BP214-500
MgSO2 Fisher Scientific BP213-1
Super Optimal Broth with Catabolite Repression (SOC) medium 0.5% (w/v) yeast extract, 2% (w/v) tryptone, 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 20 mM MgSO4 and 20 mM Glucose
BfuC I NEB R0636S Partial digestion of genomic DNA
Xho I NEB R0146S Plasmid digestion
T4 DNA Ligase NEB M0202S
Nuclease Free Water Amresco, Inc. E476-1L For dissolving precipitated DNA and restriction endonuclease reactions
GenomeLab DTCS - Quick Start Kit Beckman Coulter 608120 DNA sequencing
Wizard Genomic DNA Purification Kit Promega A1120A
Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System Promega A1460 Plasmid purification
Replica Plating Block Thermo Fisher 09-718-1
Velveteen Squares Thermo Fisher 09-718-2 Replica plating
PetriStickers Diversified Biotech PSTK-1100 Grid for replica plating
Petri Dishes Thermo Fisher FB0875712
Gene Pulser II BioRad Electroporation
Electroporation Cuvettes – 2 mm BioExpress E-5010-2
CentriVap DNA Vacuum Concentrator Labconco 7970010 Drying DNA
CEQ 2000XL DNA Analysis System Beckman Coulter DNA sequencing
Vector NTI Advance 11.5.0 Life Technologies 12605099 DNA sequence analysis

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References

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