タンパク質機能に2DE - ゲルスポットから:慢性リンパ性白血病で、HS1から学んだレッスン

Medicine

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Summary

ここでは、カップル2プロテオミクス技術、すなわち2次元電気泳動(2DE)および質量分析(MS)は、一次サンプルの2つ以上のグループ間で差次的に発現/翻訳後修飾タンパク質を同定するためのプロトコールを記載する。このアプローチは、一緒に機能的な実験と、予後マーカー/治療標的の同定および特徴を可能にします。

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Apollonio, B., Bertilaccio, M. T. S., Restuccia, U., Ranghetti, P., Barbaglio, F., Ghia, P., Caligaris-Cappio, F., Scielzo, C. From a 2DE-Gel Spot to Protein Function: Lesson Learned From HS1 in Chronic Lymphocytic Leukemia. J. Vis. Exp. (92), e51942, doi:10.3791/51942 (2014).

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Abstract

腫瘍の開始と進行に関与する分子の同定は、患者の臨床管理のために、結果として、理解病の生物学のための基本であり。本研究では、慢性リンパ性白血病(CLL)の進行に関与する分子の同定のために最適化されたプロテオミクスアプローチを説明する。詳細には、白血病細胞溶解物を、2次元電気泳動(2DE)によって解決され、2DEゲル上の「スポット」として可視化した。プロテオームマップの比較分析は、採取、単離および質量分析(MS)により同定される(存在量および翻訳後修飾の点で)示差的に発現するタンパク質の同定を可能にする。同定された候補の生物学的機能は、私たちが一次白血病細胞のために最適化されていること、異なるアッセイ( すなわち遊走、接着およびF-アクチン重合)によって試験することができる。

Introduction

慢性リンパ性白血病(CLL)、西洋諸国の中で最も一般的な成人の白血病は、モノクローナル腫瘍性CD5 + Bリンパ球の蓄積から派生し、臨床的に非常に不均一である。それは、モノクローナルB細胞リンパ球増加症(MBL)1,2,3として定義前白血病の形として存在することができる。病気はどちら無痛臨床経過と表示されることが他のケースでは、それは、治療を必要とする前に、何年も安定した状態を保つことができ、あるいは予後不良を伴う進行化学療法抵抗性疾患などの治療にもかかわらず。最後に、頻繁に致命的な高悪性度リンパ腫(リヒター症候群-RS)2,3,4に進むことができる。疾患の転帰および生存の予測因子に関する補足情報を提供して予後因子のセットに基づいて、良い面と悪い予後:患者は通常、2つの主要なサブセットに分類される。臨床異質性が可能性が高い生物学的な不均一性を反映している。遺伝、微小環境およびCEの数全く統一メカニズムは5見出されていないにもかかわらずllular因子は、疾患の病因に同意することが示されている。詳細には、いくつかの研究は、疾患の臨床経過の差が部分的に予後値6,7,8を持ついくつかの生物学的マーカーの存在(または不在)によって説明することができることを実証した。これらのデータは、疾患の生物学のより良い理解の両方の予後マーカーおよび治療標的の同定により、病状の臨床管理のための追加のヒントを提供することができることを実証した。

本研究の目的は、異なるプロテオーム技術の組み合わせは、CLLの発症および進行に関与するタンパク質の同定のために使用することができる方法を示すことである。われわれのアプローチは、共に基本的なプロテオミクスおよび臨床データ5を結合することが可能であることを示している。

選択された患者から現在のワークフローでは、一次白血病細胞(予後不良良好な)単離され、そして細胞溶解物をプロテオームマップを得るために使用される。 2DEは、このように、各タンパク質の生物学的活性に間接的に情報を与えて、翻訳後修飾を含む細胞集団のプロテオミクスプロファイルの特徴付けを可能にする。全細胞溶解物は、それらの分子量に基づいてタンパク質を解決するポリアクリルアミドゲル上で泳動二次元続いて、等電点に基づく第一次元の実行によって解決される。プロテオームマップの比較分析は、示差的に発現するタンパク質の同定を可能にする(両方の存在量および翻訳後修飾の点で)を切断し、質量分析によって分析することができるゲル上のスポットとして。各候補の役割は、異なるアッセイによって悪用される可能性があります。

現在の原稿にCLLに限定このアプローチは、簡単に、したがってproteomiについての情報を提供する、他の疾患/サンプルに拡張することができ両群間のC /生物学的な違いは、(通常の対すなわち病的な、ノックダウン非刺激、野生型刺激さ)。

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Protocol

注:すべての組織サンプルはサンラッファエッレ病院(ミラノ、イタリア)の治験審査委員会の承認が得られた。

1ヒト組織サンプルおよび細胞精製(図1)

注:白血病リンパ球はマリガンによると、CLL患者の末梢血(PB)から入手したと診断された9。

PBから1.1)白血病細胞分離

  1. ヘパリンナトリウムとバキュテナー採血管でPBを収集します。
  2. 15mlチューブに血液を移し、全血の50μL/ mLでヒトB細胞濃縮カクテルを追加します。よく混合し、室温で20分間インキュベートする。
  3. 、PBS + 2%FBSを等容量の試料を希釈してくださいインターフェイスを壊さないこと、フィコールの上に優しく、慎重にオーバーレイ血を混ぜる。希釈した試料15ミリリットルtの( すなわち 4ミリリットルをFicoll + 10ミリリットルの血液を2部にフィコールの少なくとも1部を使用してくださいUBE)。
  4. ブレーキなしで20分間、室温(20℃)で400×gで遠心する。単核細胞を界面になります。
  5. 慎重に細胞を回収し、新しいチューブにするインターフェイスを吸引。 5分間、暗所で、300×gでPBSおよび遠心分離機で一回、4℃で細胞を洗浄する。ペレットを一番下になります。
  6. 上清を捨てる。指で前後にチューブをフリックで、残りの上清中にペレットを再懸濁。 (10%ウシ胎児血清および15 mg / mlのゲンタマイシンを補充したRPMI 1640)を10mlの完全RPMI培地でペレットを希釈し、トリパンブルー排除法を用いて細胞数を計測する。

1.2)純度評価

注:すべての調製物の純度は常に99%以上であることが必要である。

  1. CD3 FITC(5μL/ TES:;以下の抗体(材料の表を参照の市販品)で精製された細胞懸濁液100μlをインキュベートt)は、CD14 PE(5μL/テスト)、CD19 ECD(6μL/テスト)、CD16-CD56 PC5(2μL/テスト)、CD5 PC7において、4℃で20分間(4μL/テスト)、 FACSチューブ。
  2. (300×gで5分間遠心)4mlのPBSでサンプルを洗浄し、プロットにようにその表面にCD19およびCD5を共発現するCLL細胞(> 99%)の%を流れcytometry.Checkによる純度を確認する図1に示されている(6)。準備がゼロに近いあるべきプロットで、CD3、CD14およびCD16-56の%をチェックすることにより、NK、Tリンパ球および単球の事実上欠いていることを確認してください。

1.3)サンプルストレージ

  1. プロテオミクス研究のために、1.5mlチューブ中で25×10 6個の細胞、10分間300×gで遠心分離細胞は、4時間上清と凍結乾燥ペレットを捨てる集める。 -80℃で使用するまで保管してください。
  2. 検証アッセイ、完全RPMI中に再懸濁細胞(の場合は量である、さらに、アッセイに依存選択された)、ステップ4に進みます。

2。二次元電気泳動(2-DE)(図2)

2.1)等電点電気泳動(IEF)

  1. 380μlの2-DEバッファー(RBthio液の344μlの(9 M尿素、10 mMトリス、4%CHAPS)、65ミリメートル、DTT、2%IPGバッファーアンフォラインの6μlと30μlの最終容量でCLL細胞ペレットを可溶化pHは4-7)。
  2. 18 IPGストリップ(pHは4-7)に、タンパク質サンプル(1 mg)を適用し、コンティによって説明されている標準的なプロトコルに従って、IEFを実行します。10
  3. RTで15分間、新鮮なDTTを2%を補充した、(6 M尿素、30%グリセロール、2%SDSを含有する50mM pH8.8のトリス-HCl緩衝液EB)平衡化バッファー2mlにストリップを平衡化する。破棄EB + DTTおよびEBの2ミリリットルを追加し、2.5%ヨードアセトアミドを補充した。ロッキングプラットフォーム上で室温で15分間インキュベートする。

2.2)のSDS-PAGE

  1. 削除したゲルに触れることなく、紙の上のストリップを乾燥さEBの過剰。 9から16%勾配​​SDS-PAGEゲルの上に各ストリップをロードします。ストリップの装着を容易にするために、ゲルの上に(w / vのトリス、25mMのグリシン192 mMの、SDS 0.1%)をSDS-電気泳動バッファーを少量を追加します。
  2. 電気泳動ユニットを組み立て、SDS-電気泳動緩衝液で埋めるその後、ストリップの浮き上がりを防止するために、寒天溶液(0.8%)の〜5ミリリットルを添加することによりゲルをシールする。 4℃で4時間、60ミリアンペア/ゲルで実行を行います。
  3. 電気泳動装置からゲルを外し、適切な染色ボックスに入れてください。

調製用ゲル2.3)銀染色

FIXER 50%メタノール、12%酢酸
0,05%ホルマリン
2時間(または一晩)*
洗浄バッファー 35%Ehanol 20分(ステップを3回繰り返す)
増感 0,02%チオ硫酸ナトリウム 2分
WASH H 2 O 5分(ステップを3回繰り返す)
硝酸銀 0.2%硝酸銀0076パーセントホルマリン 20分
WASH H 2 O 1分(2回ステップを繰り返す)
DEVELOPER 6%炭酸ナトリウム0.0004%チオ硫酸ナトリウム
0,05%ホルマリン
染色は、十分になるまで
STOP 50%メタノール 30分
* 2時間は、タンパク質固定化に必要な最小時間である

表1。

NOTE:タンパク質スポットはMS互換銀染色11でゲルを染色することによって可視化することができる。必要なすべてのソリューション銀染色のために、表1に記載されています。

  1. 各溶液/ゲルの約200mlを準備し、 表1に示したように進んでください。慎重にゲルを含む染色ボックスに各ソリューションを追加します。ロッキングプラットフォーム上のすべてのインキュベーションを行います。
  2. 染色後、停止液を除去し、買収されるまで1%酢酸の溶液中でゲルを残す。

2.4)ゲルの取得と解析

  1. 染色から3日以内に、濃度計を用いて、高解像度で画像を取得します。
  2. 2-DEゲルのソフトウェアを使用して2-Dのタンパク質パターンを分析する。
    メモ:ソフ​​トウェアが高速かつ信頼性の高い画像比較が可能になります。
    1. コンテキストメニューから「新規プロジェクトを作成」を選択して、プロジェクトを作成します。フォルダを作成し、tifファイルで「輸入ゲル画像」を選択することで、ゲルをインポートし、.PNG。または.gel拡張子。
    2. ゲルはworkspにインポートされ、追加されるとエースは、スポット検出用のゲルを選択し、メニューの「編集>スポット>検出する」を選択することで自動化されたスポット検出を行う。
    3. 次に、メニューの「減算バックグラウンド」から選択することで、背景差分を行う。注:複数のゲルを比較し、定量的および/または定性的分析による差異または類似性を検出することが可能であることを後

MALDI-TOF MS分析により3タンパク質同定(図3)

3.1)タンパク質消化

  1. (清潔なメスで切断する)マニュアルによって、あるいは自動化された切除のいずれかによってゲルからの関心の水と物品税のスポットを有するゲルを洗い流す。
  2. 水で洗ってゲル粒子(100-150μL)、(400×gで30秒)をスピンダウンし、液体を除去する。
  3. ゲル片に、CH 3 CNの(ゲル体積に応じて)、等量を追加し、ゲル片が縮小するまで、10〜15分間待ちます。ゲル粒子を乾燥させるiのナの真空遠心。
  4. 50 mMのNH 4 HCO 3で希釈した10 mMのジチオエリスリトールの75〜100μLを加え、56℃(還元工程)で30分間インキュベートする。ステップ3.1.3で説明したように、再びCH 3 CNとゲル片を縮小。
  5. 55mMのヨードアセトアミドを50mM NH 4 HCO 3中で希釈し、暗所で室温で20分間インキュベートし、溶液の75-100を添加することによりアルキル化を進める。
  6. ステップ3.1.3で説明したようにゲル断片をカバーするのに十分な量を使用して、CH 3 CNでもう一度ゲル片を縮小。真空遠心分離機中で乾燥。
  7. 25mMのNH 4 HCO 3を含有する緩衝液中の粒子、5mMのCaCl 2を、4℃にてトリプシンの12,5 ngの/μlを20分間再水和する。ゲル片をカバーするためにバッファーの十分な量を使用してください。ゲル片から吸収されない上清を除去し、25 mMのNH 4 HCO 3、5 mMのCaCl 2をトリプシンなしでCOVを追加ERゲル。
  8. 一晩37℃で少なくとも3時間(ペプチド消化に必要な最小時間)でサンプルにしておきます。

3.2)質量分析(乾燥液滴法)

  1. ステンレス鋼のMALDIプレート上の各サンプルスポット1μlのアリコートおよび50%のCH 3 CNおよび0.1%TFAで調製し、マトリックスとしてα-シアノ-4 -ヒドロキシ桂皮酸、1μlを混ぜる。
  2. MALDI-TOF質量分析計で質量スペクトルを取得する。信号の飽和を防止するか、シグナルを増大させるために、レーザ強度​​を調整する、スポット当たり約200スペクトルを蓄積する。データエクスプローラのソフトウェアを介してプロセスのスペクトルは、下記のように:
    1. .datファイルをインポートし、「プロセス>ベースライン補正」を選択することで、ベースライン補正を行う。 "プロセス>質量キャリブレーション>手動校正を選択することで、トリプシン自己分解生成物およびマトリックスピークを用いて質量を校正します。のm / z 855.1および2163.1 Bに近いピークを選択するyを左ドラッグし、「プロット」をクリックして、手動校正ウィンドウに「キャリブレーションを適用する」、その後、対応する基準質量を選択します。
    2. 、ピーク検出(「ピーク>ピーク検出」)のためのしきい値を調整するアクティブ·トレースを複製(「表示>アクティブなトレースを複製」)、新しいトレースを選択して、deisotoping(「ピーク> deisotoping」)を実行します。マクロ「getpeaklist」を使用して、識別のために使用される質量のリストを生成する。必要に応じて、手動でノイズ信号を除去するピークリストをきれいにし、より良い識別を取得するように選んだ。
  3. 検索エンジン12として深いとマスコットを使用した総合的な非冗長タンパク質データベースを検索することにより、タンパク質を同定する。
    1. すべての検索で、次のパラメータを使用します。1は、固定の修正とのinitiなどのペプチドあたりの切断、変数の変更などのメチオニンの酸化、システインカルバミドメチル化を逃した50ppmのAlの質量公差。

4。細胞骨格活性アッセイ(図4)

注:再懸濁細胞を、完全RPMI(10 6細胞/200μl)をステップ1で精製した。

4.1)遊走アッセイ。このテストでは、分析した細胞(リンパ球)の移動能力の定量化を可能にする。 6.5ミリメートル径と5.0μmの孔サイズのトランスウェルチャンバーを使用し、三連でアッセイを行う。異なる細胞型の場合には細孔サイズおよび移動時間(ステップ4.1.3)を最適化する。

  1. それぞれ誘起さを測定し、自発的な移行のために特定の刺激( すなわち 、SDF-1)の有無にかかわらず完全RPMI600μlのを追加して下室を準備します。
  2. その上に上部チャンバーを入れて、システムがインキュベーター内で37℃で30分間平衡しましょう​​。
  3. シード10 6細胞/上部チャンバー内に200μl(総細胞数)とインキュベートインキュベーター内で37℃で4時間プレート。
  4. 、上部チャンバーを取り外し下部チャンバー内のメディアを収集し、1mlのPBSで一回下室を洗う。チューブにPBSを収集します。
  5. 5分300×gで遠心分離し、500μlのPBS中の上清と再懸濁を捨てる。
  6. フローサイトメトリーによって、取得の1分後に遊走した細胞の数を数える。単離された細胞集団の場合には、任意の表面抗体を添加する必要はない。細胞の側が散乱し、計算に使用する番号である1分、で可視化されるイベントの数を考慮し、二次元ドットプロット中の細胞数を確認してください。
  7. として移行インデックス(MI)を計算します。
    式(1)

4.2)接着アッセイ。このアッセイは、細胞の接着能を測定することを可能にする。三連でアッセイを実行します。

  1. プレコート96-WELlsコマンドの50μlを有するプレート(平底)/ウェルのいずれか一晩4℃で、PBSで希釈し、2%BSA-PBS(背景として)または1μgICAM-1。
  2. PBSで2回プレートを洗浄し、37℃で1時間、2%BSA-PBS(100μl/ウェル)を添加することによって非特異的部位をブロックする。
  3. 完全RPMI中5×10 6 / mlでその間の再懸濁細胞では、1 mMのCMFDA緑色の細胞トラッカーでそれらにラベルを付け、37℃で30分間インキュベートする。
  4. ブロッキング溶液(ステップ4.2.2)を廃棄した後、1×10 6細胞/ウェルで予めコーティングしたウェルに添加し、37℃で1時間インキュベートする。
  5. ELISAリーダー(:485 nm、発光フィルター:535 nMの励起フィルター)を使用して接着性を定量化する。総入力(INPUT)の最初の測定を行います。
  6. 2%BSA-PBSで穏やかにプレートを洗浄し(200μl/ウェル)4回(x)である。各洗浄工程(接着x)の後に、プレートの読み取りを行います。
  7. 各測定のためのバックグラウンドを差し引いた後に、特定のadhesを計算イオン(接着):
    式(1)

4.3)重合アッセイ。これは、F-アクチンの重合を定量比色アッセイである。三連でアッセイを実行します。

  1. 再懸 ​​濁1×10 ^予め温め完全RPMI100μl中6個の細胞、10分間、特定の刺激( すなわち 、α-IgM抗体を20μg/ ml)を追加します。
  2. 4%パラホルムアルデヒド400μlので反応を停止し、室温で10分間、細胞を固定。
  3. (5分、4℃、300×gで遠心分離)をPBSで3回洗浄する。
  4. 上清を破棄し、2分間氷上でPBS-サポニン0.2%(200μl)を用いて細胞を透過性。
  5. PBS-サポニン0.1%(5分間100×gで遠心、4℃)で3回洗浄し、100μlのPBS-サポニン0.1%上清と再懸濁を捨てる。
  6. 室温tでの30分間のファロイジン-アレクサ488(3μg/ ml)を用いて染色暗闇の中でemperature。
  7. PBS-0.1%サポニンで3回洗浄する。 300μlのPBS中の上清と再懸濁を捨てる。
  8. ファロイジンの平均蛍光強度(MFI)を計算する、フローサイトメトリーによってF-アクチンの量を定量する。蛍光強度に基づいてヒストグラムを生成するために、一次元プロットで生成されたデータを分析し、MFI値はグラフレポートに示されている。
  9. F-アクチンの重合(ΔF-アクチン)などを測定します。
    式(1)

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Representative Results

私たちは、一次白血病B細胞はCLL患者のPBを形成する単離され、私たちはプロテオームマップを分析した。サンプルた(n = 104)は、各患者の臨床的特徴に基づいて、2つの主要なサブセット(良好な予後悪い予後)にグループ分けし、2DEゲルの比較分析を行った。

分析許容差次つのサブセット間で発現スポットの同定(翻訳後修飾の変化を暗示存在/不在又はゲル上のシフト期間中、であり、n≈16)。私たちは、MALDIプレート上にスポットした2DEゲルから選択されたスポットを切り出し、還元およびアルキル化された後、タンパク質が得られた上清中にトリプシンおよびペプチドを用いて消化した。スペクトルは、MALDI-TOFボイジャーDEで取得した。その結果、ピークリストはMASCOTと深遠に提出された。特定の質量許容内の質量は、考えられているタンパク質の中に、データベース内のペプチド配列に割り当てられ、その後、組み立てられているそれは一定の確率スコア( 図3)合格した場合に識別。この分析により、私たちは、主に細胞骨格活性や代謝プロセス(未発表データ)に関与するタンパク質を同定した。

その中で、私たちは、その差分のリン酸化に強く疾患の臨床経過に関連した( 図4)の造血系統細胞特異的タンパク質-1(HS1)に焦点を当てた。具体的には、私たちは2斑点た(n = 60、低刺激性リン酸化HS1)を有する患者は13( 図4良好な予後を持っている間単一のスポットを運ぶ患者(n = 44、ハイパーリン酸化HS1)は、悪い臨床転帰を経験することを見出した)。スポットでのHS1タンパク質の存在は、その後HS1 13に対するモノクローナル抗体を用いて2DEゲルを免疫ブロッティングにより確認した。

それはHS1は細胞骨格のリモデリング14に関与することが知られているので、私達は私をテストするためのインビトロアッセイを行うF HS1のリン酸化状態を差動(予後不良よい)2 CLLサブセット内の細胞骨格活性に影響を与える可能性があります。私たちはつのスポットとしてHS1を運ぶCLL細胞は、このように異なる臨床的挙動15( 図5)を説明する、低刺激性リン酸化-HS1サンプルと比較して、遊走、接着およびアクチン重合の点で損なわ細胞骨格活性を有することを見出した。

図1
図1:PBからの白血病細胞の精製の ​​ワークフロー CLL患者から血液を15mlのチューブに移し、(1)ヒトB細胞濃縮カクテルを、サンプル(2)に添加し、20分間インキュベートする。次に血液を1の割合でPBSで希釈:1および密度勾配(3)の上に置いた。その後のサンプルの遠心分離(4)は、複数リットルの形成を可能にするエアーズは、a)プラズマ、b)はBリンパ球、c)のフィコール、d)の赤血球および望ましくない細胞。精製されたBリンパ球(B層)を次に(5)、(6)で洗浄し、細胞調製物の純度は、フローサイトメトリーによって分析されている収集されます。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図2
図2:2DEのワークフローペレット(1)2DEバッファーに可溶化し、最初の次元ラン(2 -等電点電気泳動)用のIPGストリップ上にロードされている。平衡化後、ストリップを二次元ラン(3-SDS-PAGE)用の勾配ポリアクリルアミドゲルの上にロードされる。次いで、ゲルスポットを可視化するために染色され/タンパク質(4)。高解像度画像の取得後、プロテオームマップが分析される(5)。レ/ ftp_upload / 51942 / 51942fig2highres.jpg "ターゲット=" _ブランク」>この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図3
図3:MS解析のワークフロー (1)対象とスポットをメスで2Dゲルから切り出し、清潔なチューブに移す。。還元およびアルキル化された後、(2)、タンパク質をトリプシンで消化し、得られた上清中のペプチドをMALDIプレート(3)上にスポットされる。スペクトルは、MALDI-TOFボイジャーDEが取得される。 (4)結果のピークリストは、MASCOTと深遠な検索エンジンに提出され、総合的な非重複タンパク質データベースに対して検索されます。 (5)特定の質量公差内の質量がデータベース中のペプチド配列に割り当てられ、次にタンパク質に組み立てる。ターゲット= "_ブランク」>この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図4
図4:HS1のリン酸化状態は、CLL患者の予後と相関する (1)円 ​​は、それぞれ4.83および4.86の79 kDaの同じ分子量(氏)および異なる等電点(pI)と近接する2本のスポットを識別することにより同定した HS1タンパク質としてのMS(2)。 (2)1悪い予後(赤い四角)と一つ予後良好CLL患者(緑色の四角形)の2つの代表的なゲル化する。 (3)カプラン·マイヤー曲線は、HS1のリン酸化パターンに従ってグループ化CLL患者の累積生存を示し(1スポットはn = 44、2 のスポットはn = 60)。 2地点(緑の点)の患者は、1つの(赤い点)と比べて有意に長い生存期間(生存期間中央値に達していない)を有している。/files/ftp_upload/51942/51942fig4highres.jpg "ターゲット=" _ブランク」>この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図5
図5:CLL一次サンプルにおけるHS1リン酸化状態に影響を与える細胞骨格機能の SDF-1の存在下または非存在下での一次サンプルのトランスウェル(1)移行グラフでは、SEM(N = 7 1のスポットHS1 はn = 12 2スポットのHS1)フローサイトメーターで1分間で取得されたセルの数の手段を表示します。 (2)自発的接着は、細胞標識し、96ウェルプレート中で1時間のインキュベーション後に測定した。表示された一次サンプルのための手段SEMである(1スポットHS1のはn = 7 n = 2のスポットHS1の12)。 (3)一次サンプルのF-アクチンの重合能力を。表示された相対的なF-アクチン続き手段SEMであるFITC標識ファロイジンでSDF-1および染色による刺激後のCLL細胞のENT(n = 1のスポットHS1の5 n = 2のスポットHS1の5)。 MFI:平均蛍光強度。ヒストグラムは、サンプル取得の一例として表しています。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

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Discussion

本稿の目的は、このアプローチは他の疾患および/ ​​または他のサンプルタイプ16-18に拡張することができる場合であっても、CLLの病因に関与する分子の同定のための最適化されたプロトコルを記述することである。悪い予後19 ​​良好CLL患者の2サブセットのプロテオミクスプロファイルを比較することによって、私たちは、彼らがHS1のリン酸化状態が異なり、その活性化が白血病細胞の遊走および接着能力に影響を与えることを実証した。

他の方法に関しては、原稿、2DEゲル及びMSに提示プロテオミクス技術の主な利点は、それらが細胞プロテオームの完全な指紋を提供し、最も重要なことは、タンパク質の翻訳後修飾に関する情報を提供することである。差別的にリン酸化またはグリコシル化されたタンパク質は、ゲル中で自分の位置を変更し、おそらく細胞内でそれらの活性を変更する。

ove_content ">また、私たちは細胞骨格の機能をテストするために使用された細胞の遊走および接着性の評価のためのプロトコルを記載し、これらのプロトコルは依然として不十分懸濁液中で増殖する細胞について記載されている、それらは一般に接着細胞に適用されているので( 例えば、創傷治癒機能アッセイのために、それが細胞の生存率の間)。2DEとMS技術の主な制限は、細胞/タンパク質(ゲルあたり≈25×10 6細胞)の量は、ある。本当の課題は、一次細胞で働くことですしかし、多くの病気のためには、細胞またはそれらの実験を実行するための生細胞の十分な数に到達することは不可能であり、この場合には、可能な場合、それは細胞株を使用することが可能である。

MSプロトコルのための最も重要なステップは、汚染を避けるために、明確なタンパク質同定を得るためにクリーン(ケラチンフリー)条件下で作業することである。細胞骨格アッセイは特に疎に(通常は再現が困難であるリュー細胞)、したがって、それは三連で実験を行うことが提案されている。

私達が証明してきたように私たちはHS1タンパク質19について示されているように、この原稿で提示手法の組み合わせは、このように新たな治療標的の発見を提供する、別の疾患に関与する新たな経路の同定に役立つ。

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Acknowledgments

私たちは、リンパ性悪性ユニット、エリサ10ハッケン、リディアScarfò、マッシモアレッシオ、アントニオ·コンティ、アンジェラテガミバチ、そしてアンジェラカッタネーオに感謝します。

Associazione ItalianaのあたりのラRicercaスルCancro AIRC( - ミルフィーユの#9965あたり5調査官助成や特別プログラム分子臨床腫瘍):このプロジェクトは、によってサポートされていました

CSとBAは、研究を設計し実験を行ってデータを分析し、原稿を書いている。 MTSB、原稿を書くことを支援UR、FBPR。 PGおよびFCCは研究は、患者のサンプルや臨床データを提供して設計しました。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetonitril MERCK 61830025001730 
Ammonium Bicarbonate SIGMA A6141-500G
1,4-Dithioerythritol SIGMA D9680-5G
Iodoacetamide SIGMA I6125-25G
Calcium chloride dihydrate SIGMA 223506-25G
Trypsin, Sequencing Grade ROCHE 11418475001
α-cyano-4-hydroxycinnamic acid SIGMA C2020-10G
Trifluoroacetic acid SIGMA T6580
ZipTipµ-C18 MILLIPORE ZTC18M096
RosetteSep Human B Cell Enrichment Cocktail STEMCELL 15064
PBS EUROCLONE ECB4004L
FBS DOMINIQUE DUTSCHER S1810
Lymphoprep SENTINEL DIAGNOSTICS 1114547
Trypan Blue SIGMA T8154
CD19 BECKMAN COULTER 082A07770 ECD
CD5 BECKMAN COULTER 082A07754 PC5
CD3 BECKMAN COULTER 082A07746 FITC
CD14 BD 345785 PE
CD16 BECKMAN COULTER 082A07767 PC5
CD56 BECKMAN COULTER 082A07789 PC5
Ettan IPGphor 3 Isoelectric Focusing Unit GE-Healthcare 11-0033-64 
Urea SIGMA U6504
Tris-Hcl Buffer BIO-RAD 161-0799
CHAPS SIGMA C2020-10G
DTT SIGMA D9163-5G
IPGstrips GE-Healthcare 17-1233-01  Linear pH 4-7 18cm
IPGbuffer GE-Healthcare 17-6000-86 pH 4-7
Glycerol SIGMA G6279
PROTEAN II XL Cell BIO-RAD 165-3188
SDS INVITROGEN NP0001
Acrilamide BIO-RAD 161-0156
Agarosio INVITROGEN 16500
Methanol SIGMA 32213
Acetic Acid VWR 631000
Formalin BIO-OPTICAL 05-K01009
Ethanol VWR 9832500
Sodium Thiosulfate FLUKA 72049
Silver Nitrate FLUKA 85228
Molecular Dynamics Personal SI Laser Densitometer Amersham Biosciences
ImageMaster 2D Platinum 5.0 Amersham Biosciences
Sodium Carbonate MERCK A0250292
MALDI-TOF Voyager-DE STR Applied Biosystems
Data Explorer software (version 3.2)  Applied Biosystems
transwell chambre 6.6 mm diameter CORNING 3421
RPMI EUROCLONE ECB2000L WITH L-GLUTAMINE
Gentamicin SIGMA G1397
SDF-1 PREPROTECH 300-28A
Flat-bottom 96-well plate BECTON DICKINSON 353072
BSA SANTA CRUZ 9048-46-8
ICAM-1 R&D Systems 720-IC
CMFDA Life Thechnology C7025 Green
IgM SOUTHERNBIOTECH 2020-02
Paraformaldehyde SIGMA P6148
Saponine SIGMA S-7900
Phalloidin  Life Thechnology A12379 Alexa fluor 488

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References

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