אסטרטגיות למעקב Anastasis, תופעת הישרדות תא שהיפוך אפופטוזיס

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Tang, H. L., Tang, H. M., Hardwick, J. M., Fung, M. C. Strategies for Tracking Anastasis, A Cell Survival Phenomenon that Reverses Apoptosis. J. Vis. Exp. (96), e51964, doi:10.3791/51964 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Anastasis (יווני עבור "עולה לחיים") מתייחס להתאוששות של תאים מתים. לפני תאים אלה להתאושש, הם עברו דרך מחסומים חשובים של אפופטוזיס, כוללים פיצול של המיטוכונדריה, שחרורו של המיטוכונדריה ג ציטוכרום לcytosol, הפעלה של caspases, עיבוי הכרומטין, נזק לדנ"א, פיצול גרעיני, blebbing קרום פלזמה, התכווצות תא, חשיפת תא שטח של phosphatidylserine, והיווצרותם של גופים אפופטוטיים. Anastasis יכול להתרחש כאשר גירויים אפופטוטיים יוסרו לפני המוות, ובכך מאפשרים לתאים למות כדי להפוך אפופטוזיס ומנגנוני מוות פוטנציאלי אחרים. לכן, Anastasis מופיע לערב תהליכי ריפוי פיסיולוגיים שיכול גם לקיים תאים פגומים בצורה בלתי הולמת. הפונקציות והמנגנונים של Anastasis עדיין אינן ברורות, הקשו בחלקו על ידי הכלים מוגבלים לאיתור אירועי עבר לאחר ההתאוששות של תאים בריאים לכאורה. אסטרטגיות כדי לזהות anastasis יאפשר מחקרים של המנגנונים הפיסיולוגיים, סכנות של תאים מתים בפתולוגיה מחלה, ורפויים פוטנציאליים לווסת Anastasis. כאן אנו מתארים אסטרטגיות יעילות באמצעות מיקרוסקופ תא חי וbiosensor caspase יונקים לזיהוי ומעקב Anastasis בתאי יונקים.

Introduction

אפופטוזיס (יווני "נופל למוות") הנחה הוא בדרך כלל להיות תהליך חד-כיווני המסתיים בתא התאבדות 1-7. הפרעה גנטית של תוצאות גני פרו-מוות בהישרדותם של תאים נוספים שאחרת היה מתים בכל בעלי חיים, כוללים תאים שכבר יזמו את 8,9 מסלול אפופטוזיס. באופן דומה, מניפולציות גנטיות מאפשרות לתאי יונקים בריאים באופן מלאכותי להציג "לאכול אותי" אותות או שיאבדו את הדביקות למטריצת החוץ תאית שלהם כדי להינצל ממוות על ידי phagocytosis כל תא או entosis, בהתאמה 10,11. עם זאת, אנחנו ואחרים הראינו כי ללא תאי מניפולציה גנטית נורמלים בריאים יונקים ושורות תאים יכולים גם להתאושש מהמוקדמים של אפופטוזיס 12-15 שלבים. שימוש בכלים כדי לעקוב אחר תאים בודדים, יש לנו הפגנו נוסף התאוששות מהשלבים מאוחרים של אפופטוזיס 12,13, לאחר התאים עברו מחסומים חשובים שאופייניly לסמן את "נקודת אל-חזור" 2-6. מחסומים אלה של אפופטוזיס שלב מאוחר כוללים שחרור המיטוכונדריה של ציטוכרום C, הפעלה של caspases, פיצול גרעיני, והיווצרותם של גופים אפופטוטיים. אנחנו אימצנו מילה יוונית מתחם "Anastasis", שפירושו "עולה לחיים", כדי לתאר את המהפך הזה של אפופטוזיס על סף מות תא 2-6.

אלא אם כן את תהליך גסיסה-ההתאוששות כולו נצפה על ידי הדמיה תא חי, הוא מאתגר להבחין בין תאים שעברו Anastasis מהתאים שמעולם לא חוו אירועים אפופטוטיים. עשרות שנים של עבודה חשפו כי תכונות מורפולוגיות של התאבדות תאים על ידי אפופטוזיס מונעות על ידי אירועים ביוכימיים ומולקולריים אבולוציונית שמורה 16-19. אירועים אלה לקדם הרס עצמי של תאים כדי לווסת תהליכים התפתחותיים וhomoeostatic באורגניזמים חד תאיים ורבים תאיים על ידי ביטול פגום או דתאי angerous 16-19. בעוד תאים אפופטוטיים ניתן להבחין בקלות על ידי גילויים מורפולוגיים, ביוכימי ומולקולריים אחידים של אפופטוזיס 1,5,6,16,20, כרגע אין סמן ידוע ספציפי לAnastasis 12,13. חשוב לציין, תאים שעברו Anastasis נראים תאים נורמלים בריאים, ותאים שפשוט להתחיל היפוך אפופטוזיס מופיע תאים מתים אפופטוטיים כ12,13. לפיכך, יש צורך בכלים חדשים לקבוע בודאות כי תא ששרד נתון חווה בעבר תהליכים אפופטוטיים פעילים.

אפופטוזיס מקובל להניח כמפל בלתי הפיך, כי זה הוא תהליך הרס מהיר ומסיבי. למרות שזה יכול לקחת דקות לימים לכמה תאים ליזום אפופטוזיס, פעם המיטוכונדריה שיחררה גורמי apoptogenic כגון ציטוכרום C לתוך cytosol 21,22, ניתן להפעיל caspases תוך 5 דקות 23,24, ואחריו cytoplasmic ועיבוי גרעיני בתוך 10 דקות 25-27, ותא מוות זמן קצר לאחר מכן 25-27. caspases הופעל לתזמר אפופטוזיס על ידי ביקוע וinactivating רכיבים מבניים ותפקודיים מפתח לצורך ההריסה הסלולרית 2,28, כגון מעכבי endonuclease DFF45 / ICAD 29,30. Caspases גם להפעיל גורמים פרו-אפופטוטיים, כגון BID חבר BCL-2 משפחה, אשר translocates למיטוכונדריה כדי לקדם את שחרורו של המיטוכונדריה של ציטוכרום C 31,32. פעילות caspase גם תוצאות חשיפת תא שטח של phosphatidylserine כאות "לאכול אותי" לקידום בליעה למות תאים על ידי מקרופאגים או תאי שכנים דרך phagocytosis 33. יתר על כן, אירועים אפופטוטיים להבהיר המיטוכונדריה מתפקדת, שיבוש ביו-אנרגיה תאית ו34,35,36 חילוף חומרים. כך, התאוששות מהרס כזה נראה באופן אינטואיטיבי סבירה.

בניגוד למקורי מצפהations, תאים יכולים להפוך את תהליך המוות של תאים אפופטוטיים אפילו בשלב מאוחר. על ידי ברציפות ניטור הגורל למות תאים בתרבית, צפינו הפיכות של אפופטוזיס בשלב מאוחר בטווח של תאים ראשוניים ושורות תאים 12,13. הסרת גירוי המוות אפשרה התאוששות מהתכונות הגלויות של אפופטוזיס, כגון פיצול המיטוכונדריה, עיבוי הכרומטין, נזק לדנ"א, blebbing קרום פלזמה, חשיפה של phosphatidylserine פני תא, שחרורו של המיטוכונדריה ג ציטוכרום, הפעלת caspase, פיצול גרעיני, התכווצות תא, והיווצרותם של גופים אפופטוטיים. תצפיות אלה מעלות שאלות לא פתורות לגבי פונקציות, השלכות, והמנגנונים של Anastasis. כדי לענות על שאלות אלה, תנאי הוא לזהות באופן אמין תאים שעברו Anastasis. כאן אנו מתארים שיטות מיקרוסקופיה חיות וbiosensor caspase לגילוי תאים שהתהפכו אפופטוזיס שלב מאוחר וה בעברen שרד.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הכנת תאים להדמיה של תא חי

  1. כדי להקל על זיהוי של שינויים מורפולוגיים, לבחור תאים חסיד כגון הלה (קרצינומה של צוואר רחם אנושי) תאים שהם שטוחים על פני המצע לדמיין שינוי של קרום הפלזמה ואברונים תוך-תאיים טוב יותר.
    הערה: ביטול אפופטוזיס נצפה בתאים שונים של היונקים 12,13, כוללים תאי עכבר עיקרי כבד, מקרופאגים עכבר העיקריים, cardiomyocytes עכברוש העיקרי, וגם תא קווים כגון תאים אנושיים כליות עוברי HEK-293T, COS האפיתל כליות קופים ירוקים אפריקאי -7 תאים, HL-1 תאי שריר לב עכבר, עכבר fibroblasts NIH 3T3, חמוס (Mustela putoris furo) תאי CRL1656 המוח, תאי A375 סרטן העור אנושיים, תאי CRL1973 סרטן אשכים אנושיים, תאי H446 אדם קטנים סרטן ריאות תא, סרטן הכבד אנושי תאי HepG2, תאי סרטן השד אנושיים MCF7, תאי סרטן הערמונית אנושיים PC3, ותאי SH-SY5Y נוירובלסטומה אנושיים.
  2. coverslips זכוכית קדם שטיפת כלים תרבית תאי תחתית זכוכית עם אתנול מוחלט לניקוי ועיקור.
    הערה 1: שימוש במנות תחתית כוס מומלץ להתערבות ההפרש לעומת זאת באיכות גבוהה מיקרוסקופיה (DIC), וconfocal ההגדלה גבוה או מיקרוסקופ פלואורסצנטי העלית (ראה דיון).
    הערה 2: להגדלה גבוהה (40X, 60 / 63X או 100X יעדים ופתחים מספריים גבוהים 1.3 או 1.4), שימוש בצלחות תרבית תאים עם תחתית דקה זכוכית (מ"מ 0.085-.16 עובי) מספקת כבר לא עובדים מרחקי הדמיה (ראה פרוטוקול 3 ).
  3. בהתאם לסוג התא, תרבות מנות תחתית כוס עשויות לדרוש ציפוי עם פולי-ד-ליזין (0.1 מ"ג / מיליליטר), קולגן (פתרון 0.01% ב0.01 M חומצה אצטית) ו / או פיברונקטין (5 מיקרוגרם / מיליליטר) לפני הזריעה תאים.
    הערה: אופטימיזציה של הסוג והריכוז של סוכן ציפוי נדרשת לשורות תאים שונות. תאים הלה יכול לדבוק ישירות על זכוכית ללא ציפוי. עם זאת, חלק מתאים, such כמו HL-1 תאי שריר לב עכבר, לא יכול לדבוק ישירות למשטחי זכוכית, אך דורשים פרוטוקולי תרבות וציפוי ספציפיים 37.
  4. זרע ~ 2-3 x 10 5 תאים על תרבות מנות 35 מ"מ זכוכית מצופה מראש-תא תחתון ולדגור על צלזיוס 37 מעלות (° C) עם 5% CO 2 ליום כדי להשיג confluency 80%.
    הערה 1: תנאים אופטימליים של צפיפות תאים, זמן דגירה, ומצב התרבות יכולים להשתנות בהתאם לסוג התא. confluency הסלולרי יכול להשפיע על התגובה של תאים אפופטוטיים (ראה פרוטוקול 2). בconfluency הגבוה, תאים יכולים להיות פחות רגישים לאותו ריכוזים של גירויים אפופטוטיים.
    הערה 2: הימנע על תאים ומחוברות, כצפיפות תאים גבוהה יכולה לטשטש שינויים מורפולוגיים של תאים בודדים ואברונים.

2. יישום והסרה של תאים אפופטוטיים גירויים

  1. זמן קצר לפני השימוש, מראש לערבב סוכן גרימת אפופטוזיס-עם 37 מעלות מדיום תרבות תא C. אתנול (3.6-4.5כרך% / כרך) שימש כinducer אפופטוזיס בהפגנה הנוכחית.
    הערה 1: נתונים שפורסמו ושלא פורסמו שלנו מראים כי תאים גם יכולים להפוך אפופטוזיס שמופעל על ידי 12,13 גירויים אפופטוטיים אחר, כגון sulfoxide דימתיל (DMSO, 8% / כרך כרך למשך 24 שעות), staurosporine (STS, 0.5 מיקרומטר ל 1 שעה), וטקסול (1 מיקרומטר לשעה 12). אופטימיזציה של מינון לאפופטוזיס מפעילה נדרש עבור סוגים שונים של תאים שונים כדי להשיג את המינון המינימאלי שיכול לגרום לרוב התאים באוכלוסייה לעבור אפופטוזיס.
    הערה 2: Pre-ערבוב סוכנים וישכנע אפופטוזיס עם מדיום תרבית תאים חשוב להימנע מחשיפה אחידה של התאים אפופטוטיים לגירויים.
  2. תמונה קבוצתית של תאי בריאות בצלחת תרבית תאים לפני יישום סוכן גרימת אפופטוזיס-להקים מורפולוגיות בסיסיות.
  3. הסר את המדיום המקורי מצלחת תרבית תאים, ולאחר מכן להחיל 2 מיליליטר סוכן גרימת אפופטוזיס-מעורבב מראש של למנה ללעורר תאים עוברים אפופטוזיס. דגירה התאים ב 37 ° C עם 5% CO 2 (או תנאי תרבות נורמלים אחרים).
  4. לאחר דגירה, להתבונן התאים על ידי אור, עלית הקרינה או confocal כדי לפקח על ההתקדמות של תכונות אפופטוטיים.
    (ראה פרוטוקולים 3 ו -4) תאים עוברים אפופטוזיס יציגו סימני ההיכר מורפולוגיות, ביוכימי ומולקולרי של אפופטוזיס שיכול להיות מזוהה על ידי מיקרוסקופ וחיישנים ביולוגיים המבוסס על הקרינה: הערה 1.
    הערה 2: זמן דגירה של תאים עם מעוררי אפופטוזיס שונים תשתנה, בהתאם לסוג תא, תנאי תא (כגון confluency ומעמד תזונתי), והמנה של גירוי מוות מיושמת. ייתכן שתהיה צורך טיטרציה זהירה.
  5. כאשר תאים להציג סימני ההיכר של אפופטוזיס, להסיר סוכן גרימת אפופטוזיס-ידי שטיפת התאים פעם אחת עם חמה (37 מעלות צלזיוס, טמפרטורה או תרבות הנורמלית אחרת) תרבית תאים בינונית טריות.
    הערה 1: ככל שתאים אפופטוטיים מחוברים באופן רופף יותרצלחת התרבות, חשוב להדביק ולהסיר בינוניים בעדינות כך שהתאים לא נשטפו.
    ניתן לשחזר תאים תלויים בשידור חי מsupernatant על ידי צנטריפוגה העדינה (מינימום 160 XG ל1) והוסיפו בחזרה לצלחת התרבות: הערה 2.
  6. דגירה תאים ב 37 מעלות צלזיוס עם 2 מיליליטר / 35 צלחת מ"מ של תרבית תאים בינונית טריות ב 5% CO 2. לחלופין, בינוני שימוש מותנה (מדיום תרבות תא ללא נאסף מהתאים בריאים) כדי לשפר עוד יותר את ההישרדות של תאים אפופטוטיים.
    הערה: כביסה ותאי דוגרים עם מדיום חדש יאפשרו רוב התאים להפוך אפופטוזיס מושרה אתנול לאחר חשיפת אתנול 12,13. עם זאת, ייתכן שיהיה צורך לחזור על שלב זה כביסה כאשר תאים נחשפים לגירויים אפופטוטיים אחרים (ראה דיון).

3. מיקרוסקופית של תא חי

  1. אנו ממליצים על שימוש במיקרוסקופ הפוכה confocal או עלית הקרינה עם בקרה סביבתית (37 ° C,5% CO 2) למיקרוסקופיה תאי חיים.
    הערה: אפשר גם לתמונת התאים באמצעות מיקרוסקופים זקופים עם מטרת טבילה במים. טובלים את המטרה ישירות לתוך מדיום תרבות תאי תמונה. עם זאת, תאים יכולים להיות נמחצו על ידי מטרת הטבילה בהתמקדות.
  2. טרום חם מיקרוסקופ (כגון תא סביבתי שליטה, חממת שלב, ודוד אובייקטיבי) לפחות 2 שעות לפני ההדמיה.
    הערה: זה מאפשר רכיבי מיקרוסקופ כדי להגיע תרמו-שיווי משקל, כך שהוא יכול למנוע את הסחיפה של מיקוד ושינוי של מישור xy עקב ההתרחבות והתכווצות התרמית של הרכיבים.
  3. מניחים צלחת תחתית זכוכית 35 מ"מ של תאים בתרבית (ראה פרוטוקול 1) על הבמה של מיקרוסקופ הפוך וללכוד תמונות תא באמצעות מטרת התכנית-Apochromat 40X או 63X עם צמצם מספרי (NA) 1.3 או 1.4 הדמיה תאים מ תחתית הצלחת דרך coverslips זכוכית.
    הערה: הימנע מהחלה מעל 2 מיליליטר של מדיום35 צלחת תחתית זכוכית מ"מ, כמשקלו של המדיום יכול לגרום עקמומיות של תחתית הכוס, ולכן קשה לתדמית תחום תאים באותו מישור המוקד.
  4. שמור על תאים על 37 מעלות צלזיוס או הטמפרטורה הרגילה המתאימה במהלך תהליך ההדמיה כולו.
    הערה: התהליך של אפופטוזיס, וסביר להניח ההיפוך של אפופטוזיס, תלויה בפעילות האנזימטית רגישה לטמפרטורה. לכן, שמירה על תאים על 37 מעלות צלזיוס (למשל עם במה מיקרוסקופ חממה עליונה) היא חשובה לאורך כל הניסוי. טמפרטורה ירדה יכולה להאט את התגובה אפופטוטיים והתאוששות התגובה לאחר הסרת הגירוי אפופטוטיים.
  5. השתמש במכשיר לחות או להניח נייר שקוף (ראה חומרים) על צלחת התרבות כדי לצמצם את אובדן מים על ידי אידוי מהמדיום.
    הערה: נייר הכסף יכול לשבש את הקוטביות של אור למיקרוסקופיה DIC. שחזור קוטביות על ידי התאמת המקטב בנתיב האור.
  6. לשמור על pH בתרבית תאים בינוני (pH 6.8 -7.3) על ידי דוגרים ב 5% CO 2 עם חדר בקרה סביבתי על המיקרוסקופ.
    הערה: תחזוקת pH במדיום התרבות יכול להיות מושגת גם על ידי הוספת חיץ HEPES, או על ידי שימוש במדיום -independent מסחרי CO 2 (ראה חומרים). תנאים אופטימליים יכולים להשתנות בהתאם לסוג התא.
  7. למזער הקרינה / לייזר (עוצמת אור עירור) חשיפה לתאים במהלך תהליך ההדמיה, כדי למנוע phototoxicity על ידי הפחתת עוצמת הקרינה לרמה הנמוכה ביותר הנדרש כדי להשיג תמונות באיכות גבוהות של תא / מבני subcellular או biosensors הביע (פרטים בפרוטוקול 4).

4. אסטרטגיות לAnastasis זיהוי ומעקב במהלך ולאחר אירועים אפופטוטיים

  1. blebbing פלזמה קרום, עיבוי cytoplasmic, התכווצות תא והיווצרות גוף אפופטוטיים (ראה איורים 1 א - C, E).
    1. בצע diffe תא חי זמן לשגותלעומת זאת rential התערבות (DIC) או מיקרוסקופ לעומת שלב כדי לעקוב אחר קבוצה של תאי בריאות ולהתבונן המורפולוגיה הנייד שלהם (ראה פרוטוקול 3 למיקרוסקופיה תא חי, וראה דיון).
      הערה 1: להפחית את עוצמת מקור אור להדמית חוזה דסק"ש / שלב, כדי למנוע phototoxicity לתאים.
      הערה 2: אם דסק"ש ומיקרוסקופ לעומת השלב אינו זמינים, להשתמש CellTracker להכתים את cytosol להתוות את המורפולוגיה של תאי חיים עבור מיקרוסקופיה confocal או עלית הקרינה ולפקח על המורפולוגיה של התאים.
    2. החל גירוי מוות של תאים כדי לעורר תאים עוברים אפופטוזיס (ראה פרוטוקול 2 ליישום וההסרה של גירויים אפופטוטיים).
    3. שים לב לסימני היכר תאים שטופלו מורפולוגיים של אפופטוזיס כגון blebbing פלזמה קרום, עיבוי cytoplasmic, התכווצות תא והיווצרות גוף אפופטוטיים (איורים 1 א, 1 ב, 1 ג, 1E).
    4. לשטוף את גירויי מוות, ותאים מחדש אספקה ​​עם מדיום חדש כאשר התאים displaסימני ההיכר מורפולוגיות y של אפופטוזיס.
      הערה 1: החל גירוי מוות של תאים או שינוי מדיום תרבית תאים על הבמה מיקרוסקופ במהלך הדמיה תא חי זמן לשגות יכול להיות מושגת על ידי שימוש בתא תרבית תאי זלוף, או יכול להתבצע ישירות על צלחת תרבית תאים על ידי pipetting בזהירות בלי לגעת הצלחת, במרווחים בין ההדמיה.
      הערה 2: מערכות פיצוי להיסחף מוקד השתמש כדי למנוע מחוץ לפוקוס של התאים עקב אובדן תרמו-שיווי משקל של מערכת מיקרוסקופ לאחר שינוי מדיום תרבית תאים (ראה דיון).
    5. הזמן לשגות הדמיה רציפה כדי לעקוב אחר גורלם של תאים המציגים סימני ההיכר של אפופטוזיס. תאים שיכולים להפוך אפופטוזיס לתקן את הנזק ולהחזיר את נורמלי מורפולוגיה שטוחה (איורים 1 א, 1 ב, 1 ג, 1E).
  2. פיצול מיטוכונדריאלי, DNA / עיבוי הכרומטין, ופיצול גרעיני (ראה 1D דמויות, 1F, 1G).
    1. כדי להמחיש mitochondריה, תאי כתם עם 50 ננומטר צבע MitoTracker אדום / אדום עמוק / ירוק-ניאון, ובו זמנית להכתים את הגרעין עם 10 מיקרוגרם / מיליליטר של 33342 צבע גרעיני הכחול Hoechst במדיום התרבות במשך 20 דקות ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2.
      הערה 1: להפחית את הריכוז של צבעים ומשך הדגירה, כדי למנוע cytotoxicity ולהפחית הקרינה רקע כאשר צורך. לייעל את התנאים מכתים לקבל אות טובה יחס רעש עם הכמות המינימלית של צבע ודגירת זמן לצביעה.
      הערה 2: השתמשו בכתמי ניאון למיטוכונדריה כגון MitoTracker האדום CMXRos, MitoTracker Deep Red FM, או MitoTracker הירוק FM, שלא ידלפו החוצה מן המיטוכונדריה באפופטוזיס. זה מאפשר הדמיה מורפולוגיה של המיטוכונדריה במהלך אפופטוזיס וAnastasis. ראה חומרים וציוד לשולחן פרטים על הכתמים האלה.
    2. שמור את התאים מוכתמים בחושך כדי למנוע photobleaching.
    3. להסיר את הכתם עודף על ידי שטיפת התאים3 פעמים עם 37 מעלות פוספט-חיץ C פתרון או בינוני תרבית תאים טריות (PBS), עם דגירה 1 דקות במדיום החדש בין כל שטיפה, ולאחר מכן דגירה נוספת במדיום החדש עבור 20 דקות לפני השטיפה הסופית כדי לאפשר מוגזם כתמים כדי לצאת מהתאים כדי להפחית את רקע אות שאינה ספציפי להדמיה.
      הערה: לקצר דגירה פעמים עם מדיום סלולארי לאחר הצביעה עלולה לגרום רקע גבוה להדמיה.
    4. לבצע בזמן אמת confocal תא חי או מיקרוסקופ פלואורסצנטי העלית לתאים בריאים תמונה לפני גיוס אפופטוטיים מוחל (ראה פרוטוקול 3 למיקרוסקופיה תא החי).
      הערה: תאים בריאים להציג המיטוכונדריה צינורי וגרעינים עגולים ברוב סוגי תאים (1D דמויות, 1F, 1G).
    5. לעורר תאים עוברים אפופטוזיס (ראה פרוטוקול 2 ליישום וההסרה של גירויים אפופטוטיים לתאים).
    6. המשך זמן לשגות מיקרוסקופי תא חי להתבונן שינויים בmorpholog המיטוכונדריה והגרעיניIES מייד לאחר גירוי המוות מוחל על התאים. שים לב תאים להציג סימני ההיכר של אפופטוזיס כגון פיצול המיטוכונדריה ונפיחות, עיבוי הכרומטין ופיצול גרעיני, בניגוד לתאים הבריאים בו מוצגות המיטוכונדריה צינורי וגרעינים עגולים.
    7. כאשר תאים להציג סימני ההיכר של אפופטוזיס, לשטוף ולספק תאים עם מדיום חדש, ולהמשיך זמן לשגות הדמיה כדי לעקוב אחר גורלם של תאים. תאים שלהפוך אפופטוזיס להחזיר המיטוכונדריה נורמלית ומורפולוגיה גרעינית (1D דמויות, 1F, 1G).
      הערה: בצע מיקרוסקופיה DIC במקביל כאשר ניתן לקבל מידע נוסף על גישה לשלבים של אפופטוזיס על ידי התבוננות השינויים של מורפולוגיה של תאים באותה הקבוצה של תאים (ראה פרוטוקול 4.1 למיקרוסקופיה DIC).
  3. איתור של שחרור המיטוכונדריה של ציטוכרום C תוך שימוש בתאים ביציבות להביע היתוך -GFP ציטוכרום C יחסי ציבורotein (ראה איור 2).
    1. תאי כתם יציבות להביע ציטוכרום C -GFP 23,24 עם MitoTracker האדום לתייג המיטוכונדריה תא מקוטבת (ראה צעדים 4.2.1 ל4.2.3 עבור מכתים המיטוכונדריה תא חי).
    2. בצע מיקרוסקופיה confocal התא חי או עלית הקרינה בזמן אמת כדי לעקוב אחר תאים בריאים (פרטים בפרוטוקול 3 להדמית תא חי).
      הערה: אות -GFP ציטוכרום C localizes בעיקר במיטוכונדריה של תאים בריאים (2A דמויות i, 2B).
    3. לעורר תאים עוברים אפופטוזיס (ראה פרוטוקול 2 ליישום וההסרה של גירויים אפופטוטיים לתאים). המשך מיקרוסקופיה זמן לשגות להתבונן טרנסלוקציה של -GFP ג ציטוכרום מן המיטוכונדריה לcytosol (איורים 2Aii-iii, 2B).
      הערה: שחרור מיטוכונדריאלי של ציטוכרום C לתוך cytosol הוא סמן של permeabilization קרום החיצוני של המיטוכונדריה (MOMP)4, שלב קריטי באפופטוזיס המיטוכונדריה תלויה 21,22
    4. כאשר תאים להציג את אות -GFP ציטוכרום C בציטופלסמה, להסיר את גירוי המוות של תאים, ותאי אספקה ​​עם מדיום חדש (ראו פרוטוקול 2). המשך זמן לשגות הדמיה כדי לעקוב אחר גורלם של תאים עם GFP cytosolic.
      הערה: תאים שלהפוך אפופטוזיס להחזיר מורפולוגיה של תאים נורמלים, ולהפחית את אות -GFP cytosolic ציטוכרום C ככל הנראה דרך השפלה או טרנסלוקציה חזרה למיטוכונדריה (איורים 2Aiv-vii, 2B).
    5. צלם תמונות דסק"ש במקביל לקבלת מידע נוסף לגישה השלבים של אפופטוזיס על ידי התבוננות שינויים במורפולוגיה תא בתאים בודדים או קבוצה של תאים (ראה פרוטוקול 4.1 למיקרוסקופיה DIC).
  4. זיהוי של פעילות caspase באמצעות biosensor caspase (ראה איור 3)
    1. תאי Transfect עם biosensor caspase NES-DEVD-YFP-NLS ל16 עד 24 שעות לפני העמדתם לגירוי אפופטוטיים 13.
    2. להכתים את תרבויות transfected עם Hoechst 33342 לתייג גרעין תא (ראה צעדים 4.2.1 ל4.2.3 עבור מכתים גרעיני תא חי).
    3. בצע מיקרוסקופיה confocal התא חי או עלית הקרינה בזמן אמת כדי לעקוב אחר תאים בריאים (פרטים בפרוטוקול 3 להדמית תא חי).
      הערה: אות biosensor NES-DEVD-YFP-NLS localizes בעיקר בcytosol של תאים בריאים בשל האות הגרעינית יצוא (NES) (איורים 3 א, 3Bi ו3C, ראו דיון).
    4. לעורר תאים עוברים אפופטוזיס (ראה פרוטוקול 2 ליישום וההסרה של גירויים אפופטוטיים לתאים). המשך מיקרוסקופיה זמן לשגות להתבונן טרנסלוקציה הגרעינית של YFP.
      הערה: הפעלה של דבק caspases מוטיב DEVD בbiosensor caspase NES-DEVD-YFP-NLS, וכתוצאה מכך טרנסלוקציה YFP-NLS מcytosol לגרעין (האיורים 3 א, 3Bii-iv, ראה דיון).
    5. הערה: תאים שלהפוך אפופטוזיס להחזיר מורפולוגיה של תאים נורמלים, אך נשמר האות הגרעינית YFP (איורים 3Bv-x, תאי 1 ו -2, ו3D).
    6. המשך זמן לשגות הדמיה כדי לעקוב אחר גורלם של תאים המציגים YFP הגרעיני.
      הערה: אות YFP הגרעינית תהפוך כמה שעות מושפלת לאחר התאים הפוכים אפופטוזיס (3B דמויות, vi-x, תא 1, ראה תוצאות ודיון) ככל הנראה באמצעות מנגנוני אישור תא נורמלים כגון השפלה פרוטאזום.
    7. צלם תמונות דסק"ש במקביל לקבלת מידע נוסף לגישה השלבים של אפופטוזיס על ידי התבוננות שינויים במורפולוגיה תא בתאים בודדים או קבוצה של תאים. (ראה פרוטוקול 4.1 למיקרוסקופיה DIC).
  5. חשיפה של phosphatidylserine פני תא (ראה איור 4)
    1. תאי זרע בGLהתחת coverslips להשיג 80% confluency תא (ראה 1 לפרוטוקול).
    2. Co-להכתים את התאים עם MitoTracker אדום-הניאון וכתם Hoechst 33342 כחול למיטוכונדריה וגרעינים, בהתאמה (ראה צעדים 4.2.1 ל4.2.3 להמיטוכונדריה תא חי והכתמה גרעינית).
    3. לעורר תאים עוברים אפופטוזיס באמצעות inducer אפופטוזיס (ראה פרוטוקול 2).
    4. החל V Annexin שכותרתו ניאון (ראה חומרים) להכתים תאים אפופטוטיים 10 דקות ב 37 מעלות צלזיוס לפני הסרת inducer אפופטוזיס לזהות חשיפה של phosphatidylserine על פני השטח של תאים אפופטוטיים.
      הערה 1: תאים בריאים אינם מוכתמים עם Annexin V phosphatidylserine כי בדרך כלל מוחרם על-הפנימי העלון של קרום הפלזמה תא 38. תאים אפופטוטיים מגואלות V Annexin, אשר נקשר phosphatidylserine על פני תא (איורים 4 א ו -4 ב).
      הערה 2: V Annexin שכותרתו פלורסנט יכול להיות מיושם גם להכתים תאים אפופטוטיים IMMediately לאחר הסרת inducer אפופטוזיס, עם דגירה 10 דקות.
    5. הסר גירוי מוות של תאים, לשטוף את התאים המוכתמים עם PBS החם או בינוני טרי פעם אחת, ולאחר מכן לספק תאים עם מדיום חדש לשעה 2 ב 37 ° C עם 5% CO 2 (ראה פרוטוקול 2).
      הערה 1: תאים שהתהפכו אפופטוזיס להחזיר מורפולוגיה נורמלית ולשמור אות V Annexin שכותרתו fluorescently לאחר שהשיב את המורפולוגיה נורמלית (איורים 4 א, ​​ו -4).
      הערה 2: אות V Annexin פוחתת עם זמן בתאים התאוששו (ראה דיון).
    6. תקן תאים בנקודות זמן שנבחרו עם paraformaldehyde 4% המכיל סוכרוז 8% ב1x PBS במשך 20 דקות בחושך בטמפרטורת חדר, ולשטוף את התאים הקבועים עם PBS במשך 3 פעמים כדי להסיר paraformaldehyde לפני ההרכבה תאים בשקופיות זכוכית coverslips עם antifade mountant (ראה חומרים) למיקרוסקופיה confocal או עלית הקרינה ולבחון V Annexin בתאים לאחר הסרת inducer אפופטוזיס.
      הערה 1: סוכרוז במקבע משמרת מבנה קרום תא בקיבעון.
      הערה 2: אחסן את פתרון paraformaldehyde בחושך ב 4 ° C כדי למנוע השפלה.
      הערה 3: לחמם את פתרון paraformaldehyde לטמפרטורת חדר לפני היישום זה לתאים לקיבעון, כדי למנוע הלם קר לתאים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

כדי לחקור את ההיפוך של אפופטוזיס, תאים בתרבית רקמה חשופים ראשון לגירוי מוות כדי לעורר אפופטוזיס. כאשר התאים להציג סימני ההיכר של אפופטוזיס, מדיום תרבות הטרי מוחל אז לשטוף את הגירוי ולאחר מכן דגירה התאים המתים כדי לאפשר התאוששות (איור 1 א). כאן, שאלת המפתח שפונים היא כמה רחוק תאים בתרבית למות אדם יכולים להתקדם לאפופטוזיס ועדיין עוברים Anastasis. שאלה זו ניתן לענות בודאות על ידי ניטור רציף עם סמנים ביולוגיים לעקוב אחר גורל תא באמצעות השיטות מתוארות להלן.

אנו מתארים ראשון אסטרטגיות שלנו כדי לזהות היפוך של אפופטוזיס בתאים בתרבית רקמה באמצעות מיקרוסקופ תא חי זמן לשגות, אשר נדרש למעקב והקלטת התגובה של תאים בודדים לפני, במהלך, ואחרי חשיפה לגירוי 12,13 אפופטוטיים. תאים חסיד בריאים למרוח על המצע המצורף שלהם (איור 1Bi) 12,13, ומוצג המיטוכונדריה פילמנטיות וגרעינים עגולים לפני הטיפול (איורים 1Ci, Di, Ei, Fi, Gi) 12,13. לאחר החשיפה לאתנול 3.8-4.5% במדיום תרבית תאים (כרך / כרך), DIC או מיקרוסקופ לעומת השלב גילה כי התאים הציגו סימני ההיכר מורפולוגיות של אפופטוזיס, כוללים עיבוי cytoplasmic, blebbing קרום פלזמה, והצטמקות תא (איורים 1Bii, 1Cii- iii, ו1Eii-vi) 12,13. היווצרות גוף אפופטוטיים על ידי אותם תאים נצפתה בקלות על ידי דסק"ש (איורים 1Eii-vi). פיצול של המיטוכונדריה שכותרתו MitoTracker (איורים 1Dii-iii, 1Fii-vi) 12,13 וכן ההתעבות של DNA הגרעיני הצבעוני Hoechst (איורים 1Dii-iii, FII-iii, Gii) 12,13, ופיצול של גרעינים (איורures 1Evi וFvi, חצים לבנים), התגלו בו זמנית על ידי מיקרוסקופ confocal או עלית הקרינה. התאים שהתהפכו אפופטוזיס בהצלחה נצפו לאחר מכן להחזיר את המורפולוגיה נורמלית, ככל הנראה תיקון הנזקים שלהם (איורים 1Biii, C וDiv-vi, E וFvii-xii, וGiii) 12,13. תאים בתנאים אלה גם הוכחו כדי להחזיר את תנועתיות אברון, נדידת תאים, ואנדוציטוזה הפונקציונלית המבוססות על ספיגה של חטיבה פולטות הקרינה נקודות קוונטיות ותא 13. מעניין, כמה תאים שאפופטוזיס הנערץ מוצג מורפולוגיה סדירה גרעינית (איור 1Fxii), וגם את חלוקת תא נורמלית והיווצרות גרעינונים (איורים 1Giv-ז) 13, שבו הוא סמן ביולוגי של נזק לדנ"א, שבירת כרומוזום ואובדן כרומוזום שלם בתאים מתחלקים 39, 40. ג עקורhromosomes או שברי כרומוזום מחוץ להיכשל להיכלל בגרעין תא הבת מוקפים על ידי קרום גרעין 39, 40. לפיכך, תוצאה של Anastasis יכולה להיות מחסה של הגנום שניזוקו במהלך אפופטוזיס הכושל, שהובילה ליצירת גידולים והתקדמות הסרטן. הנוכחות של גרעינונים מקובל גם בתאי סרטן 40,41.

שחרורו של המיטוכונדריה ג ציטוכרום הוא שלב קריטי לתווך או להגביר אפופטוזיס caspase-תלוי 20-22. שימוש בתאי הלה ביציבות להביע GFP-tagged ציטוכרום C, אנחנו פיקוח רילוקיישן subcellular של ציטוכרום C באפופטוזיס וAnastasis על ידי מיקרוסקופ confocal. כ23,24 דיווח, -GFP ג ציטוכרום המקומי למיטוכונדריה לפני הטיפול (איורים 2Ai ו- B), אבל אז שוחרר לcytosol לאחר גירוי מוות היה מיושם (איורים 2Aii,2Aiii ו- B). מורפולוגיות מאפיין אחרות כגון פיצול המיטוכונדריה וblebbing קרום פלזמה, נצפו גם בתאים ששוחררו -GFP ציטוכרום C (איור 2Aiii). תאים אלה דווחו לעבור מוות של תאי זמן קצר לאחר שחרורו של ציטוכרום C 23-27. עם זאת, לאחר הסרת גירוי המוות, שמו לב שרמות -GFP ג ציטוכרום cytosolic ירדו, המיטוכונדריה חזרה מבני פילמנטיות, וקרום הפלזמה התאושש מראה נורמלי (איורים 2Aiv-vii, ו- B). לכן, תאים אפופטוטיים יכולים לעבור Anastasis לאחר שחרור המיטוכונדריה של ציטוכרום C.

הגברה של caspases ביקוע-DEVD במורד הזרם הנחה היא בדרך כלל להיות "נקודת אל-חזור" באפופטוזיס 2,5. לכן, השתמשנו expr NES-DEVD-YFP-NLS biosensor caspaseessed מפלסמיד 13, כך שניתן לזהות תאים ששרדו שחוו פעילות caspase (איור 3 א) בעבר. biosensor caspase זה פוליפפטיד עם אות N-terminal הדרה גרעינית (NES), מקשר עם caspase-3 אתר / 7 מחשוף קונסנסוס (DEVD) 26,42,43, ואחריו חלבון פלואורסצנטי צהוב (YFP) ו אות C-מסוף לוקליזציה גרעינית (NLS). בתאים בריאים, biosensor זה בעיקר localizes לcytosol כפונקציה של NES (איורים 3Bi, Ci-iv, ו- D) 13. במהלך אפופטוזיס, caspases מופעל לדבוק מוטיב DEVD, שחרור YFP-NLS, אשר translocates ביעילות מcytosol לגרעין בתאים שבו זמנית, או לאחר מכן, להציג תכונות אחרות של אפופטוזיס כגון 3B DNA / עיבוי הכרומטין והצטמקות תא (האיורים ii -IV, ו- D) 13. כך,תאי se לשמר פונקצית יבוא גרעינית לאחר הפעלת caspase. לאחר הסרת inducer אפופטוזיס, תאים שעוברים התאוששות מורפולוגיים תצוגת Anastasis גם לאחר הפעלת caspase התרחשה (איורים 3Bv-x, ו- D) 13, ככל הנראה היפוך אפופטוזיס שלב מאוחר. במהלך ההתאוששות של מורפולוגיה נורמלית, אות YFP הגרעינית מצטמצמת באינטנסיביות בחלק מהתאים כאשר הם מתחילים להפוך אפופטוזיס לאחר הסרת גירוי מוות (איורים 3Bv-x, Cell 1) 13, המצביעה על כך תאים לבזות את biosensor-ביקע caspase, ככל הנראה על ידי אותו המנגנון המשמש להסרת מוצרים-ביקע caspase אחרים במהלך ואחרי Anastasis.

יכול גם להתגלות Anastasis ללא מיקרוסקופ תא חי. זו יכולה להיות מושגת על ידי שימוש בV Annexin שכותרתו fluorescently 38,44, אשר נקשר וסימני מוחץ phosphatidylserine (PS) בשלב מוקדם באפופטוזיס ( (איור 4) 13, כphosphatidylserine מוגבל לעלון הפנימי של קרום הפלזמה של תאים בריאים 38. בניגוד לכך, תאים מתים אפופטוטיים מושרה אתנול לחשוף phosphatidylserine על פני התא (איור 4) 13, ולכן, יכולים להיות מתויג עם V Annexin ניאון 38,44. במידה ניכרת, שכותרתו תאי V Annexin יכולים להחזיר מורפולוגיה נורמלית לאחר הסרת גירויי המוות, המצביע על כך cardiomyocytes העיקרי שהתהפך אפופטוזיס (איור 4) 13. אחרים יישמו בעבר באסטרטגיה דומה למציעה התאוששות שמאפופטוזיס יכול להתרחש in vivo. במודל in vivo של פגיעת איסכמי חולפת, תיוג V Annexin caspase-התלוי של cardiomyocytes בארנבות ועכברים מחדש כנראהsulted בהפנמה של V Annexin ששרד תאים לאחר איסכמיה החולפת 45, המצביע על Anastasis שעלול להתרחש בבעלי חיים. בנוסף, שני מחקרים אחרים המשמשים תא מיון לזהות חלק של BCL עכבר Annexin שכותרתו V 1 .3B3 תאי B לימפומה (חשופים לנוגדנים נגד אימונוגלובולינים שגורמים לאפופטוזיס ב 1 .3B3 BCL) וקרצינומה של תאי עכבר החלב MOD להביע טמפרטורה p53 -sensitive (שגורם לאפופטוזיס מודגרות אחרי מתחת לטמפרטורה מתירנית) המשיך להתרבות לאחר שהוחזרו לתנאי תרבות נורמלים 14,15. ככלל, מחקרים אלה מראים כי V Annexin שימושי לקביעת גורלם של תאים שהתהפכו אפופטוזיס ללא הדמיה מיקרוסקופית תאי חיים. עם זאת, יש אזהרות באסטרטגיה זו, כקרינת V Annexin אינה קבועה (איור 4) 13, שנותרו לגילוי לכמה שעות בלבד לאחר הסרת גירוי המוות, כך ששיטות אלה אינם יכולים לספק מעקב לטווח ארוך של תאים שהתהפכו אפופטוזיס.

איור 1
איור 1: מעקב היפוך של אפופטוזיס על ידי הדמיה תא חי. (הודפס מחדש באישור מטאנג et al, 23 MBoC, 2,240-2,252 13, לאיורים 1 א -. D, ו- G). גישה () כדי לגרום לאפופטוזיס, ולאחר מכן לאפשר לתאים בתרבית כדי להתאושש לאחר שטיפת inducer אפופטוזיס. מיקרוסקופיה (B) זמן לשגות שלב תא חי ניגודיות של תאי כבד העכבר עיקריים בריאים (ללא טיפול), אותה הקבוצה של תאים שטופלו עם אתנול 4.5% במדיום התרבות (כרך / כרך) במשך 5 שעות (שטופל), ולאחר מכן לשטוף וטופחו נוסף עם מדיום תרבות טרי למשך 24 שעות (שטף). בר סולם, 100 מיקרומטר. מיקרוסקופיה עלית הקרינה הזמן לשגות רציף תא החי של אותו תא כבד העכבר העיקרי לפני etha (C)טיפול nol (i), במועדים המצוין לאחר טיפול עם 4.5% אתנול במדיום תרבית תאים של 2.5 שעות (II ו- III), ולאחר שטיפה ודוגר עם מדיום חדש כדי לאפשר התאוששות עבור שעה 1 (iv - vi). תמונות הממוזגות של המיטוכונדריה צבעונית MitoTracker (אדום) ואת הגרעין (הכחול) הצבעוני Hoechst היו דמיינו ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי העלית, ומורפולוגיה של תאים על ידי מיקרוסקופ דסק"ש. בר סולם, 10 מיקרומטר תמונות. (ד) מוזגו הקרינה בלבד (ללא DIC) מC הפנל לחשוף מורפולוגיות אברון. (E) מיקרוסקופיה זמן לשגות רציף תא חי confocal של תאי H446 סרטן הריאות של תאים הקטנים אדם לפני הטיפול באתנול (i) , לאחר טיפול עם אתנול 3.8% במדיום תרבית תאים למשך 2 דקות שעות 28 (ii-vi), ולאחר שטיפה ודוגר עם מדיום חדש כדי לאפשר התאוששות (vii-יב). תמונות הממוזגות של המיטוכונדריה צבעונית MitoTracker (אדום) וגרעינים הצבעוניים Hoechst (כחול) היו דמיינו ידי מיקרוסקופ confocal, וג ell מורפולוגיה ידי מיקרוסקופ דסק"ש. חצים לבנים מצביעים על גרעין מקוטע בגופים אפופטוטיים (vi). בר סולם, 10 מיקרומטר. (F) מוזגו תמונות הקרינה בלבד (ללא DIC) מE הפנל לחשוף מורפולוגיות אברון. (G) רציף מיקרוסקופיה זמן לשגות תא חי עלית הקרינה הדמיה גרעינית צבעונית Hoechst מונוכרום של הלה תא בודד שעובר חלוקת תא לא מדויקת. לפני הטיפול באתנול (i), טיפול עם 4.3% אתנול בתרבית תאים בינוניים במשך 5 שעות (ii) ולאחר הסרת אתנול (שטף, iii-vi). iv פנלים מגלה חלוקות תא נורמליות. חיצים אדומים מציינים את הגרעינים הגדולים בתאים מתחלקים (iv- vi). בר סולם, 30 מיקרומטר. פעמים הם ציינו hr:. דקות אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

"Src =" תרשים 2 "/> / קבצים / ftp_upload / 51,964 / 51964fig2highres.jpg
איור 2: זיהוי היפוך של אפופטוזיס לאחר שחרור המיטוכונדריה של ציטוכרום C () מיקרוסקופיה זמן לשגות רציף חי תא confocal של תאי הלה ביציבות להביע -GFP ציטוכרום C (Cyto C -GFP) לפני (i), במהלך (ii-iii) ולאחר חשיפה (iii-ז) לרמה של 3.9% אתנול במדיום תרבית תאים. תמונות confocal התמזגו של CytoC-GFP (ירוק), מיטוכונדריה הצבעונית MitoTracker (אדום), וגרעינים צבעוניים Hoechst (כחול) בשילוב עם תמונות דסק"ש (פנל משמאל). גרסאות לא ממוזגות מוצגות בנפרד לCytoC-GFP, מוצגים כמפת חום של עוצמת האות (פנל באמצע משמאל), תמונה בשחור-לבן של CytoC-GFP (פנל באמצע), ותמונה בשחור-לבן של המיטוכונדריה (פנל באמצע מימין). תמונות הממוזגות של CytoC-GFP ומיטוכונדריה (פנל מימין). (ב) השינוי בעוצמת אות ג-GFP ציטוכרום cytosolic של התאים, Cel1 ליטר ותא 2, כפי שצוין בתמונה CytoC-GFP בשחור-לבן בלוח Ai. פעמים הם ציינו hr:. דקות אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3: זיהוי היפוך של אפופטוזיס לאחר הפעלת caspase (הודפס מחדש באישור מטאנג et al, 23 MBoC, 2,240-2,252 13, לאיורי 3 א - ד.). (א) תרשים של חלבון היתוך biosensor caspase המורכב מאות יצוא גרעיני (NES), אתר caspase DEVD מחשוף, חלבון פלואורסצנטי צהוב (YFP), ואת אות הלוקליזציה הגרעינית (NLS). (ב) זמן לשגות רציף חי מיקרוסקופיה תא confocal של תאי הלה להביע NES-DEVD-YFP-NLS biosensor caspase לפני (i), במהלך (ii -IV) ואחרי (חשיפה) vx ל -4.3% אתנול במדיום תרבית תאים. תמונות confocal התמזגו של biosensor caspase (הירוק), גרעינים צבעוניים Hoechst (כחול) ותמונות דסק"ש (פנל משמאל), תמונות בשחור-לבן של אות YFP (פנל באמצע), ומפת חום המעידה על עוצמת אות YFP (פנל מימין) . (ג) שלא טופלו בקרות ניתחו כמו בB. פנל (ד ') לכימות עוצמות הקרינה לbiosensor caspase הגרעיני הופעל בתאים בודדים (ממוספרים 1 ו- 2 בלוח Bi) לפני, במהלך, ואחרי החשיפה של אתנול, ובבקרה שלא טופלה (ממוספר 3 ו -4 בלוח Ci) חושבו כאחוז מהווה YFP בגרעין (עוצמת אות YFP תא גרעינית / כוללת x 100%). פעמים הם ציינו שעה: דקות. בר סולם, 10 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

ays "> איור 4
איור 4: זיהוי היפוך של אפופטוזיס על ידי V Annexin שכותרתו ניאון (הודפס מחדש באישור מטאנג et al, 23 MBoC, 2,240-2,252 13, לאיורים 4 א - B.). (א) תרשים של assay Anastasis V-FITC Annexin משמש בB. פנל עכברוש הילודים myocytes חדרית לב העיקרי נחשף לאתנול 4.5% במדיום תרבית תאים במשך 5 שעות, ולאחר מכן הודגרו עם Annexin V-FITC 10 (ב) דקות לפני הסרת בינוני אתנול. תאים היו קבועים או מייד (שטופלו), או קבועים לאחר refeeding עם מדיום חדש להתאוששות 2 שעות נוספות (שטף). תאים שלא טופלו שנחשפו Annexin V-FITC לשמש כביקורת (ללא טיפול). המיטוכונדריה צבעונית MitoTracker, גרעינים צבעוניים Hoechst (כחול) וAnnexin V-FITC (ירוק) (אדום) היו דמיינו ידי מיקרוסקופ confocal, ומורפולוגיה של תאים הייתה דמיינה ידי מיקרוסקופ דסק"ש. Scבר אייל, 10 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Anastasis מתייחס לתופעה שבה תאים שהופעלו מסלול המוות של תאים לאחר מכן להפוך את תהליך הגסיסה ולשרוד. הנה, יש לנו הראינו שהדמית תא חי יכולה לשמש כדי לאשר שאותם תאים בודדים למעשה יכולים להפוך את תהליך המוות של תאים אפופטוטיים בשלב מאוחר, ולאחר מכן להמשיך ולשרוד ולהתרבות. הפרוטוקולים שלנו לתאר כמה תנאי טיפול ספציפי לסוג תא מותאם כדי לגרום לאפופטוזיס ולאפשר חלק גדול מהתאים לעבור ההיפוך של אפופטוזיס במעקב עם כמה סמנים ביולוגיים לאימות. בעניינים טכניים, מנות תחתית זכוכית שמשו לתאי תרבות הדמיה 12,13, בגלל הזכוכית שקופה מאוד דקה שבין תאים ואובייקטיביים מיקרוסקופ, המאפשרת מרחקי עבודה ארוכים לconfocal באיכות גבוהה או מיקרוסקופ פלואורסצנטי העלית בהגדלה גבוהה, מאפשר תצפית של אפופטוזיס הקלאסי כוללים פיצול של המיטוכונדריה, שחרורו של ציטוכרום C, ועיבוי גרעיני ופיצול. זכוכית גם לא לעוות את הקוטביות של אור, כדי לאפשר מיקרוסקופיה DIC באיכות גבוהה עבור ניטור של blebbing קרום, התכווצות תא של תאים, והיווצרות גוף אפופטוטיים באפופטוזיס. יש מיקרוסקופיה DIC יתרונות על פני מיקרוסקופ לעומת השלב להתבונן סימני ההיכר מורפולוגיות אלה של אפופטוזיס, כדסק"ש משפר את הניגודיות של דגימות תאים בלא כתם ושקופים, שיפור זיהוי של מורפולוגיות תא. אם דסק"ש ומיקרוסקופ לעומת השלב אינו זמינים, CellTracker יכול לשמש כדי להכתים את cytosol להתוות את המורפולוגיה של תאי חיים עבור מיקרוסקופיה confocal או עלית הקרינה ולפקח על המורפולוגיה של התאים.

היישום של מינונים המתאימים של גירויי מוות והאסטרטגיות של הסרת הגירויים הם צעדים קריטיים לזיהוי של Anastasis. אנחנו בחרנו להשתמש בריכוזים נמוכים של אתנול כגירוי למוות descr הניסוייםibed כאן כי אחוז גדול של תאים שטופלו באופן אחיד יכול לעבור אפופטוזיס ויכול להתאושש מזה, שעלול להיות מתון יותר, גירוי מוות. עם זאת, יכולות להיות מיושמות גם גישות אלה בהצלחה עם גירויי מוות אחרים, כפי שדיווחנו 12,13. עם זאת, כמה גירויי מות מטבעם יותר מאתגר מאשר כגון staurosporine (STS), סוכן גרימת אפופטוזיס-נפוץ, אחרים. אולי משום שהוא נקשר מצעים שלה עם זיקה גבוהה 46-48, שטיפות חוזרות ונשנות הן חיוניות, אבל עדיין לא ביעילות להסיר STS מהתאים. במקרה זה, שימוש בריכוזים נמוכים יותר בסמים וזמן דגירה קצר יותר תרופה שעדיין יכול להפעיל את תהליך גסיסה אפופטוטיים יכול להיות מועיל כדי לאפשר יותר תאים להפוך אפופטוזיס. תאים עם מדיום תרבות תא מותנה גם יכול לשפר את ההיפוך של אפופטוזיס טוב יותר מתרבית תאים הבינוני טרי האכלה מחדש. תאים אפופטוטיים בדרך כלל מחוברים באופן רופף על פני השטח צלחת התרבות במיוחד על sur הזכוכיתפרצופים, ולכן חשוב לשטוף את inducers אפופטוזיס בעדינות כדי למנוע ניתוק תאים. ציפוי זכוכית מאכל עם פולי-D ליזין, קולגן ו / או פיברונקטין יכול להגדיל את דבקות תא ולמאפשרים סוגים מסוימים של תאים, כגון cardiomyocytes 37, לצרף כראוי על משטח הזכוכית של מנות תרבית תאים, במיוחד לאחר החשיפה של תאים ל גירוי מוות.

התהליך של אפופטוזיס, וסביר להניח ההיפוך של אפופטוזיס, תלוי בפעילות האנזימטית שיכול להיות מושפעת מטמפרטורה. לכן, שמירה על תאים על 37 מעלות צלזיוס או במצב הרגיל שלהם התרבות היא חשובה לאורך כל תהליך ההדמיה לחיות כדי להבטיח שחזור של תוצאות ניסויים. מיקרוסקופ טרום חם לפני שמתחיל הדמיה תא חי הוא גם שלב קריטי המאפשר רכיבי מיקרוסקופ כדי להגיע תרמו-שיווי משקל. זה יכול למנוע את הסחיפה של מיקוד ושינוי של מישור xy עקב ההתרחבות והתכווצות התרמית שלרכיבים במהלך הדמיה תא חי. החלת או הסרת גירוי המוות על ידי שינוי המדיום תרבות צלחת עם או pipet או על ידי זלוף במערכת מיקרוסקופיה מראש חימם במהלך הדמיה הזמן לשגות עדיין יכול לגרום לסחיפה של מוקד עקב שינויים בטמפרטורה או נפח של המדיום. רכישת Z-ערימה יכולה לעזור לתאי תמונה במישור המוקד הנכון, אבל תגדיל את הסיכון של phototoxicity בשל חשיפה נוספת של תאים ללייזרי ניאון. לחלופין, שימוש במערכות פיצוי להיסחף מוקד, כגון מערכת תיקון פוקוס האוטומטי מבוסס לייזר אינפרא-אדומה, יכול לשמור על תאים באותו מישור המוקד במהלך הדמיה תא חי זמן לשגות על ידי שמירה על המרחק בין התאים / הזכוכית והאובייקטיבית ללא נוסף חשיפה של התאים לאורך גל קצר, הקרינה phototoxic.

שחרור מיטוכונדריאלי של חלבוני apoptogenic כגון ציטוכרום C, והפעלה של caspases מפעיל, כגון במורד הזרם / אפקטאו caspase-3 וcaspase-7, כבר נחשבו בדרך כלל להיות "נקודת אל-חזור" ב2,5,6 תהליך המוות של תאים אפופטוטיים. כתמים מערביים היו בשימוש כדי לזהות את המחשוף (הפעלה) של caspase-3 והמצעים שלה כגון פולי (ADP) -ribose פולימראז-1 (PARP) וDFF45 / ICAD באוכלוסיית כולה התא במהלך אינדוקציה אפופטוטיים ולאחר הסרת אפופטוטיים גירויים, וגילו שהבקיע caspase-3, ICAD, וPARP הופיע בתאים במהלך חשיפה לגירויי מוות, אך נעלמו לאחר התאים מחדש הזנה עם התרבות טרי בינוני 13. עם זאת, שיטות אלה חושפים את המצב הכללי באוכלוסיית תא, אך אינו מבחינות התאים הבודדים שסופו של דבר למות מאלו שיתהפכו אפופטוזיס ולאחר מכן לשרוד. יש חלוקה ביוכימיים לנתח שחרורו של המיטוכונדריה ג ציטוכרום אזהרות דומות. לכן, כדי לעקוב אחר גורלם של תאים בודדים לאחר שחרור ציטוכרום C וcaspase-activation, שני מסימני ההיכר המוכרים ביותר של אפופטוזיס 2,5,6, מתויג GFP ציטוכרום C (Cyto C -GFP) וbiosensor caspase, כגון זה המשמש כאן NES-DEVD-YFP-NLS, בשילוב עם תא חי מיקרוסקופיה לעקוף בעיות אלה על ידי ההתבוננות ישירות התאוששות מורפולוגיים וטרנסלוקציה של biosensor Cyto C -GFP באותם תאים. תוצאות אלו מצביעות על ההפיכות של אפופטוזיס לאחר שחרור ציטוכרום C המיטוכונדריה והפעלת caspase.

האתגר הנוכחי ללימוד Anastasis הוא חוסר טכניקות תיוג כדי לזהות תאים שעברו Anastasis בכל נקודה לאורך כל החיים שלהם, in vivo או במבחנה. ביטוי יציב של biosensor caspase NES-DEVD-YFP-NLS גם מאפשר זיהוי של פעילות caspase אם caspases מופעל שוב בעתיד, אבל לא באופן קבוע להקליט פעילות caspase כbiosensor הופעל יהיה מושפל ללא sustaפעילות caspase אינו עומד ל-13. חיישנים ביולוגיים אחרים שדווחו בעבר caspase, כגון החיישנים הביולוגיים קישטא מבוסס סריג (למשל ECFP- [DEVD] -Venus) 26,49, כמו גם כתבי ניאון Apoliner (CD8-RFP- [DQVD] -GFP) 50 וCPV (למשל CD8 - [DEVD] -Venus) 51,52, יכול לשמש כדי לזהות פעילות caspase בכל בעלי חיים ובתאים בתרבית, אבל יש מגבלות דומות. באופן דומה, Cyto C -GFP לא ניתן להשתמש כדי לעקוב אחר תאים שהתהפכו אפופטוזיס בטווח ארוך, כפי שהוא שוחרר מן המיטוכונדריה לתוך cytosol במהלך אפופטוזיס ונפגע בהמשך. תיוג V Annexin נעשה שימוש כדי לעקוב אחר תאים שהתהפכו אפופטוזיס, אך עוצמת האות גם יורדת עם זמן, ולכן הוא לא שימושי למעקב לטווח ארוך של Anastasis 13,45. לטווח ארוך רצוף בהדמיה vivo יכול לשמש כדי לעקוב אחר גורלם של אותם תאים לאחר החשיפה של גירויי מוות. עם זאת, לטווח ארוך בתחום ההדמיה vivo עדיין מאתגר to לבצע ברוב בעלי חיים. לכן יש צורך בגישות נוספות להארכת מחקר Anastasis למחקרים בבעלי חיים שלמים, ולסינון תרופות שיכולים לקדם או לעכב Anastasis שימוש בתאים בתרבית הרקמה

בעתיד, יש צורך בפרוטוקולים חדשים וטכניקות העוקבים אחר גורל תא לטווח ארוך כדי לפתח ולבדוק את ההשלכות פיסיולוגיות, פתולוגי וטיפוליות של Anastasis. אנחנו הצענו שAnastasis יכול להיות מנגנון הישרדות תא כללי להצלת תאים נפצעו שקשה להחליף, כגון תאים בוגרים ותאי לב 13. עם זאת, Anastasis של תאי סרטן אפופטוטיים לאחר טיפולים כימותרפיים עלול לגרום להתאוששות של תאים מסוכנים המובילים להישנות של גידולים עמידים 12,13. גם Anastasis יכול להיות מנגנון חשוב של יצירת גידולים, כחלק מתאים להציג שינוי שבעור אחרי שהתהפכו אפופטוזיס 13. לפיכך, שיפור Anastasis יכול להיות Thera חדשאסטרטגית peutic לעיכוב תהליכי ניוון מוחיה ואי ספיקת לב, תוך דיכוי Anastasis כדרך חדשה למניעה או טיפול בסוגי הסרטן. פיתוח חיישנים ביולוגיים למעקב היפוך של אפופטוזיס במערכות מודל מחלה יקדם את הבנתנו את מנגנוני הישרדות תא של Anastasis, והתרופות פוטנציאליות למחלות סוררות על ידי ויסות Anastasis.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

אנו מודים לכומר ד"ר ראלף Bohlmann וכומר ד"ר ג'יימס Voelz למציעים את המילה "Anastasis" כדי לתאר את ההיפוך של אפופטוזיס; דאגלס ר 'ירוק לתאים הלה ביציבות להביע ציטוכרום C -GFP; Charles M. רודין ואריק א גרדנר לH446 תאים; הת'ר כבש לסיוע בציור קריקטורה בווידאו; איי הואי Yeo לדיון חשוב של כתב היד הזה. עבודה זו נתמכה על ידי אדוארד Youde זיכרון מלגת סר (HLT), מלגת ד"ר וולטר Szeto הזיכרון (HLT), מענק פולברייט 007-2,009 (HLT), מלגת מדעי חיים קרן המחקר (HLT), NIH מעניק NS037402 (JMH) וNS083373 (JMH), וועדת מענקי אוניברסיטת הונג קונג AoE / B-07/99 (MCF). הו Lam טאנג הוא קרן עמית Shurl וקיי קורצ'י של מדעי החיים קרן המחקר.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
LSM780 confocal microscopy Carl Zeiss
Glass bottom culture dish MatTek Corporation P35G-0-14-C
Transparent CultFoi Carl Zeiss 000000-1116-084
CO2 independent medium Life Technologies 18045-088
CellTracker Life Technologies C34552
Mitotracker Red CMXRos Life Technologies M-7512
Hoechst 33342 Life Technologies H1399
Fluorescently labeled annexin V Biovision K201

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kerr, J. F., Wyllie, A. H., Currie, A. R. Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics. British Journal of Cancer. 26, 239-257 (1972).
  2. Riedl, S. J., Shi, Y. Molecular mechanisms of caspase regulation during apoptosis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 5, 897-907 (2004).
  3. Green, D. R., Kroemer, G. The pathophysiology of mitochondrial cell death. Science. 305, 626-629 (2004).
  4. Chipuk, J. E., Bouchier-Hayes, L., Green, D. R. Mitochondrial outer membrane permeabilization during apoptosis: the innocent bystander scenario. Cell Death and Differentiation. 13, 1396-1402 (2006).
  5. Kroemer, G., et al. Classification of cell death recommendations of the Nomenclature Committee on Cell Death 2009. Cell Death and Differentiation. 16, 3-11 (2009).
  6. Galluzzi, L., et al. Molecular definitions of cell death subroutines: recommendations of the Nomenclature Committee on Cell Death 2012. Cell Death and Differentiation. 19, 107-120 (2012).
  7. Holland, A. J., Cleveland, D. W. Chromoanagenesis and cancer: mechanisms and consequences of localized, complex chromosomal rearrangements. Nature Medicine. 18, 1630-1638 (2012).
  8. Reddien, P. W., Cameron, S., Horvitz, H. R. Phagocytosis promotes programmed cell death in C. elegans. Nature. 412, (2001).
  9. Hoeppner, D. J., Hengartner, M. O., Schnabel, R. Engulfment genes cooperate with ced-3 to promote cell death in Caenorhabditis elegans. Nature. 412, 202-206 (2001).
  10. Segawa, K., et al. Caspase-mediated cleavage of phospholipid flippase for apoptotic phosphatidylserine exposure. Science. 344, 1164-1168 (2014).
  11. Overholtzer, M., et al. A nonapoptotic cell death process, entosis, that occurs by cell-in-cell invasion. Cell. 131, 966-979 (2007).
  12. Tang, H. L., Yuen, K. L., Tang, H. M., Fung, M. C. Reversibility of apoptosis in cancer cells. British Journal of Cancer. 100, (2009).
  13. Tang, H. L., et al. Cell survival, DNA damage, and oncogenic transformation after a transient and reversible apoptotic response. Molecular Biology of the Cell. 23, 2240-2252 (2012).
  14. Hammill, A. K., Uhr, J. W., Scheuermann, R. H. Annexin V staining due to loss of membrane asymmetry can be reversible and precede commitment to apoptotic death. Experimental Cell Research. 251, (1999).
  15. Geske, F. J., Lieberman, R., Strange, R., Gerschenson, L. E. Early stages of p53-induced apoptosis are reversible. Cell Death and Differentiation. 8, 182-191 (2001).
  16. Jacobson, M. D., Weil, M., Raff, M. C. Programmed cell death in animal development. Cell. 88, 347-354 (1997).
  17. Hardwick, J. M., Cheng, W. C. Mitochondrial programmed cell death pathways in yeast. Developmental Cell. 7, 630-632 (2004).
  18. Frohlich, K. U., Fussi, H., Ruckenstuhl, C. Yeast apoptosis-from genes to pathways. Seminars in Cancer Biology. 17, 112-121 (2007).
  19. Fuchs, Y., Steller, H. Programmed cell death in animal development and disease. Cell. 147, 742-758 (2011).
  20. Taylor, R. C., Cullen, S. P., Martin, S. J. Apoptosis: controlled demolition at the cellular level. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 9, 231-241 (2008).
  21. Wang, X. The expanding role of mitochondria in apoptosis. Genes & Development. 15, 2922-2933 (2001).
  22. Galluzzi, L., Kepp, O., Kroemer, G. Mitochondria: master regulators of danger signalling. Nature Reviews Molecular Cell Biolog. 13, 780-788 (2012).
  23. Goldstein, J. C., Waterhouse, N. J., Juin, P., Evan, G. I., Green, D. R. The coordinate release of cytochrome c during apoptosis is rapid, complete and kinetically invariant. Nature Cell Biology. 2, 156-162 (2000).
  24. Goldstein, J. C., et al. Cytochrome c is released in a single step during apoptosis. Cell Death and Differentiation. 12, 453-462 (2005).
  25. Tyas, L., Brophy, V. A., Pope, A., Rivett, A. J., Tavare, J. M. Rapid caspase-3 activation during apoptosis revealed using fluorescence-resonance energy transfer. EMBO Reports. 1, 266-270 (2000).
  26. Takemoto, K., Nagai, T., Miyawaki, A., Miura, M. Spatio-temporal activation of caspase revealed by indicator that is insensitive to environmental effects. The Journal of Cell Biology. 160, 235-243 (2003).
  27. Albeck, J. G., et al. Quantitative analysis of pathways controlling extrinsic apoptosis in single cells. Molecular Cell. 30, 11-25 (2008).
  28. Luthi, A. U., Martin, S. J. The CASBAH: a searchable database of caspase substrates. Cell Death and Differentiation. 14, 641-650 (2007).
  29. Liu, X., Zou, H., Slaughter, C., Wang, X. DFF, a heterodimeric protein that functions downstream of caspase-3 to trigger DNA fragmentation during apoptosis. Cell. 89, 175-184 (1997).
  30. Enari, M., et al. A caspase-activated DNase that degrades DNA during apoptosis, and its inhibitor ICAD. Nature. 391, 43-50 (1998).
  31. Li, H., Zhu, H., Xu, C. J., Yuan, J. Cleavage of BID by caspase 8 mediates the mitochondrial damage in the Fas pathway of apoptosis. Cell. 94, 491-501 (1998).
  32. Slee, E. A., Keogh, S. A., Martin, S. J. Cleavage of BID during cytotoxic drug and UV radiation-induced apoptosis occurs downstream of the point of Bcl-2 action and is catalysed by caspase-3: a potential feedback loop for amplification of apoptosis-associated mitochondrial cytochrome c release. Cell Death and Differentiation. 7, 556-565 (2000).
  33. Suzuki, J., Denning, D. P., Imanishi, E., Horvitz, H. R., Nagata, S. Xk-related protein 8 and CED-8 promote phosphatidylserine exposure in apoptotic cells. Science. 341, 403-406 (2013).
  34. Kroemer, G., Martin, S. J. Caspase-independent cell death. Nature Medicine. 11, 725-730 (2005).
  35. Chipuk, J. E., Green, D. R. Do inducers of apoptosis trigger caspase-independent cell death. Nature Reviews Molecular Cell Biolog. 6, 268-275 (2005).
  36. Tait, S. W., Green, D. R. Mitochondria and cell death: outer membrane permeabilization and beyond. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11, 621-632 (2010).
  37. Claycomb, W. C., et al. HL-1 cells: a cardiac muscle cell line that contracts and retains phenotypic characteristics of the adult cardiomyocyte. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 2979-2984 (1998).
  38. Zhang, G., Gurtu, V., Kain, S. R., Yan, G. Early detection of apoptosis using a fluorescent conjugate of annexin V. BioTechniques. 23, 525-531 (1997).
  39. Fenech, M. Cytokinesis-block micronucleus cytome assay. Nature Protocols. 2, 1084-1104 (2007).
  40. Fenech, M., et al. Molecular mechanisms of micronucleus, nucleoplasmic bridge and nuclear bud formation in mammalian and human cells. Mutagenesis. 26, 125-132 (2011).
  41. Gordon, D. J., Resio, B., Pellman, D. Causes and consequences of aneuploidy in cancer. Nature Reviews Genetics. 13, (2012).
  42. Poreba, M., Strozyk, A., Salvesen, G. S., Drag, M. Caspase substrates and inhibitors. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5, a008680 (2013).
  43. Talanian, R. V., et al. Substrate specificities of caspase family proteases. The Journal of Biological Chemistry. 272, 9677-9682 (1997).
  44. Logue, S. E., Elgendy, M., Martin, S. J. Expression, purification and use of recombinant annexin V for the detection of apoptotic cells. Nature Protocols. 4, 1383-1395 (2009).
  45. Kenis, H., et al. Annexin A5 uptake in ischemic myocardium: demonstration of reversible phosphatidylserine externalization and feasibility of radionuclide imaging. Journal of Nuclear Medicine. 51, 259-267 (2010).
  46. Ruegg, U. T., Staurosporine Burgess, G. M. K-252 and UCN-01: potent but nonspecific inhibitors of protein kinases. Trends in Pharmacological Sciences. 10, 218-220 (1989).
  47. Bertrand, R., Solary, E., O'Connor, P., Kohn, K. W., Pommier, Y. Induction of a common pathway of apoptosis by staurosporine. Experimental Cell Research. 211, 314-321 (1994).
  48. Chae, H. J., et al. Molecular mechanism of staurosporine-induced apoptosis in osteoblasts. Pharmacological Research. 42, 373-381 (2000).
  49. Takemoto, K., et al. Local initiation of caspase activation in Drosophila salivary gland programmed cell death in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 13367-13372 (2007).
  50. Bardet, P. L., et al. A fluorescent reporter of caspase activity for live imaging. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 13901-13905 (2008).
  51. Florentin, A., Arama, E. Caspase levels and execution efficiencies determine the apoptotic potential of the cell. The Journal of Cell Biology. 196, 513-527 (2012).
  52. Chihara, T., et al. Caspase inhibition in select olfactory neurons restores innate attraction behavior in aged Drosophila. PLoS Genetics. 10, e1004437 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics