Generatie

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Enterobacter sp. YSU groeit in glucose minimale zouten medium. Auxotrofen worden gegenereerd door transformatie met een transposome die willekeurig plaatst zichzelf in het gastheergenoom. Mutanten worden gevonden door replica plating van complexe medium tot minimaal medium. Onderbroken genen worden geïdentificeerd door gen-rescue en sequencing.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Caguiat, J. J. Generation of Enterobacter sp. YSU Auxotrophs Using Transposon Mutagenesis. J. Vis. Exp. (92), e51934, doi:10.3791/51934 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Prototrofe bacteriën groeien op M-9 minimale zouten medium aangevuld met glucose (M-9 medium), welke wordt gebruikt als een koolstof- en energiebron. Auxotrofen kan worden gegenereerd met behulp van een transposome. De commercieel verkrijgbare, Tn 5 -afgeleide transposome gebruikt in dit protocol bestaat uit een lineair segment van DNA dat een R6K γ replicatieoorsprong, een gen voor kanamycine resistentie en twee mozaïek sequentie eindigt, die als transposase bindingsplaatsen. De transposome, verschaft als een DNA / transposase eiwit complex wordt geïntroduceerd door elektroporatie in de stam prototroof, Enterobacter sp. YSU, en integreert zich willekeurig in het genoom van deze host. Transformanten zijn replica uitgeplaat op Luria-Bertani agar platen die kanamycine, (LB-kan) en op M-9 medium agarplaten die kanamycine (M-9-kan). De transformanten die groeien op LB-kan borden maar niet op M-9-kan kentekenplaten geacht auxotrofen zijn. Gezuiverd genomischeDNA van een auxotroph wordt gedeeltelijk verteerd, geligeerd en getransformeerd in een PIR + Escherichia coli (E. coli) stam. De R6Kγ replicatieoorsprong kan het plasmide te repliceren in pir + E. coli-stammen, en de kanamycineresistentie marker zorgt voor plasmide selectie. Elke transformant bezit een nieuw plasmide dat het transposon geflankeerd door de onderbroken chromosomale regio. Sanger sequencing en de Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) suggereren een vermeende identiteit van de onderbroken gen. Er zijn drie voordelen om met deze transposome mutagenese strategie. Ten eerste is het niet vertrouwen op de expressie van een transposase gen van de gastheer. Ten tweede wordt de transposome in het doel gastheer geïntroduceerd door elektroporatie, niet door conjugatie of transductie en daarom efficiënter. Ten derde, de R6Kγ replicatieoorsprong maakt het gemakkelijk om de gemuteerde g identificerenene die gedeeltelijk wordt teruggewonnen in een recombinant plasmide. Deze techniek kan worden gebruikt om de genen in andere kenmerken van Enterobacter sp. YSU of meer verschillende bacteriestammen.

Introduction

Prototrofe bacteriën groeien op M-9 minimale zouten medium glucose (M-9 medium) bevattende glucose omzetten door de centrale koolstof metabolisme routes voorlopers, zoals aminozuren, nucleïnezuren en vitaminen genereren voor biosynthese 1. M-9 medium bevat ammoniumchloride als een stikstofbron, natrium en kalium fosfaat als buffer en fosforbron, magnesium sulfaat als zwavelbron en glucose als koolstof- en energiebron. Luria-Bertani (LB) medium rijk aan aminozuren van trypton en vitaminen en groeifactoren uit gistextract. Het ondersteunt de groei van auxotrofen die aminozuren, vitaminen en andere groeifactoren vereist voor groei op M-9 medium niet kan synthetiseren. Zo zal prototrofen groeien in LB en M-9 medium, terwijl auxotrofen groeien in LB-medium, maar niet in M-9 medium. Door het introduceren van mutaties in een prototrofe bacteriepopulatie en identificatie gemuteerde genen die auxotrofe fenotypes veroorzaken, is het possible een beter begrip van het metabolisme in een bacteriële stam te verkrijgen.

Transposon mutagenese kan worden gebruikt om veel van de genen die nodig zijn voor groei op glucose in M-9 medium identificeren. Transposons voegen zich willekeurig in het gastheergenoom 2. Door het spotten transposon transformanten op LB-agarplaten en replica uitplaten ze op M-9 medium agarplaten, kan men screenen voor auxotrofen. Onderbroken genen worden geïdentificeerd door middel van genetische rescue. Deze studie maakt gebruik van een in de handel verkrijgbaar Tn 5 -afgeleide transposome die wordt geleverd als een oplossing van een lineair transposon DNA-segment gemengd met transposase eiwit. Het DNA-segment mist een transposase-gen, maar bevat een gen voor kanamycine resistentie, een R6K γ replicatieoorsprong en twee mozaïekmotief die DNA sequenties voor transposase binden aan elk uiteinde van het segment 3,4 zijn. Aangezien het transposase eiwit direct toegevoegd aan het DNA, de DNA-segment alleenwordt gedefinieerd als het transposon en de DNA / transposase eiwit complex wordt gedefinieerd als de transposome. De transposome wordt getransformeerd door elektroporatie 5 in een kanamycine gevoelige gastheer (Figuur 1A). Kolonies die groeien op LB-agarplaten die kanamycine (LB-kan) hebben transposon inserts (Figuur 1B), en replica uitgeplaat transformanten die niet groeien op M-9 medium agarplaten die kanamycine (M-9-kan) zijn auxotrofen (Figire 1C). Genomisch DNA van een mutant is gezuiverd en gedeeltelijk gedigereerd met 4-base knippende restrictie endonuclease, BFU CI (figuur 1D). Het geligeerde DNA wordt getransformeerd in een stam van Escherichia coli (E. coli) die het pir gen (figuur 1E) bevat. Dit gen maakt de nieuwe plasmide dat het transposon en flankerende chromosomale regio repliceren in E. coli 6. De kanamycine resistentiegen fungeert alsverkiesbare marker voor de nieuwe plasmide. Tenslotte sequentiebepaling met primers complementair aan elk uiteinde van de transposon en Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) 7,8 analyse van de resulterende sequentie worden gebruikt om de identiteit van de onderbroken genen bepalen.

Dit transposome mutagenesestrategie biedt drie voordelen 3. Ten eerste, omdat het transposase eiwit direct gebonden aan het transposon insertie niet afhangt van de expressie van het transposase-gen in de gastheer. Zodra het transposon omvat zelf in het gastheergenoom, wordt de transposase afgebroken, waardoor extra beweging van het transposon. Echter, kan extra beweging niet worden voorkomen als de gastheer bezit een endogene Tn 5 transpositional element. Tweede, invoering van de transposome door elektroporatie maakt het mogelijk om het te gebruiken in een grote verscheidenheid van gastheren. Het elimineert tevens de noodzaak om de transposon voeren door bacteriële conjugatie of viral infectie. Beide processen vereisen waardplantgevoeligheid. Ten derde, opname van de kanamycine resistentie gen en de R6K γ replicatieoorsprong in de transposome vergemakkelijkt de onderbroken gen te identificeren. Transposon-onderbroken gebieden worden bewaard en de sequentie plasmiden, waardoor de noodzaak om de inverse polymerase chain reaction (PCR) techniek voor gen-identificatie.

De in deze video protocol beschrijft elke stap transposon mutagenese van Enterobacter sp. YSU 9 met een transposome van het inbrengen ervan in de bacteriecellen op het identificeren van de vermoedelijke gen dat onderbroken. Naast de eerder gepubliceerde protocollen 3,4,10 zijn nauwkeurige werkwijzen voor het gebruik replica plating te screenen voor auxotrofen gepresenteerd. Deze mutagenese techniek kan worden gebruikt voor het onderzoeken fenotypes, zoals antibiotica en metaal weerstanden, verschillende soorten bacteriën, identcerende het minimale aantal genen die nodig zijn voor de groei onder gedefinieerde kweekomstandigheden in de synthetische biologie studies, of voor het onderwijzen van een laboratorium onderdeel van een genetica of microbiële fysiologie cursus.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Electroporatie van Competent Cells 5,11

  1. Verdun een O / N LB cultuur van Enterobacter sp. YSU 1/20 in 50 ml vers LB-medium en kweken onder schudden bij 120 rpm en 30 ° C tot een OD (600 nm) tussen 0,4 en 0,6. Eventueel groeien andere bacteriestammen op hun optimale groeitemperatuur.
  2. Koel de cellen op ijs gedurende 5 minuten en centrifugeer bij 4 ° C en 7000 g gedurende 5 min.
  3. Verwijder het supernatant, resuspendeer de cellen in 50 ml steriel ijskoud water en centrifuge bij 4 ° C en 7000 g gedurende 5 min. Herhaal deze stap.
  4. Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in een volume van ijskoud water gelijk aan het volume celpellet. Voor langdurige opslag, was de cellen met 10 ml ijskoude 10% (v / v) glycerol, resuspendeer in een gelijk volume pellet ijskoude 10% (v / v) glycerol, bewaar bij -80 ° C en ontdooien op ijs vóór elektroporatie.
  5. Voeg 0,5 ul van de transposome 40 glcellen. De commercieel verkrijgbare transposome oplossing wordt toegevoerd aan een DNA- concentratie van 0,33 ug / ul. Hoewel 0,33 ug aanbevolen, 0,165 ug DNA voldoende.
  6. Plaats de cel / transposome mengsel in een ijskoude, 0,2 mm, elektroporatie cuvette en tik het mengsel naar de bodem van de cuvet. Shock de cellen bij 25 uF, 200 Ω, en 2,5 kV. Om de cellen blijven gekoeld, slaan de elektroporatie cuvetten in een -20 ° C diepvriezer vóór gebruik.
  7. Onmiddellijk voeg 960 gl filter gesteriliseerd super optimale bouillon met katabolische repressie (SOC) medium. Meng door en neer te pipetteren en breng de cellen naar een steriele 1,5 ml microcentrifugebuis.
    OPMERKING: De cellen beginnen af ​​te sterven na de schok, maar het zout in het SOC medium hen in staat stelt om te herstellen. Bezuinigen is niet noodzakelijk transposome toevoegen of de negatieve controlecellen schok. Voeg 960 ul van steriel SOC medium aan.
  8. Incubeer de cellen bij 30 ° Cfof 45-60 min met schudden bij 120 rpm. Dit verschaft tijd voor de transposome recombineren met het gastheergenoom en de cellen voor kanamycine resistentie drukken.
  9. Spread 100 pl cellen op LB-kan agar plaat en incubeer de plaat O / N bij 30 ° C. Bewaar de resterende transformatiemengsel in de koelkast bij 4 ° C. Verspreid extra bedragen op een later tijdstip tot 2 weken na de eerste elektroporatie indien nodig.

2. gridding van Transformanten

  1. Tape een rooster om het deksel van een lege 100 x 15 mm petrischaal. Kopieer een raster van "een korte cursus in Bacteriële Genetica" 12.
  2. Teken een lijn op de bodem van een LB-kan agarplaat. Gebruik een klein stukje tape om het te verankeren aan de gerasterde deksel, zodat het raster zichtbaar is door de agar. Zorg dat de lijn op de bodem van de plaat is uitgelijnd met de bovenkant, het midden van het raster. Verankeren van de plaat met tape houdt het schuiven, waardoor er een nog gridding. De lijn faciliteert kolonie identificatie na replica plating.
  3. Sla een transformant met een steriele tandenstoker en ter plaatse het in het midden van een plein in het raster. Raak de kolonie en de spot. Graven niet de tandenstoker in de agar. Om verontreiniging van de plaat te voorkomen, omgaan met de tandenstoker slechts aan één zijde.
  4. Spot andere transformant in een aangrenzend veld als in stap 2.3. Wanneer de plaat vol, incubeer het O / N bij 30 ° C. Dit is de meester plaat.

3. Replica Plating aan Bepaal de auxotroph Phenotype 12

  1. Voor elke plaat die was gerasterde, maak een stapel van drie verse agarplaten genummerd één tot drie: één voor LB-kan, twee voor M-9-kan en drie LB-kan. Droog de platen ondersteboven, O / N bij 37 ° C vóór gebruik.
  2. Teken een lijn op de top van elke plaat als in stap 2.2.
  3. Veeg de replica plating tool met 70% ethanol, plaats een steriele velveteen plein op de top van de replica plating aanol en klem de velveteen plein beneden. Handen zitten vol met microben, zelfs na het wassen. Voorkomen dat de introductie van verontreinigende micro-organismen door het hanteren van de fluwelen plein bij de rand.
  4. Lijn de lijn op de master-plaat met een lijn op de klem en zet de plaat op de top van de fluwelen plein. Druk zachtjes op de bacteriën te dragen van de plaat naar de velveteen plein. Wees voorzichtig niet om de bacteriën te smeren. Verwijder de master plaat uit de velveteen plein.
  5. Lijn de lijn getrokken op plaat nummer één met de lijn op de klem en plaats het op de top van de fluwelen plein. Pas lichte druk om de bacteriën overdragen van de fluwelen haaks op de plaat. Verwijder plaat nummer één.
  6. Gooi de velveteen plein in een beker water en plaats een schone, steriele velveteen plein aan de replica plating hulpmiddel zoals in stap 3.3. Deze stap voorkomt over-inenting die de groei doorbraak en vals positieve resultaten veroorzaakt.
  7. Lijn delijn op plaat nummer één met de lijn op de klem en plaats het op de top van de nieuwe fluwelen plein. Druk zachtjes op de bacteriën overbrengen van plaat nummer één op de velveteen plein. Verwijder plaat nummer één.
  8. Lijn de lijn getrokken op plaat nummer twee met de lijn op de klem en plaats het op de top van de fluwelen plein. Druk zachtjes op de bacteriën overbrengen van de velveteen plein aan plaat nummer twee. Verwijder plaat nummer twee.
  9. Herhaal stap 3.8 voor plaat nummer drie. De derde plaat als controle voor volledige overdracht van de masterplaat aan de andere twee platen. Gooi de velveteen plein in een beker water. Om de velveteen pleinen hergebruiken, autoclaaf de beker die de verontreinigde velveteen pleinen, was ze, droog ze af, wikkel ze in aluminiumfolie en re-autoclaaf hen.
  10. Incubeer de platen bij 30 ° CO / N. Kolonies die groeien op beide LB-kan agarplaten maar niet groeien op M-9-kan kentekenplaten geacht auxotrofen (be
  11. Streak uit auxotrofen van plaat nummer één op een verse LB-kan agar plaat, en incubeer de plaat bij 30 ° CO / N.
  12. Streak uit voor isolatie 3 kolonies van de streak plaat in stap 3.11 op een verse LB-kan plaat. Incubeer de plaat bij 30 ° CO / N. Dit zorgt ervoor dat de mutant is goed geïsoleerd. Verdeel de plaat in drieën en streak uit elke kolonie in één sectie.
  13. Spot kolonies van de uitgestreken kolonies afgeleid van stap 3.12 op een verse LB-kan plaat om een ​​rooster te vormen zoals in de stappen 2,1-2,4. Elke mutant wordt opnieuw getest in drievoud.
  14. Repliceren plaat weer zoals in de stappen 3,1-3,10 de auxotroph fenotype bevestigen.

4. Gene Rescue

  1. Kweek een 3 ml O / N kweek van een geïsoleerde mutant kolonie van stap 3.13 in vloeibaar LB-kan medium bij 30 ° C. Zuiver genoom DNA van 1 ml van de cultuur met behulp van een in de handel verkrijgbaar genomische DNA-zuivering kit.
  2. Het opzetten van een mengsel van 0,025 UBFU CI restrictie endonuclease en 14 pl van 1 ug / ul genomisch DNA in een 20 ul reactie op ijs. Aangezien BFU CI snijdt het transposon op twaalf verschillende locaties, kan het efficiënter zijn om restrictie-endonuclease, BFA I of Hae III, die het transposon snijdt op twee en drie verschillende locaties, respectievelijk gebruikt.
  3. Incubeer de reactie bij 37 ° C gedurende 25 minuten en vervolgens bij 80 ° C gedurende 20 minuten om het enzym te inactiveren. Analyseer 3 pl van het gedeeltelijk gedigereerd DNA op een 0,8% agarosegel (Figuur 3). Een succesvolle gedeeltelijke digestie resulteert in een uitstrijk van boven 10 kb naar de onderkant van de gel.
  4. Ligeren 15 ui genomisch DNA gedeeltelijk gedigereerd met 800 eenheden T4 DNA ligase in een 500 ui reactie. Incubeer het reactiemengsel O / N bij 4 ° C. De grote reactievolume maximaliseert de ligatie van de fragmenten aan zichzelf en minimaliseert interacties tussen twee of meer DNA-fragmenten.
  5. Precipitate de geligeerde DNA door toevoeging van 50 pl 3 M natriumacetaat, pH 5,5, en 1 ml 95% ethanol en incuberen bij -20 ° C gedurende 20 min.
  6. Microfuge het DNA bij 4 ° C en 13.500 g gedurende 10 min, was de pellet met 70% ethanol, gedroogd in een centrifugale vacuümconcentrator en resuspendeer in 10 pl nuclease-vrij water. Als alternatief kan de DNA lucht gedroogd bij kamertemperatuur gedurende 15 min.
  7. Gebruik 4 pi geresuspendeerd DNA te transformeren E. coli stam ECD100D pir of ECD100D pir116 door elektroporatie zoals in hoofdstuk 1. De R6K γ replicatie oorsprong vereist een bacteriële stam met een PIR-gen te repliceren 6. De PIR-stam resulteert in lage kopie plasmiden, en de pir116 stam bevat een pir mutant gen dat resulteert in hoge kopie plasmiden. Elke transformant bevat een nieuw plasmide met de transposon en een gebied van de onderbroken chromosoom (figuur 1E).
  8. Inoculat 5 ml LB-kan medium met een enkele kolonie, groeien O / N onder schudden bij 120 rpm en 37 ° C en zuiveren plasmide-DNA uit het gehele O / N kweek met commerciële kit.
  9. Digest 14 ul van het plasmide met de restrictie-endonuclease XhoI Zorg ervoor dat het eindvolume van de reactie 20 pl. Dit enzym herkent een plaats in het midden van het transposon einde van het kanamycine resistentie-gen 5 '. Analyseer 10 ul van de gedigesteerde en de gedigesteerde plasmide op een 0,8% agarosegel (Figuur 3). Het plasmide bestaat uit de 2 kb plus transposon flankerende gastheer DNA.

5. DNA Sequencing

  1. Sequentie het plasmide met een algemeen verkrijgbare sequencing kit, primers die homoloog zijn aan elk uiteinde van de transposon zijn, en een capillair sequencing analysesysteem. Alternatief, kan het plasmide worden verzonden naar een externe inrichting voor sequencing.
  2. Gebruik het molecuulgewicht standaard (1 kb ladder) inde gel om de grootte van het plasmide te schatten. Vervolgens schat het aantal nanogram (ng) van plasmide die nodig is voor 50 fmol.
  3. Meet de concentratie van het plasmide DNA met behulp van een spectrofotometer bij golflengten van 260 nm (260 A) en 280 nm (A280). Zorg ervoor dat het licht lang pad door de cuvet is 1 cm. Bepaal de concentratie van de absorptie bij 260 nm te vermenigvuldigen met 50 ng / ul. Hoogwaardige plasmide-DNA zal een A260 / A280 verhouding tussen 1,8 en 2,0.
  4. De hoeveelheid DNA voor elke sequencing reactie is het aantal ng vereist 50 fmol en de concentratie van het plasmide. Meng de benodigde hoeveelheid plasmide met water om het totale volume tot 10 pi te brengen.
  5. Verwarm het plasmide DNA / water mengsel bij 96 ° C gedurende 1 minuut en koel het af tot kamertemperatuur.
  6. Voeg 8 pi Master Mix van de sequencing kit en 2 pl van 1,6 uM van één van de sequencing primers.
  7. Follaag het protocol van de sequencing kit voor de thermocycler programma en reactie opruimen.
  8. Analyseer elk monster met behulp van een capillair DNA-analyse-systeem.
  9. Gebruik een in de handel verkrijgbaar softwarepakket voor de DNA-sequentie zien. Zoek de sequentie "5'-GAGACAG-3 '," die de laatste 7 bp van de transposon (figuur 4). De volgorde voor het einde van deze 7 bp segment van de 5 'behoort tot het transposon. De sequentie na het 3 'uiteinde van het 7 bp segment behoort tot de onderbroken gen.
  10. Bepaal de mogelijke functie van de onderbroken gen met behulp van de Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) 7,8. Gebruik de volgende link: http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&BLAST_PROGRAMS=megaBlast&PAGE_TYPE=BlastSearch . Plak de sequentie van de interrupted-gen in de doos query, selecteert u "anderen" in het kader van de database en klik op "BLAST" aan de onderkant van de pagina. Wanneer het resultaat verschijnt, scroll naar beneden de pagina om de uitlijning resultaten (figuur 5) te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Transformatie van Enterobacter sp. YSU door elektroporatie met de transposome ingeleid genoom willekeurige insertie in het gastheergenoom (Figuur 1A, B). Een succesvolle elektroporatie leverde enkele duizenden transformanten welk op LB-kan-platen. Voor het verkrijgen 300-400, goed gespreid kolonies per plaat, werd de hoeveelheid transformatiemengsel verspreid over elke LB-kan agarplaat geoptimaliseerd. Elke transformant bevatte ten minste een transposon insertie, maar het was niet duidelijk of een belangrijk gen voor groei M-9 medium werd onderbroken zonder screening door replica plating. Transformanten werden overgebracht naar verse LB-kan-platen in de netten van 88 en replica uitgeplaat op M-9 medium. Merk op dat de transposon wordt gehandhaafd in de transformanten de sectie protocollen beveelt aan kanamycine de M-9 medium platen. De M-9 medium niet aangevuld met kanamycine in dit geval, maar het was nog steeds mogelijk om auxotrofen verkrijgen zonder. In (figuur 1C). De overige 86 kolonies hadden geen onderbreking in een gen dat nodig is voor groei M-9 minimaal medium.

Sommige kolonies kan zijn besmet met aangrenzende kolonies tijdens replica plating. Een mutant als een zuivere kweek isoleren, werd uitgestreken uit LB-kan plate aantal in stap 3.1 op een verse LB-kan agarplaat en gegroeid O / N bij 30 ° C. Drie kolonies die groeiden werden uitgestreken op een tweede verse LB-kan plaat en gegroeid O / N bij 30 ° C. Toen, op een kolonie die is ontstaan ​​uit elk van de drie kolonies werd gespot op een derde vers LB-kan plaat. Replica plating terug op een M-9 minimal medium plaat geverifieerd in drievoud de auxotrofische fenotype dat werd waargenomen in figuur 2. Van de 1760 transposon transformanten gescreend in een 2013 Microbiële Fysiologie natuurlijk, 23 waren auxotrofen.

De onderbroken gen uit een auxotroph werd vervolgens geïdentificeerd met behulp van gen-rescue. Een auxotrofe kolonie uit de tweede streak plaat boven (stap 3.13) werd gekweekt O / N in LB-kan medium, en genomische DNA werd gezuiverd uit de cultuur met behulp van een genomische DNA-zuivering kit. Agarose gelelektroforese bleek dat het gezuiverde DNA was groter dan 10 kb (figuur 3, laan 2). Het genomische DNA in kleinere fragmenten die de transposon bevatte en flankerende onderbroken gastheer gebieden (figuur 1D) breken, werd gedeeltelijk gedigereerd met 0.025 eenheden BFU CI gedurende 25 min bij 37 ° C. Deze beperking endonuclease bezuinigingen op 5'-GATC-3 'sites die ongeveer iedere 200 tot 500 basenparen. Hoewel erzijn twaalf 5'-GATC-3 'plaatsen in het transposon, zal een groot aantal fragmenten die de intacte en transposon flankerende gastheergenoom nog in de gedeeltelijk verteerde DNA. Laan 3 van figuur 3 toont gedeeltelijk gedigereerd genomisch DNA met een uitstrijkje van DNA begint dan 10 kb, helemaal naar de onderkant van de gel tot onder 0,5 kb. Als de DNA uitstrijk begint dan 2 kb, de grootte van de transposon, dan het DNA is teveel gedigereerd. Het zal nodig zijn de hoeveelheid toegevoegd enzym, de 37 ° C incubatietijd, of beide verlagen. Als er geen uitstrijkje en de baan met het gedigereerde DNA wordt dezelfde grootte als het DNA met de onverteerde DNA, is geen digestie gebeurde. Het zal nodig zijn de hoeveelheid toegevoegd enzym verhogen, de 37 ° C incubatietijd of beide. In plaats van BFU CI, kan het goed zijn om de restrictie-endonucleasen BFA I of Hae III, die het transposon op twee en drie verschillende locaties gesnedenrespectievelijk. Slechts één van deze enzymen kan E. toenemen coli pir + transformatie opbrengst tijdens gen redding.

Het gedeeltelijk gedigesteerde DNA werd geligeerd in een 500 ui reactie. Deze toegenomen geminimaliseerd interacties tussen andere DNA-fragmenten zijn maximale waarschijnlijkheid dat elk fragment geligeerd met zichzelf om een ​​circulair molecuul. Het geligeerde DNA werd geprecipiteerd en door elektroporatie in E. coli stam ECD100D pir116. De transformatie mengsel werd uitgespreid op LB-kan-platen. Kolonies die groeiden bevatte een nieuwe plasmide bestaat uit het transposon en een gebied van de onderbroken gastheergen (figuur 1E). Het aantal kolonievormende eenheden varieerde van 0 tot 2.000 per ml transformatiemengsel. Indien de flankerende chromosomale gebied codeerde voor een eiwit dat toxisch is voor de E. was coli gastheer, de transformatie-efficiëntie laag was of slechts een klein segment van het chromowat is gekoppeld aan de nieuwe plasmide. Plasmide DNA werd gezuiverd uit een kweek die werd geïnoculeerd met één transformant en gedigereerd met de restrictie-endonuclease XhoI, die een enkele plaats in het midden van het transposon nabije einde van het kanamycine resistentie-gen 5 'opgenomen. Laan 4 in figuur 3 bevat de onverteerde plasmide en laan 5 bevat de verteerde plasmide. Omdat gezuiverd plasmide-DNA vaak wordt supercoiled, migreerde sneller tempo dan dezelfde streng van lineair DNA gedigereerd. De juiste omvang van dit plasmide was 3 kb. Het bevatte 2 kb van het transposon, plus ongeveer 1 kb van de onderbroken gastheergen. Indien de flankerende DNA gastheer één of meer Xho I herkenningsplaatsen, twee of meer plasmide banden worden waargenomen in de laan met XhoI gedigereerde DNA.

Figuur 4 toont een sequencing resultaat een plasmide dat werd geïsoleerd uit een auxotroof. Na het verwijderen van de short transposon sequentie in vet, was de gastheer DNA-sequentie ingediend voor Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) analyse 7,8. Eén van de BLAST resultaten suggereerden dat de onderbroken sequentie is vergelijkbaar met een Enterobacter cloacae subsp. cloacae NCTC 9394 (emb | FP929040.1 |) gen voor chorismaatmutase, dat betrokken is bij de biosynthese van L-tyrosine en L-fenylalanine (figuur 5) 13. Soms tijdens de ligatie van gedeeltelijk gedigereerd genomisch DNA, de lineaire transposon ligates één of meer andere BFU CI fragmenten. Dit kan het BLAST resultaten verwarrend omdat de identiteit van een gen abrupt. Bijvoorbeeld, de eerste 41 basenparen van een auxotroof gekoppeld aan een gen voor glutamaat-5-semialdehydedehydrogenase dat betrokken is bij proline biosynthese 1. Vervolgens zal de volgende 219 basenparen gekoppeld aan een gen voor een ribonucleoside-difosfaat reductase subeenheid, gevolgd door een 62 basepaar segment lipide-A-disacc haride kinase. De laatste 295 basenparen segment gekoppeld aan glutamaat-5-semialdehydedehydrogenase opnieuw. De aanwezigheid van 5'-GATC-3 'sites voor BFU CI voorgesteld twee kleinere DNA fragmenten geligeerd in het plasmide gered. Aldus verdunning van gedeeltelijk gedigereerd DNA ligatie reacties niet volledig elimineren achtergrond veroorzaakt door ligatie van kleinere fragmenten. Uit deze resultaten werd geconcludeerd dat de transposome zelf ingebracht in het gen voor glutamaat-5-semialdehydedehydrogenase omdat de sequentie van dit gen werd onmiddellijk naast het transposon. Andere auxotrofen die onderbrekingen in het gen voor cystathione beta lyase betrokken bij biosynthese methionine; voor histidinoldehydrogenase betrokken bij biosynthese histidine; voor fosfoserine fosfatase betrokken serine, glycine, cysteïne en biosynthese; en ketol- zuur reducto betrokken leucine, isoleucine en valine biosynthese 1.

nt "fo: keep-together.within-page =" always "> Figuur 1
Figuur 1. transposon mutagenese. (A) Bacteriële cellen die een gen dat nodig is voor groei op M-9 minimale zouten glucose bevattend medium. De boxed M-9 is een auxotrofe gen. (B) De transposome wordt in de bacteriestam door elektroporatie, en de transposase eiwit gebonden aan elk uiteinde mozaïek (pijlen) willekeurig voegt de transposon in het gastheer chromosoom 3,4. Alleen transposon bevattende transformanten groeien op LB-kan mediumplaten. (C) De transformanten worden replica uitgeplaat op M-9 medium dat glucose en op LB-kan medium. De transformanten die niet aan (doorstreepte) groeien op M-9 medium met glucose zijn auxotrofen. (D) Genomic DNA wordt uit de auxotrofen gezuiverd en is gedeeltelijk verteerd met de 4-base cutter, BFU CI, waarin het DNA plaats herkent, 5'-GATC-3 '. (E) De gedeeltelijk gedigereerde DNA werd behandeld met T4 DNA ligase en getransformeerd door elektroporatie in E. coli stam ECD100D pir in nieuw plasmide dat het transposon en de onderbroken chromosomale gen dat nodig is voor groei M-9 medium bevat te vormen. Het pir gen maakt circulaire DNA fragmenten die de R6K γ replicatieoorsprong in het transposon te dienen als een replicatieoorsprong in het nieuwe plasmide 6. De kanamycine resistentiegen dient als een selecteerbare merker voor het nieuwe plasmide. Het plasmide wordt gezuiverd, en een ~ 500 bp sequentie van de onderbroken gen wordt bepaald met behulp van primers (pijlen) die homoloog zijn aan elk uiteinde van de transposon zijn. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.


Figuur 2. Replica Plating. (A) Net van transformanten die werden overgebracht naar een LB-kan agarplaat. (B) Grid van dezelfde transformanten die werden overgebracht naar een M-9 medium plaat. Auxotrofen groeide de LB-kan borden maar niet op de M-9 medium platen. Deze zijn te herkennen aan de zwarte vierkantjes. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 3
Figuur 3. 0,8% agarosegel Laan 1:. 1 kb ladder. Laan 2: Niet gedigereerd genomisch DNA. Laan 3: BFU CI gedeeltelijk gedigereerd genomisch DNA. Laan 4: Onverteerd gered plasmid. Laan 5: XhoI gedigereerde plasmide gered.

Figuur 4
Figuur 4. Gedeeltelijke DNA sequentie van een plasmide. De volgorde vet deel van de transposon en is voor BLAST analyse niet verzonden. De rest van de sequentie is een segment van de geredde genen van de gastheer.

Figuur 5
Figuur 5. Analyse BLAST 7,8. Vanaf de eerste basis (Query), wordt de onderbroken gen een Enterobacter cloacae chorismaatmutase, dat betrokken is bij fenylalanine en tyrosine biosynthese coderen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Transposon mutagenese met behulp van een transposome is een efficiënte tool voor het genereren auxotrofen in Enterobacter sp. YSU en andere vormen van Gram-negatieve en Gram-positieve bacteriën 3,4. Het proces werd geïnitieerd door de invoering van de Tn 5-afgeleide transposome in de gastheer door middel van elektroporatie. Om kolonies te identificeren met inserts, de ongetransformeerde stam doel moest gevoelig voor kanamycine voor het selecteren van de resistentiemerker de transposon uitgevoerd. Sommige gastheren produceren restrictie endonucleasen die de transposon DNA afbreken voordat het kan recombineren met het gastheergenoom. Toevoeging van een restrictie endonuclease remmer aan de elektroporatie mix kan afbraak te minimaliseren en verhogen de transformatie opbrengst 3. Tijdens de voorbereiding electroporation competent bacteriën, was het belangrijk om zoveel zout te verwijderen mogelijk om een ​​elektrische vlamboog of vonk dat de bacteriën door de aanwezigheid van zout doodt voorkomen. Zelfs bij afwezigheid vaneen elektrische boog, begonnen de cellen snel sterven na schokkend hen. Het toevoegen van het zout dat SOC groeimedium onmiddellijk hersteld van de osmotische balans, geminimaliseerd celdood en verhoogde efficiëntie van de omzetting 5. Kanamycine resistente transformanten werden vervolgens door aanstippen op een verse LB-kan plaat en replica uitgeplaat op M-9 minimaal medium agar. Over-inoculatie die vals positieve resultaten mogelijk auxotrofen missen kunnen leiden, te voorkomen, werden velveteen vierkanten geschakeld stap 3.6 voordat de rest van de platen werden geïnoculeerd. Dan, tijdens replica plating, was net genoeg druk uitgeoefend op de koloniën over te dragen zonder dat vegen of besmetting tussen aangrenzende kolonies.

De gemuteerde genen in de auxotrofen werden geïdentificeerd door middel van genetische rescue. Genomic DNA van elk auxotroph werd geschoren met behulp van een gedeeltelijke ontsluiting met de frequente-base snijder BFU C I. Gedeeltelijke ontsluitingen behulp BFA I of Hae III, waarin de tr snijdenansposon minder vaak, kan transposon transformatie-efficiëntie te verbeteren. Het is ook mogelijk een volledige digestie met andere restrictie-endonucleasen, 6-base en 8-base cutters die plaatsen in het transposon ontbreken gebruiken. Het gedigereerde DNA werd vervolgens geligeerd en getransformeerd in E. coli stam ECD100D pir of ECD100D pir116 6. Hoewel de E. pir116 coli stam werd getransformeerd door elektroporatie in stap 4.8, is het ook mogelijk om chemisch competente cellen gebruiken. In dit geval moet de gehele transformatie uitgestreken op een grote selectie van geredde plasmiden te verkrijgen. Het pir gen maakt het gecirculariseerde transposon te repliceren als laag kopieaantal plasmide en de pir116 mutant gen toelaat te repliceren als een hoog kopie plasmide. Lage transformatie opbrengsten met de pir116 stam kan als gevolg van de expressie van toxische genproducten van de oorspronkelijke gastheer. Toxiciteit kan worden verminderd door de low copy pir stam sequencing uitdagender te maken.

Genomische sequencing 10 en PCR sequencing 14 zijn alternatieve methoden voor gen redding. De genomische sequencing methode sequenties flankerende chromosomale regio rechtstreeks van gezuiverd genomisch DNA. Deze strategie is nuttig wanneer het genoom van het doelorganisme al sequentie. Zodra het gemuteerde gebied wordt geïdentificeerd door genomische sequentie en BLAST kunnen de hele regio worden geamplificeerd door PCR en gekloneerd voor verdere analyse. De PCR-werkwijze gebruikt twee PCR reacties en vier verschillende primers. De eerste reactie paren een transposon homoloog primer (primer 1) met een gedegenereerde primer die een korte DNA linkersequentie (primer 2) bevat. De tweede PCR-reactie is een geneste PCR-reactie, koppelt een transposon homologe primer (primer 3) met een homologe linkersequentie primer (primer 4). De priming site voor primer 3 isgelegen aan de 3 'kant van de initiatie- plaats van primer 1. Vervolgens wordt de amplicand van tweede PCR reactie opgeruimd en gesequenced. Deze geautomatiseerde sequencing methode versterkt DNA direct van de mutante cellen, waardoor de noodzaak voor zowel genomisch DNA zuivering en plasmideredding.

In plaats van de identificatie van genen die betrokken zijn bij auxotrofie, transposon mutagenese kan ook worden gebruikt om andere gemakkelijk getest fenotypes. Enterobacter sp bestuderen. YSU is een multi-metal resistente bacteriestam die ook bestand 100 ug / ml ampicilline (ongepubliceerde gegevens). De minimale remmende concentratie (MIC) voor HgCl2 is 70 uM, ZnCl2 is 800 uM, AgNO 3 is 80 uM en NAASO 2 is 14 mm 9. Na de introductie van de transposome in deze stam en gridding transformanten op LB-kan-platen, kan de gerasterde kolonies replica worden uitgeplaat op medium dat metalen bij concentraties lager dan de MIC van deze bacte-rial stam. Reddings- en sequencing van een onderbroken gen uit een mutant met een verlaagde MIC kan een gen dat resistentie verleent tegen een van deze metalen onthullen.

Naast het genereren van mutanten kan de transposome worden gebruikt als een vector in vitro of in vivo tot overexpressie-genen, zoals antibiotica of metaal resistentieproteïnen. Voor de in vitro strategie, genomisch DNA van Enterobacter sp. YSU wordt gedigereerd met een restrictie-endonuclease plaatsen die buiten de transposon herkent. Het DNA wordt geligeerd en gemengd met de transposome in een buffer die Mg 2+. Na recombinatie tussen de transposon en willekeurige genomische fragmenten, E. coli stam ECD100D pir wordt getransformeerd met het DNA en uitgespreid op platen die ampicilline of een metaalzout. Kolonies die groeien zal een nieuw plasmide dat het transposon naast resistentiegen bevat de gastheer bezitten. Voor de in vivo strategy, Enterobacter sp. YSU is getransformeerd met de transposome. Vervolgens wordt de gehele transformatiereactie gekweekt in LB-kan vloeibaar medium te selecteren voor een grote populatie met willekeurige transposon inserts. Genomisch DNA wordt gedigereerd met een restrictie-enzym dat de plaatsen herkent buiten transposome, geligeerd en getransformeerd in E. coli stam ECD100D pir. Zoals in de in vitro werkwijze transformanten worden uitgespreid op ampicilline of metalen platen. Nogmaals, het resulterende plasmide uit de transposon ingevoegd naast een resistentiegen. Deze twee strategieën succesvol zal zijn wanneer het doel resistentiegen kan worden uitgedrukt en is actief in de E. coli stam.

Transposon mutagenese kan worden gebruikt om het minimum aantal genen een bacteriestam vereist voor groei 15,16 identificeren. Twee transposomes met loxP plaatsen en verschillende antibioticumresistentiemerkers vereist deze strategie invt bacteriestam met een bekende genoomsequentie. Na twee transposons integreren uitgedrukt cre recombinase katalyseert een recombinatie reactie tussen de twee loxP plaatsen, waardoor chromosomale gebieden tussen de transposon inserties. Kennis van de genoomsequentie is het mogelijk te bepalen welke genen geëlimineerd. Kunnen groeien blijkt dat de uitgeschakelde genen niet zijn vereist voor groei. Deze techniek is arbeidsintensief, en een minimaal genoom groei met deze strategie is nog niet voltooid. Echter, een geautomatiseerde transposon mutagenese studie van Pseudomonas aeruginosa met PCR sequencing schatting 300-400 genen nodig voor de groei van deze bacterie in rijk medium 14. Deze studie maakte geen gebruik van de loxP / cre recombinasesysteem.

Microben met minimale genomen zijn nuttig voor synthetische biologie 17. Een bacteriestam met een minimale genoom especially vooral nuttig om de productie van ongewenste bijproducten. Zo wordt Clostridium acetobutylicum (C. acetobutylicum) gebruikt om de biobrandstof butanol 18 produceren. Tijdens de groei, dit soort produceert butanol aan het einde van de exponentiële groeifase net voordat het stationaire fase binnengaat. Op dit punt, is het gevoelig voor butanol en andere fermentatie producten wordt en vormt slapende endospores die niet langer naar het product te synthetiseren. Aangezien transposomes zijn gebruikt om Clostridium perfringens 3 bestuderen, kan het mogelijk zijn om een gelijkaardige transposome / loxP / cre recombinase systeem een stam van C. acetobutylicum dat de genen voor ongewenste gistingsproducten en sporulatie mist construeren, maar bevat genen voor grotere butanol tolerantie. Deze stam zou het product opbrengst met minimale verontreinigingen verhogen.

Kortom, deze video tijdschriftartikel biedt een complete step voor stap beschrijving van de procedures die worden gebruikt om auxotrofen door transposon mutagenese creëren. Het heeft betrekking op de invoering van de transposome door elektroporatie, screening op mutaties door replica plating, het redden van gemuteerde genen door het klonen van technieken en identificatie van genen onderbroken door DNA-sequencing. Deze techniek kan worden gebruikt voor het identificeren van de functie van onbekende genen of eventueel construeren van een bacteriestam die kunnen worden gebruikt in een industrieel proces.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteur heeft niets te onthullen.

Acknowledgments

De auteur wil graag al mijn undergraduate Independent Research Studenten en al mijn Microbiële Fysiologie afgestudeerde studenten die mijn transposon mutagenese ideeën tijdens de 2010-2014 lentesemesters getest bedanken. Dit werk werd gefinancierd door de Afdeling Biologische Wetenschappen aan Youngstown State University.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
EZ-Tn5 R6Kγori/KAN-2 Tnp Transposome Kit Epicentre (Illumina) TSM08KR
EC100D pir+ Electrocompetent E. coli Epicentre (Illumina) ECP09500 Capable of replicating plasmids with an R6Kγ replication origin at a low copy number
EC100D pir-116 Electrocompetent E. coli Epicentre (Illumina) EC6P095H Capable of replicating plasmids with an R6Kγ replication origin at a high copy number
5X M-9 Salts Thermo Fisher DF048517
Lennox LB Broth Thermo Fisher BP1427-2
Agar Amresco, Inc. J637-1KG Solid media contained 1.6% (w/v) agar
Kanamycin Sulfate  Amresco, Inc. 0408-25G When required, media contained 50 μg/ml kanamycin sulfate
D-Glucose Monohydrate Amresco, Inc. 0643-1KG
Yeast Extract Amresco, Inc. J850-500G
Tryptone Amresco, Inc. J859-500G
KCl Sigma-Aldrich P4504-500G
NaCl Amresco, Inc. X190-1KG
MgCl2 Fisher Scientific BP214-500
MgSO2 Fisher Scientific BP213-1
Super Optimal Broth with Catabolite Repression (SOC) medium 0.5% (w/v) yeast extract, 2% (w/v) tryptone, 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 20 mM MgSO4 and 20 mM Glucose
BfuC I NEB R0636S Partial digestion of genomic DNA
Xho I NEB R0146S Plasmid digestion
T4 DNA Ligase NEB M0202S
Nuclease Free Water Amresco, Inc. E476-1L For dissolving precipitated DNA and restriction endonuclease reactions
GenomeLab DTCS - Quick Start Kit Beckman Coulter 608120 DNA sequencing
Wizard Genomic DNA Purification Kit Promega A1120A
Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System Promega A1460 Plasmid purification
Replica Plating Block Thermo Fisher 09-718-1
Velveteen Squares Thermo Fisher 09-718-2 Replica plating
PetriStickers Diversified Biotech PSTK-1100 Grid for replica plating
Petri Dishes Thermo Fisher FB0875712
Gene Pulser II BioRad Electroporation
Electroporation Cuvettes – 2 mm BioExpress E-5010-2
CentriVap DNA Vacuum Concentrator Labconco 7970010 Drying DNA
CEQ 2000XL DNA Analysis System Beckman Coulter DNA sequencing
Vector NTI Advance 11.5.0 Life Technologies 12605099 DNA sequence analysis

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kim, B. H., Gadd, G. M. Bacterial physiology and metabolism. Cambridge University Press. Cambridge. (2008).
  2. Hayes, F. Transposon-based strategies for microbial functional genomics and proteomics. Annual review of genetics. 37, 3-29 (2003).
  3. Hoffman, L. M. Random chromosomal gene disruption in vivo using transposomes. Methods in molecular biology. 765, Clifton, N.J. 55-70 (2011).
  4. Goryshin, I. Y., Jendrisak, J., Hoffman, L. M., Meis, R., Reznikoff, W. S. Insertional transposon mutagenesis by electroporation of released Tn5 transposition complexes. Nature biotechnology. 18, (1), 97-100 (2000).
  5. Dower, W. J., Miller, J. F., Ragsdale, C. W. High Efficiency Transformation of E. coli by High Voltage Electroporation. Nucleic Acids Research. 16, (13), 6127-6145 (1988).
  6. Metcalf, W. W., Jiang, W., Wanner, B. L. Use of the rep technique for allele replacement to construct new Escherichia coli hosts for maintenance of R6Kγ origin plasmids at different copy numbers. Gene. 138, (1-2), 1-7 (1994).
  7. Morgulis, A., Coulouris, G., Raytselis, Y., Madden, T. L., Agarwala, R., Schäffer, A. a Database indexing for production MegaBLAST searches. Bioinformatics. 24, (16), Oxford, England. 1757-1764 (2008).
  8. Zhang, Z., Schwartz, S., Wagner, L., Miller, W. A greedy algorithm for aligning DNA sequences. Journal of computational biology a journal of computational molecular cell biology. 7, (1-2), 203-214 (2000).
  9. Holmes, A., Vinayak, A., et al. Comparison of two multimetal resistant bacterial strains: Enterobacter sp. YSU and Stenotrophomonas maltophilia OR02. Current microbiology. 59, (5), 526-531 (2009).
  10. Hoffman, L. M., Jendrisak, J. J., Meis, R. J., Goryshin, I. Y., Reznikoff, W. S. Transposome insertional mutagenesis and direct sequencing of microbial genomes. Genetica. 108, (1), 19-24 (2000).
  11. Ausubel, F., Brent, R., et al. Short Protocols in Molecular Biology. John Wile., & Sons, Inc. New York, NY. (1997).
  12. Miller, J. H. A short course in bacterial genetics: a laboratory manual and handbook for Escherichia coli and related bacteria. 2, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Plainview, N.Y. (1992).
  13. Gibson, M. I., Gibson, F. Preliminary studies on the isolation and metabolism of an intermediate in aromatic biosynthesis: chorismic acid. The Biochemical journal. 90, (2), 248-256 (1964).
  14. Jacobs, M. A., Alwood, A., et al. Comprehensive transposon mutant library of Pseudomonas aeruginosa. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, (24), (2003).
  15. Reznikoff, W., Winterberg, K. Transposon-Based Strategies for the Identification of Essential Bacterial Genes. Microbial Gene Essentiality: Protocols and Bioinformatics SE. 2, 13-26 (2008).
  16. Suzuki, N., Inui, M., Yukawa, H. Random genome deletion methods applicable to prokaryotes. Applied Microbiology and Biotechnology. 79, (4), 519-526 (2008).
  17. Malley, M. A., Powell, A., Davies, J. F., Calvert, J. Knowledge-making distinctions in synthetic biology. BioEssays news and reviews in molecular, cellular and developmental biology. 30, (1), 57-65 (2008).
  18. Zheng, Y. -N., Li, L. -Z., et al. Problems with the microbial production of butanol. Journal of industrial microbiolog., & biotechnology. 36, (9), 1127-1138 (2009).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics