Strategier för spårning Anastasis, A Cell Survival fenomen som Vänder Apoptos

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Tang, H. L., Tang, H. M., Hardwick, J. M., Fung, M. C. Strategies for Tracking Anastasis, A Cell Survival Phenomenon that Reverses Apoptosis. J. Vis. Exp. (96), e51964, doi:10.3791/51964 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Anastasis (grekiska för "stiga till liv") avser återvinning av döende celler. Innan dessa celler återhämta sig, de har passerat genom viktiga kontrollpunkter för apoptos, inklusive mitokondriell fragmentering, frigivning av mitokondrie cytokrom c i cytosolen, aktivering av kaspaser, kromatinkondensation, DNA-skador, kärnkraft fragmentering, plasmamembran blåsbildning, cellkrympning, exponering cellytan fosfatidylserin, och bildning av apoptotiska kroppar. Anastasis kan uppstå när apoptotiska stimuli avlägsnas före döden, vilket gör det möjligt döende celler för att vända apoptos och potentiellt andra mekanismer döds. Därför förefaller Anastasis att engagera fysiologiska läkningsprocesser som också skulle kunna upprätthålla skadade celler olämpligt. Funktionerna och mekanismerna för Anastasis är fortfarande oklart, hämmas delvis av de begränsade verktyg för att upptäcka tidigare händelser efter återvinning av till synes friska celler. Strategier för att upptäcka Anastasis kommer att möjliggöra studier av fysiologiska mekanismer, farorna med odöda celler i sjukdomspatologi, och potentiella läkemedel för att modulera Anastasis. Här beskriver vi effektiva strategier som använder levande cell mikroskopi och en däggdjurs kaspas biosensor för att identifiera och spåra Anastasis i däggdjursceller.

Introduction

Apoptos (grekiska för "faller till döds") antas allmänt vara en enkelriktad process som slutar i cell självmord 1-7. Genetisk avbrott i pro-döden gener leder överlevnad extra celler som annars skulle dö i hela djur, inklusive celler som redan har inlett apoptosvägen 8,9. Likaså genetiska manipulationer tillåter friska däggdjursceller som på konstgjord väg visa "äter mig" signaler eller att förlora vidhäftning till deras extracellulära matrix att undkomma döden genom hela cell fagocytos eller entosis respektive 10,11. Men har vi och andra visat att utan genetisk manipulation normala friska däggdjursceller och cellinjer kan också återhämta sig från de tidiga stadierna av apoptos 12-15. Använda verktyg för att spåra enskilda celler, har vi ytterligare visat återhämtning från sena stadier av apoptos 12,13, efter celler har passerat viktiga kontrollpunkter som typiskaly markera "point of no return" 2-6. Dessa kontrollpunkter i sent skede apoptos inkluderar mitokondriell frisättning av cytokrom c, aktivering av kaspaser, kärnkraft fragmentering, och bildandet av apoptotiska kroppar. Vi antog en grekisk förening ordet "Anastasis", vilket betyder "stiger till livet", för att beskriva denna återföring av apoptos vid randen av celldöd 2-6.

Om inte hela döende-återställningsprocessen följs av levande cell imaging, är det utmanande att särskilja celler som har genomgått Anastasis från celler som aldrig upplevt apoptotiska händelser. Årtionden av arbete har avslöjat att de morfologiska särdragen hos cellsjälvmord genom apoptos drivs av evolutionärt konserverade biokemiska och molekylära händelser 16-19. Dessa händelser främjar självförstörelse av celler för att reglera utvecklings- och homoeostatic processer i encelliga och flercelliga organismer genom att eliminera skadade eller dangerous celler 16-19. Medan apoptotiska celler kan lätt särskiljas genom standardiserade morfologiska, biokemiska och molekylära manifestationer av apoptos 1,5,6,16,20, för närvarande finns det ingen känd markör specifik för Anastasis 12,13. Viktigt celler som har genomgått Anastasis verkar vara normala friska celler och celler som precis börjar back apoptos visas som apoptotiska döende celler 12,13. Således är nya verktyg som behövs för att avsluta med säkerhet att en given överlevande cell tidigare hade upplevt aktiva apoptotiska processer.

Apoptos antas allmänt som en irreversibel kaskad eftersom det är en snabb och massiv förstörelse processen. Även om det kan ta några minuter till dagar för vissa celler att initiera apoptos, när mitokondrier har släppt apoptogenic faktorer såsom cytokrom c i cytosolen 21,22, kan kaspaser aktiveras inom 5 minuter 23,24, följt av cytoplasma ochnukleär kondensation inom 10 min 25-27, och celldöd kort därefter 25-27. Aktiverade kaspaser orkestrera apoptos genom att klyva och inaktive viktiga strukturella och funktionella komponenter i syfte att cellulära rivning 2,28, såsom endonukleas hämmaren DFF45 / ICAD 29,30. Kaspaser aktiverar också pro-apoptotiska faktorer, såsom BCL-2 familjemedlem BID, vilket translokerar till mitokondrier att främja mitokondrie frisättning av cytokrom c 31,32. Kaspasaktivitet resulterar också i cellytan exponering av fosfatidylserin som en "äta mig" signal för att främja omvälvning av döende celler genom makrofager eller grannceller genom fagocytos 33. Dessutom apoptotiska händelser gör mitokondrier dysfunktionella, störa cellulära bioenergetik och ämnesomsättning 34,35,36. Således verkar intuitivt osannolikt återhämtning från sådan förstöring.

I motsats till original förväntationer kan celler vända den apoptotiska celldödsprocess även i ett sent skede. Genom att kontinuerligt övervaka öde döende celler i kultur, observerade vi reversibilitet sent stadium apoptos i en rad primära celler och cellinjer 12,13. Borttagning av döds stimulans tillät återhämtning från de uppenbara funktionerna i apoptos, såsom mitokondriell fragmentering, kromatinkondensation, DNA-skador, plasmamembran blåsbildning, cellytan exponering av fosfatidylserin, frigivning av mitokondrie cytokrom c, kaspasaktivering, kärnkraft fragmentering, cellkrympning, och bildning av apoptotiska kroppar. Dessa observationer höjer obesvarade frågor om funktioner, konsekvenser och mekanismer för Anastasis. För att lösa dessa frågor, är en förutsättning för att på ett tillförlitligt sätt identifiera celler som har genomgått Anastasis. Här beskriver vi levande mikroskopimetoder och en kaspas biosensor för detektion av celler som tidigare har vänt sent skede apoptos och thsv levde.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Beredning av celler för levande cell imaging

  1. För att underlätta detektion av morfologiska förändringar, väljer adherenta celler såsom HeLa (humant cervikalkarcinom) celler som är platt på substratet för att bättre visualisera förändring av plasmamembranet och intracellulära organeller.
    Obs: Återföring av apoptos har observerats i olika däggdjursceller 12,13, inklusive primär mus leverceller, primära musmakrofager, primära råttkardiomyocyter, och även cellinjer såsom mänskliga embryonala njur HEK-293T celler, afrikansk grön apa njur epiteliala COS -7 celler, mus hjärtmuskel HL-1 celler, mus NIH 3T3 fibroblaster, iller (Mustela putoris furo) hjärn CRL1656 celler, mänskliga hudcancer A375-celler, humana testikelcancer CRL1973 celler, mänskliga småcellig lungcancer H446 celler, mänskliga levercancer HepG2-celler, humana bröstcancer MCF7 celler, humana prostatacancer PC3 celler och humana neuroblastom SH-SY5Y celler.
  2. Pre-wash täckglas av glas botten cellodlings rätter med ren etanol för rengöring och sterilisering.
    Anmärkning 1: Användning av glas botten rätter rekommenderas för högkvalitativa differential interferens kontrast (DIC) mikroskopi och hög förstoring konfokala eller epi-fluorescens mikroskopi (se diskussion).
    Not 2: För höga förstoringar (40X, 60 / 63x eller 100X mål och höga bländare 1.3 eller 1.4), ger längre arbetsavstånd för avbildning användning av cellodlingsskålar med tunnare glas botten (tjocklek 0,085-0,16 mm) (Se protokoll 3 ).
  3. Beroende på celltypen, kan glas botten odlingsskålar kräva beläggning med poly-D-lysin (0,1 mg / ml), kollagen (0,01% lösning i 0,01 M ättiksyra) och / eller fibronektin (5 pg / ml) före sådd celler.
    Anm: Optimering av typ och koncentration av beläggningsmedel krävs för olika cellinjer. HeLa-celler kan vidhäfta direkt på glaset utan beläggning. Men vissa celler, such som mus hjärtmuskel HL-1 celler, inte kan hålla sig direkt till glasytor, men kräver särskilda kultur och beläggningsprotokoll 37.
  4. Seed ~ 2-3 x 10 5 celler på 35 mm förbelagd glas botten cellodlingsskålar och inkubera vid 37 grader Celsius (° C) med 5% CO2 under en dag för att uppnå 80% sammanflytning.
    Not 1: Optimala betingelser för celldensitet, inkubationstid, och odlingsbetingelser kan variera, beroende på celltypen. Cell confluency kan påverka apoptotiska svaret av celler (se protokoll 2). Vid hög konfluens kunde celler vara mindre känsliga för samma koncentrationer av apoptotiska stimuli.
    Not 2: Undvik att sammanflytande celler, så hög celltäthet kan skymma morfologiska förändringar i enskilda celler och deras organeller.

2. Ansökan och borttagning av apoptotiska Cell Stimuli

  1. Strax före användning, förblanda apoptosinducerande medlet med 37 ° C cellodlingsmedium. Etanol (3,6-4,5% Vol / vol) tjänade som apoptos inducerare i föreliggande demonstration.
    Anmärkning 1: Våra publicerade och opublicerade data visar att celler också kan vända apoptos som utlöses av andra apoptotiska stimuli 12,13, såsom dimetylsulfoxid (DMSO, 8% vol / vol 24 h), staurosporin (STS, 0,5 ^ M för 1 tim), och taxol (1 pM för 12 h). Optimering av dosering för trigg apoptos krävs för olika typer av celler för att uppnå den minsta dos som kan utlösa huvuddelen av cellerna i populationen att genomgå apoptos.
    Not 2: Pre-blandningsapoptosframkallande medel med cellodlingsmediet är viktigt att undvika ojämn exponering av cellerna för att apoptotiska stimuli.
  2. Bild en grupp av hälso- och sjukvårds celler i cellodlingsskål före applicering av apoptos-inducerande medel för att fastställa nominella morfologier.
  3. Ta bort originalet mediet från cellkulturen skålen, och sedan tillämpa 2 ml färdigblandad apoptosinducerande medel till skålenutlösa celler att genomgå apoptos. Inkubera cellerna vid 37 ° C med 5% CO2 (eller andra normala odlingsbetingelser).
  4. Efter inkubering observera cellerna genom ljus, epi-fluorescens eller konfokalmikroskopi för att övervaka fortskridandet av apoptotiska funktioner.
    Not 1: Celler som genomgår apoptos kommer att visa morfologiska, biokemiska och molekylära kännetecken apoptos som kan detekteras genom mikroskopi och fluorescensbaserade biosensorer (se protokollen 3 och 4).
    Not 2: Inkubationstid av celler med olika apoptos inducerare varierar beroende på celltyp, cellförhållanden (såsom konfluens och näringsstatus), och dosen av döds stimulans tillämpas. Noggrann titrering kan behövas.
  5. När celler uppvisar kännetecken på apoptos, avlägsna apoptosinducerande medlet genom tvättning av cellerna en gång med varmt (37 ° C, eller annan normal odlingstemperatur) färskt cellodlingsmedium.
    Anmärkning 1: Som apoptotiska celler mer löst fästa påodlingsplattan, är det viktigt att applicera och ta bort mellan försiktigt så att cellerna inte kommer att tvättas bort.
    Not 2: Live suspenderade celler kan utvinnas från supernatanten genom försiktig centrifugering (160 xg i 1 min) och läggs tillbaka till odlingsskålen.
  6. Inkubera cellerna vid 37 ° C med 2 ml / 35 mm skål av färskt cellodlingsmedium i 5% CO2. Alternativt användning konditionerat medium (cellfria odlingsmediet uppsamlades från friska celler) för att ytterligare öka överlevnaden av apoptotiska celler.
    Anm: Tvättning och inkubera celler med färskt medium tillåta majoriteten av celler att reversera etanol-inducerad apoptos efter etanolexponering 12,13. Men upprepa detta tvättsteg kan krävas när cellerna exponeras för andra apoptotiska stimuli (se diskussion).

3. Levande cell Mikroskopi

  1. Vi rekommenderar att du använder en inverterad konfokala eller epi-fluorescensmikroskop med miljökontroll (37 ° C,5% CO2) för levande celler mikroskopi.
    Obs: Det är också möjligt att bilden cellerna med hjälp upprätt mikroskop med en vatten doppa mål. Doppa målet direkt i odlingsmediet till bildceller. Däremot kan celler krossas av avbländande mål under fokusering.
  2. Pre-värma mikroskop (t.ex. miljökontroll kammare, etapp inkubator och objektiv värmare) minst 2 timmar före avbildning.
    Anmärkning: Det mikroskopets komponenter för att nå termo jämvikt, så att den kan undvika avdrift av fokus och förskjutning av xy-planet på grund av den termiska expansionen och kontraktionen av komponenterna.
  3. Placera en 35 mm glas botten maträtt av odlade celler (se protokoll 1) på scenen av ett inverterat mikroskop och fånga cellbilder med hjälp av en 40X eller 63X planen-Apochromat mål med en numerisk apertur (NA) 1.3 eller 1.4 för avbildning celler från botten av skålen genom täckglas av glas.
    Obs: Undvik att över 2 ml mediumtill 35 mm glas nedre skålen, som vikten av mediet kan orsaka krökning av glasbotten, vilket gör det svårt att avbilda ett fält av celler vid samma fokalplan.
  4. Behåll cellerna vid 37 ° C eller motsvarande normal temperatur under hela avbildningsprocessen.
    Obs: Processen för apoptos, och sannolikt återföring av apoptos, beror på temperaturkänsliga enzymatiska aktiviteter. Därför är det viktigt under hela experimentet bibehålla cellerna vid 37 ° C (t.ex. med ett mikroskop skede topp inkubator). Minskad temperatur kan bromsa den apoptotiska respons och återhämtning svaret efter avlägsnande av apoptotiska stimulans.
  5. Använd en fuktskyddsanordningen eller lägga en genomskinlig folie (se Material) på odlingsplattan för att minska vattenförlusten genom avdunstning från mediet.
    Notera: folien kan störa polaritet ljus för DIC mikroskopi. Återställ polaritet genom att justera polarisatorn på ljusstrålen.
  6. Bibehåll pH icellodlingsmedium (pH 6,8 -7,3) genom inkubering i 5% CO2 med en miljöstyrkammare på mikroskopet.
    OBS: Underhåll pH i odlingsmedium kan också uppnås genom att tillsätta HEPES buffert, eller genom att använda kommersiellt CO2-oberoende medium (se Material). Optimala betingelser kan variera beroende på celltypen.
  7. Minimera fluorescens / laser (excitationsljusintensiteten) exponering för celler under avbildningsprocessen för att undvika fototoxicitet genom att minska fluorescensintensiteten till den lägsta som krävs för att få högkvalitativa bilder av cell / subcellulära strukturer eller uttryckta biosensorer (Detaljer i protokoll 4) kvalitet.

4. Strategier för att upptäcka och spåra Anastasis under och efter Apoptotiska Evenemang

  1. Plasma membranblåsbildning, cytoplasmatisk kondens, cell krympning och apoptotiska kroppsbildning (se figurerna 1A - C, E).
    1. Utför tidsförlopp levande cell differential interferens kontrast (DIC) eller faskontrastmikroskopi att spåra en grupp av hälsoceller och iaktta sin cell morfologi (se protokoll 3 för levande cell mikroskopi, och se diskussion).
      Not 1: Minska intensitet ljuskälla för DIC / fas kontrakt imaging att undvika fototoxicitet till cellerna.
      Anm 2: Om DIC och faskontrastmikroskopi är inte tillgängliga, använd Celltracker att färga cytosolen att beskriva morfologi av levande celler för konfokala eller epi-fluorescens mikroskopi och övervaka cellmorfologin.
    2. Applicera celldöd stimulans att utlösa celler genomgå apoptos (se protokoll 2 för applicering och borttagning av apoptotiska stimuli).
    3. Beakta behandlade celler för morfologiska kännetecken apoptos såsom plasma membranblåsbildning, cytoplasmisk kondensation, cellkrympning och apoptotisk kropp bildning (figurerna 1A, 1B, 1C, 1E).
    4. Tvätta bort döds stimuli, och återförsörjnings celler med färskt medium när cellerna display morfologiska kännetecken apoptos.
      Anmärkning 1: Applicera celldöd stimulans eller ändra cellodlingsmediet på mikroskop scenen under time-lapse levande cell imaging kan uppnås genom att använda en perfusion cellodlingskammare, eller kan utföras direkt på cellodlingsskål genom att försiktigt pipettera utan att röra skålen, under pauserna mellan avbildning.
      Not 2: Använd fokus avdrift kompensationssystem för att undvika ur fokus av celler på grund av förlusten av termo jämvikt av mikroskopsystemet efter byte av cellodlingsmedium (se diskussion).
    5. Kontinuerlig tidsförlopp imaging att spåra öde celler som uppvisar kännetecken apoptos. Celler som omvända apoptos kan reparera skador och återfå normal platt morfologi (Figur 1A, 1B, 1C, 1E).
  2. Mitokondriell fragmentering, DNA / kromatinkondensation och nukleär fragmentering (Se figur 1D, 1F, 1G).
    1. Att visualisera mitochondria, fläck celler med 50 nM MitoTracker röd / djupt röd / grön-fluorescerande färgämne, och samtidigt färga kärnan med 10 ug / ml Hoechst 33342 blå nukleär färgämne i odlingsmedium för 20 minuter vid 37 ° C med 5% CO2.
      Not 1: Minska koncentrationen av färgämnen och varaktighet inkubation att undvika cytotoxicitet och minska bakgrunds fluorescens när behov. Optimera färgnings förhållanden för att erhålla en bra signalbrusförhållande med den minimala mängden färgämne och inkubationstid för missfärgning.
      Not 2: Använd fluorescerande fläckar för mitokondrier såsom MitoTracker Red CMXRos, MitoTracker Deep Red FM eller MitoTracker Grön FM, som inte läcker ut från mitokondrier under apoptos. Detta gör att visualisera mitokondriell morfologi under apoptos och Anastasis. Se de material och utrustning bord för information om dessa fläckar.
    2. Håll färgade celler i mörker för att undvika fotoblekning.
    3. Avlägsna överflödigt fläcken genom att tvätta cellerna3 gånger med 37 ° C fosfat-buffertlösning (PBS) lösning eller färskt cellkulturmedium, med en min inkubation i färskt medium mellan varje tvättning, och sedan inkubera ytterligare i färskt medium under 20 min innan den slutliga tvätten för att tillåta överdriven fläckar att avsluta cellerna att minska icke-specifik signal bakgrund för avbildning.
      Obs: Korta inkubationstider med cellmedium efter färgning kan resultera i hög bakgrund för avbildning.
    4. Utför realtid levande cell konfokala eller epi-fluorescens mikroskopi till bild friska celler innan apoptotiska induktion appliceras (se protokoll 3 för levande cell mikroskopi).
      Obs: Friska celler visar rörformiga mitokondrier och runda kärnor i de flesta celltyper (figur 1D, 1F, 1G).
    5. Trigger celler att genomgå apoptos (se protokoll 2 för applicering och borttagning av apoptotiska stimuli till cellerna).
    6. Fortsätt tidsförlopp levande cell mikroskopi att observera förändringar i mitokondriernas och kärnkrafts morphologIES omedelbart efter döden stimulus anbringas till cellerna. Observera celler för att visa kännetecken apoptos såsom mitokondriell fragmentering och svullnad, kromatinkondensation och nukleär fragmentering, i motsats till friska celler som uppvisar rörformade mitokondrier och runda kärnor.
    7. När celler uppvisar kännetecken på apoptos, tvätta och förse cellerna med färskt medium, och fortsätta tidsförlopp imaging att spåra ödet för celler. Celler som omvända apoptos återfå normal mitokondrie och nukleär morfologi (Figur 1D, 1F, 1G).
      OBS: Utför DIC mikroskopi parallellt när det är möjligt att få ytterligare information för åtkomst stadier av apoptos genom att observera förändringar i cellmorfologin i samma grupp av celler (se protokoll 4.1 för DIC mikroskopi).
  3. Upptäckt av mitokondriell frisättning av cytokrom c användning av celler som stabilt uttrycker en cytokrom c -GFP fusion protein (Se figur 2).
    1. Stain celler stabilt uttrycker cytokrom c -GFP 23,24 med MitoTracker Röd att märka polarise cellens mitokondrier (Se Steg 4.2.1 till 4.2.3 för levande cell mitokondrier färgning).
    2. Utför realtid levande cell konfokala eller epi-fluorescens mikroskopi för att spåra friska celler (Detaljer i protokoll 3 för levande cell imaging).
      Obs: cytokrom c -GFP signal lokaliserar främst i mitokondrierna av friska celler (figur 2A i, 2B).
    3. Trigger celler att genomgå apoptos (se protokoll 2 för applicering och borttagning av apoptotiska stimuli till cellerna). Fortsätt tidsförlopp mikroskopi att observera translokation av cytokrom c -GFP från mitokondrier till cytosolen (Siffror 2Aii-iii, 2B).
      Anm: Mitokondriell frisättning av cytokrom c i cytosolen är en markör av mitokondriell yttre membran permeabilisering (MOMP)4, ett kritiskt steg i mitokondrierna beroende apoptos 21,22
    4. När celler visar cytokrom c -GFP signal i cytoplasman, avlägsna celldöd stimulus och försörjnings celler med färskt medium (Se protokoll 2). Fortsätt tidsförlopp imaging att spåra öde celler med cytosoliskt GFP.
      Notera: Celler som omvänd apoptos återfå normal cell morfologi, och minska deras cytosoliskt cytokrom c -GFP signal förmodligen genom nedbrytning eller flyttning tillbaka till mitokondrier (Siffror 2Aiv-vii, 2B).
    5. Fånga DIC bilder parallellt för att få ytterligare information för att komma åt de olika stadierna av apoptos genom att observera förändringar i cellmorfologi i enstaka celler eller grupp av celler (se protokoll 4.1 för DIC mikroskopi).
  4. Upptäckt av kaspasaktivitet med hjälp av en kaspas biosensor (se figur 3)
    1. Transfektera celler med kaspas biosensor NES-DEVD-YFP-NLS för16 till 24 timmar innan de utsätts för en apoptotiska stimulans 13.
    2. Färga transfekterade kulturerna med Hoechst 33342 för att märka cellkärnor (Se Steg 4.2.1 till 4.2.3 för levande cell nukleär färgning).
    3. Utför realtid levande cell konfokala eller epi-fluorescens mikroskopi för att spåra friska celler (Detaljer i protokoll 3 för levande cell imaging).
      Obs: NES-DEVD-YFP-NLS biosensorsignalen lokaliserar främst i cytosolen av friska celler på grund av sitt nukleära exportsignalen (NES) (Figur 3A, 3Bi och 3C, se diskussion).
    4. Trigger celler att genomgå apoptos (se protokoll 2 för applicering och borttagning av apoptotiska stimuli till cellerna). Fortsätt tidsförlopp mikroskopi att observera kärntranslokering av YFP.
      Observera: Aktivering av kaspaser klyver DEVD motiv i kaspas biosensor NES-DEVD-YFP-NLS, vilket resulterar i YFP-NLS sloka från cytosolen till kärnan (Figur 3A, 3Bii-iv, se diskussion).
    5. Notera: Celler som omvänd apoptos återfå normal cell morfologi, men behåller den nukleära YFP signalen (Siffror 3Bv-x, Celler 1 och 2, och 3D).
    6. Fortsätt tidsförlopp imaging att spåra öde celler som uppvisar kärn YFP.
      Obs: Den nukleära YFP signalen blir förstörd flera timmar efter celler har vänt apoptos (Figurerna 3B, vi-x, Cell 1, Se Resultat och Diskussion) förmodligen genom normala klarecell mekanismer såsom proteasom nedbrytning.
    7. Fånga DIC bilder parallellt för att få ytterligare information för att komma åt de olika stadierna av apoptos genom att observera förändringar i cellmorfologi i enskilda celler eller en grupp av celler. (Se protokoll 4.1 för DIC mikroskopi).
  5. Cell ytexponering av fosfatidylserin (se figur 4)
    1. Seed celler på glass täckglas för att uppnå 80% cell confluency (Se protokoll 1).
    2. Co-färga cellerna med röda fluorescerande MitoTracker och blått Hoechst 33342 fläck för mitokondrier och kärnor, respektive (Se Steg 4.2.1 till 4.2.3 för levande cell mitokondrie och nukleär färgning).
    3. Trigger celler att genomgå apoptos genom att använda en apoptos inducerare (se protokoll 2).
    4. Applicera fluorescensmärkt annexin V (se Material) för att färga apoptotiska celler 10 min vid 37 ° C före avlägsnande av apoptos inducerare för att detektera exponering av fosfatidylserin på ytan av apoptotiska celler.
      Not 1: Friska celler inte färgas med annexin V eftersom fosfatidylserin normalt binds på inner bipacksedel av cellplasmamembranet 38. Apoptotiska celler färgas med annexin V, som binder till fosfatidylserin på cellytan (fig 4A och 4B).
      Not 2: Fluorescent-märkt annexin V kan också tillämpas för att färga apoptotiska celler Immediately efter avlägsnande av apoptos-induceraren, med 10 min inkubation.
    5. Avlägsna celldöd stimulans, tvätta de färgade cellerna med varm PBS eller färskt medium en gång, och sedan förse cellerna med färskt medium under 2 h vid 37 ° C med 5% CO 2 (Se protokoll 2).
      Anmärkning 1: Celler som omvända apoptos återfå normal morfologi och behålla fluorescerande annexin V signal efter att återfå normal morfologi (fig 4A och 4B).
      Anmärkning 2: annexin V-signalen minskar med tiden på återvunna celler (se diskussion).
    6. Fix celler vid valda tidpunkter med 4% paraformaldehyd innehållande 8% sackaros i 1x PBS under 20 minuter i mörker vid rumstemperatur, och tvätta de fixerade cellerna med PBS under 3 gånger för att avlägsna paraformaldehyd före montering celler på objektglas täckglas med antifad monterings (Se Materials) för konfokala eller epi-fluorescens mikroskopi och observera annexin V på celler efter avlägsnande av apoptos inducerare.
      Anmärkning 1: Sackaros i fixativ bevarar cellmembranstruktur under fixering.
      Not 2: Förvara paraformaldehydlösning i mörker vid 4 ° C för att förhindra nedbrytning.
      Not 3: Värm upp paraformaldehydlösning till rumstemperatur innan du använder den till celler för fixering för att undvika köldchock till cellerna.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

För att studera återföring av apoptos, är vävnadsodlingsceller först utsatt för en döds stimulans för att utlösa apoptos. När celler uppvisar kännetecken på apoptos, är färskt odlingsmedium applicerades sedan för att tvätta bort stimulus och sedan inkubera de döende celler för att tillåta återhämtning (Figur 1A). Här är den centrala frågan behandlas hur långt individuella döende odlade celler kan utvecklas mot apoptos och fortfarande genomgår Anastasis. Denna fråga kan definitivt besvaras av kontinuerlig övervakning med biomarkörer för att spåra cell öden som använder de metoder som beskrivs nedan.

Vi beskriver först våra strategier för att upptäcka återföring av apoptos i vävnadskulturceller med hjälp time-lapse levande cell mikroskopi, vilket krävs för att spåra och spela in svaret från enskilda celler före, under och efter exponering för en apoptotiska stimulans 12,13. Friska vidhäftande celler sprids på deras bifogade substrat (Figur 1Bi) 12,13, och visas rådiga mitokondrier och runda kärnor före behandling (Siffror 1Ci, Di, Ei, Fi, Gi) 12,13. Efter exponering för 3,8 till 4,5% etanol i cellodlingsmedium (vol / vol), DIC eller faskontrastmikroskopi avslöjade att cellerna uppvisade morfologiska kännetecken på apoptos, inklusive cytoplasmisk kondensation, plasmamembranblåsbildning, och cellkrympning (figurerna 1Bii, 1Cii- iii, och 1Eii-vi) 12,13. Apoptotisk kroppsbildning av samma celler lätt observeras av DIC (Siffror 1Eii-vi). Fragmentering av MitoTracker-märkta mitokondrier (Siffror 1Dii-iii, 1Fii-vi) 12,13 samt kondensation av Hoechst-färgade nukleärt DNA (Siffror 1Dii-iii, Fii-iii, Gii) 12,13, och fragmentering av kärnor (figgärder 1Evi och FVI, vita pilar), upptäcktes samtidigt av konfokala eller epi-fluorescens mikroskopi. De celler som framgångsrikt omvända apoptos därefter observer att återfå normal morfologi, tydligen reparera sina skador (Siffror 1Biii, C och Div-vi, E och FVII-xii, och GIII) 12,13. Celler under dessa förhållanden också hade visat att återfå organell motilitet, cellmigration och funktionell endocytos baserade på upptag av fluorescens-emitterande kvantprickar och celldelning 13. Intressant vissa celler som vördade apoptos visas oregelbunden nukleär morfologi (fig 1Fxii), och även onormal celldelning och bildning av mikrokärnor (Figurer 1Giv-vii) 13, vilken är en biomarkör av DNA-skada, kromosombrott och hel kromosomförlust i delande celler 39, 40. Förskjuten chromosomes eller kromosomfragment utanför undgå att ingå i dottern cellkärnor är omslutna av en nukleär membran 39, 40. Således kunde en konsekvens av Anastasis vara hysande av genom som skadats under avbruten apoptos, vilket leder till tumörbildning och cancerutveckling. Förekomsten av mikrokärnor är också vanligt i cancerceller 40,41.

Release av mitokondrie cytokrom c är ett kritiskt steg för att medla eller förstärka kaspas-beroende apoptos 20-22. Använda HeLa-celler som stabilt uttrycker GFP-märkta cytokrom c, övervakade vi subcellulära omlokalisering av cytokrom c under apoptos och Anastasis av konfokalmikroskopi. Som rapporterats 23,24, cytokrom c -GFP lokaliserad till mitokondrierna före behandling (figur 2AI och B), men sedan släpptes i cytosolen efter en döds stimulans hade tillämpats (Siffror 2Aii,2Aiii och B). Andra karakteristiska morfologier såsom mitokondriell fragmentering och plasmamembran blåsbildning, observerades också i celler som hade släppt cytokrom c -GFP (Figur 2Aiii). Dessa celler rapporterades att genomgå celldöd strax efter utgivningen av cytokrom c 23-27. Men efter avlägsnande av döds stimulans, konstaterade vi att cytosoliskt cytokrom c -GFP nivåerna sjönk, mitokondrier återfått trådformiga strukturer, och plasmamembranet återhämtade en normalt utseende (figur 2Aiv-vii, och B). Därför kan apoptotiska celler genomgå Anastasis efter mitokondriell frisättning av cytokrom c.

Förstärkning av nedströms DEVD-klyva kaspaser antas allmänt vara den "point of no return" i apoptos 2,5. Därför använde vi en kaspas biosensor NES-DEVD-YFP-NLS exprEssed från en plasmid 13, vilket gör det möjligt att detektera överlevande celler som tidigare har drabbats av kaspasaktivitet (figur 3A). Denna kaspas biosensor är en polypeptid med en N-terminal nukleär avstängningssignal (NES), en linker med kaspas-3/7 konsensusklyvningsställe (DEVD) 26,42,43, följt av en gul fluorescerande protein (YFP) och en C-terminal nukleär lokaliseringssignal (NLS). Hos friska celler, lokaliserar denna biosensor främst till cytosolen som en funktion av NES (figurerna 3Bi, Ci-iv, och D) 13. Under apoptos, aktiverade kaspaser klyva DEVD motiv, släppa YFP-NLS, som effektivt translokerar från cytosolen till kärnan i celler som samtidigt, eller senare, visar andra funktioner i apoptos såsom DNA / kromatinkondensation och cell krympning (figurerna 3B ii -iv, och D) 13. SålundaSE celler behåller kärnimportfunktion efter kaspasaktivering. Efter avlägsnande av apoptos-induceraren, celler som undergår Anastasis display morfologisk återhämtning även efter kaspasaktivering har inträffat (Figurer 3Bv-x, och D) 13, som synes backning sent skede apoptos. Under återhämtning av normal morfologi, minskar den nukleära YFP signalen i intensitet i vissa celler när de börjar att vända apoptos efter avlägsnande av död stimulus (fig 3Bv-x, Cell 1) 13, vilket antyder att celler försämra kaspas-klyvs biosensor, eventuellt genom samma mekanism som används för att avlägsna andra kaspas-klyvs produkter under och efter Anastasis.

Anastasis kan också detekteras utan levande cell mikroskopi. Detta kan åstadkommas genom användning av fluorescensmärkt annexin V 38,44, som binder och märken externaliserats fosfatidylserin (PS) i ett tidigt steg i apoptos ( (Figur 4B) 13, som fosfatidylserin är begränsad till den inre bipacksedel av plasmamembranet av friska celler 38. I motsats, etanol-inducerade apoptotiska döende celler exponerar fosfatidylserin på cellytan (figur 4B) 13, och därför, kan märkas med det fluorescerande annexin V 38,44. Märkbart, kan annexin V-märkta celler återfå normal morfologi efter avlägsnande av döds stimuli, vilket tyder på att primära kardiomyocyter har vänt apoptos (Figur 4B) 13. Andra har tidigare tillämpade en liknande strategi som tyder på att återhämtningen från apoptos kan inträffa in vivo. I en modell av transitorisk ischemisk skada in vivo, kaspas beroende annexin V märkning av hjärtmuskelceller i kaniner och möss tydligen rerade i internalisering av annexin V genom överlevande celler efter transitorisk ischemi 45, vilket tyder på att Anastasis skulle kunna inträffa i levande djur. Dessutom, två andra studier använde cellsortering för att identifiera en fraktion av annexin V-märkt mus BCL 1 .3B3 B-lymfomceller (utsatta för anti-immunglobulin-antikroppar som inducerar apoptos i BCL 1 .3B3) och mus-bröstkarcinom MOD-celler som uttrycker temperatur -känsliga p53 (som orsakar apoptos efter inkuberas under tillåtna temperaturen) fortsatte att föröka efter att de återvänt till normala odlingsbetingelser 14,15. Tillsammans står dessa studier tyder på att annexin V är användbar för att bestämma ödet för celler som har återförts apoptos utan live-cell mikroskopi avbildning. Men det finns förbehåll med denna strategi, eftersom annexin V fluorescens är inte permanent (Figur 4B) 13, resterande detekterbara för bara några timmar efter borttagande av döds stimulans, så attdessa metoder kan inte ge begreppet spårning länge av celler som omvända apoptos.

Figur 1
Figur 1: Spårning återföring av apoptos genom levande cell imaging. (Återges med tillstånd från Tang et al, MBoC 23, 2240-2252 13, för figurerna 1A -. D och G). (A) Approach att inducera apoptos och därefter låta odlade celler att återhämta sig efter tvätt bort apoptos inducerare. (B) Time-lapse levande cell faskontrastmikroskopi friska primära musleverceller (obehandlat), samma grupp av celler som behandlades med 4,5% etanol i odlingsmedium (vol / vol) för 5 h (behandlad), och tvättades sedan och inkuberades ytterligare med färskt odlingsmedium under 24 h (tvättade). Skala bar, 100 nm. (C) Kontinuerlig tidsförlopp levande cell epi-fluorescens mikroskopi av samma primära muslever cell innan Ethanol behandling (i), vid de indikerade tidpunkterna efter behandling med 4,5% etanol i cellodlingsmedium under 2,5 h (II och III), och efter tvättning och inkubering med färskt medium för att tillåta återhämtning under 1 h (iv - vi). Sammanslagna bilder av MitoTracker-färgade mitokondrier (röd) och Hoechst-färgade kärnan (blå) visualiserades genom epi-fluorescens mikroskopi och cellmorfologi från DIC mikroskopi. Skala bar, 10 um. (D) Sammanslagna fluorescens bara (utan DIC) bilder från panel C avslöjar organell morfologier. (E) Kontinuerlig tidsförlopp levande cell konfokalmikroskopi av de mänskliga småcellig lungcancer H446 celler före etanolbehandling (i) , efter behandling med 3,8% etanol i cellodlingsmedium under 2 h 28 min (II-VI), och efter tvättning och inkubering med färskt medium för att tillåta återhämtning (vii-XII). Sammanslagna bilder av MitoTracker-färgade mitokondrier (röd) och Hoechst-färgade kärnor (blå) visualiserades genom konfokalmikroskopi, och c ell morfologi av DIC mikroskopi. Vita pilar anger en fragmenterad kärna i apoptotiska kroppar (VI). Skala bar, 10 mikrometer. (F) Sammanslagen fluorescens bilder bara (utan DIC) från panelen E avslöja organell morfologier. (G) Kontinuerlig tidsförlopp levande cell epi-fluorescens mikroskopi för monokroma Hoechst-färgade kärn avbildning av en enda HeLa cell som genomgår oprecisa celldelning. Före etanolbehandling (i), behandling med 4,3% etanol i cellodlingsmedium för 5 h (II) och efter avlägsnande etanol (tvättad, III-VI). Paneler iv avslöjar onormala celldelningar. Röda pilar indikerar de stora kärnor i de delade celler (IV- vi). Scale bar, 30 | im. Tiderna anges som hr:. Min Klicka här för att se en större version av denna siffra.

gur 2 "src =" / filer / ftp_upload / 51.964 / 51964fig2highres.jpg "/>
Figur 2: Upptäcka återföring av apoptos efter mitokondriell frisättning av cytokrom c (A) Kontinuerlig tidsförlopp levande cell konfokalmikroskopi av HeLa-celler stabilt uttrycker cytokrom c -GFP (Cyto C -GFP) före (i), under (ii-iii) och efter (III-VII) exponering för 3,9% etanol i cellodlingsmediet. Sammanslagna konfokala bilder av CytoC-GFP (grön), MitoTracker-färgade mitokondrier (röd), och Hoechst-färgade kärnor (blå) kombineras med DIC bilder (till vänster). Sammanslagen versioner visas separat för CytoC-GFP, som presenteras som en värmekarta över signalintensiteten (vänstra mellersta panelen), monokrom bild av CytoC-GFP (mittenpanelen), och monokrom bild av mitokondrier (högra mellersta panelen). Sammanslagna bilder av CytoC-GFP och mitokondrier (högra panelen). (B) Förändringen av det cytosoliska cytokrom c-GFP signalintensitet av cellerna, Cell 1 och Cell 2, som anges i den monokroma CytoC-GFP bild vid Panel Ai. Tiderna anges som hr:. Min Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3
Figur 3: Upptäcka återföring av apoptos efter kaspasaktivering (Återges med tillstånd från Tang et al, MBoC 23, 2240-2252 13, för figurerna 3A - D.). (A) Diagram av kaspas biosensorfusionsprotein sammansatt av en nukleär exportsignal (NES), klyvningsstället DEVD caspas, gult fluorescerande protein (YFP), och den nukleära lokaliseringssignalen (NLS). (B) Kontinuerlig tidsförlopp levande cell konfokalmikroskopi av HeLa-celler som uttrycker de kaspas biosensor NES-DEVD-YFP-NLS före (i), under (ii -iv) och efter (vx) exponering för 4,3% etanol i cellodlingsmediet. Sammanslagna konfokala bilder av kaspas biosensor (grön), Hoechst-färgade kärnor (blå) och DIC bilder (till vänster), en monokroma bilder av YFP signal (mitten panel), och en värme karta indikerar YFP signalintensiteten (högra panelen) . (C) Obehandlade kontroller analyseras som i panelen B. (D) Kvantifierat fluorescensintensiteter för aktiverade kärn kaspas biosensor i enskilda celler (numrerade 1 och 2 i panelen Bi) före, under och efter exponering för etanol, och i obehandlade kontroller (numrerade 3 och 4 i panel Ci) beräknades som procent av YFP närvarande i kärnan (nukleär / totalt cell YFP signalintensitet x 100%). Tiderna anges som hr: min. Skala bar, 10 mikrometer. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

ays "> Figur 4
Figur 4: Upptäcka återföring av apoptos genom fluorescensmärkt annexin V (Återges med tillstånd från Tang et al, MBoC 23, 2240-2252 13, för figurerna 4A - B.). (A) Diagram av annexin V-FITC-Anastasis analys som användes i panel B. (B) Neonatal rått primära hjärtventrikulära myocyter exponerades för 4,5% etanol i cellodlingsmedium för 5 h, och inkuberades sedan med annexin V-FITC för 10 min före avlägsnande av etanolmedium. Celler antingen fast omedelbart (behandlad), eller fast efter återmatning med färskt medium under ytterligare 2 h återhämtning (tvättade). Obehandlade celler som exponerats annexin V-FITC tjäna som kontroll (obehandlat). MitoTracker-färgade mitokondrier (red), Hoechst-färgade kärnor (blå) och annexin V-FITC (grön) visualiserades genom konfokalmikroskopi och cellmorfologin visualiserades av DIC mikroskopi. Scale bar, 10 mikrometer. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Anastasis hänvisar till fenomen där celler som har aktiverat celldöd vägen därefter vända den döende processen och överleva. Här har vi visat att levande cell imaging kan användas för att bekräfta att samma enskilda celler i själva verket kan vända apoptotiska celldöd process i ett sent skede, och sedan fortsätta efterlevande och reproducera. Våra protokoll beskriver flera optimerad cell typspecifika behandlingsförhållanden för att inducera apoptos och låta en stor del av cellerna att genomgå återföring av apoptos övervakas med flera biomarkörer för verifiering. Beträffande tekniska frågor, var glas botten rätter som används för att odla celler för avbildning 12,13, på grund av den mycket transparent tunt glas mellan celler och mikroskop målet, vilket gör att långa arbetsavstånd för högkvalitativ konfokala eller epi-fluorescens mikroskopi i hög förstoring, underlättar observation av klassiska apoptos inklusive mitokondriell fragmentering, Frisättning av cytokrom c, och nukleär kondensation och fragmentering. Glas också inte snedvrider polariteten av ljus, för att möjliggöra högkvalitativ DIC mikroskopi för övervakning av membranblåsbildning, cell krympning av celler och apoptotiska kroppsbildning under apoptos. DIC mikroskopi har fördelar över faskontrastmikroskopi att observera dessa morfologiska kännetecken apoptos, som DIC förbättrar kontrasten ofärgade och genomskinliga cellprover, förbättra upptäckt av cell morfologier. Om DIC och faskontrastmikroskopi inte är tillgängliga, kan Celltracker användas för att färga cytosolen att beskriva morfologi av levande celler för konfokala eller epi-fluorescens mikroskopi och övervaka cellmorfologin.

Tillämpningen av lämpliga doser av döds stimuli och strategier avlägsnandet av stimuli är kritiska steg för detektion av Anastasis. Vi har valt att använda låga koncentrationer av etanol som döds stimulans för experiment described här eftersom en stor procent av behandlade celler kan jämnt genomgå apoptos och kan återhämta sig från detta, potentiellt mildare, död stimulans. Ändå kan dessa metoder också tillämpas framgångsrikt med andra döds stimuli, som vi har rapporterat 12,13. Men vissa döds stimuli är i sig mer utmanande än andra, såsom staurosporin (STS), en vanligt förekommande apoptos framkallande medel. Kanske för att det binder sina substrat med hög affinitet 46-48, upprepade tvättar är viktiga, men kan fortfarande inte effektivt avlägsna STS från cellerna. I detta fall kan med hjälp av lägre läkemedelskoncentrationer och kortare drog inkubationstid som fortfarande kan aktivera apoptotiska döende processen vara till hjälp för att fler celler att vända apoptos. Åter utfodring celler med konditionerad cellodlingsmedium kan också förbättra återföring av apoptos bättre än färskt cellodlingsmedium. Apoptotiska celler är oftast löst knutna till odlingsskålen ytan speciellt på glas suransikten, är det följaktligen viktigt att tvätta bort de apoptos inducerare försiktigt för att undvika att lossa celler. Beläggning glas rätter med poly-D-lysin, kollagen och / eller fibronektin skulle kunna öka cellvidhäftning för att tillåta vissa typer av celler, såsom kardiomyocyter 37, för att fästa ordentligt på glasytan på cellodlingsskålar, särskilt efter exponering av celler för en död stimulans.

Processen för apoptos, och sannolikt återföring av apoptos, beroende enzymatiska aktiviteter som kan påverkas av temperaturen. Därför är det viktigt under hela levande avbildningsprocessen upprätthålla celler vid 37 ° C eller vid normal kulturen villkor för att säkra reproducerbarhet av experimentella resultat. Pre-varm mikroskop innan levande cell imaging är också ett viktigt steg som gör att mikroskopets komponenter för att nå termo jämvikt. Detta kan undvika avdrift av fokus och förskjutning av xy-planet på grund av den termiska expansionen och kontraktionen avkomponenter under levande cell imaging. Tillämpa eller ta bort döds stimulans genom att ändra mediet en odlingsskål med antingen en pipett eller genom perfusion i förvärmda mikroskopi systemet under time-lapse avbildning kan fortfarande orsaka avdrift av fokus på grund av förändringar i temperatur eller volym av mediet. Z-stack förvärv kan hjälpa till bildceller vid korrekt fokalplanet, men kommer att öka risken för fototoxicitet på grund av ytterligare exponering av celler för fluorescerande lasrar. Alternativt använda fokusdriftkompensation system, såsom en infraröd laserbaserad automatisk fokus korrigeringssystem, kan hålla cellerna på samma fokalplanet under time-lapse levande cell imaging genom att upprätthålla avståndet mellan celler / glas och målet utan ytterligare exponering av cellerna till kort våglängd, fototoxisk fluorescens.

Mitokondriell frisättning av apoptogenic proteiner såsom cytokrom c, och aktivering av effektor-caspaser, såsom den nedströms / effekteller kaspas-3 och kaspas-7, har allmänt anses vara det "point of no return" i apoptotiska celldöd process 2,5,6. Western blöts har använts för att detektera klyvning (aktivering) av kaspas-3 och dess substrat såsom poly (ADP) -ribose polymeras-1 (PARP) och DFF45 / ICAD i hela cellpopulationen under apoptotisk induktion och efter avlägsnande av apoptotiska stimuli, och avslöjade att kluvna caspase-3, ICAD och PARP visade upp i celler under exponering för döds stimuli, men försvann efter cellerna åter foder med färskt odlingsmedium 13. Men dessa metoder avslöjar det allmänna villkoret i cellpopulationen, men skiljer inte de enskilda cellerna som i slutändan kommer att dö av dem som kommer att vända apoptos och sedan överleva. Biochemical fraktione att analysera frisättningen av mitokondrie cytokrom c har liknande varningar. Därför, för att spåra ödet för individuella celler efter cytokrom c frisättning och kaspas-activation, två av de mest erkända kännetecken apoptos 2,5,6, GFP-märkt cytokrom c (Cyto C -GFP) och ett kaspas biosensor, såsom en som används här NES-DEVD-YFP-NLS, i kombination med levande cell mikroskopi kringgå dessa problem genom att direkt observera morfologiska återhämtning och translokation av Cyto C -GFP biosensor i samma celler. Dessa resultat indikerar reversibilitet apoptos efter mitokondrie cytokrom c release och kaspasaktivering.

Den stora utmaningen för att studera Anastasis är bristen på märkningstekniker för att detektera celler som har genomgått Anastasis vid någon punkt under hela deras livslängd, in vivo eller in vitro. Stabil uttryck för kaspas biosensor NES-DEVD-YFP-NLS tillåter också upptäckt av caspase aktivitet om kaspaser aktiveras igen i framtiden, men inte permanent spela kaspasaktivitet som aktiverade biosensorn kommer att degraderas utan Sustagranskat kaspasaktivitet 13. Andra tidigare rapporterade kaspas biosensorer, såsom FRET-baserade SCAT biosensorer (t.ex. ECFP- [DEVD] -Venus) 26,49 samt fluorescerande reportrar Apoliner (CD8-RFP- [DQVD] -GFP) 50 och CPV (t.ex. CD8 - [DEVD] -Venus) 51,52, kan användas för att detektera kaspasaktivitet i hela djur och i odlade celler, men har liknande begränsningar. På liknande sätt kan Cyto C -GFP inte användas för att spåra celler som omvända apoptos i lång sikt, eftersom det frigörs från mitokondrier i cytosolen under apoptosen och därefter nedbrytes. Annexin V märkning har använts för att spåra celler som omvända apoptos, men signalstyrkan avtar också med tiden, så är inte användbart för begreppet spårning av Anastasis 13,45 lång. Kontinuerlig långtids in vivo imaging kan användas för att spåra öde samma celler efter exponering av döds stimuli. Dock är långsiktigt in vivo imaging fortfarande utmanande to prestera i de flesta levande djur. Därför behövs ytterligare metoder för att utvidga Anastasis forskning till hela djurstudier, och för screening läkemedel som kan främja eller hämma Anastasis använder vävnadsodlingsceller

I framtiden är nyare protokoll och tekniker som spårar långsiktig cell öde krävs för att utveckla och testa de fysiologiska, patologiska och terapeutiska konsekvenser Anastasis. Vi föreslog att Anastasis skulle kunna vara en allmän cellöverlevnad mekanism för att rädda skadade celler som är svåra att ersätta, såsom mogna neuron och hjärtceller 13. Men Anastasis apoptotiska cancerceller efter kemoterapeutiska behandlingar kan leda till återvinning av farliga celler vilket leder till återkommande resistenta tumörer 12,13. Anastasis kan också vara en viktig mekanism för tumörbildning, eftersom vissa celler visar onkogen transformation efter att de vänt apoptos 13. Därför kan öka Anastasis bli en ny theratiska strategi för att hämma neurodegeneration och hjärtsvikt, samtidigt undertrycka Anastasis som ett nytt sätt för att förebygga eller behandla cancer. Utveckla biosensorer för att spåra återföring av apoptos i sjukdomsmodellsystem kommer att öka förståelsen av de cellöverlevnadsmekanismer Anastasis, och potentiella läkemedel till svårbehandlade sjukdomar genom att modulera Anastasis.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Vi tackar Rev. Dr Ralph Bohlmann och Rev. Dr James Voelz för tyder ordet "Anastasis" för att beskriva återföring av apoptos; Douglas R. Grön för HeLa-celler stabilt uttrycker cytokrom c -GFP; Charles M. Rudin och Eric E. Gardner för H446-celler; Heather Lamb om bistånd i tecknad ritning på videon; Yee Hui Yeo för värdefulla diskussion om detta manuskript. Detta arbete stöddes av en Sir Edward Youde Memorial Fellowship (HLT), Dr Walter Szeto Memorial Scholarship (HLT), Fulbright bidrag 007-2009 (HLT), Life Science Research Foundation gemenskap (HLT), beviljar NIH NS037402 (JMH) och NS083373 (JMH) och University Grants kommitté Hongkong AoE / B-07/99 (MCF). Ho Lam Tang är en Shurl och Kay Curci Foundation Fellow i Life Sciences Research Foundation.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
LSM780 confocal microscopy Carl Zeiss
Glass bottom culture dish MatTek Corporation P35G-0-14-C
Transparent CultFoi Carl Zeiss 000000-1116-084
CO2 independent medium Life Technologies 18045-088
CellTracker Life Technologies C34552
Mitotracker Red CMXRos Life Technologies M-7512
Hoechst 33342 Life Technologies H1399
Fluorescently labeled annexin V Biovision K201

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kerr, J. F., Wyllie, A. H., Currie, A. R. Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics. British Journal of Cancer. 26, 239-257 (1972).
  2. Riedl, S. J., Shi, Y. Molecular mechanisms of caspase regulation during apoptosis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 5, 897-907 (2004).
  3. Green, D. R., Kroemer, G. The pathophysiology of mitochondrial cell death. Science. 305, 626-629 (2004).
  4. Chipuk, J. E., Bouchier-Hayes, L., Green, D. R. Mitochondrial outer membrane permeabilization during apoptosis: the innocent bystander scenario. Cell Death and Differentiation. 13, 1396-1402 (2006).
  5. Kroemer, G., et al. Classification of cell death recommendations of the Nomenclature Committee on Cell Death 2009. Cell Death and Differentiation. 16, 3-11 (2009).
  6. Galluzzi, L., et al. Molecular definitions of cell death subroutines: recommendations of the Nomenclature Committee on Cell Death 2012. Cell Death and Differentiation. 19, 107-120 (2012).
  7. Holland, A. J., Cleveland, D. W. Chromoanagenesis and cancer: mechanisms and consequences of localized, complex chromosomal rearrangements. Nature Medicine. 18, 1630-1638 (2012).
  8. Reddien, P. W., Cameron, S., Horvitz, H. R. Phagocytosis promotes programmed cell death in C. elegans. Nature. 412, (2001).
  9. Hoeppner, D. J., Hengartner, M. O., Schnabel, R. Engulfment genes cooperate with ced-3 to promote cell death in Caenorhabditis elegans. Nature. 412, 202-206 (2001).
  10. Segawa, K., et al. Caspase-mediated cleavage of phospholipid flippase for apoptotic phosphatidylserine exposure. Science. 344, 1164-1168 (2014).
  11. Overholtzer, M., et al. A nonapoptotic cell death process, entosis, that occurs by cell-in-cell invasion. Cell. 131, 966-979 (2007).
  12. Tang, H. L., Yuen, K. L., Tang, H. M., Fung, M. C. Reversibility of apoptosis in cancer cells. British Journal of Cancer. 100, (2009).
  13. Tang, H. L., et al. Cell survival, DNA damage, and oncogenic transformation after a transient and reversible apoptotic response. Molecular Biology of the Cell. 23, 2240-2252 (2012).
  14. Hammill, A. K., Uhr, J. W., Scheuermann, R. H. Annexin V staining due to loss of membrane asymmetry can be reversible and precede commitment to apoptotic death. Experimental Cell Research. 251, (1999).
  15. Geske, F. J., Lieberman, R., Strange, R., Gerschenson, L. E. Early stages of p53-induced apoptosis are reversible. Cell Death and Differentiation. 8, 182-191 (2001).
  16. Jacobson, M. D., Weil, M., Raff, M. C. Programmed cell death in animal development. Cell. 88, 347-354 (1997).
  17. Hardwick, J. M., Cheng, W. C. Mitochondrial programmed cell death pathways in yeast. Developmental Cell. 7, 630-632 (2004).
  18. Frohlich, K. U., Fussi, H., Ruckenstuhl, C. Yeast apoptosis-from genes to pathways. Seminars in Cancer Biology. 17, 112-121 (2007).
  19. Fuchs, Y., Steller, H. Programmed cell death in animal development and disease. Cell. 147, 742-758 (2011).
  20. Taylor, R. C., Cullen, S. P., Martin, S. J. Apoptosis: controlled demolition at the cellular level. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 9, 231-241 (2008).
  21. Wang, X. The expanding role of mitochondria in apoptosis. Genes & Development. 15, 2922-2933 (2001).
  22. Galluzzi, L., Kepp, O., Kroemer, G. Mitochondria: master regulators of danger signalling. Nature Reviews Molecular Cell Biolog. 13, 780-788 (2012).
  23. Goldstein, J. C., Waterhouse, N. J., Juin, P., Evan, G. I., Green, D. R. The coordinate release of cytochrome c during apoptosis is rapid, complete and kinetically invariant. Nature Cell Biology. 2, 156-162 (2000).
  24. Goldstein, J. C., et al. Cytochrome c is released in a single step during apoptosis. Cell Death and Differentiation. 12, 453-462 (2005).
  25. Tyas, L., Brophy, V. A., Pope, A., Rivett, A. J., Tavare, J. M. Rapid caspase-3 activation during apoptosis revealed using fluorescence-resonance energy transfer. EMBO Reports. 1, 266-270 (2000).
  26. Takemoto, K., Nagai, T., Miyawaki, A., Miura, M. Spatio-temporal activation of caspase revealed by indicator that is insensitive to environmental effects. The Journal of Cell Biology. 160, 235-243 (2003).
  27. Albeck, J. G., et al. Quantitative analysis of pathways controlling extrinsic apoptosis in single cells. Molecular Cell. 30, 11-25 (2008).
  28. Luthi, A. U., Martin, S. J. The CASBAH: a searchable database of caspase substrates. Cell Death and Differentiation. 14, 641-650 (2007).
  29. Liu, X., Zou, H., Slaughter, C., Wang, X. DFF, a heterodimeric protein that functions downstream of caspase-3 to trigger DNA fragmentation during apoptosis. Cell. 89, 175-184 (1997).
  30. Enari, M., et al. A caspase-activated DNase that degrades DNA during apoptosis, and its inhibitor ICAD. Nature. 391, 43-50 (1998).
  31. Li, H., Zhu, H., Xu, C. J., Yuan, J. Cleavage of BID by caspase 8 mediates the mitochondrial damage in the Fas pathway of apoptosis. Cell. 94, 491-501 (1998).
  32. Slee, E. A., Keogh, S. A., Martin, S. J. Cleavage of BID during cytotoxic drug and UV radiation-induced apoptosis occurs downstream of the point of Bcl-2 action and is catalysed by caspase-3: a potential feedback loop for amplification of apoptosis-associated mitochondrial cytochrome c release. Cell Death and Differentiation. 7, 556-565 (2000).
  33. Suzuki, J., Denning, D. P., Imanishi, E., Horvitz, H. R., Nagata, S. Xk-related protein 8 and CED-8 promote phosphatidylserine exposure in apoptotic cells. Science. 341, 403-406 (2013).
  34. Kroemer, G., Martin, S. J. Caspase-independent cell death. Nature Medicine. 11, 725-730 (2005).
  35. Chipuk, J. E., Green, D. R. Do inducers of apoptosis trigger caspase-independent cell death. Nature Reviews Molecular Cell Biolog. 6, 268-275 (2005).
  36. Tait, S. W., Green, D. R. Mitochondria and cell death: outer membrane permeabilization and beyond. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11, 621-632 (2010).
  37. Claycomb, W. C., et al. HL-1 cells: a cardiac muscle cell line that contracts and retains phenotypic characteristics of the adult cardiomyocyte. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 2979-2984 (1998).
  38. Zhang, G., Gurtu, V., Kain, S. R., Yan, G. Early detection of apoptosis using a fluorescent conjugate of annexin V. BioTechniques. 23, 525-531 (1997).
  39. Fenech, M. Cytokinesis-block micronucleus cytome assay. Nature Protocols. 2, 1084-1104 (2007).
  40. Fenech, M., et al. Molecular mechanisms of micronucleus, nucleoplasmic bridge and nuclear bud formation in mammalian and human cells. Mutagenesis. 26, 125-132 (2011).
  41. Gordon, D. J., Resio, B., Pellman, D. Causes and consequences of aneuploidy in cancer. Nature Reviews Genetics. 13, (2012).
  42. Poreba, M., Strozyk, A., Salvesen, G. S., Drag, M. Caspase substrates and inhibitors. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5, a008680 (2013).
  43. Talanian, R. V., et al. Substrate specificities of caspase family proteases. The Journal of Biological Chemistry. 272, 9677-9682 (1997).
  44. Logue, S. E., Elgendy, M., Martin, S. J. Expression, purification and use of recombinant annexin V for the detection of apoptotic cells. Nature Protocols. 4, 1383-1395 (2009).
  45. Kenis, H., et al. Annexin A5 uptake in ischemic myocardium: demonstration of reversible phosphatidylserine externalization and feasibility of radionuclide imaging. Journal of Nuclear Medicine. 51, 259-267 (2010).
  46. Ruegg, U. T., Staurosporine Burgess, G. M. K-252 and UCN-01: potent but nonspecific inhibitors of protein kinases. Trends in Pharmacological Sciences. 10, 218-220 (1989).
  47. Bertrand, R., Solary, E., O'Connor, P., Kohn, K. W., Pommier, Y. Induction of a common pathway of apoptosis by staurosporine. Experimental Cell Research. 211, 314-321 (1994).
  48. Chae, H. J., et al. Molecular mechanism of staurosporine-induced apoptosis in osteoblasts. Pharmacological Research. 42, 373-381 (2000).
  49. Takemoto, K., et al. Local initiation of caspase activation in Drosophila salivary gland programmed cell death in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 13367-13372 (2007).
  50. Bardet, P. L., et al. A fluorescent reporter of caspase activity for live imaging. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 13901-13905 (2008).
  51. Florentin, A., Arama, E. Caspase levels and execution efficiencies determine the apoptotic potential of the cell. The Journal of Cell Biology. 196, 513-527 (2012).
  52. Chihara, T., et al. Caspase inhibition in select olfactory neurons restores innate attraction behavior in aged Drosophila. PLoS Genetics. 10, e1004437 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics