実行するには非常に再現性と簡単な方法
1Department of Biology, KU Leuven - University of Leuven
* These authors contributed equally

Biology
 

Summary

また、脱核と呼ばれる目の除去は、それが不可逆的な部分(単眼)または完全な(両眼)視力低下を誘導するため、視覚的なクロスモーダル、および哺乳動物の視覚系に沿って発達可塑性の側面を研究するための有用な戦略を提供しています。ここでは、 生体内で脱核実行するには、非常に再現性と簡単な方法について説明します。

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Aerts, J., Nys, J., Arckens, L. A Highly Reproducible and Straightforward Method to Perform In Vivo Ocular Enucleation in the Mouse after Eye Opening. J. Vis. Exp. (92), e51936, doi:10.3791/51936 (2014).

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Abstract

摘出または眼の外科的除去は、一般的に、神経求心路遮断のためのモデルとして考えることができる。これは、哺乳動物の視覚系1-4に沿って視覚的に、クロスモーダル·発生の可塑性の異なる側面を研究するための貴重なツールを提供します。

ここでは、大人2名まで20日齢のマウスでは検証されたマウスの1の除去または両眼のためのエレガントで簡単な方法を実証する。簡単に言うと、消毒湾曲した鉗子は、目の後ろに視神経をクランプするために使用されます。その後、円の動きは、視神経を収縮し、眼球を除去するために行われる。この技術の利点は、高い再現性、無出血への最小限の、迅速な術後の回復や実験者のための非常に低い学習しきい値です。したがって、動物の大量の最小限の労力で操作し、処理することができる。技術の性質は、わずかに損傷を誘導する可能性が手順中の網膜。この副作用は、マハジャンと比較して、この方法はあまり適しています。(2011)5ゴールは、網膜組織を収集し、分析することであれば。眼球がまぶたを削除せずにソケットから変位させる必要があるので - :また、私たちの方法は、ポストアイ開口の年齢(13年以降P10マウス)に制限されています。この原稿に記載のin vivoでの除核技術は、最近成功したラットにおいて軽微な変更を加えて適用され、一般的にはげっ歯類の求心視経路を研究するために有用であると思われています。

Introduction

目を削除し、それにより不可逆的感覚受容体表面(網膜)を破壊、視覚路に沿って感覚入力のかなりの損失を課す。若年及び成体視覚系における摘出モデルは、異なる視覚中心1-4の発達、可塑性および機能を理解する上で貴重であることが証明された。この感覚遮断の、分子細胞および生理学的結果は、皮質回路が対処し、経験ではそのような大規模な変更に対応して、その構造と機能をどのように変化するか正常な発達調節されているとどのように確立された洞察を提供することができます。

視覚的剥奪の異なる方法が存在し、それらはすべて、ビジョン関連の研究では、それらの具体的な利点があります。例えば、暗い飼育は、具体的にはまだそれが自発的な網膜活性に影響を与えない、視覚的に駆動アクティビティを排除します。同様に、蓋縫合糸またはアイパッチは、パターン化された映像設備を削除L入力自発活動を妨害することなく、彼らは、閉じた目を通して分散光の透過を可能にする。これらの方法は、可逆的であり、開発6-8中に皮質回路を彫刻における眼の入力のパターン化視覚および低レベルの相関の役割を理解する上で貴重であることが示されている。それは視神経9,10を構成網膜神経節細胞の入力の進行性の喪失を確立するため、緑内障の研究では、成体動物における視神経挫滅モデルが広く用いられている。目的は不可逆的に一度に自発的でパターン化された両方のビジョンを削除するときに、目とは、このように、網膜が完全に瞬時に取り除かれる一方、脱核、上、剥奪の適切な選択である。また、活動マッピング研究11,12における信号対雑音比を向上させることができる強固な眼内活動の不均衡を誘発する。目に摘出に応答して、機能的および構造的変化を比較する大証、例えば蓋縫合糸としてはあまり思い切った方法によって、剥奪した後、また、可塑性の恒常性とシナプス型の両方の自発網膜活動の役割に新たな洞察を公開する可能性があります。

除核は、直接網膜標的における栄養の影響の損失をトリガします。例えば、BDNFレベルが有意に外側膝状核(LGN)と成人の除核したラット13の上丘で下方制御されている。構造的リモデリングを媒介するメッセンジャー分子として機能する反応性酸素種もまた、成体ラットの視覚システム14の皮質下の構造で検出された。さらに、マウスの異なる皮質下の視覚ターゲット構造全体のミクログリアおよびアストログリアの活性化は、一週間15の具体的なポスト摘出時間枠で起こる。一緒に、グリア、構造的および分子レベルで異なる皮質下の応答における視神経求心路遮断をもたらす。これらの皮質下にもかかわらず効果は、必ずしも、皮質レベル16での効果を巻き込むません。奪わ視覚野への非視覚的な入力の強化の隣に他の感覚分野の修正を含む注目すべきは、クロスモーダル皮質可塑性は、単眼(ME)3,4,17,18および双眼(BE)1,17の両方の後に発生摘出。

別に視覚神経科学に貢献するから、求心路遮断のタイプとして除核は、中枢神経系の19の神経保護及び神経変性20-22特性のバランスを研究するために使用することができる。

摘出を実行するための異なる手順は、既に文献に記載されている。ラットとマウスにおけるin vivo私の ​​ためにいくつかの方法論が原因軌道筋肉や組織23〜25の不必要な切片にあまり簡単である。そのようなマハジャンのような他の出版。(2011)5を用いて詳細なプロトコルを提供遺伝子型 - 表現型の相関関係を研究するための、目の高スループット収集、おそらく検死のための鈍的切開。その目的のために、この方法は、便利で速い。一つは(生きた動物での)除核ではなく、目自体、次求心視覚路を勉強することを選択するときしかし、この方法は、in vivoでの摘出にはあまり適しています。このような設定では、後の摘出生存率は非常に重要である。また、 生体内の損傷や視神経の保存および眼窩組織における最小限のは有利で ​​ある。 ここで、私たちはファゲにより記載されたものと類似の代替摘出方法を提示する(2008)26、すなわち、特定の有利な特性を提供する:それは、迅速な術後回復に関連しており、非常に低い学習しきい値によって特徴付けられる研究者のための。眼の形態学的または視覚的経路の研究:一般的に、異なる方法が、その後の研究の焦点に応じて相補的である。

ve_contentは">要するに、摘出は恒常性とクロスモーダル脳の可塑性、グリア応答特性、および軸索の安定性の調査に向けてのビジョンの研究から適用することができます。この可視化の記事では、私たちがin vivoでの眼の摘出のために実行可能で信頼性の高い方法を実証マウス。

Protocol

全ての実験は、KUルーベンの倫理調査委員会により承認され、2010年9月22日の欧州共同体理事会指令(63分の2010 / EU)に厳密に従ってとベルギーの法律(2013年5月29日のKB)であった。あらゆる努力は、動物の苦痛を最小限にし、動物の数を減らすために行われた。

1動物の治療と麻酔

  1. 塩酸ケタミン(75 mg / ml)を生理食塩水でメデトミジン塩酸塩(1mg / kg)の混合物の腹腔内注射でマウスを麻酔。
  2. マウスが完全に鎮静されている保証するために鉗子でつま先をつまんで反射神経をチェックしてください。
  3. まぶたや綿棒を使って、目の周囲の領域を消毒するために70%エタノールを適用します。さらに鎮静の程度を評価するためにまぶた反射を確認してください。

2アイの削除

  1. 乾いた、動物が平らに常駐していることを確認して、滑らかな表面。
  2. 湾曲した、鋸歯状の先端部(:0.5×0.4ミリメートル優先チップサイズ)鉗子を滅菌する。
  3. 静かに眼球をソケットから変位して視神経が到達可能であるされるまで、鉗子で眼角(目の角)に押してください。
  4. 目の後ろの鉗子ガイド。押しては、好ましくは、曲線の始点と鉗子のではない、非常に先端で、しっかりと視神経を開催しています。これはソケットから地球を持ち上げるようにし、完全な視神経をクランプするのに役立ちます。
  5. マウスは、平らな面にしたまま手が最も抵抗のある方に鉗子を保持した円の動きを作る。マウスは、手の動きの方向に応じて表面に沿ってスイングします。
  6. 視神経が二つに絞られるまで漸増速度でこのアクションを実行します(通常は7〜15円の動きとの間に、約半分毎秒1フルターンまで)。したがって、デタッチ目玉です削除しました。

3。術後ケア

  1. (まれ)出血の場合には、粘性の凝固および止血剤で軌道を埋める。
  2. 腹腔内に生理食塩水にatipamezol塩酸塩を1mg / kgで注入して麻酔を元に戻します。
  3. 痛みを和らげるために腹腔内に24時間毎メロキシカムの1mg / kgのを管理します。
  4. 角膜の脱水を防ぐために、残りの眼に眼軟膏を適用します。
  5. 動物は、加熱プレート上回復または体温を制御するために個別のケージに絶縁材料で動物をラップしてみよう。
  6. 最低2日間毎日マウスの体重を測定します。重量の損失は、苦痛を示し、動物が完全に回復するまで、この場合には、メロキシカムの治療を継続することができる。

Representative Results

図1に記載したプロトコルを用いて眼の正常な除去を示し、出血の非存在下または眼窩組織または眼窩( 図1A、1B)に明らかな物理的損傷によって特徴付けられる。さらに、削除された眼は完全に無傷の地球儀( 図1C)の指標と、滑らかな角膜、脈絡膜および光ディスクを持っています。私たちのプロトコルは、目と機械旋盤の後ろに視神経のクランプを包含しているため、削除された眼の視神経は、網膜( 図1D)の基部にくびれている。周囲の脳領域( 図1E)を損傷することなく、きれいなカットの視神経に記載されたプロシージャの結果を実行する。

単眼摘出は、活動マッピング( 図2)との組み合わせで、一方が急激に反対映像設備で機能的または眼特定の入力領域を描写することができサル28のような高次の哺乳動物におけるマウス12,27、さらには眼優位コラムlの皮質。

マウスを用いた実験では、一方の除去(ME)または両眼(BE)は、ターゲットを絞った視覚刺激と組み合わせ、 をZif268のmRNAまたはc-Fos蛋白質発現レベルの検出は、視覚野12,27の地域ニューロンの活性化を明らかにするために適用した。視覚的に刺激された対照( 図2A)とは対照的に、BEマウスは、視覚入力( 図2B)の欠如を完了することにより、視覚野において基底活性を示した。このように、非視覚野( すなわち 、より前方部分より後方のセクションの聴覚野における体性感覚皮質)との視覚との間に境界線が発見された。 1週間の生存時間で私のマウスからの結果は、反対側の視覚皮質に目特定の入力領域を可視化した。 2単眼駆動型の領域は、低活動だったとメディ位置アルと中央両眼ゾーン( 図2C)の横。

図1
眼窩、取り出し、目と視神経の後の除核状態の図1。定性的評価。曲がったピンセット(A)は出血や損傷が眼窩(B)に観察されないと、眼を除去した後。角膜および脈絡膜(C、D)の通常の出現によって反映されるように除去された眼は、完全に無傷である。視神経は、目(D)を残す視神経乳頭に絞られている。脳の腹側の部分の検査は、きれいにカット視神経(アスタリスク)およびその他の構造(E)の明白な損傷を明らかにしている。 C、D中のスケールバー:1ミリメートル。 E中のスケールバー:5ミリメートル。 :前方; L:左; P:後部; R:右。


図摘出によって明らかにされたマウス視覚野における2。機能が目を入力固有の下位区分 。目や皮質を接続黒と灰色の線は、網膜求心と目特定の入力領域の上の交差を表す。神経活動は、コントロールの冠状断面上で可視化(A)、(B)BE、そしてブレグマレベルの周りのZif268のためのin situハイブリダイゼーション (ISH) 放射性によるME(C)マウス(グレースケール)-3.40 mmである。コントロール動物(A)は、両半球での視覚野は、視覚的な刺激後に高活性を発現する。一方または両方の眼(群)を摘出した場合、活動信号の明らかな減少が奪わ皮質領域の対応に表示されます。単眼は(C)マウスは、高ACTIのゾーンを示して除核削除された眼の反対単眼ゾーンで減少した信号に囲まれた視覚野の両眼ゾーンでVITY。スケールバー:2ミリメートル。ヴァンブリュッセル 12からの許可を得て転載。

Discussion

私たちの方法に従って成功した除核を行うためには、考慮すべき最も重要なステップは、1)適切なサイズの湾曲や鋸歯状の先端を有するピンセットを用いて; 2)滑らかで乾燥した表面上の摘出を実施する。 3)徐々少なくとも摩擦方向に円の動きをスピードアップ。

効果的な結果のためには、湾曲した鋸歯状の先端部(;:2.15のx 1.3ミリメートル:マウス、ラットのx 0.4ミリメートル0.5優先先端サイズ)を特徴とする、適切な鉗子を使用することが不可欠である。曲率は眼球変位後視神経への容易なアクセスを可能にし、円運動を行う際に、正しい手の配置が必要である。視神経を保持しているときに、必要なグリップを欠いているので、スムーズなヒントが推奨されていません。円の動きの間、適切に視神経を保持しないと、眼動脈、眼の貧しい離脱ひいては貧困再現性の破壊をもたらす。そのためには、 生体内での方法を適用した後、最大の動物福祉を保証するために、取り扱い鉗子の最適化のために安楽死させた動物に最初の練習にこの手法をお勧めします。成功した眼の摘出は、最近、手動で動物体を旋回し、鉗子を静止状態に保つことを除いて同じ手法を用いて研究室でラットにおいて行われた。

技術の一つの制限は、おそらく網膜を損傷する可能性がある。したがって、この方法は、組織学5を実行するために網膜を収集するにはあまり適していない。眼球がまぶたを削除するか、切断することなく、ソケットから変位される必要があるので、私たちの方法は、年齢を開いて目を投稿する制限されています。

げっ歯類を含む異なる種における眼の摘出は、日常的に、多くの場合、まぶたの除去を必要と視神経18,23-25 ​​を切断する別の方法を用いて行われる。これらのメトdsはより侵襲的である傾向があり、ここに記載の技術よりも高い学習曲線を持っている。取り外しやまぶたを縫合する必要性がなければ、手術後の回復時間は、より高い動物福祉と、より再現性のある結果をもたらし、最小化される。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ketamine hydrochloride (Anesketin) Dechra Veterinary Products (Eurovet) BE-V136516
Medetomidine hydrochloride (Domitor) Orion Corporation (Janssen Animal Health) BE-V151742
Atipamezol hydrochloride (Antisedan) Orion Corporation (Elanco Animal Health) BE-V153352
Antibiotics (cefazolin, Kefzol) Eurocept Pharmaceuticals BE 106267
Eye ointment (Fucithalmic) Leo Pharma nv-sa BE 144654
Moria MC31 Forceps - Serrated Curved Fine Science Tools 11370-31 For application in the mouse. Any forceps with similar dimensions can be used as long as the tip is curved and serrated.
Narrow Pattern Forceps - curved Fine Science Tools 11003-13 For application in the rat. Any forceps with similar dimensions can be used as long as the tip is curved and serrated.
Hemostatic cotton wool Qualiphar N/A Other hemostatic agents are equally suitable (e.g., Viscostat, #649, Ultradent Products)

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References

  1. Toldi, J., Fehér, O., Wolff, J. R. Neuronal plasticity induced by neonatal monocular (and binocular) enucleation. Progress in Neurobiology. 48, (3), 191-218 (1996).
  2. Steeves, J. K. E., González, E. G., Steinbach, M. J. Vision with one eye: a review of visual function following unilateral enucleation. Spatial vision. 21, (6), 509-529 (2008).
  3. Van Brussel, L., Gerits, A., Arckens, L. Evidence for cross-modal plasticity in adult mouse visual cortex following monocular enucleation. Cerebral Cortex. 21, (9), 2133-2146 (2011).
  4. Nys, J., Aerts, J., Ytebrouck, E., Vreysen, S., Laeremans, A., Arckens, L. The cross-modal aspect of mouse visual cortex plasticity induced by monocular enucleation is age-dependent. Journal of Comparative Neurology. 522, (4), 950-970 (2014).
  5. Mahajan, V. B., Skeie, J. M., Assefnia, A. H., Mahajan, M., Tsang, S. H. Mouse eye enucleation for remote high-throughput phenotyping. Journal of Visualized Experiments. (57), e57 (2011).
  6. Morales, B., Choi, S. -Y., Kirkwood, A. Dark rearing alters the development of GABAergic transmission in visual cortex. Journal of Neuroscience. 22, (18), 8084-8090 (2002).
  7. Chen, X. J., Rasch, M. J., Chen, G., Ye, C. Q., Wu, S., Zhang, X. H. Binocular input coincidence mediates critical period plasticity in the mouse primary visual cortex. Journal of Neuroscience. 34, (8), 2940-2955 (2014).
  8. Konur, S., Yuste, R. Developmental regulation of spine and filopodial motility in primary visual cortex: Reduced effects of activity and sensory deprivation. Journal of Neurobiology. 59, (2), 236-246 (2004).
  9. Parrilla-Reverter, G., et al. Time-course of the retinal nerve fibre layer degeneration after complete intra-orbital optic nerve transection or crush: A comparative study. Vision Research. 49, (23), 2808-2825 (2009).
  10. Galindo-Romero, C., et al. Axotomy-induced retinal ganglion cell death in adult mice: Quantitative and topographic time course analyses. Experimental Eye Research. 92, (5), 377-387 (2011).
  11. Kanold, P. O., Kim, Y. A., GrandPre, T., Shatz, C. J. Co-regulation of ocular dominance plasticity and NMDA receptor subunit expression in glutamic acid decarboxylase-65 knock-out mice. The Journal of Physiology. 587, (12), 2857-2867 (2009).
  12. Van Brussel, L., Gerits, A., Arckens, L. Identification and localization of functional subdivisions in the visual cortex of the adult mouse. Journal of Comparative Neurology. 514, (1), 107-116 (2009).
  13. Avwenagha, O., Bird, M. M., Lieberman, A. R., Yan, Q., Campbell, G. Patterns of expression of brain-derived neurotrophic factor and tyrosine kinase B mRNAs and distribution and ultrastructural localization of their proteins in the visual pathway of the adult rat. Neuroscience. 140, (3), 913-928 (2006).
  14. Hernandes, M. S., Britto, L. R. G., Real, C. C., Martins, D. O., Lopes, L. R. Reactive oxygen species and the structural remodeling of the visual system after ocular enucleation. Neuroscience. 170, (4), 1249-1260 (2010).
  15. Cuyvers, A., Paulussen, M., Smolders, K., Hu, T. -T., Arckens, L. Local cell proliferation upon enucleation in direct retinal brain targets in the visual system of the adult mouse. Journal of Experimental Neuroscience. 4, 1-15 (2010).
  16. Smith, S. L., Trachtenberg, J. T. Experience-dependent binocular competition in the visual cortex begins at eye opening. Nature Neuroscience. 10, (3), 370-375 (2007).
  17. Toldi, J., Farkas, T., Völgyi, B. Neonatal enucleation induces cross-modal changes in the barrel cortex of rat. A behavioural and electrophysiological study. Neuroscience Letters. 167, (1-2), 1-4 (1994).
  18. Newton, J. R., Sikes, R. W., Skavenski, A. A. Cross-modal plasticity after monocular enucleation of the adult rabbit. Experimental Brain Research. 144, (4), 423-429 (2002).
  19. Lalonde, J., Chaudhuri, A. Dynamic changes in CREB phosphorylation and neuroadaptive gene expression in area V1 of adult monkeys after monocular enucleation. Molecular and Cellular Neuroscience. 35, (1), 24-37 (2007).
  20. You, Y., Gupta, V. K., Graham, S. L., Klistorner, A. Anterograde degeneration along the visual pathway after optic nerve injury. PLoS ONE. 7, (12), e52061 (2012).
  21. Kelly, K. R., McKetton, L., Schneider, K. A., Gallie, B. L., Steeves, J. K. E. Altered anterior visual system development following early monocular enucleation. NeuroImage: Clinical. 4, 72-81 (2014).
  22. Chow, A. M., Zhou, I. Y., Fan, S. J., Chan, K. W. Y., Chan, K. C., Wu, E. X. Metabolic changes in visual cortex of neonatal monocular enucleated rat: a proton magnetic resonance spectroscopy study. International Journal of Developmental Neuroscience. 29, (1), 25-30 (2011).
  23. Dyer, R. S., Hammond, M. Effects of enucleation in retinal degenerate mice. Physiology & behavior. 14, (2), 207-210 (1975).
  24. Smith, S. A., Bedi, K. S. Unilateral eye enucleation in adult rats causes neuronal loss in the contralateral superior colliculus. Journal of Anatomy. 190, (4), 481-490 (1997).
  25. Gonzalez, D., et al. Effects of monocular enucleation on calbindin-D 28k and c-Fos expression in the lateral geniculate nucleus in rats. Okajimas folia anatomica Japonica. 82, (1), 9-18 (2005).
  26. Faguet, J., Maranhao, B., Smith, S. L., Trachtenberg, J. T. Ipsilateral eye cortical maps are uniquely sensitive to binocular plasticity. Journal of Neurophysiology. 101, (2), 855-861 (2008).
  27. Van der Gucht, E., Hof, P. R., Van Brussel, L., Burnat, K., Arckens, L. Neurofilament protein and neuronal activity markers define regional architectonic parcellation in the mouse visual cortex. Cerebral Cortex. 17, (12), 2805-2819 (2007).
  28. Chaudhuri, A., Matsubara, J. A., Cynader, M. S. Neuronal activity in primate visual cortex assessed by immunostaining for the transcription factor Zif268. Visual Neuroscience. 12, (1), 35-50 (1995).

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