Strategien für die Spurhaltung Anastasis, einer Zelle Überleben Phänomen, das Apoptose Kehrt

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Tang, H. L., Tang, H. M., Hardwick, J. M., Fung, M. C. Strategies for Tracking Anastasis, A Cell Survival Phenomenon that Reverses Apoptosis. J. Vis. Exp. (96), e51964, doi:10.3791/51964 (2015).

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Abstract

Anastasis (griechisch für "Rising to life") bezieht sich auf die Wiederherstellung von sterbenden Zellen. Bevor diese Zellen zu gewinnen, sie durch wichtige Kontrollpunkte der Apoptose, einschließlich mitochondriale Fragmentierung, Freigabe der mitochondrialen Cytochrom c in das Zytosol, Aktivierung von Caspasen, Chromatin-Kondensation, DNA-Schäden, Kernfragmentierung, Plasmamembran Blasenbildung, Zellschrumpfung, Zelloberflächenexposition bestanden haben Phosphatidylserin und Bildung von apoptotischen Körpern. Anastasis kann auftreten, wenn apoptotische Reize vor dem Tod entfernt, wodurch sterbenden Zellen zur Apoptose und möglicherweise anderen Todesmechanismen umzukehren. Daher erscheint anastasis physiologischen Heilungsprozesse, die auch beschädigte Zellen zu erhalten könnte unangemessen einzubeziehen. Die Funktionen und Mechanismen der Rekonvaleszenz sind noch unklar, zum Teil durch die begrenzte Tools zur Erkennung Ereignissen der Vergangenheit nach der Wiederherstellung der scheinbar gesunden Zellen behindert. Strategien zur Anasta erkennensis werden Studien über die physiologischen Mechanismen, die Gefahren von Untoten Zellen in Krankheitspathologie und potenziellen Therapeutika ermöglichen anastasis modulieren. Hier beschreiben wir effektive Strategien mit Lebendzellmikroskopie und eine Säugetier Caspase Biosensor zur Identifikation und Verfolgung anastasis in Säugerzellen.

Introduction

Apoptose (griechisch für "fallen in den Tod") wird im Allgemeinen angenommen, dass ein einseitiger Prozess endet in Zelle Selbstmord 1-7 sein. Genetische Störung der pro-Tod Gene Ergebnisse in der Überlebensrate von zusätzlichen Zellen, die sonst in ganzen Tieren sterben würde, einschließlich Zellen, die bereits die Apoptoseweg 8,9 eingeleitet haben. Auch genetische Manipulationen ermöglichen gesunden Säugetierzellen, die künstlich Anzeige "essen mich" Signale oder die Haftfähigkeit zu verlieren, ihre extrazellulären Matrix zum Tod durch Ganzzell-Phagozytose oder entosis bzw. 10,11 entkommen. Jedoch haben wir und andere gezeigt, dass ohne genetische Manipulation normalen gesunden Säugetierzellen und Zelllinien, können auch aus den frühen Stadien der Apoptose 12-15 erholen. Mit Werkzeugen, einzelne Zellen zu verfolgen, haben wir weiter gezeigt, sich nach späten Stadien der Apoptose 12,13, nachdem Zellen wichtige Kontrollpunkte, dass typische gebenly markieren den "point of no return" 2-6. Diese Checkpoints Stufe Apoptose spät schließen mitochondrialen Freisetzung von Cytochrom c, Aktivierung von Caspasen, eine Kernfragmentierung und Bildung von apoptotischen Körpern. Wir nahm eine griechische gesetztes Wort "Anastasis", das bedeutet "stieg auf Leben", um diese Umkehrung der Apoptose am Rande der Zelltod 2-6 beschreiben.

Es sei denn, die gesamte Sterbe-Recovery-Prozess wird von lebenden Zellen beobachtet wird, wird es eine Herausforderung, Zellen, die anastasis aus Zellen, die nie apoptotischen Ereignisse erlebt unterzogen haben zu unterscheiden. Die jahrzehntelange Arbeit haben gezeigt, dass die morphologischen Merkmale der Zelltod durch Apoptose durch evolutionär konservierte biochemischen und molekularen Ereignisse 16-19 angetrieben. Diese Veranstaltungen fördern die Selbstzerstörung der Zellen, Entwicklungs- und homöostatischen Prozesse in einzelligen und mehrzelligen Organismen durch die Beseitigung beschädigter oder d zu regelnangerous Zellen 16-19. Während apoptotischen Zellen können leicht durch standardisierte morphologischen, biochemischen und molekularen Manifestationen Apoptose 1,5,6,16,20 unterschieden werden, gibt es bisher keine bekannte Marker spezifisch anastasis 12,13. Wichtig ist, dass Zellen, die anastasis laufen haben scheinen normale gesunde Zellen und Zellen, die gerade beginnen Umkehr Apoptose erscheinen als apoptotische sterbenden Zellen 12,13 sein. Damit neue Werkzeuge erforderlich sind, um mit Gewissheit, dass ein bestimmter überlebenden Zellen zuvor erlebt aktiven apoptotischen Prozessen abzuschließen.

Apoptose ist im Allgemeinen als eine irreversible Kaskade angenommen, weil es eine schnelle und massive Zerstörungsprozess. Man könnte zwar Minuten bis Tage dauern für einige Zellen, die Apoptose auslösen, sobald Mitochondrien apoptogene Faktoren wie Cytochrom c in das Cytosol freigesetzt 21,22 kann Caspasen innerhalb von 5 Minuten 23,24 aktiviert werden, gefolgt von cytoplasmatischen undKernkondensation innerhalb von 10 Minuten 25 bis 27, und Zelltod kurz danach 25-27. Aktivierte Caspasen dirigieren Apoptose durch Spaltung und Inaktivierung wichtigsten strukturellen und funktionellen Komponenten für die Zwecke der zellulären Abbruch 2,28, wie die Endonuklease-Inhibitor DFF45 / ICAD 29,30. Caspasen aktiviert auch pro-apoptotischen Faktoren wie BCL-2-Familienmitglied BID, die Mitochondrien transloziert mitochondriale Freisetzung von Cytochrom c 31,32 fördern. Caspase-Aktivität führt auch zu Zelloberflächenexposition von Phosphatidylserin als "essen mich" Signal für die Förderung der Phagozytose von sterbenden Zellen durch Makrophagen oder Nachbarzellen durch Phagozytose 33. Außerdem apoptotische Vorgänge machen Mitochondrien dysfunktional, Störung zellulärer Bioenergetik und Stoffwechsel 34,35,36. So scheint Erholung von solchen Zerstörung intuitiv unwahrscheinlich.

Entgegen der ursprünglichen erwartentionen können Zellen die Apoptose Prozess noch in einem späten Stadium umzukehren. Durch die kontinuierliche Überwachung das Schicksal der sterbenden Zellen in Kultur, beobachteten wir die Reversibilität der Bühne Apoptose spät in einem Spektrum von primären Zellen und Zelllinien 12,13. Die Entfernung der Tod Reizes Erholung von den offenkundigen Eigenschaften der Apoptose, wie mitochondriale Fragmentierung, Chromatin-Kondensation, DNA-Schäden, Plasmamembran Blasenbildung, Zelloberflächenexposition von Phosphatidylserin, Freigabe der mitochondrialen Cytochrom C, Caspase-Aktivierung, Kernfragmentierung, Zellschrumpfung, und Bildung von apoptotischen Körpern. Diese Beobachtungen werfen unbeantwortete Fragen zu den Funktionen, Folgen und Mechanismen der Rekonvaleszenz. Um diese Fragen anzugehen, ist eine Voraussetzung, um zuverlässig zu identifizieren Zellen, anastasis unterzogen wurden. Hier beschreiben wir Live-Mikroskopieverfahren und eine Caspase Biosensor zum Nachweis von Zellen, die zuvor rückgängig gemacht haben, spät Apoptose und then überlebt.

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Protocol

1. Vorbereitung der Zellen für das Live Cell Imaging

  1. Um den Nachweis von morphologischen Veränderungen zu erleichtern, wählen adhärenten Zellen wie HeLa (humane Zervixkarzinom-Zellen), die flach auf dem Substrat zur Änderung der Plasmamembran und intrazellulären Organellen besser zu visualisieren.
    Hinweis: Umkehr der Apoptose in verschiedenen Säugetierzellen 12,13, einschließlich primären Mausleberzellen, primären Maus-Makrophagen, primären Ratten-Kardiomyozyten beobachtet und auch Zelllinien wie menschliche embryonale Nieren HEK-293T-Zellen, der afrikanischen grünen Meer Nierenepithelzellen COS -7 Zellen, Maus Herzmuskel HL-1-Zellen, Maus NIH 3T3 Fibroblasten, Frettchen (Mustela putoris furo) Gehirn CRL1656-Zellen, menschliche Hautkrebs A375-Zellen, menschliche Hodenkrebs CRL1973 Zellen, menschlichen kleinzelligen Lungenkarzinoms H446-Zellen, menschliche Leberkrebs HepG2-Zellen, menschliche Brustkrebs MCF7-Zellen, menschlichen Prostatakrebs PC3-Zellen und humanen Neuroblastom-SH-SY5Y-Zellen.
  2. Vorwäsche Deckgläser der Glasboden-Zellkulturschalen mit absolutem Ethanol zur Reinigung und Sterilisation.
    Hinweis 1: Die Verwendung von Glasbodenschalen ist für hochwertige Interferenzkontrast (DIC) Mikroskopie und hoher Vergrößerung konfokalen oder Epifluoreszenzmikroskopie (siehe Diskussion) empfohlen.
    Anmerkung 2: Für hohen Vergrößerungen (40x, 60 / 63X oder 100X Ziele und hohe numerische Aperturen 1.3 oder 1.4), stellt die Verwendung von Zellkulturschalen mit dünneren Glasboden (Dicke von 0,085 bis 0,16 mm) größere Arbeitsabstände für die Bildgebung (siehe Protokoll 3 ).
  3. Je nach Zelltyp können Glasboden-Kulturschalen-Beschichtung mit Poly-D-Lysin (0,1 mg / ml), Collagen (0,01% ige Lösung in 0,01 M Essigsäure) und / oder Fibronectin (5 ug / ml) vor der Aussaat erfordern Zellen.
    Anmerkung: Die Optimierung der Art und Konzentration der Beschichtungsmittel für verschiedene Zelllinien erforderlich. HeLa-Zellen können direkt auf Glas ohne Beschichtung haften. Jedoch können einige Zellen, such als Maus Herzmuskel HL-1-Zellen, können nicht direkt haften an Glasflächen, sondern erfordern spezifische Kultur und Beschichtungsprotokolle 37.
  4. Samen ~ 2-3 x 10 5 Zellen auf 35 mm vorbeschichtetes Glasboden-Zellkulturschalen und bei 37 Grad Celsius (° C) mit 5% CO 2 für einen Tag auf 80% Konfluenz erreichen.
    Anmerkung 1: Die optimalen Bedingungen der Zelldichte, Inkubationszeit und Kulturbedingungen können variieren, je nach dem Zelltyp. Zellkonfluenz können die apoptotische Antwort von Zellen (siehe Protokoll 2) beeinflussen. Bei hohen Konfluenz könnten Zellen weniger empfindlich gegenüber den gleichen Konzentrationen von apoptotischen Stimuli.
    Anmerkung 2: Vermeiden Sie zu konfluenten Zellen, wie hohe Zelldichte können morphologische Veränderungen einzelner Zellen und ihre Organellen zu verschleiern.

2. Anwendung und Entfernung von apoptotischen Stimuli

  1. Kurz vor Gebrauch vormischen Apoptose induzierende Agens mit 37 ° C Zellkulturmedium. Ethanol (3,6-4,5% Vol / vol) diente als Apoptose-Induktor in der vorliegenden Demonstration.
    Anmerkung 1: Die unveröffentlichte Daten zeigen, dass Zellen können auch Rückwärts Apoptose, die durch andere apoptotische Stimuli 12,13 ausgelöst wird, wie beispielsweise Dimethylsulfoxid (DMSO, 8% vol / vol 24 h), Staurosporin (STS, 0,5 uM für 1 h), und Taxol (1 uM für 12 h). Optimierung der Dosierung für das Auslösen von Apoptose ist für verschiedene Arten von Zellen erforderlich ist, um die Minimaldosis, welche die Mehrzahl der Zellen in der Population auslösen kann zur Apoptose zu erzielen.
    Anmerkung 2: Vormischen Apoptose-induzierende Mittel mit Zellkulturmedium ist wichtig, um ungleichmäßige Belichtung der Zellen auf Stimuli apoptotische vermeiden.
  2. Bild eine Gruppe von Gesundheits Zellen in der Zellkulturschale, bevor die Apoptose-induzierende Mittel zum Ausgangs Morphologien herzustellen.
  3. Entfernen des ursprünglichen Mediums aus der Zellkulturschale und dann 2 ml vorgemischt Apoptose induzierende Mittel gelten für die Schale zuTriggerzellen Apoptose. Inkubieren der Zellen bei 37 ° C mit 5% CO 2 (oder anderen normalen Kulturbedingungen).
  4. Nach der Inkubation wurden die Zellen zu beobachten durch das Licht, Epi-Fluoreszenz oder konfokale Mikroskopie, um die Progression von apoptotischen Eigenschaften überwachen.
    Anmerkung 1: Die Zellen, die einer Apoptose wird morphologischen, biochemischen und molekularen Kennzeichen der Apoptose, die durch Mikroskopie und Fluoreszenz-basierten Biosensoren detektiert werden kann an (siehe Protocols 3 und 4).
    Anmerkung 2: Die Inkubationszeit der Zellen mit verschiedenen Apoptose induzieren kann variieren, je nach Zelltyp, Zellbedingungen (wie Konfluenz und Nährstoffzustand), und die Dosis des Todes Stimulus. Sorgfältige Titration erforderlich.
  5. Wenn Zellen anzuzeigen Kennzeichen der Apoptose, entfernen apoptoseinduzierende Mittel durch Waschen der Zellen einmal mit warmem (37 ° C, oder andere normale Kulturtemperatur) frisches Zellkulturmedium.
    Anmerkung 1: Als apoptotischen Zellen werden mehr lose auf befestigtdie Kulturplatte ist es wichtig, anzuwenden und zu entfernen Medium vorsichtig, so dass die Zellen nicht weggeschwemmt werden.
    Anmerkung 2: Phasen suspendierten Zellen können aus dem Überstand durch leichtes Zentrifugieren (160 × g für 1 min) wiedergewonnen und wieder in die Kulturschale gegeben.
  6. Zellen bei 37 ° C mit 2 ml / 35 mm-Schale mit frischem Zellkulturmedium in 5% CO 2. Alternativ können Sie konditionierte Medium (zellfreier von gesunden Zellen gesammelt Kulturmedium) zur weiteren Verbesserung der Überlebensrate von apoptotischen Zellen.
    Hinweis: Waschen und Inkubieren von Zellen mit frischem Medium ermöglichen die Mehrheit der Zellen gegenüber Ethanol-induzierten Apoptose nach Ethanol Exposition 12,13 umzukehren. Jedoch Wiederholen dieses Waschschritt erforderlich, wenn die Zellen auf andere apoptotische Stimuli ausgesetzt werden (siehe Diskussion).

3. Live Cell Microscopy

  1. Wir empfehlen die Verwendung eines invertierten konfokalen oder Auflicht-Fluoreszenz-Mikroskop mit Umweltkontrolle (37 ° C,5% CO 2) für lebende Zellen, Mikroskopie.
    Hinweis: Es ist auch möglich, Bild die Zellen mit aufrechten Mikroskopen mit einem Wassertauchziel. Tauchen Sie das Ziel direkt in das Kulturmedium zur Bildzellen. Jedoch können die Zellen durch das Tauchziel beim Fokussieren zerkleinert werden.
  2. Pre-warm das Mikroskop (wie Umweltsteuerraum, Bühne Inkubator und Ziel Heizung) mindestens 2 Stunden vor der Bildgebung.
    Anmerkung: Dies ermöglicht Mikroskopkomponenten thermo Gleichgewicht aufgrund der thermischen Expansion und Kontraktion der Komponenten zu erreichen, so dass er die Drift des Fokus und der Verschiebung der xy-Ebene zu vermeiden.
  3. Legen Sie eine 35 mm Glasbodenschale von kultivierten Zellen (siehe Protokoll 1) auf der Bühne einem inversen Mikroskop und erfassen Zelle von Bildern mit einem 40X oder 63X-Plan-Apochromat Objektiv mit einer numerischen Apertur (NA) 1.3 oder 1.4 für die Bildgebung von Zellen aus der Boden der Schale durch Deckgläser.
    Hinweis: Vermeiden Sie die Anwendung mehr als 2 ml Mediumbis 35 mm Glasbodenschale, wie das Gewicht des Mediums konnte Krümmung der Glasboden verursachen, was es schwierig macht Bild ein Feld von Zellen mit der gleichen Brennebene.
  4. Pflegen Zellen bei 37 ° C oder der entsprechenden normalen Temperatur während des gesamten Abbildungsprozesses.
    Hinweis: Der Prozess der Apoptose, und wahrscheinlich die Umkehrung der Apoptose abhängig von Temperatur empfindlichen Enzymaktivitäten. Daher sollte die Zellen bei 37 ° C (zB mit einem Mikroskoptisch oberen Inkubators) ist während der gesamten Versuchs wichtig. Verminderte Temperatur könnte sich die apoptotische Reaktion und die Wieder Reaktion nach der Entfernung von apoptotischen Stimulus verlangsamen.
  5. Verwenden Sie eine Feuchtigkeitsschutzeinrichtung oder lag eine transparente Folie (siehe Materialien) auf der Kulturschale um den Wasserverlust durch Verdunstung aus dem Medium zu reduzieren.
    Hinweis: Die Folie kann die Polarität von Licht für DIC-Mikroskopie unterbrechen. Wiederherstellen Polarität durch Anpassung der Polarisator im Strahlengang.
  6. Pflegen pH-Wert in derZellkulturmedium (pH 6.8 -7.3) durch Inkubation in 5% CO 2 mit einem Umgebungssteuerkammer auf dem Mikroskop.
    Anmerkung: Wartung der pH-Wert in einem Kulturmedium kann auch durch Zugabe HEPES-Puffer erreicht werden, oder durch die Verwendung von kommerziellen CO 2 -unabhängigen Medium (siehe Materialien). Optimale Bedingungen können variieren, je nach dem Zelltyp.
  7. Minimieren Fluoreszenz / Laser (Anregungslichtintensität) Exposition von Zellen während des Abbildungsprozesses Phototoxizität durch Verringern der Fluoreszenzintensität zu den niedrig, qualitativ hochwertige Bilder von Zell / subzellulären Strukturen oder exprimiert Biosensoren (Details des Protokolls 4) zu erhalten, zu vermeiden.

4. Strategien zur Detektion und Verfolgung Anastasis während und nach der apoptotischen Ereignisse

  1. Plasmamembran-Bläschenbildung, zytoplasmatische Kondensation, Zellschrumpfung und apoptotische Körper-Bildung (siehe 1A - C, E).
    1. Führen Sie Zeitraffer-Live Cell verschierenzInterferenzKontrast (DIC) oder Phasenkontrastmikroskopie, um eine Gruppe von Gesundheits Zellen zu verfolgen und ihre Zellmorphologie (Siehe Protokoll 3 für Lebendzellmikroskopie, und siehe Diskussion) zu beobachten.
      Hinweis 1: Reduzieren Intensität Lichtquelle für DIC / Phasen Vertrag Bildgebung zu Phototoxizität zu den Zellen zu vermeiden.
      Hinweis 2: Wenn DIC und Phasenkontrastmikroskopie nicht verfügbar sind, verwenden Celltracker die Cytosol Fleck, um die Morphologie von lebenden Zellen für die konfokale oder Epifluoreszenzmikroskopie skizzieren und Überwachung der Zellmorphologie.
    2. Anwenden Zelltod Stimulus an Zellen Apoptose auslösen (siehe Protokoll 2 für die Anwendung und Entfernung von apoptotischen Stimuli).
    3. Beobachten behandelten Zellen zur morphologischen Kennzeichen der Apoptose, wie Plasmamembran blebbing cytoplastisches Kondensation Zellschrumpfung und apoptotische Körper Bildung (1A, 1B, 1C, 1E).
    4. Wegspülen Tod Reize und Nachschub Zellen mit frischem Medium, wenn die Zellen display morphologischen Kennzeichen der Apoptose.
      Hinweis 1: Tragen Sie Zelltod Reiz oder die Änderung der Zellkulturmedium auf dem Mikroskoptisch bei Zeitraffer-Live Cell Imaging kann mit einem Durchblutung Zellkulturkammer erreicht werden kann, oder kann direkt auf die Zellkulturschale durch vorsichtiges Pipettieren ohne Berührung durchgeführt werden die Schale, während der Intervalle zwischen Bildgebung.
      Anmerkung 2: Verwenden Sie die Fokusdrift-Kompensationssysteme zu unscharf der Zellen durch den Verlust der thermo Gleichgewicht des Mikroskopsystems nach der Änderung der Zellkulturmedium (siehe Diskussion) zu vermeiden.
    5. Kontinuierliche Zeitraffer-Bildgebung, um das Schicksal von Zellen, die Kennzeichen der Apoptose angezeigt verfolgen. Zellen, die Apoptose umkehren kann Schaden zu reparieren und wieder normale flache Morphologie (1A, 1B, 1C, 1E).
  2. Die mitochondriale Fragmentierung, DNA / Chromatin-Kondensation und Kernfragmentierung (siehe 1D, 1F, 1G).
    1. Um mitochond visualisierenria, Flecken Zellen mit 50 nM MitoTracker rot / tief rot / grün-fluoreszierenden Farbstoff und gleichzeitig gefärbt den Kern mit 10 ug / ml Hoechst 33342 blau Kernfarbstoff in einem Kulturmedium für 20 min bei 37 ° C mit 5% CO 2.
      Hinweis 1: Reduzieren Sie die Konzentration der Farbstoffe und Dauer der Inkubation zu Zytotoxizität zu vermeiden und zu reduzieren Hintergrundfluoreszenz bei Bedarf. Optimierung der Färbebedingungen ein gutes Signal-Rausch-Verhältnis mit der minimalen Menge an Farbstoff und der Inkubationszeit auf die Färbung zu erhalten.
      Hinweis 2: Verwenden Fluoreszenzfarbstoffe für Mitochondrien wie MitoTracker Red CMXRos, MitoTracker Deep Red FM oder MitoTracker Grün FM, die nicht auslaufen wird aus den Mitochondrien während der Apoptose. Dies ermöglicht die Visualisierung der mitochondrialen Morphologie während der Apoptose und Rekonvaleszenz. Siehe die Materialien und Geräte-Tabelle für Einzelheiten zu diesen Flecken.
    2. Halten gefärbten Zellen im Dunkeln zu Ausbleichen zu vermeiden.
    3. Überschüssiges Fleck durch Waschen der Zellen3 mal mit 37 ° C phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) oder frisches Zellkulturmedium mit 1 min Inkubation in frisches Medium zwischen Waschen und dann weiter in frischem Medium, 20 min vor der endgültigen Waschmäßiger zu ermöglichen Flecken, um die Zellen zu verlassen, um zu reduzieren unspezifische Signal Hintergrund für die Bildgebung.
      Hinweis: Kürzen Inkubationszeiten mit Zellmedium nach der Färbung kann in hohen Hintergrund für die Bildgebung führen.
    4. Führen Sie Echtzeit-Live-Cell-konfokale oder Epifluoreszenzmikroskopie für Bild in gesunden Zellen vor apoptotischen Induktions angewendet wird (siehe Protokoll 3 für Lebendzellmikroskopie).
      Hinweis: Gesunde Zellen anzuzeigen Rohr Mitochondrien und runden Kernen in den meisten Zelltypen (1D, 1F, 1G).
    5. Triggerzellen Apoptose (siehe Protokoll 2 für die Anwendung und Entfernung von apoptotischen Stimuli zu den Zellen).
    6. Weiter Zeitraffer-Lebendzellmikroskopie, Änderungen in der mitochondrialen und Kern morpholog beobachtenies unmittelbar nach dem Tod Reiz auf die Zellen aufgebracht. Beachten Zellen Kennzeichen der Apoptose, wie mitochondriale Fragmentierung und Schwellungen, Chromatin-Kondensation und Kernfragmentierung angezeigt, im Gegensatz zu gesunden Zellen, die Mitochondrien und Rohr runden Kernen.
    7. Wenn Zellen anzuzeigen Kennzeichen der Apoptose, waschen und versorgen die Zellen mit frischem Medium, und weiter Zeitraffer-Bildgebung, um das Schicksal von Zellen zu verfolgen. Zellen, die Apoptose wieder rückgängig normalen mitochondrialen und Kernmorphologie (1D, 1F, 1G).
      Anmerkung: Führen DIC-Mikroskopie in parallel, wenn möglich, zusätzliche Informationen für den Zugriff auf die Phasen der Apoptose durch Beobachten der Änderungen der Zellmorphologie in der gleichen Gruppe von Zellen (siehe Protokoll 4.1 für DIC-Mikroskopie) erhalten.
  3. Der Nachweis von mitochondrialen Freisetzung von Cytochrom c unter Verwendung von Zellen eine Cytochrom-c--GFP Fusion pr stabil exprimierenotein (siehe Abbildung 2).
    1. Stain-Zellen, die Cytochrom-c--GFP 23,24 mit MitoTracker Red beschriften polarisierten Zelle Mitochondrien (siehe Schritte 4.2.1 bis 4.2.3 für Live Cell Mitochondrien-Färbung).
    2. Führen Sie Echtzeit-Live-Cell-konfokale oder Epifluoreszenzmikroskopie zu verfolgen gesunde Zellen (Einzelheiten in Protokoll 3 für Live Cell Imaging).
      Anmerkung: Die Cytochrom c-GFP-Signal lokalisiert vornehmlich in den Mitochondrien der gesunden Zellen (2A i, 2B).
    3. Triggerzellen Apoptose (siehe Protokoll 2 für die Anwendung und Entfernung von apoptotischen Stimuli zu den Zellen). Weiter Zeitraffer-Mikroskopie zur Translokation von Cytochrom c aus Mitochondrien -GFP in das Cytosol zu beobachten (Abbildungen 2Aii-iii, 2B).
      Anmerkung: Mitochondrial Freisetzung von Cytochrom c in das Cytosol ein Marker der mitochondrialen Außenmembran Permeabilisierung (MOMP)4 ist ein kritischer Schritt bei der Mitochondrien-abhängige Apoptose 21,22
    4. Wenn Zellen die Cytochrom-c--GFP Signal im Zytoplasma, entfernen Sie den Zelltod Reiz und Versorgungs Zellen mit frischem Medium (siehe Protokoll 2). Weiter Zeitraffer-Bildgebung, um das Schicksal von Zellen mit GFP cytosolische verfolgen.
      Hinweis: Zellen, die Apoptose rückwärts wieder normale Zellmorphologie, und reduzieren ihre zytosolische Cytochrom c -GFP Signal vermutlich durch Abbau oder Verlagerung zurück in den Mitochondrien (Abbildungen 2Aiv-vii, 2B).
    5. Erfassen DIC Bilder parallel, um zusätzliche Informationen für den Zugriff auf die Phasen der Apoptose durch Beobachten Veränderungen in der Zellmorphologie in einzelne Zellen oder Gruppen von Zellen (siehe Protokoll 4.1 für DIC-Mikroskopie) erhalten.
  4. Nachweis von Caspase-Aktivität unter Verwendung eines Caspase-Biosensor (siehe 3)
    1. Transfektion von Zellen mit dem Caspase Biosensor NES-DEVD-YFP-NLS für16 bis 24 Stunden, bevor sie einer einen apoptotischen Stimulus 13.
    2. Färben die transfizierten Kulturen mit Hoechst 33342, um Zellkerne zu kennzeichnen (siehe Schritte 4.2.1 bis 4.2.3 für Lebendzellkernfärbung).
    3. Führen Sie Echtzeit-Live-Cell-konfokale oder Epifluoreszenzmikroskopie zu verfolgen gesunde Zellen (Einzelheiten in Protokoll 3 für Live Cell Imaging).
      Hinweis: Das NES-DEVD-YFP-NLS-Biosensor-Signal lokalisiert hauptsächlich im Cytosol von gesunden Zellen aufgrund seiner Kernexportsignal (NES) (3A, 3Bi und 3C finden Diskussion).
    4. Triggerzellen Apoptose (siehe Protokoll 2 für die Anwendung und Entfernung von apoptotischen Stimuli zu den Zellen). Weiter Zeitraffer-Mikroskopie, um nukleäre Translokation von YFP beobachten.
      Hinweis: Die Aktivierung von Caspasen spaltet die DEVD Motiv in der Caspase Biosensor NES-DEVD-YFP-NLS, was zu YFP-NLS Translokation vom Zytosol in den Zellkern (3A, 3Bii-iv, siehe Diskussion).
    5. Anmerkung: Die Zellen, die Apoptose wieder normale Zellmorphologie umkehren, aber die Kern YFP Signal (Figuren 3 BV-x, Zellen 1 und 2, und 3D) zu halten.
    6. Weiter Zeitraffer-Bildgebung, um das Schicksal von Zellen, die Kern YFP Anzeige verfolgen.
      Hinweis: Die Kern YFP-Signal wird abgebaut mehrere Stunden werden nach der Zellen Apoptose umgekehrt (3B, vi-x, Cell 1, siehe Ergebnisse und Diskussion) vermutlich durch normale Zellabstand Mechanismen wie Proteasom-Abbau.
    7. Erfassen DIC Bilder parallel, um zusätzliche Informationen für den Zugriff auf die Phasen der Apoptose durch Beobachten Veränderungen in der Zellmorphologie in einzelnen Zellen oder einer Gruppe von Zellen zu erhalten. (Siehe Protokoll 4.1 für DIC-Mikroskopie).
  5. Zelloberflächenexposition von Phosphatidylserin (siehe 4)
    1. Samenzellen auf glass Deckgläser zu 80% Zellkonfluenz (siehe Protokoll 1) zu erzielen.
    2. Co-färben die Zellen mit rot-fluoreszierende MitoTracker und blaue Hoechst 33342-Färbung für Mitochondrien und Zellkerne, bzw. (siehe Schritte 4.2.1 bis 4.2.3 für Live Cell mitochondrialen und Kernfärbung).
    3. Triggerzellen, die Apoptose durch die Verwendung eines Apoptose-Induktor zu unterziehen (siehe Protokoll 2).
    4. Anwenden fluoreszenzmarkierten Annexin V (siehe Materialien), den apoptotischen Zellen bei 37 ° C vor der Entfernung der Apoptose-Induktor, um die Exposition von Phosphatidylserin auf der Oberfläche der apoptotischen Zellen nachzuweisen Fleck 10 min.
      Anmerkung 1: Gesunde Zellen werden nicht mit Annexin V gefärbten weil Phosphatidylserin ist normalerweise auf der inneren Blatt der Plasmamembran der Zelle 38 abgesondert. Apoptotische Zellen werden mit Annexin V, das an Phosphatidylserin an der Zelloberfläche (4A und 4B) bindet gefärbt.
      Hinweis 2: fluoreszenzmarkierten Annexin V kann auch angewendet zu färben apoptotischen Zellen imm werdenediately nach Entfernen der Apoptose-Induktor, mit 10 Minuten Inkubation.
    5. Entfernen Zelltod Stimulus, Waschen der gefärbten Zellen mit warmer PBS oder frisches Medium einmal und dann den Zellen mit frischem Medium, 2 h bei 37 ° C mit 5% CO 2 (siehe Protokoll 2).
      Hinweis 1: Zellen, die Apoptose wieder normale Morphologie und bewahren fluoreszenzmarkierten Annexin V-Signal nach der Wiedererlangung normaler Morphologie umgekehrt (4A und 4B).
      Anmerkung 2: Der Annexin V-Signal mit der Zeit auf gewonnenen Zellen (siehe Diskussion) abnimmt.
    6. Fix Zellen an ausgewählten Zeitpunkten mit 4% Paraformaldehyd, enthaltend 8% Saccharose in 1 × PBS für 20 min im Dunkeln bei Raumtemperatur und Waschen der fixierten Zellen mit PBS 3x Paraformaldehyd vor der Montage-Zellen auf Glasobjektträger zu entfernen Deckgläser mit Antibleich mountant (siehe Materialien) für die konfokale oder Epifluoreszenzmikroskopie und beobachten Annexin V an Zellen nach dem Entfernen der Apoptose-Induktor.
      Anmerkung 1: Saccharose in Fixativ bewahrt Zellmembranstruktur während der Fixierung.
      Anmerkung 2: Speichern Sie die Paraformaldehydlösung in Dunkeln bei 4 ° C, um den Abbau zu verhindern.
      Anmerkung 3: Warm up Paraformaldehydlösung auf Raumtemperatur, bevor es zu den Zellen zur Befestigung an Kälteschock zu den Zellen zu vermeiden.

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Representative Results

Um die Auflösung der Apoptose zu untersuchen, werden Gewebekulturzellen zunächst auf einen Tod Reiz ausgesetzt, die Apoptose auslösen. Wenn die Zellen anzuzeigen Kennzeichen der Apoptose wird frisches Kulturmedium dann angewendet, um abzuwaschen den Reiz und bebrüten die sterbenden Zellen der Besserung (1A) zu ermöglichen. Hier ist die entscheidende Frage angesprochen, wie weit einzelne sterben kultivierten Zellen gegenüber Apoptose Fortschritt und noch anastasis eingehen können. Diese Frage lässt sich eindeutig durch eine kontinuierliche Überwachung mit Biomarkern, um Zellschicksale mit den unten beschriebenen Verfahren zu verfolgen beantworten.

Wir beschreiben zunächst unserer Strategien zur Umkehr der Apoptose in Gewebekulturzellen unter Verwendung von Zeitraffermikroskopie lebenden Zellen, die für die Verfolgung erforderlich ist, und Aufzeichnen der Reaktion einzelner Zellen vor, während detektieren, und nach der Einwirkung eines apoptotischen Stimulus 12,13. Gesunde adhärenten Zellen auf ihre angeschlossenen Substrat verteilt (Abbildung 1Bi) 12,13 und angezeigt Faden Mitochondrien und runden Kernen vor der Behandlung (Abbildungen 1CI, Di, Ei, WLAN, Gi) 12,13. Nach der Belichtung mit 3,8-4,5% Ethanol in Zellkulturmedium (vol / vol), DIC oder Phasenkontrastmikroskopie zeigte, dass die Zellen zeigten morphologische Kennzeichen der Apoptose, einschließlich zytoplasmatischen Kondensation Plasmamembran blebbing und Zellschrumpfung (Figuren 1Bii, 1Cii- iii und 1Eii-vi) 12,13. Apoptotischen Körperbildung von den gleichen Zellen leicht durch DIC beobachtet (Abbildungen 1Eii-vi). Die Fragmentierung der MitoTracker markierten Mitochondrien (Abb 1Dii-iii, 1Fii-vi) 12,13 als auch die Kondensation von Hoechst-gefärbte Kern-DNA (Abbildungen 1Dii-iii, Fii-iii, Gii) 12,13, und die Zersplitterung der Kerne (Feigemen 1Evi und fvi, weiße Pfeile), wurden gleichzeitig durch konfokale oder epi-Fluoreszenzmikroskopie nachgewiesen. Anschließend wurden die Zellen, die erfolgreich umgekehrt Apoptose beobachtet normaler Morphologie wieder, anscheinend Reparatur ihrer Beschädigung (Abbildungen 1Biii, C und Div-vi, E und FVII-XII und Giii) 12,13. Zellen unter diesen Bedingungen hatte auch gezeigt, dass Organelle Motilität, Zellmigration und Funktions Endozytose basierend auf Aufnahme von Fluoreszenz-emittierenden Quantenpunkte und Zellteilung 13 zurückzugewinnen. Interessanterweise haben einige Zellen, verehrt Apoptose angezeigt unregelmäßigen Kernmorphologie (Abbildung 1Fxii) sowie abnorme Zellteilung und Bildung von Mikrokernen (Fig 1Giv-vii) 13, die ein Biomarker der DNA-Schädigung, Chromosomenbruch und ganze Chromosomenverlust in sich teilenden Zellen ist 39, 40. Vertriebene chromosomes oder Chromosomenfragmenten außerhalb Entwicklung nicht in die Tochterzellkerne enthalten sein werden durch Kernmembran 39, 40 umschlossen. Somit könnte eine Folge anastasis die Beherbergung von Genomen, die während abgebrochen Apoptose beschädigt sein, was zu Tumorentstehung und Tumorprogression. Das Vorhandensein von Mikrokernen, auch in Krebszellen 40,41 gemeinsam.

Veröffentlichung mitochondrialen Cytochrom C ist ein wichtiger Schritt, um zu vermitteln oder zu verstärken Caspase-abhängige Apoptose 20-22. Mit HeLa-Zellen, die stabil exprimieren GFP-markierten Cytochrom c wachten wir die subzelluläre Verlagerung von Cytochrom c während der Apoptose und anastasis durch konfokale Mikroskopie. Wie berichtet 23,24, Cytochrom C -GFP Mitochondrien vor der Behandlung lokalisiert (Abb 2AI und B), aber dann wurde in das Cytosol entlassen, nachdem ein Todes Reiz aufgebracht worden war (Abbildungen 2Aii,2Aiii und B). Weitere charakteristische Morphologien wie mitochondriale Fragmentierung und Plasmamembran Blasenbildung, wurden ebenfalls in Zellen, die Cytochrom-c--GFP (Abbildung 2Aiii) veröffentlicht hatte beobachtet. Diese Zellen wurden ausgewiesen, um den Zelltod nach der Freisetzung von Cytochrom c 23-27 kurz zu unterziehen. Jedoch nach der Entfernung des Stimulus Tod beobachteten wir, dass cytosolischen Cytochrom c -GFP Niveaus nahmen, Mitochondrien wieder filamentöse Strukturen, und die Plasmamembran zurückgewonnen ein normales Aussehen (Fig 2Aiv-vii, und B). Daher kann apoptotischen Zellen anastasis nach mitochondrialen Freisetzung von Cytochrom c zu unterziehen.

Die Amplifikation von nachgeschalteten DEVD-spalt Caspasen wird allgemein angenommen, dass der "point of no return" in Apoptose 2,5 sein. Daher haben wir eine Caspase Biosensor NES-DEVD-YFP-NLS expraus einem Plasmid 13 Essed, die es ermöglichen, überlebenden Zellen, die zuvor Caspase-Aktivität (3A) litten, detektieren. Das Caspase-Biosensor ist ein Polypeptid mit einem N-terminalen Kernausschluss Signal (NES), einen Linker mit der Caspase 3/7 Konsensus-Spaltungsstelle (DEVD) 26,42,43, gefolgt von einer gelb fluoreszierendes Protein (YFP) und ein C-terminale Kernlokalisationssignal (NLS). In gesunden Zellen, diese Biosensor überwiegend lokalisiert Cytosol in Abhängigkeit von der NES (Abbildungen 3Bi, Ci-iv, und D) 13. Während der Apoptose aktivierte Caspasen spalten die DEVD-Motiv, die Freigabe YFP-NLS, die effizient transloziert aus dem Cytosol in den Zellkern in Zellen, die gleichzeitig oder später, zeigen weitere Merkmale der Apoptose, wie DNA / Chromatin-Kondensation und Zellschrumpfung (3B ii -iv und D) 13. Somit wird diese Zellen behalten Kernimportfunktion folgende Caspase-Aktivierung. Nach Entfernen des Apoptose-Induktor-Zellen, anastasis Anzeige morphologischen Erholung selbst nach Caspaseaktivierung aufgetreten (laufen Figuren 3 BV-x, und D) 13, offenbar Umkehrstufe Apoptose spät. Während der Wiederherstellung der normalen Morphologie, in der Intensität in einigen Zellen nimmt die Kern YFP-Signal, wenn sie beginnen, die Apoptose nach der Entfernung des Todes Stimulus (Abbildungen 3 BV-x, Cell 1) 13 umzukehren, was darauf hindeutet, dass die Zellen verschlechtern die Caspase-gespaltenen Biosensor, möglicherweise durch der gleiche Mechanismus verwendet werden, um andere Caspase-gespaltenen Produkte während und nach anastasis entfernen.

Anastasis kann auch ohne Lebendzellmikroskopie nachgewiesen werden. Dies kann durch Verwendung fluoreszenzmarkierten Annexin V 38,44, welche bindet und markiert externalisierten Phosphatidylserin (PS) in einem frühen Schritt in Apoptose (erreicht werden (4B) 13 markiert werden, wie Phosphatidylserin zu dem inneren Blatt der Plasmamembran von gesunden Zellen 38 begrenzt. Demgegenüber Ethanol-induzierten Apoptose sterbende Zellen auszusetzen Phosphatidylserin an der Zelloberfläche (4B) 13, und daher kann mit dem fluoreszierenden Annexin V 38,44 markiert werden. Bemerkenswerterweise kann Annexin V-markierten Zellen normaler Morphologie nach der Entfernung der Tod Reize wieder zu erlangen, was darauf hindeutet, dass die primäre Kardiomyozyten haben Apoptose (4B) 13 umgekehrt. Andere haben bisher angewandten eine ähnliche Strategie, um diese Erholung von Apoptose könnte in vivo auftreten vorschlagen. In einem in vivo-Modell der transienten ischämischen Verletzung, Caspase-abhängigen Annexin V Kennzeichnung von Kardiomyozyten in Kaninchen und Mäusen anscheinend wiederin der Internalisierung von Annexin V von überlebenden Zellen nach transienter Ischämie 45, was darauf hindeutet, dass anastasis konnte in lebenden Tieren auftreten konsultiert. Zusätzlich verwendet Zellsortierung, um eine Fraktion von Annexin V-markierten Maus BCL 1 .3B3 B-Lymphom-Zellen (Anti-Immunglobulin-Antikörpern ausgesetzt, die Apoptose in BCL 1 .3B3 induzieren) und Mausmammakarzinomzellen MOD-Temperaturen identifizieren zwei weiteren Studien -sensitiven p53 (die Apoptose nach unten permissiven Temperatur inkubiert verursacht) weiter zu vermehren, nachdem sie in den normalen Kulturbedingungen 14,15 zurück. Zusammengenommen deuten diese Studien, dass Annexin V ist nützlich für die Bestimmung das Schicksal von Zellen, die Apoptose umgekehrt zu haben, ohne Lebendzell-Mikroskopie. Es gibt jedoch Einschränkungen bei dieser Strategie, wie Annexin V Fluoreszenz nicht dauerhaft ist (4B) 13 verbleibenden nur für wenige Stunden nach der Entfernung des Stimulus Tod nachweisbar, so dassDiese Methoden können keine langfristige Verfolgung von Zellen, die Apoptose umgekehrt.

Figur 1
Abbildung 1: Tracking-Auflösung von Apoptose durch Live Cell Imaging. (Nachdruck mit freundlicher Genehmigung von Tang et al, MBOC 23, 2240 bis 2252 13, für den 1A -. D und G). (A) Ansatz, Apoptose zu induzieren und in der Folge ermöglichen kultivierten Zellen, um nach dem Waschen entfernt die Apoptose-Induktor zu erholen. (B) Zeitraffer-Live-Cell-Phasenkontrastmikroskopie gesunder primäre Mausleberzellen (unbehandelt), die gleiche Gruppe von Zellen, die behandelt wurden, mit 4,5% Ethanol in Kulturmedium (vol / vol) für 5 h () behandelt und dann gewaschen und weiter mit frischem Kulturmedium für 24 h (gewaschen) inkubiert. Maßstabsbalken, 100 um. (C) Dauer Zeitraffer-Live Cell Epifluoreszenzmikroskopie der gleichen primären Mausleberzellen vor ethanol Behandlung (i), die zu den angegebenen Zeiten nach der Behandlung mit 4,5% igem Ethanol in Zellkulturmedium für 2,5 h (II und III), und nach dem Waschen und Inkubieren mit frischem Medium zur Rückgewinnung für 1 h zu ermöglichen (iv - vi). Zusammengeführt Bilder MitoTracker befleckten Mitochondrien (rot) und der Hoechst-gefärbten Zellkern (blau) durch Epifluoreszenzmikroskopie und Zellmorphologie von der DIC-Mikroskopie visualisiert. Maßstabsbalken, 10 um. (D) zusammengeführt Fluoreszenzbilder nur (ohne DIC) von Feld C zeigen Organelle Morphologien. (E) Dauer Zeitraffer-Live-Cell-konfokale Mikroskopie der menschlichen kleinzelligen Lungenkarzinoms H446 Zellen vor der Ethanolbehandlung (i) nach Behandlung mit 3,8% Ethanol in Zellkulturmedium für 2 h 28 min (II-VI), und nach dem Waschen und Inkubieren mit frischem Medium zur Genesung (VII-XIII) zu ermöglichen. Zusammengeführt Bilder MitoTracker befleckten Mitochondrien (rot) und der Hoechst-gefärbte Kerne (blau) wurden durch konfokale Mikroskopie und c visualisiert ell Morphologie von der DIC-Mikroskopie. Weiße Pfeile eine fragmentierte Kern in apoptotische Körper (vi). Maßstabsbalken, 10 um. (F) zusammengeführt Fluoreszenzbilder nur (ohne DIC) von der Platte E enthüllen Organell Morphologien. (G) Continuous Zeitraffer-Live Cell Epifluoreszenzmikroskopie für monochrome Hoechst-gefärbte nukleare Bildgebung aus einer einzigen HeLa-Zellen, die ungenau Zellteilung durchläuft. Bevor Ethanolbehandlung (i), die Behandlung mit 4,3% igem Ethanol in Zellkulturmedium für 5 h (ii) und nach der Ethanolentfernung (gewaschen iii-vi). Panels iv zeigt abnorme Zellteilungen. Rote Pfeile zeigen die großen Kerne in den geteilten Zellen (IV- vi). Maßstabsbalken, 30 um. Die Zeiten als h angegeben: Min. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.

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Abbildung 2: Feststellung der Umkehrung der Apoptose nach mitochondrialen Freisetzung von Cytochrom c (A) Kontinuierliche Zeitraffer-Live-Cell-konfokale Mikroskopie von HeLa-Zellen Cytochrom c -GFP (Cyto C -GFP) stabil exprimieren, vor (i), während (ii-iii) und danach (iii-vii) Belichtung auf 3,9% Ethanol in Zellkulturmedium. Zusammengeführt konfokale Bilder von CytoC-GFP (grün), MitoTracker befleckten Mitochondrien (rot) und Hoechst-gefärbte Kerne (blau) werden mit DIC Bilder (links) in Kombination. Unmerged Versionen werden für CytoC-GFP gezeigt, als Wärmekarte der Signalintensität (links Mitte), monochromes Bild CytoC-GFP (Mitte), und Schwarzweißbild von Mitochondrien (rechts Mitte) präsentiert. Zusammengeführt Bilder CytoC-GFP und Mitochondrien (rechtes Bild). (B) Die Änderung der cytosolischen Cytochrom C-GFP Signalintensität der Zellen, Cell 1 und Zelle 2, wie in der monochromen CytoC-GFP Bildes bei Steuerung Ai angegeben. Die Zeiten als h angegeben: Min. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.

Figur 3
Abbildung 3: Erkennen Umkehrung der Apoptose nach der Caspase-Aktivierung (mit freundlicher Genehmigung von Tang et al, MBOC 23, 2240-2252 13 Nachdruck, für die 3A - D.). (A) Schematische Darstellung des caspase Biosensor-Fusionsprotein eines Kernexportsignal (NES), die DEVD Caspase-Spaltungsstelle, gelb fluoreszierendes Protein (YFP) und der Kernlokalisationssignal (NLS) zusammengesetzt ist. (B) Dauer Zeitraffer-Live- Zelle Konfokalmikroskopie von HeLa-Zellen, die die Caspase-Biosensor NES-DEVD-YFP-NLS vor (i), während (ii -iv) und nach (vx) Einwirkung von 4,3% Ethanol in Zellkulturmedium. Zusammengeführt konfokale Bilder der Caspase-Biosensor (grün), Hoechst-gefärbte Kerne (blau) und DIC Bilder (linkes Bild), ein Schwarzweißbilder von YFP-Signal (Mitte), und ein Wärme Karte, die die YFP Signalintensität (rechtes Bild) . (C) unbehandelte Kontrollen während wie in Feld B (D) quantifizierte Fluoreszenzintensitäten für die aktivierte kern Caspase Biosensor in Einzelzellen (mit den Nummern 1 und 2 in der Platte Bi) vor, analysiert, und nach Exposition von Ethanol, und in den unbehandelten Kontrollen (mit den Nummern 3 und 4 in Feld Ci) wurden als Prozent der YFP vorhanden im Zellkern (Kern / Gesamtzell YFP Signalintensität x 100%) berechnet. Die Zeiten als h angegeben: min. Maßstabsbalken, 10 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.

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Abbildung 4: Feststellung der Auflösung von Apoptose durch fluoreszenzmarkierte Annexin V (Nachdruck mit freundlicher Genehmigung von Tang et al, MBOC 23, 2240 bis 2252 13, für den 4A - B.). (A) Schematische Darstellung der Annexin V-FITC anastasis Assay in Feld B (B) von neugeborenen Ratten primären kardialen ventrikulären Myozyten wurden auf 4,5% Ethanol in Zellkulturmedium für 5 Stunden unterzogen und dann mit Annexin V-FITC für 10 inkubiert verwendet min vor der Entfernung des Ethanols Medium. Die Zellen wurden entweder sofort fixiert (behandelt) oder nach Rückführung mit frischem Medium für weitere 2 Stunden Erholung feste (gewaschen). Unbehandelte Zellen, die ausgesetzt wurden Annexin V-FITC dienen als Kontrolle (unbehandelt). MitoTracker befleckten Mitochondrien (rot), Hoechst-gefärbte Zellkerne (blau) und Annexin V-FITC (grün) wurden durch konfokale Mikroskopie visualisiert und Zellmorphologie wurde von der DIC-Mikroskopie visualisiert. ScAle-Bar, 10 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.

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Discussion

Anastasis bezieht sich auf das Phänomen, bei dem Zellen, Zelltod aktiviert haben danach rückgängig den Sterbeprozess und zu überleben. Hier haben wir gezeigt, dass die Abbildung lebender Zellen verwendet werden, um zu bestätigen, dass die gleichen Einzelzellen in der Tat kann Apoptose-Prozess in einer späten Phase umkehren, und dann weiter überlebende und Wiedergabe werden. Unsere Protokolle beschreiben mehrere optimierte Zelltyp-spezifischen Behandlungsbedingungen, Apoptose zu induzieren und lassen einen großen Anteil der Zellen, um die Umkehrung der Apoptose mit mehreren Biomarkern zur Überprüfung überwacht ziehen. In Bezug auf technische Fragen, Glasbodenschalen wurden zur Kultivierung von Zellen für die Bildgebung 12,13 wegen der hochtransparenten Dünnglas zwischen den Zellen und dem Mikroskopobjektiv, das große Arbeitsabstände für hochwertige konfokale oder Epifluoreszenzmikroskopie in starker Vergrößerung ermöglicht verwendeten, Vereinfachung der Beobachtung der klassischen Apoptose einschließlich mitochondriale Fragmentierung, Freisetzung von Cytochrom c und Kernkondensation und Fragmentierung. Glass auch verzerrt nicht die Polarität von Licht, um qualitativ hochwertige DIC-Mikroskopie für die Überwachung von Membranblasenbildung, Zellschrumpfung von Zellen und apoptotische Körper Bildung während der Apoptose zu ermöglichen. DIC-Mikroskopie hat Vorteile gegenüber Phasenkontrastmikroskopie, diese morphologischen Kennzeichen der Apoptose zu beobachten, wie DIC verbessert den Kontrast von ungefärbten und transparente Zellproben, die Verbesserung der Erkennung von Zellmorphologie. Wenn DIC und Phasenkontrastmikroskopie nicht verfügbar sind, können verwendet werden, um das Celltracker Cytosol zu färben, um die Morphologie von lebenden Zellen für die konfokale oder Epifluoreszenzmikroskopie umreißen und Überwachung der Zellmorphologie werden.

Die Anwendung geeigneter Dosierungen Todes Reize und die Strategien der Entfernung des Reizes sind kritische Schritte zum Nachweis von anastasis. Wir haben uns entschieden, um niedrige Konzentrationen von Ethanol als Tod Impulse für die Experimente descr verwendenibed hier, weil ein großer Prozent der behandelten Zellen gleichmäßig Apoptose und kann dieses Problem beheben können, die möglicherweise milder, Tod Reiz. Dennoch sind diese Ansätze können auch mit anderen Todes Reize angewendet werden, wie wir 12,13 ausgewiesen. Jedoch sind einige Tod Stimuli inhärent schwieriger als andere, wie Staurosporin (STS), einem allgemein verwendeten Apoptose-induzierenden Mittel. Vielleicht, weil es seine Substrate mit hoher Affinität bindet 46-48, sind wiederholte Waschungen wesentliche, aber immer noch nicht effizient STS entfernen aus den Zellen. In diesem Fall mit niedrigeren Wirkstoffkonzentrationen und kürzere Medikament Inkubationszeit, die noch apoptotischen Sterbeprozess aktivieren können könnte hilfreich sein, um mehr Zellen zur Apoptose umzukehren. Wiederzuführungs Zellen mit konditionierten Zellkulturmedium kann auch die Förderung Umkehr Apoptose besser als frisches Zellkulturmedium. Apoptotische Zellen werden üblicherweise lose in die Kulturschale Oberfläche besonders auf Glas sur befestigtGesichter, ist es daher wichtig, vorsichtig waschen hinweg die Apoptose-Induktoren zu vermeiden Abnehmen Zellen. Beschichten Glasschalen mit Poly-D-Lysin, Kollagen und / oder Fibronektin könnte die Zellhaftung zu ermöglichen, dass bestimmte Arten von Zellen, wie Kardiomyozyten 37 zu erhöhen, um richtig auf der Glasoberfläche des Zellkulturschalen insbesondere nach Exposition der Zellen gegenüber einer zu befestigen, Tod Reiz.

Der Prozess der Apoptose, und wahrscheinlich die Umkehrung der Apoptose abhängig von enzymatischen Aktivitäten, die durch die Temperatur beeinflusst werden kann. Deshalb ist in der gesamten lebenden Abbildungsverfahren wichtig Aufrechterhaltung Zellen bei 37 ° C oder bei ihren normalen Kulturbedingungen, um die Reproduzierbarkeit von Versuchsergebnissen sicherzustellen. Vorwärmen Mikroskop vor dem Start Live Cell Imaging ist auch ein wichtiger Schritt, dass die Mikroskopkomponenten zu thermo Gleichgewicht erreichen können. Dies kann die Drift des Fokus und Verschiebung des xy-Ebene aufgrund der thermischen Expansion und Kontraktion des vermeidenKomponenten während des Live Cell Imaging. Bei Anschließen oder Entfernen des Todes Reiz, indem das Medium eine Kulturschale mit entweder einer Pipette oder durch Perfusion in die vorgewärmte Mikroskopiesystem während der Zeitraffer-Bildgebung noch Drift Fokus verursachen aufgrund von Änderungen der Temperatur oder Volumen des Mediums. Z-Stapel Aufnahme, um die Bildzellen in der richtigen Brennebene zu helfen, aber die Gefahr von Phototoxizität aufgrund der zusätzlichen Exposition von Zellen mit Fluoreszenzlasern zu erhöhen. Alternativ Einsatz von Fokusdrift Vergütungssysteme, wie beispielsweise einem Infrarot-Laser-basierte automatische Fokuskorrektursystem können Zellen in der gleichen Brennebene während der Zeitraffer-Live Cell Imaging zu halten indem Sie den Abstand zwischen Zellen / Glas und dem Ziel, ohne zusätzliche Exposition der Zellen gegenüber kurzen Wellenlängen, phototoxische Fluoreszenz.

Mitochondrial Freisetzung apoptogene Proteine ​​wie Cytochrom c, und die Aktivierung der Effektorzellen Caspasen, wie der stromabwärtigen / Effektoder Caspase-3 und Caspase-7, wurden allgemein als die "point of no return" in der Apoptose-Prozess 2,5,6 sein. Western-Blots wurden verwendet, um die Spaltung (Aktivierung) der Caspase-3 und ihre Substrate, wie Poly (ADP) -Ribose Polymerase-1 (PARP) und DFF45 / ICAD in der gesamten Zellpopulation während apoptotischen Induktions und nach Entfernung von apoptotischen detektieren Stimuli, und zeigte, dass die Caspase-3 gespalten, ICAD und PARP zeigte sich in den Zellen während der Belichtung zu Tode Stimuli, aber verschwand, nachdem die Zellen wurden erneut Feed mit frischem Kulturmedium 13. Diese Verfahren zeigen den allgemeinen Zustand in Zellpopulation, aber nicht die einzelnen Zellen, die schließlich sterben wird von denen, die Apoptose umkehren werden und zu überleben, dann unterscheiden. Biochemische Fraktionierung zur Freisetzung von mitochondrialen Cytochrom-c-Analyse hat ähnliche Vorbehalte. Deshalb, um das Schicksal der einzelnen Zellen nach der Freisetzung von Cytochrom c und Caspase-ac verfolgenvierung, zwei der bekanntesten Kennzeichen der Apoptose 2,5,6, GFP-markierten Cytochrom C (Cyto C -GFP) und eine Caspase-Biosensor, wie die hier verwendeten NES-DEVD-YFP-NLS in Kombination mit Live-Cell- Mikroskopie umgehen diese Probleme durch direkte Beobachtung morphologischen Wiederherstellung und die Translokation des Cyto C -GFP Biosensor in den gleichen Zellen. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Reversibilität der Apoptose nach mitochondrialen Freisetzung von Cytochrom c und Caspase-Aktivierung.

Die Herausforderung für das Studium anastasis ist das Fehlen von Markierungstechniken, um Zellen zu anastasis an irgendeinem Punkt während ihrer gesamten Lebensdauer unterzogen wurden, in vivo oder in vitro zu detektieren. Die stabile Expression des Caspase Biosensor NES-DEVD-YFP-NLS erlaubt auch Nachweis von Caspase-Aktivität, wenn Caspasen in Zukunft wieder aktiviert, aber nicht dauerhaft aufzeichnen Caspase-Aktivität als die Aktiv Biosensor ohne susta verschlechtertsuchten Caspase-Aktivität 13. Andere zuvor berichtet Caspase Biosensoren, wie zum Beispiel die FRET-basierten Biosensoren SCAT (zB ECFP- [DEVD] -Venus) 26,49 sowie fluoreszierenden Reportern Apoliner (CD8-RFP- [DQVD] -GFP) 50 und CPV (zB CD8 - [DEVD] -Venus) 51,52 kann verwendet werden, um die Caspase-Aktivität in ganzen Tieren und in kultivierten Zellen erkennen, aber haben ähnliche Beschränkungen. Ähnlich kann Cyto C -GFP nicht verwendet, um Zellen, die Apoptose in der Langzeit rückgängig zu verfolgen, wie es aus den Mitochondrien ins Zytosol freigesetzt während der Apoptose und anschließend abgebaut werden. Annexin V Kennzeichnung verwendet wurde, um Zellen, die eine Apoptose rückgängig zu verfolgen, aber die Signalstärke sinkt ebenfalls mit der Zeit, so ist nicht sinnvoll für eine Langzeitverfolgung der anastasis 13,45. Kontinuierliche Langzeit in vivo Bildgebung verwendet werden, um das Schicksal der gleichen Zellen nach der Exposition des Todes Stimuli zu verfolgen. Allerdings wird langfristig in-vivo-Bildgebung immer noch eine Herausforderung to in den meisten lebenden Tieren durchzuführen. Daher zusätzliche Ansätze werden benötigt, um anastasis Forschung auf ganze Tierstudien und zum Screening von Medikamenten, fördern oder hemmen anastasis mit Gewebekulturzellen konnten zu verlängern

In Zukunft gibt aktuelle Protokolle und Techniken, die langfristige Zellschicksal zu verfolgen, die zur Entwicklung und Prüfung der physiologischen, pathologischen und therapeutischen Implikationen anastasis. Wir haben vorgeschlagen, dass anastasis könnte eine allgemeine Zellüberlebensmechanismus sein, verletzte Zellen, die schwer zu ersetzen, wie reife Neuronen und Herzzellen 13 zu retten. Allerdings könnte anastasis von apoptotischen Krebszellen nach der chemotherapeutischen Behandlungen bei der Wiederherstellung von gefährlichen Zellen, die zu Wiederauftreten von resistenten Tumoren 12,13 führen. Anastasis könnte auch ein wichtiger Mechanismus der Tumorentstehung, da einige Zellen zeigen onkogene Transformation, nachdem sie umgekehrt Apoptose 13. Daher verbessert anastasis könnte eine neue thera seinpeutische Strategie zur Hemmung der Neurodegeneration und der Herzinsuffizienz, bei gleichzeitiger Unterdrückung anastasis als einen neuen Weg für die Prävention oder Behandlung von Krebserkrankungen. Entwicklung von Biosensoren zur Umkehrung der Apoptose in Krankheitsmodellsysteme verfolgen das Verständnis der Zellüberlebensmechanismen anastasis und potenzielle Therapeutika zur Behandlung von hartnäckigen Krankheiten durch Modulation anastasis voranzutreiben.

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Acknowledgments

Wir danken Rev. Dr. Ralph Bohlmann und Rev. Dr. James Voelz für die Annahme, die das Wort "Anastasis", um Umkehr der Apoptose zu beschreiben; Douglas R. Green für HeLa-Zellen, die Cytochrom-c--GFP; Charles M. Rudin und Eric E. Gardner für H446-Zellen; Heather Lamb für die Unterstützung bei Cartoon-Zeichnung auf dem Video; Yee Hui Yeo für wertvolle Diskussion des Manuskripts. Diese Arbeit wurde von einem Sir Edward Youde Memorial Fellowship (HLT), die Dr. Walter Szeto Memorial Scholarship (HLT), Fulbright-Stipendium 007-2009 (HLT), Life Science Research Foundation Fellowship (HLT) unterstützt wird, gewährt NIH NS037402 (JMH) und NS083373 (JMH) und University Grants Committee der Hong Kong AoE / B-07/99 (MCF). Ho Lam Tang ist ein Shurl und Kay Curci Foundation Fellow der Life Sciences Research Foundation.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
LSM780 confocal microscopy Carl Zeiss
Glass bottom culture dish MatTek Corporation P35G-0-14-C
Transparent CultFoi Carl Zeiss 000000-1116-084
CO2 independent medium Life Technologies 18045-088
CellTracker Life Technologies C34552
Mitotracker Red CMXRos Life Technologies M-7512
Hoechst 33342 Life Technologies H1399
Fluorescently labeled annexin V Biovision K201

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References

  1. Kerr, J. F., Wyllie, A. H., Currie, A. R. Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics. British Journal of Cancer. 26, 239-257 (1972).
  2. Riedl, S. J., Shi, Y. Molecular mechanisms of caspase regulation during apoptosis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 5, 897-907 (2004).
  3. Green, D. R., Kroemer, G. The pathophysiology of mitochondrial cell death. Science. 305, 626-629 (2004).
  4. Chipuk, J. E., Bouchier-Hayes, L., Green, D. R. Mitochondrial outer membrane permeabilization during apoptosis: the innocent bystander scenario. Cell Death and Differentiation. 13, 1396-1402 (2006).
  5. Kroemer, G., et al. Classification of cell death recommendations of the Nomenclature Committee on Cell Death 2009. Cell Death and Differentiation. 16, 3-11 (2009).
  6. Galluzzi, L., et al. Molecular definitions of cell death subroutines: recommendations of the Nomenclature Committee on Cell Death 2012. Cell Death and Differentiation. 19, 107-120 (2012).
  7. Holland, A. J., Cleveland, D. W. Chromoanagenesis and cancer: mechanisms and consequences of localized, complex chromosomal rearrangements. Nature Medicine. 18, 1630-1638 (2012).
  8. Reddien, P. W., Cameron, S., Horvitz, H. R. Phagocytosis promotes programmed cell death in C. elegans. Nature. 412, (2001).
  9. Hoeppner, D. J., Hengartner, M. O., Schnabel, R. Engulfment genes cooperate with ced-3 to promote cell death in Caenorhabditis elegans. Nature. 412, 202-206 (2001).
  10. Segawa, K., et al. Caspase-mediated cleavage of phospholipid flippase for apoptotic phosphatidylserine exposure. Science. 344, 1164-1168 (2014).
  11. Overholtzer, M., et al. A nonapoptotic cell death process, entosis, that occurs by cell-in-cell invasion. Cell. 131, 966-979 (2007).
  12. Tang, H. L., Yuen, K. L., Tang, H. M., Fung, M. C. Reversibility of apoptosis in cancer cells. British Journal of Cancer. 100, (2009).
  13. Tang, H. L., et al. Cell survival, DNA damage, and oncogenic transformation after a transient and reversible apoptotic response. Molecular Biology of the Cell. 23, 2240-2252 (2012).
  14. Hammill, A. K., Uhr, J. W., Scheuermann, R. H. Annexin V staining due to loss of membrane asymmetry can be reversible and precede commitment to apoptotic death. Experimental Cell Research. 251, (1999).
  15. Geske, F. J., Lieberman, R., Strange, R., Gerschenson, L. E. Early stages of p53-induced apoptosis are reversible. Cell Death and Differentiation. 8, 182-191 (2001).
  16. Jacobson, M. D., Weil, M., Raff, M. C. Programmed cell death in animal development. Cell. 88, 347-354 (1997).
  17. Hardwick, J. M., Cheng, W. C. Mitochondrial programmed cell death pathways in yeast. Developmental Cell. 7, 630-632 (2004).
  18. Frohlich, K. U., Fussi, H., Ruckenstuhl, C. Yeast apoptosis-from genes to pathways. Seminars in Cancer Biology. 17, 112-121 (2007).
  19. Fuchs, Y., Steller, H. Programmed cell death in animal development and disease. Cell. 147, 742-758 (2011).
  20. Taylor, R. C., Cullen, S. P., Martin, S. J. Apoptosis: controlled demolition at the cellular level. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 9, 231-241 (2008).
  21. Wang, X. The expanding role of mitochondria in apoptosis. Genes & Development. 15, 2922-2933 (2001).
  22. Galluzzi, L., Kepp, O., Kroemer, G. Mitochondria: master regulators of danger signalling. Nature Reviews Molecular Cell Biolog. 13, 780-788 (2012).
  23. Goldstein, J. C., Waterhouse, N. J., Juin, P., Evan, G. I., Green, D. R. The coordinate release of cytochrome c during apoptosis is rapid, complete and kinetically invariant. Nature Cell Biology. 2, 156-162 (2000).
  24. Goldstein, J. C., et al. Cytochrome c is released in a single step during apoptosis. Cell Death and Differentiation. 12, 453-462 (2005).
  25. Tyas, L., Brophy, V. A., Pope, A., Rivett, A. J., Tavare, J. M. Rapid caspase-3 activation during apoptosis revealed using fluorescence-resonance energy transfer. EMBO Reports. 1, 266-270 (2000).
  26. Takemoto, K., Nagai, T., Miyawaki, A., Miura, M. Spatio-temporal activation of caspase revealed by indicator that is insensitive to environmental effects. The Journal of Cell Biology. 160, 235-243 (2003).
  27. Albeck, J. G., et al. Quantitative analysis of pathways controlling extrinsic apoptosis in single cells. Molecular Cell. 30, 11-25 (2008).
  28. Luthi, A. U., Martin, S. J. The CASBAH: a searchable database of caspase substrates. Cell Death and Differentiation. 14, 641-650 (2007).
  29. Liu, X., Zou, H., Slaughter, C., Wang, X. DFF, a heterodimeric protein that functions downstream of caspase-3 to trigger DNA fragmentation during apoptosis. Cell. 89, 175-184 (1997).
  30. Enari, M., et al. A caspase-activated DNase that degrades DNA during apoptosis, and its inhibitor ICAD. Nature. 391, 43-50 (1998).
  31. Li, H., Zhu, H., Xu, C. J., Yuan, J. Cleavage of BID by caspase 8 mediates the mitochondrial damage in the Fas pathway of apoptosis. Cell. 94, 491-501 (1998).
  32. Slee, E. A., Keogh, S. A., Martin, S. J. Cleavage of BID during cytotoxic drug and UV radiation-induced apoptosis occurs downstream of the point of Bcl-2 action and is catalysed by caspase-3: a potential feedback loop for amplification of apoptosis-associated mitochondrial cytochrome c release. Cell Death and Differentiation. 7, 556-565 (2000).
  33. Suzuki, J., Denning, D. P., Imanishi, E., Horvitz, H. R., Nagata, S. Xk-related protein 8 and CED-8 promote phosphatidylserine exposure in apoptotic cells. Science. 341, 403-406 (2013).
  34. Kroemer, G., Martin, S. J. Caspase-independent cell death. Nature Medicine. 11, 725-730 (2005).
  35. Chipuk, J. E., Green, D. R. Do inducers of apoptosis trigger caspase-independent cell death. Nature Reviews Molecular Cell Biolog. 6, 268-275 (2005).
  36. Tait, S. W., Green, D. R. Mitochondria and cell death: outer membrane permeabilization and beyond. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11, 621-632 (2010).
  37. Claycomb, W. C., et al. HL-1 cells: a cardiac muscle cell line that contracts and retains phenotypic characteristics of the adult cardiomyocyte. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 2979-2984 (1998).
  38. Zhang, G., Gurtu, V., Kain, S. R., Yan, G. Early detection of apoptosis using a fluorescent conjugate of annexin V. BioTechniques. 23, 525-531 (1997).
  39. Fenech, M. Cytokinesis-block micronucleus cytome assay. Nature Protocols. 2, 1084-1104 (2007).
  40. Fenech, M., et al. Molecular mechanisms of micronucleus, nucleoplasmic bridge and nuclear bud formation in mammalian and human cells. Mutagenesis. 26, 125-132 (2011).
  41. Gordon, D. J., Resio, B., Pellman, D. Causes and consequences of aneuploidy in cancer. Nature Reviews Genetics. 13, (2012).
  42. Poreba, M., Strozyk, A., Salvesen, G. S., Drag, M. Caspase substrates and inhibitors. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5, a008680 (2013).
  43. Talanian, R. V., et al. Substrate specificities of caspase family proteases. The Journal of Biological Chemistry. 272, 9677-9682 (1997).
  44. Logue, S. E., Elgendy, M., Martin, S. J. Expression, purification and use of recombinant annexin V for the detection of apoptotic cells. Nature Protocols. 4, 1383-1395 (2009).
  45. Kenis, H., et al. Annexin A5 uptake in ischemic myocardium: demonstration of reversible phosphatidylserine externalization and feasibility of radionuclide imaging. Journal of Nuclear Medicine. 51, 259-267 (2010).
  46. Ruegg, U. T., Staurosporine Burgess, G. M. K-252 and UCN-01: potent but nonspecific inhibitors of protein kinases. Trends in Pharmacological Sciences. 10, 218-220 (1989).
  47. Bertrand, R., Solary, E., O'Connor, P., Kohn, K. W., Pommier, Y. Induction of a common pathway of apoptosis by staurosporine. Experimental Cell Research. 211, 314-321 (1994).
  48. Chae, H. J., et al. Molecular mechanism of staurosporine-induced apoptosis in osteoblasts. Pharmacological Research. 42, 373-381 (2000).
  49. Takemoto, K., et al. Local initiation of caspase activation in Drosophila salivary gland programmed cell death in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 13367-13372 (2007).
  50. Bardet, P. L., et al. A fluorescent reporter of caspase activity for live imaging. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 13901-13905 (2008).
  51. Florentin, A., Arama, E. Caspase levels and execution efficiencies determine the apoptotic potential of the cell. The Journal of Cell Biology. 196, 513-527 (2012).
  52. Chihara, T., et al. Caspase inhibition in select olfactory neurons restores innate attraction behavior in aged Drosophila. PLoS Genetics. 10, e1004437 (2014).

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