一个高度可重复的和直接的方法来执行
1Department of Biology, KU Leuven - University of Leuven
* These authors contributed equally

Published 10/06/2014
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Biology
 

Summary

去除眼,也叫剜除,为研究沿哺乳动物视觉系统的可视化,跨模态和发育可塑性方面,因为它导致不可逆的部分(单眼)或完全(双眼)视力减退有用的策略。在这里,我们描述了一个高度可重复的和直接的方法, 在体内摘除术表演。

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Aerts, J., Nys, J., Arckens, L. A Highly Reproducible and Straightforward Method to Perform In Vivo Ocular Enucleation in the Mouse after Eye Opening. J. Vis. Exp. (92), e51936, doi:10.3791/51936 (2014).

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Abstract

剜除术或手术切除的眼睛一般可以视为典范神经传入神经阻滞。它提供了可视化研究,跨模态的发育可塑性的不同方面以及哺乳动物的视觉系统1-4的宝贵工具。

在这里,我们证明了优雅和简单的技术,用于除去的一个或两个眼睛的小鼠,其在20天龄达小鼠对成年人进行验证。简言之,将消毒的弯钳是用来夹持眼后面的视神经。随后,圆周运动中进行,以收缩视神经和取出眼球。这种技术的优点是高的再现性,最小或没有出血,快速术后恢复和对实验者非常低的学习阈值。因此,大量的动物可以被操纵和精力最小量的处理。该技术的性质可引起轻微损坏在手术过程中的视网膜。这种副作用使得这种方法不适合作为比较马哈詹等人(2011)5,如果目标是要收集和分析视网膜组织。此外,我们的方法仅限于后睁眼年龄(鼠标:P10 - 13日起),因为眼球需要从插座移位不去除眼睑。在这个手稿中描述的体内摘除术的技术最近已成功地与小的修改适用于大鼠和研究啮齿类动物的传入视觉通路一般会出现非常有用。

Introduction

取出眼,从而不可逆转地自毁感觉受体表面(视网膜),规定了相当的损失感觉输入沿视觉通路。在幼年和成年视觉系统中的去核的模型已经被证明是在理解的不同的视觉中心1-4的发展,可塑性和功能有价值。这种感觉丧失的分子,细胞和生理后果可以提供深入了解皮质电路发展如何正常的调节,以及如何既定处理,并响应改变其结构和功能,以经验这样一个广泛的改变。

视觉剥夺的方法不同,存在的,他们都有自己的视力相关的研究特定的优势。例如暗饲养具体地说消除视觉驱动活动但它不影响自发视网膜活性。同样地,盖缝线或眼罩去除图案visuaL输入,而不会干扰自发活动,但他们可以通过闭上眼睛分散的光线穿透。这些方法都是可逆的,并已被证明是在理解的双眼输入图案的视觉和低级别的相关性在发展中6-8塑身皮质回路的作用价值。在青光眼的研究,在成年动物的视神经损伤模型已被广泛使用,因为它确立了构成视神经9,10视网膜神经节细胞的输入累进损失。另一方面,去核,其中所述眼,从而在视网膜完全和立即除去,是剥夺的适当的选择,当目标是在一次不可逆地除去是自发性的,图案化的视野。它也导致一个强大的眼压活性不平衡,可提高信号噪声比在活性作图研究11,12。比较功能和结构的变化响应眼球摘除与日OSE剥夺通过温和的方法,例如盖缝合例如之后,也可能会暴露出新的见解自发视网膜活性的两种稳态和突触可塑性类型的角色。

眼球摘除触发营养的影响,在视网膜的直接目标的损失。例如,BDNF的水平显著在外侧膝状体(LGN)和成年大鼠去核13的上丘下调。活性氧,它充当信使分子介导的结构重塑,也分别在成年大鼠视觉系统14的皮层下结构检测。此外,小胶质细胞和星形胶质细胞的活化在不同的皮层下的视觉目标结构中的鼠标发生在一个15星期的特定后眼球摘除的时间框架。一起,视神经传入神经阻滞导致的神经胶质,结构和分子水平不同的皮层下的反应。尽管有这些皮层下的影响,并不一定牵涉在皮层水平16特效。这两个单眼后值得注意的是,跨通道皮质可塑性,包括修改在其他感官方面旁边的非视觉输入到被剥夺视觉皮层的加强会发生(ME)的3,4,17,18和双眼(BE)1,17眼球摘除。

除了 ​​有助于视觉神经,去核的类型传入神经 ​​阻滞可被用来研究对中枢神经系统的神经保护19和神经变性20-22性能之间的平衡。

不同的程序进行眼球摘除文献中已经有说明。用于体内 ME在大鼠和小鼠中的某些方法是较复杂的,由于轨道的肌肉和组织23-25 ​​不必要的切片。其他出版物如马哈詹等人 (2011)5使用提供一份详细的协议钝性分离对眼睛的一种高通量的收集,研究基因型 - 表型的相关性,可能验尸。对于他们的目的,该方法简便,快速。然而,该方法是不太适合体内摘除术时人们选择学习的传入视觉通路下列摘除术(在活的动物),而不是眼睛本身。在这样的设置,后期摘除术的生存是非常重要。此外,最小的体内损伤和保存视神经和眼眶组织是有利的。这里,我们提出了一种替代眼球摘除方法,更类似于由Faguet 等人所描述的(2008)26,它提供某些有利的特性它具有快速的术后恢复相关联,其特征是一个非常低的学习阈研究人员。一般情况下,不同的方法是互补取决于后续研究的重点:眼部形态或视觉通路的研究。

ve_content“>总之,剜除术可以从视觉研究应用朝着稳态和跨模态脑的可塑性,胶质反应性,以及轴突稳定性调查,在这个可视化的文章中,我们证明在体内摘除眼球的一种可行和可靠的方法鼠标。

Protocol

所有实验均批准了鲁汶大学的研究伦理委员会,均严格按照欧共体理事会指令2010年9月22日(2010/63 /欧盟),并与比利时的法律(KB 29日2013年5月)。尽一切可能的努力,以尽量减少动物的痛苦,并减少动物的数量。

1,动物诊疗和麻醉剂

  1. 麻醉小鼠腹膜内注射盐酸氯胺酮(75毫克/毫升)和盐酸美托咪定(1毫克/千克)在盐水的混合物。
  2. 按捏脚趾用钳,以保证鼠标完全镇静检查反射。
  3. 应用70%乙醇消毒眼睑,并用棉签眼睛周围的区域。检查眼睑反射到另外评估镇静程度。

2,取出眼

  1. 确保动物驻留在平整,干燥和光滑的表面。
  2. 消毒镊子用弯曲的,锯齿状的尖端(首选头尺寸:0.5×0.4毫米)。
  3. 轻轻按到眼角(眼角),与之前的眼球从插槽中流离失所,视神经可达镊子。
  4. 引导视线背后的镊子。按住视神经牢固,优选与弯道的开始和钳子的不是很尖。这将有助于从插座全球,用镊子将完整的视神经。
  5. 作圆周运动的手拿着镊子与阻力最小的方向,而鼠标仍然在平坦的表面上。鼠标将根据手移动的方向沿着表面摆动。
  6. 与逐渐增加的速度执行这个动作,直到视神经收缩的两个(通常在7至15圆周运动,约半至每秒一整圈)。因此,分离的眼球删除。

3,术后护理

  1. 如果出血(罕见)的,充满粘性凝结和止血剂的轨道。
  2. 通过注射1毫克/千克盐酸atipamezol在盐水腹膜内扭转麻醉。
  3. 辖1毫克/千克美洛昔康的腹腔内,每24小时,以减轻疼痛。
  4. 应用眼膏剩余的眼睛,以防止角膜脱水。
  5. 让动物恢复在加热板上或包裹在一个单独的笼子,以控制体温绝缘材料的动物。
  6. 每天测量小鼠的体重,至少2天。重量的损失可以表示痛苦和在这种情况下,继续美洛昔康治疗,直到动物被完全恢复。

Representative Results

图1示出了使用所描述的协议的成功摘除眼球,并且特征在于没有出血或眶组织或眼圈( 图1A,1B)的任何明显的物理破坏。此外,除去眼具有平滑的角膜,脉络膜和光盘中,表示为一个完全不变地球( 图1C)。因为我们的协议包括眼球和机械车削后视神经的夹紧,将除去的眼的视神经是缩在视网膜上( 图1D)的基极。在执行上述过程的结果在一个干净的切割视神经而不向周围脑区域( 图1E)的任何损坏。

单眼摘除术,与活动的映射( 图2)的组合,使人们得以大幅描绘功能或眼睛特定输入区域在对侧visua鼠标12,27甚至眼优势列在高阶哺乳动物象猴子28的升皮质。

在小鼠实验中,除去一个的(ME)或双眼(BE)结合有针对性的视觉刺激和zif268基因或c-Fos蛋白的表达水平,检测施加到露出的区域的神经元激活在视觉皮层12,27 。相反,在视觉刺激的控制( 图2A),BE小鼠显示出在由于完全缺乏视觉输入( 图2B)的视觉皮质基底活动。正因为如此,使用非视觉皮层( 躯体感觉皮层在更前的部分和在更后段听觉皮层)视觉之间的边界被揭露。结果从ME的小鼠进行为期一周的存活时间可视眼睛特定的输入地区,在对侧视觉皮层。这两个单眼带动地区是机能减退和位于MEDI人与横向的中央双目区( 图2C)的。

图1
眼窝中,取出眼球和视神经的后眼球摘除状态图1定性评价。摘除眼球用弯钳( 一)无出血或损伤眼窝( 二)观察后。被删除的眼睛是完全不变所反映的角膜和脉络膜(C,D)的正常外观。视神经被缢缩在视盘,其中它离开眼睛(D)。考试大脑的腹侧部分揭示了一个干净的切割视神经(星号)和其他结构(E)没有明显的损伤。比例尺在C,D:1毫米。在电子商务比例尺:5毫米。答:前; L:左;病人:后路; R:对。


图中的鼠标视觉皮层所揭示的眼球摘除2眼功能输入特定的细分 。连接眼睛和皮质黑色和灰色线代表了跨越传入视网膜和眼睛特定的输入区域。神经活动可视化的控制( 一)冠状切片,BE(B)ME(C)小鼠放射性原位杂交(ISH)的zif268(灰度)前囟门左右的水平-3.40毫米。在对照组动物(一),在两个半球的视觉皮层表达了以下的视觉刺激活性高。当一个或两个眼睛(s)值摘除,在活动信号清晰的降低是在对应剥夺皮层区域可见。单眼去核(C)的小鼠表现出较高的ACTi的区域VITY在视觉皮层由下降信号在单眼区对侧取出的眼睛所包围的双目区。比例尺:2毫米。转载自范布鲁塞尔[12]的权限。

Discussion

根据我们的方法执行成功摘除术,要考虑的最重要的步骤是:1)使用镊子与适当大小的弯曲和锯齿尖; 2)表演光滑,干燥的表面去核;和3)逐渐加快了圆周运动中,用最少的摩擦方向。

对于一个有效的结果,就必须使用特点是弯曲的,锯齿状的尖端合适的镊子(最好头尺寸:鼠标:0.5×0.4毫米;鼠:2.15×1.3毫米)。曲率使得眼球移位后容易进入视神经和进行圆周运动时,有必要正确的手的位置。流畅的提示不推荐,因为他们持有的视神经时缺乏必要的抓地力。故障期间的圆运动适当保持视神经导致眼动脉,眼的剥离差和再现性,因此较差的断裂。因此,建议首先实践本技术的实施安乐死的动物进行处理,以保证最大的动物福利一旦施加的方法在体内钳子的最优化。成功的眼眼球摘除最近也已在大鼠中使用相同的技术,除了手工转动动物体和保持镊子固定的执行在我们的实验室中。

该技术的一个限制是,它可能损害视网膜。因此,该方法是不太适合用于收集视网膜进行组织学5。此外,我们的方法是有限的张贴睁眼青睐,因为眼球需要从插座位移不除去或切断眼睑。

在不同的物种,包括啮齿类动物的眼睛剜除术,是经常进行使用替代方法,这往往带来切除眼睑和切断视神经18,23-25。这些实现方法具DS往往更侵入,并有比这里所描述的技术,较高的学习曲线。无需去除或缝合眼睑,在手术后的恢复时间被最小化,从而获得更高的动物福利和更可重复的结果。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ketamine hydrochloride (Anesketin) Dechra Veterinary Products (Eurovet) BE-V136516
Medetomidine hydrochloride (Domitor) Orion Corporation (Janssen Animal Health) BE-V151742
Atipamezol hydrochloride (Antisedan) Orion Corporation (Elanco Animal Health) BE-V153352
Antibiotics (cefazolin, Kefzol) Eurocept Pharmaceuticals BE 106267
Eye ointment (Fucithalmic) Leo Pharma nv-sa BE 144654
Moria MC31 Forceps - Serrated Curved Fine Science Tools 11370-31 For application in the mouse. Any forceps with similar dimensions can be used as long as the tip is curved and serrated.
Narrow Pattern Forceps - curved Fine Science Tools 11003-13 For application in the rat. Any forceps with similar dimensions can be used as long as the tip is curved and serrated.
Hemostatic cotton wool Qualiphar N/A Other hemostatic agents are equally suitable (e.g., Viscostat, #649, Ultradent Products)

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