Stratégies pour le suivi Anastasis, une cellule de survie Phénomène qui renverse apoptose

Biology

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Tang, H. L., Tang, H. M., Hardwick, J. M., Fung, M. C. Strategies for Tracking Anastasis, A Cell Survival Phenomenon that Reverses Apoptosis. J. Vis. Exp. (96), e51964, doi:10.3791/51964 (2015).

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Abstract

Anastasis (grec pour «la hausse à la vie») fait référence à la récupération des cellules mourantes. Avant que ces cellules se rétablissent, ils sont passés par des points de contrôle importants de l'apoptose, y compris la fragmentation mitochondriale, la libération du cytochrome c mitochondrial dans le cytosol, l'activation des caspases, la condensation de la chromatine, des dommages de l'ADN, la fragmentation nucléaire, bourgeonnement de la membrane plasmique, le rétrécissement des cellules, l'exposition de la surface cellulaire de phosphatidylsérine, et la formation de corps apoptotiques. Anastasis peut se produire lorsque les stimuli apoptotiques sont retirés avant la mort, permettant ainsi cellules mourantes pour inverser l'apoptose et potentiellement d'autres mécanismes de mort. Par conséquent, Anastasis semble impliquer des processus physiologiques de guérison qui pourrait également soutenir les cellules endommagées de façon inappropriée. Les fonctions et les mécanismes de Anastasis sont pas encore claires, entravée en partie par les outils limités pour détecter les événements passés après la récupération des cellules apparemment en bonne santé. Stratégies pour détecter AnastaSIS permettra des études sur les mécanismes physiologiques, les dangers de cellules morts-vivants dans la pathologie de la maladie, et des thérapies potentielles pour moduler Anastasis. Ici, nous décrivons des stratégies efficaces en utilisant la microscopie de cellules vivantes et un biocapteur de caspase mammifère pour l'identification et le suivi Anastasis dans des cellules mammifères.

Introduction

Apoptose (grec pour «tomber à la mort") est généralement supposé être un processus à sens unique se terminant par suicide cellulaire 1-7. La perturbation génétique de gènes pro-mort conduit à la survie des cellules supplémentaires qui seraient autrement mourir dans des animaux entiers, y compris des cellules qui ont déjà ouvert la voie de 8,9 apoptose. De même, les manipulations génétiques permettent aux cellules de mammifères en bonne santé qui affichent artificiellement "Eat Me" signaux ou qui perdent leur adhérence à la matrice extracellulaire pour échapper à la mort par phagocytose de cellules entières ou entose respectivement 10,11. Cependant, nous et d'autres avons montré que, sans manipulation génétique des cellules de mammifères sains et de lignées cellulaires peuvent également récupérer dès les premiers stades de l'apoptose 12-15. Utilisation d'outils pour suivre des cellules individuelles, nous avons encore démontré la récupération de stades tardifs de l'apoptose 12,13, après que les cellules ont passé les postes de contrôle important que typiqueLy marquer le «point de non-retour" 2-6. Ces points de contrôle de l'apoptose au stade avancé comprennent la libération du cytochrome c mitochondrial, l'activation des caspases, la fragmentation nucléaire, et la formation de corps apoptotiques. Nous avons adopté un mot composé grec "Anastasis", qui signifie "la hausse à la vie", pour décrire ce renversement de l'apoptose au bord de la mort cellulaire 2-6.

Sauf tout le processus de recouvrement des mourants est observé par imagerie des cellules vivantes, il est difficile de distinguer les cellules qui ont subi Anastasis partir de cellules qui ne ont jamais connu les événements apoptotiques. Des décennies de travail ont révélé que les caractéristiques morphologiques de suicide cellulaire par apoptose sont entraînés par des événements biochimiques et moléculaires évolutives conservées 16-19. Ces événements favorisent l'auto-destruction des cellules pour réguler les processus de développement et homéostatiques dans les organismes unicellulaires et multicellulaires en éliminant endommagé ou dcellules angerous 16-19. Alors que les cellules apoptotiques peuvent être facilement distingués par des manifestations morphologiques, biochimiques et moléculaires de l'apoptose 1,5,6,16,20 standardisés, il ne existe actuellement aucun marqueur spécifique connue Anastasis 12,13. Fait important, les cellules qui ont subi anastasis semblent être les cellules saines normales et des cellules qui commencent juste inverser l'apoptose des cellules mourantes apparaître comme apoptotiques 12,13. Ainsi, de nouveaux outils sont nécessaires pour conclure avec certitude qu'une cellule donnée survivant avait déjà connu des processus apoptotiques actifs.

L'apoptose est généralement admis comme une cascade irréversible parce que ce est un processus de destruction rapide et massive. Bien qu'il pourrait prendre quelques minutes à quelques jours pour certaines cellules pour initier l'apoptose, une fois mitochondries ont publié facteurs tels que apoptogènes cytochrome c dans le cytosol 21,22, caspases peuvent être activées dans les 5 minutes 23,24, suivis par cytoplasmique etcondensation nucléaire dans les 10 minutes de 25 à 27, et la mort cellulaire peu après 25-27. Les caspases activées orchestrent l'apoptose par clivage et en inactivant des composants structuraux et fonctionnels clés dans le but de démolition 2,28 cellulaire, tel que l'inhibiteur d'endonucléase DFF45 / CISD 29,30. Caspases activent également des facteurs pro-apoptotiques, comme famille Bcl-2 BID membre, qui translocation vers les mitochondries pour favoriser la libération du cytochrome c mitochondrial 31,32. l'activité de la caspase résulte également dans la cellule exposition de la surface de la phosphatidylsérine comme un signal "me manger" pour la promotion de l'engloutissement de mourir cellules par les macrophages ou les cellules voisines par phagocytose 33. En outre, les événements apoptotiques rendent la dysfonction mitochondriale, perturbant bioénergétique cellulaire et métabolisme 34,35,36. Ainsi, la récupération de cette destruction semble intuitivement peu probable.

Contrairement à l'original se attendretions, les cellules peuvent inverser le processus de mort cellulaire par apoptose, même à un stade tardif. En surveillant en permanence le sort de mourir des cellules en culture, nous avons observé la réversibilité de l'apoptose de stade tardif dans une plage de cellules primaires et des lignées cellulaires 12,13. L'élimination du stimulus de mort a permis la récupération des éléments visibles de l'apoptose, telles que fragmentation mitochondriale, de la condensation de la chromatine, des dommages de l'ADN, le plasma membrane bourgeonnement, l'exposition de la surface cellulaire de la phosphatidylsérine, la libération du cytochrome c mitochondrial, l'activation des caspases, la fragmentation nucléaire, rétrécissement des cellules, et la formation de corps apoptotiques. Ces observations soulèvent des questions sans réponses concernant les fonctions, les conséquences et les mécanismes de Anastasis. Pour répondre à ces questions, une condition préalable est d'identifier de manière fiable des cellules qui ont subi Anastasis. Ici, nous décrivons des méthodes de microscopie vivants et un biocapteur de caspase pour détecter des cellules qui ont déjà inversé apoptose et e de stade tardifen survécu.

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Protocol

1. Préparation des cellules pour imagerie de cellules vivantes

  1. Pour faciliter la détection des changements morphologiques, pour choisir des cellules adhérentes telles que HeLa (carcinome cervical humain) des cellules qui sont à plat sur le substrat afin de mieux visualiser l'altération de la membrane plasmique et les organites intracellulaires.
    Note: Inversion de l'apoptose a été observée dans diverses cellules de mammifères 12,13, y compris les cellules hépatiques de souris primaire, des macrophages de souris primaires, les cardiomyocytes primaires de rat, et de la cellule aussi des lignes telles que des cellules HEK-293T humaines de rein embryonnaire, singe vert COS épithéliales rénales africains -7 cellules, de muscle cardiaque de souris NS-1 des cellules, des fibroblastes de souris NIH 3T3, le furet (Mustela putoris furo) des cellules du cerveau CRL1656, les cellules A375 de cancer de la peau humaine, des cellules CRL1973 du cancer testiculaire humaine, les petites cellules H446 de carcinome du poumon à grandes cellules humaines, le cancer du foie humain cellules HepG2, les cellules MCF7 du cancer du sein humain, des cellules PC3 de cancer de la prostate et des cellules humaines SH-SY5Y de neuroblastome humain.
  2. Pré-lavage des lamelles de verre de verre des boîtes de culture cellulaire bas avec de l'éthanol absolu pour le nettoyage et la stérilisation.
    Note 1: utilisation de plats à fond de verre est recommandé pour la haute qualité contraste d'interférence différentiel (DIC) microscopie et haute confocale d'agrandissement ou la microscopie épi-fluorescence (voir la discussion).
    Note 2: Pour des grossissements élevés (40X, 60 / 63X ou 100X objectifs et des ouvertures numériques élevées 1,3 ou 1,4), l'utilisation de boîtes de culture cellulaire à fond de verre plus mince (épaisseur 0,085 à 0,16 mm) fournit de plus longues distances pour l'imagerie de travail (voir Protocole 3 ).
  3. Selon le type cellulaire, plats en verre de culture sur le fond peuvent nécessiter revêtement de poly-D-lysine (0,1 mg / ml), du collagène (solution à 0,01% dans 0,01 M d'acide acétique) et / ou de la fibronectine (5 ug / ml) avant l'ensemencement cellules.
    Note: Optimisation de la nature et la concentration de l'agent de revêtement est nécessaire pour différentes lignées cellulaires. Cellules HeLa peuvent adhérer directement sur verre sans revêtement. Cependant, certaines cellules, such comme souris muscle cardiaque HL-1 cellules, ne peuvent pas adhérer directement à des surfaces de verre, mais exiger des protocoles de culture et de revêtement spécifiques 37.
  4. Graine ~ 2-3 x 10 5 cellules de verre pré-enduit des boîtes de culture de cellules de 35 mm en bas et incuber à 37 degrés Celsius (° C) avec 5% de CO 2 pendant une journée pour atteindre 80% de confluence.
    Note 1: Les conditions optimales de la densité cellulaire, le temps d'incubation, et des conditions de culture peut varier en fonction du type de cellule. Cellule confluence peut affecter la réponse apoptotique des cellules (Voir Protocole 2). A forte confluence, les cellules pourraient être moins sensibles aux mêmes concentrations de stimuli apoptotiques.
    Note 2: Évitez de trop cellules confluentes, que la densité cellulaire élevée peut masquer des changements morphologiques des cellules individuelles et de leurs organites.

2. Application et suppression des cellules apoptotiques stimuli

  1. Peu de temps avant utilisation, de pré-mélanger l'agent inducteur d'apoptose à 37 ° C du milieu de culture cellulaire. De l'éthanol (03/06 à 04/05% Vol / vol) a servi comme inducteur de l'apoptose dans la présente manifestation.
    Note 1: Nos données publiées et non publiées démontrent que les cellules peuvent également inverser l'apoptose qui est déclenchée par d'autres stimuli 12,13 apoptotique, tel que le diméthylsulfoxyde (DMSO, 8% vol / vol pendant 24 heures), la staurosporine (STS, 0,5 uM pour 1 h), et le taxol (1 pM pendant 12 h). L'optimisation de la dose pour le déclenchement de l'apoptose est requis pour différents types de cellules pour atteindre la dose minimum qui peut déclencher la majorité des cellules dans la population à subir une apoptose.
    Note 2: Le pré-mélange des agents induisant l'apoptose par du milieu de culture cellulaire est important d'éviter l'exposition non uniforme des cellules à des stimuli apoptotiques.
  2. Image un groupe de cellules de la santé dans la boîte de culture cellulaire avant d'appliquer l'agent inducteur d'apoptose pour établir morphologies de base.
  3. Retirez le support original de la boîte de culture cellulaire, et ensuite appliquer 2 ml de prémélange agent induisant l'apoptose dans le plat àdéclencher les cellules à subir une apoptose. Incuber les cellules à 37 ° C avec 5% de CO 2 (ou d'autres conditions de culture normales).
  4. Après incubation, observer les cellules par la lumière, épi-fluorescence ou microscopie confocale à surveiller la progression de caractéristiques apoptotiques.
    Note 1: Les cellules en apoptose afficheront caractéristiques morphologiques, biochimiques et moléculaires de l'apoptose qui peut être détecté par microscopie et biocapteurs basés sur la fluorescence (voir Protocoles 3 et 4).
    Note 2: Le temps d'incubation des cellules avec différents inducteurs d'apoptose peut varier, selon le type de cellule, les conditions cellulaires (tels que des nutriments et de l'état de confluence), et la dose de stimulus appliqué mort. Titration prudente peut être nécessaire.
  5. Lorsque les cellules présentent des caractéristiques de l'apoptose, éliminer l'agent induisant l'apoptose par lavage des cellules une fois avec chaude (37 ° C, ou une autre température de culture normale) milieu de culture cellulaire frais.
    Note 1: Comme les cellules apoptotiques sont plus mal fixés surla plaque de culture, il est important d'appliquer et d'éliminer le milieu doucement afin que les cellules ne seront pas emportés.
    Note 2: Les cellules vivantes en suspension peuvent être récupérés à partir du surnageant par centrifugation douce (160 g pendant 1 min) et rajoutés à la boîte de culture.
  6. Incuber les cellules à 37 ° C avec 2 ml / boîte de 35 mm de milieu de culture de cellules fraîches dans 5% de CO2. En variante, l'utilisation de milieu conditionné (milieu de culture exempt de cellules recueillies à partir de cellules saines) pour améliorer encore la survie des cellules apoptotiques.
    Remarque: Le lavage et l'incubation de cellules avec du milieu frais permettent la majorité des cellules à inverser l'apoptose induite par l'éthanol après exposition à l'éthanol 12,13. Cependant, en répétant cette étape de lavage peut être nécessaire lorsque les cellules sont exposées à d'autres stimuli apoptotiques (voir la discussion).

3. cellules vivantes Microscopie

  1. Nous vous recommandons d'utiliser un confocale ou épi-fluorescence microscope inversé avec contrôle de l'environnement (37 ° C,5% de CO 2) pour la microscopie de cellules vivantes.
    Remarque: Il est également possible à l'image des cellules en utilisant les microscopes droits avec un objectif à immersion. Tremper l'objectif directement dans le milieu de culture de cellules d'image. Cependant, les cellules peuvent être écrasés par l'objectif de focalisation au cours de l'immersion.
  2. Pré-réchauffer le microscope (tels que chambre de contrôle de l'environnement, l'étape d'incubation, et l'élément chauffant objectif) au moins 2 heures avant l'imagerie.
    Note: Ceci permet aux composants de microscope pour atteindre thermo-équilibre, de façon à pouvoir éviter la dérive du décalage de mise au point et le plan xy du fait de la dilatation et la contraction thermiques des composants.
  3. Placez un 35 mm verre plat bas de cellules cultivées (Voir Protocole 1) sur la scène d'un microscope inversé et capturer des images de cellules en utilisant un objectif 40X ou 63X Plan-Apochromat avec une ouverture numérique (NA) 1.3 ou 1.4 pour l'imagerie de cellules à partir de la fond de la boîte par l'intermédiaire des lamelles de verre.
    Remarque: Évitez d'appliquer plus de 2 ml de milieu35 mm à fond plat en verre, selon le poids du milieu peut provoquer une courbure du fond de verre, ce qui rend difficile pour un champ d'image de cellules dans le même plan focal.
  4. Maintenir les cellules à 37 ° C ou la température normale correspondante pendant le processus d'imagerie.
    Remarque: Le processus de l'apoptose, et probablement le renversement de l'apoptose, dépend de la température activités enzymatiques sensibles. Par conséquent, le maintien des cellules à 37 ° C (par exemple avec une platine de microscope en haut de l'incubateur) est important tout au long de l'expérience. Diminution de la température pourrait ralentir la réponse apoptotique et la réponse de récupération après le retrait des mesures de relance apoptotique.
  5. Utiliser un dispositif d'humidité ou de porter une feuille transparente (Voir Matériaux) sur la boîte de culture pour réduire la perte d'eau par évaporation du milieu.
    Remarque: la feuille pourrait perturber la polarité de la lumière pour microscopie DIC. Restaurer la polarité en ajustant le polariseur à la trajectoire de la lumière.
  6. Maintenir le pH dans lamilieu de culture cellulaire (pH 6,8 -7,3) par incubation dans 5% de CO 2 avec une chambre de contrôle de l'environnement sur ​​le microscope.
    Remarque: Maintien du pH dans le milieu de culture peut également être réalisée par addition de tampon HEPES, ou à l'aide de CO 2 -indépendante milieu commercial (Voir Matériaux). Les conditions optimales peuvent varier en fonction du type de cellule.
  7. Réduire la fluorescence / laser (d'intensité lumineuse d'excitation) exposition aux cellules pendant le processus d'imagerie pour éviter phototoxicité en réduisant l'intensité de fluorescence à la plus faible nécessaire pour obtenir des images de haute qualité de cellules / structures sous-cellulaires ou biocapteurs exprimées (Détails du protocole 4).

4. Stratégies pour détecter et suivre Anastasis pendant et après apoptotiques Evénements

  1. Plasma bourgeonnement de la membrane, une condensation cytoplasmique, rétrécissement des cellules et la formation de corps apoptotiques (voir les figures 1A - C, E).
    1. Effectuer time-lapse diffé de cellules vivantesrentiel contraste d'interférence (DIC) ou microscopie à contraste de phase de suivre un groupe de cellules de santé et d'observer leur morphologie cellulaire (Voir le protocole 3 pour la microscopie de cellules vivantes, et de voir Discussion).
      Note 1: Réduire l'intensité de la source lumineuse pour le contrat imagerie DIC / de phase pour éviter phototoxicité aux cellules.
      Note 2: Si DIC et microscopie à contraste de phase ne sont pas disponibles, utilisez CellTracker pour colorer le cytosol de décrire la morphologie des cellules vivantes pour la microscopie confocale ou épi-fluorescence et surveiller la morphologie cellulaire.
    2. Appliquer la mort cellulaire stimulus pour déclencher cellules à l'apoptose (Voir protocole n ° 2 pour l'application et l'élimination des stimuli apoptotiques).
    3. Respecter les cellules traitées pour caractéristiques morphologiques de l'apoptose tels que le bourgeonnement de la membrane plasmatique, la condensation cytoplasmique, rétrécissement des cellules et la formation de corps apoptotiques (figures 1A, 1B, 1C, 1E).
    4. Laver stimuli de mort, et les cellules de ravitaillement avec du milieu frais lorsque les cellules displacaractéristiques morphologiques y de l'apoptose.
      Note 1: Appliquer la mort cellulaire stimulus ou en changeant le milieu de culture cellulaire sur la platine du microscope au cours de time-lapse imagerie des cellules vivantes peut être réalisé en utilisant une chambre de culture de cellules de perfusion, ou peut être réalisée directement sur la boîte de culture cellulaire en soigneusement pipetage sans toucher le plat, pendant les intervalles entre les images.
      Note 2: Utilisez les systèmes accent de compensation de la dérive pour éviter de mise au point des cellules en raison de la perte de thermo-équilibre du système de microscope après avoir changé le milieu de culture cellulaire (voir la discussion).
    5. Continue imagerie time-lapse de suivre le destin des cellules qui affichent caractéristiques de l'apoptose. Les cellules que l'apoptose inverse peut réparer les dommages et de retrouver la morphologie normale plat (Figures 1A, 1B, 1C, 1E).
  2. La fragmentation mitochondriale, ADN / condensation de la chromatine et la fragmentation nucléaire (Voir les figures 1D, 1F, 1G).
    1. Pour visualiser mitochondria, cellules tache avec 50 nM MitoTracker rouge profond colorant / rouge / vert fluorescent, et simultanément colorent le noyau avec 10 pg / ml de colorant Hoechst 33342 nucléaire bleu dans un milieu de culture pour 20 min à 37 ° C avec 5% de CO 2.
      Note 1: Réduire la concentration de colorants et de durée d'incubation pour éviter la cytotoxicité et de réduire la fluorescence de fond lorsque le besoin. Optimiser les conditions de coloration pour obtenir un bon rapport signal sur bruit avec la quantité minimale de colorant et la durée d'incubation pour la coloration.
      Note 2: Utilisez colorants fluorescents pour les mitochondries tels que MitoTracker Rouge CMXRos, MitoTracker Deep Red FM ou MitoTracker vert FM, qui ne fuit pas des mitochondries cours de l'apoptose. Ceci permet la visualisation de la morphologie des mitochondries pendant l'apoptose et anastasis. Voir les matériaux et tableau des équipements pour plus de détails au sujet de ces taches.
    2. Gardez cellules colorées dans l'obscurité pour éviter photoblanchiment.
    3. Retirer l'excès de colorant par lavage des cellulesTrois fois avec de 37 ° C tampon phosphate saline (PBS) ou du milieu de culture cellulaire frais, avec une min d'incubation dans le milieu frais entre chaque lavage, puis incuber en outre dans le milieu frais pendant 20 minutes avant le lavage final à permettre excessive les taches de sortir des cellules pour réduire arrière-plan du signal non-spécifique pour l'imagerie.
      Remarque: Raccourcir les temps d'incubation avec du milieu cellulaire après coloration peut entraîner une forte arrière-plan pour l'imagerie.
    4. Effectuer en temps réel confocale de cellules vivantes ou la microscopie épi-fluorescence pour les cellules saines de l'image avant l'induction apoptotique est appliquée (Voir le protocole 3 pour la microscopie de cellules vivantes).
      Remarque: Les cellules saines présentent des mitochondries et des noyaux tubulaires ronds dans la plupart des types de cellules (figures 1D, 1F, 1G).
    5. Déclencher cellules à l'apoptose (Voir protocole n ° 2 pour l'application et l'élimination des stimuli apoptotiques dans les cellules).
    6. Continuer time-lapse microscopie de cellules vivantes pour observer des modifications dans morpholog mitochondrial et nucléaireies immédiatement après le stimulus est appliqué à la mort des cellules. Respecter les cellules affichant caractéristiques de l'apoptose mitochondriale tels que la fragmentation et le gonflement, la condensation de la chromatine et la fragmentation nucléaire, contrairement aux cellules saines présentant des mitochondries et des noyaux tubulaires ronds.
    7. Lorsque les cellules affichent caractéristiques de l'apoptose, laver et fournir les cellules avec du milieu frais, et continuer imagerie time-lapse de suivre le destin des cellules. Les cellules que l'apoptose mitochondriale inversent retrouver normale et de la morphologie nucléaire (figures 1D, 1F, 1G).
      Remarque: effectuer DIC microscopie en parallèle lorsque ce est possible d'obtenir des informations supplémentaires pour accéder aux étages de l'apoptose en observant les modifications de la morphologie des cellules dans le même groupe de cellules (voir Protocole 4,1 pour microscopie DIC).
  3. Détection de la libération du cytochrome c mitochondrial utilisant des cellules exprimant de manière stable un cytochrome c pr fusion GFPotein (voir figure 2).
    1. cellules exprimant de façon stable taches cytochrome c GFP avec 23,24 MitoTracker Rouge d'étiqueter les mitochondries des cellules polarisées (voir les étapes 4.2.1 à 4.2.3 pour vivre cellules mitochondries coloration).
    2. Effectuer en temps réel confocale de cellules vivantes ou épi-microscopie à fluorescence pour suivre les cellules saines (Détails dans le protocole no 3 pour l'imagerie de cellules vivantes).
      Remarque: Le signal de GFP cytochrome c se localise principalement dans les mitochondries des cellules saines (figures 2A i, 2B).
    3. Déclencher cellules à l'apoptose (Voir protocole n ° 2 pour l'application et l'élimination des stimuli apoptotiques dans les cellules). Continuer Vidéomicroscopie d'observer translocation du cytochrome c GFP des mitochondries vers le cytosol (figures 2aii-iii, 2B).
      Remarque: la libération du cytochrome c mitochondrial dans le cytosol est un marqueur de mitochondrial perméabilisation de la membrane externe (MOMP)4, une étape critique dans les mitochondries apoptose dépendante 21,22
    4. Lorsque les cellules affichent le signal de GFP du cytochrome c dans le cytoplasme, retirer le stimulus de la mort cellulaire, et les cellules d'alimentation avec du milieu frais (Voir protocole n ° 2). Continuer imagerie time-lapse de suivre le destin des cellules avec GFP cytosolique.
      Note: Les cellules que l'apoptose inversent retrouver morphologie cellulaire normale, et réduire leur signal de GFP du cytochrome c cytosolique probablement par la dégradation ou la translocation retour aux mitochondries (figures 2Aiv-vii, 2B).
    5. Capturer des images DIC en parallèle pour obtenir des informations supplémentaires pour accéder aux étages de l'apoptose par l'observation des modifications de la morphologie cellulaire dans des cellules ou groupes de cellules individuelles (Voir 4.1 Protocole pour la microscopie DIC).
  4. Détection de l'activité de la caspase en utilisant un biocapteur de caspase (voir la figure 3)
    1. transfecter des cellules avec le caspase biocapteurs NES-DEVD-YFP-NLS pour16-24 h avant de les soumettre à un stimulus apoptotique 13.
    2. Colorer les cultures transfectées avec Hoechst 33342 pour marquer les noyaux des cellules (voir les étapes 4.2.1 à 4.2.3 pour la coloration nucléaire des cellules vivantes).
    3. Effectuer en temps réel confocale de cellules vivantes ou épi-microscopie à fluorescence pour suivre les cellules saines (Détails dans le protocole no 3 pour l'imagerie de cellules vivantes).
      Remarque: Le signal de biocapteur NES-DEVD-YFP-NLS localise principalement dans le cytosol des cellules saines en raison de son signal d'export nucléaire (NES) (figures 3A, 3BI et 3C, voir la discussion).
    4. Déclencher cellules à l'apoptose (Voir protocole n ° 2 pour l'application et l'élimination des stimuli apoptotiques dans les cellules). Continuer Vidéomicroscopie d'observer la translocation nucléaire de la YFP.
      Remarque: L'activation des caspases clive le motif dans la caspase DEVD biocapteurs NES-DEVD-YFP-NLS, résultant en YFP-NLS translocation du cytosol vers le noyau (figures 3A, 3Bii-iv, voir la discussion).
    5. Remarque: Les cellules qui inversent l'apoptose retrouver la morphologie cellulaire normale, mais conservent le signal YFP nucléaire (figures 3Bv-x, les cellules 1 et 2, et 3D).
    6. Continuer imagerie time-lapse de suivre le destin des cellules qui affichent YFP nucléaire.
      Remarque: Le signal YFP nucléaire deviendra dégradées plusieurs heures après que les cellules ont inversé l'apoptose (figures 3B, vi-x, Cell 1, Résultats et discussion) vraisemblablement par le biais des mécanismes de clairance des cellules normales telles que la dégradation du protéasome.
    7. Capturer des images DIC en parallèle pour obtenir des informations supplémentaires pour accéder aux étages de l'apoptose par l'observation des modifications de la morphologie cellulaire dans des cellules individuelles ou d'un groupe de cellules. (Voir le protocole 4.1 pour microscopie DIC).
  5. l'exposition de la surface cellulaire de la phosphatidylsérine (voir Figure 4)
    1. cellules de semences sur glass lamelles de d'atteindre 80% de confluence cellulaire (Voir Protocole 1).
    2. Co-tache les cellules avec MitoTracker rouge et bleu fluorescent Hoechst 33342 tache pendant les mitochondries et les noyaux, respectivement (voir les étapes 4.2.1 à 4.2.3 pour mitochondriale des cellules vivantes et de coloration nucléaire).
    3. Déclencher cellules à l'apoptose en utilisant un inducteur d'apoptose (Voir protocole n ° 2).
    4. Appliquer à marquage fluorescent à l'annexine V (Voir Matériaux) pour colorer les cellules apoptotiques 10 min à 37 ° C avant le retrait de l'inducteur de l'apoptose pour détecter l'exposition de la phosphatidylsérine sur la surface des cellules apoptotiques.
      Note 1: saine cellules ne sont pas colorées avec l'annexine V parce phosphatidylsérine est normalement séquestré sur le centre-feuillet de la membrane plasmique de la cellule 38. Les cellules apoptotiques sont colorées avec l'annexine V, qui se lie à la phosphatidylsérine sur la surface cellulaire (figures 4A et 4B).
      Note 2: marquage fluorescent à l'annexine V peut aussi être appliquée pour colorer les cellules apoptotiques immédiatement après le retrait de l'inducteur de l'apoptose, avec 10 minutes d'incubation.
    5. Retirer la mort cellulaire stimulus, laver les cellules colorées avec du PBS chaud ou milieu frais une fois, puis fournir les cellules avec du milieu frais pendant 2 heures à 37 ° C avec 5% de CO 2 (Voir Protocole 2).
      Note 1: Les cellules qui inversée apoptose retrouver morphologie normale et retenir marqué par fluorescence signal de V annexine après avoir retrouvé une morphologie normale (figures 4A et 4B).
      Note 2: Le signal annexine V diminue avec le temps sur les cellules récupérées (voir la discussion).
    6. Fixer les cellules à des moments choisis avec 4% de paraformaldehyde contenant 8% de saccharose dans 1x PBS pendant 20 minutes dans l'obscurité à la température ambiante, et laver les cellules fixées avec du PBS pour trois fois pour éliminer paraformaldehyde avant que les cellules de montage sur des lames de verre lamelles de avec antifade milieu de montage (Voir Matériaux) pour la microscopie confocale ou épi-fluorescence et observer annexine V sur les cellules après l'enlèvement de l'apoptose inducteur.
      Note 1: Le saccharose dans un fixateur préserve la structure de la membrane cellulaire lors de la fixation.
      Note 2: Conserver la solution de paraformaldéhyde dans l'obscurité à 4 ° C pour éviter la dégradation.
      Note 3: Warm up solution de paraformaldéhyde à la température ambiante avant de l'appliquer aux cellules pour la fixation pour éviter un choc froid pour les cellules.

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Representative Results

Pour étudier l'inversion de l'apoptose, des cellules de culture tissulaire sont d'abord exposés à un stimulus de mort pour déclencher l'apoptose. Lorsque les cellules affichent caractéristiques de l'apoptose, milieu de culture frais est ensuite appliqué à laver le stimulus et ensuite incuber les cellules mourantes pour permettre la récupération (figure 1A). Ici, la question clé étant adressée est de savoir jusqu'où cellules cultivées meurent individuels peuvent progresser vers l'apoptose et encore subir Anastasis. Cette question peut être répondue définitivement par un contrôle continu avec biomarqueurs pour suivre le destin des cellules en utilisant les méthodes décrites ci-dessous.

Nous décrivons d'abord les stratégies visant à détecter l'inversion de l'apoptose dans des cellules de culture tissulaire en utilisant des time-lapse microscopie de cellules vivantes, qui est nécessaire pour le suivi et l'enregistrement de la réponse de cellules individuelles avant, pendant et après l'exposition à un stimulus 12,13 apoptotique. Cellules adhérentes santé répartis sur leur substrat fixé (Figure 1bi) 12,13, et affiché mitochondries filamenteuses et des noyaux ronds avant le traitement (figures 1Ci, Di, Ei, Fi, Gi) 12,13. Après exposition à l'éthanol 3.8 à 4.5% dans le milieu de culture cellulaire (vol / vol), DIC ou microscopie à contraste de phase ont révélé que les cellules exposées caractéristiques morphologiques de l'apoptose, y compris condensation cytoplasmique, la membrane plasmique bourgeonnement, et le rétrécissement des cellules (Figures 1Bii, 1Cii- iii et vi-1Eii) 12,13. Apoptotique formation de corps par les mêmes cellules a été facilement observé par DIC (figures 1Eii-vi). La fragmentation des mitochondries MitoTracker marqués (chiffres 1Dii-iii, 1Fii-vi) 12,13 ainsi que la condensation de l'ADN nucléaire Hoechst teinté (figures 1Dii-iii, Fii-iii, GII) 12,13, et la fragmentation des noyaux (Figuemesu- 1Evi et FVI, flèches blanches), ont été détectés simultanément par microscopie confocale ou épi-fluorescence. Les cellules qui réussi à inverser l'apoptose ont ensuite été observées pour retrouver morphologie normale, apparemment la réparation de leur dommage (figures 1Biii, C et Div-vi, E et FVII-xii, et Giii) 12,13. Les cellules dans ces conditions avaient également été montré pour retrouver la motilité organite, la migration cellulaire et endocytose fonctionnelle basée sur l'absorption de la fluorescence d'émission de points quantiques et la division cellulaire 13. Fait intéressant, certaines cellules que l'apoptose vénéré visualisée morphologie irrégulière nucléaire (Figure 1Fxii), ainsi que la division cellulaire anormale et la formation de micronoyaux (figures 1Giv-vii) 13, qui est un biomarqueur de lésions de l'ADN, cassures chromosomiques et la perte de chromosome entier dans les cellules en division 39, 40. C déplacéeshromosomes ou des fragments de chromosomes extérieur ne parviennent pas à être inclus dans les noyaux des cellules sont entourées par fille membrane nucléaire 39, 40. Ainsi, une conséquence de Anastasis pourrait être l'hébergement de génomes qui ont été endommagés lors de l'apoptose avorté, conduisant à la tumorigenèse et la progression du cancer. La présence de micronoyaux est également fréquent dans les cellules cancéreuses 40,41.

Libération de cytochrome c mitochondrial est une étape essentielle à la médiation ou d'amplifier la caspase-dépendant apoptose 20-22. En utilisant des cellules HeLa qui expriment de manière stable GFP-étiqueté cytochrome c, nous avons surveillé la relocalisation subcellulaire de cytochrome c au cours de l'apoptose et anastasis par microscopie confocale. Tel que rapporté 23,24, cytochrome c GFP localisée aux mitochondries avant le traitement (figures 2Ai et B), mais a été libéré dans le cytosol après une relance de mort a été appliquée (figures 2aii,2Aiii et B). D'autres morphologies caractéristiques tels que la fragmentation mitochondriale et bourgeonnement de la membrane plasmique, ont également été observées dans les cellules qui avaient libéré cytochrome c-GFP (figure 2Aiii). Ces cellules ont été signalés à subir la mort cellulaire peu après la libération de cytochrome c 23-27. Cependant, après le retrait du stimulus de la mort, nous avons observé que les niveaux c de GFP du cytochrome cytosolique ont diminué, les mitochondries retrouvé structures filamenteuses, et la membrane de plasma récupéré une apparence normale (figures 2Aiv-vii, et B). Par conséquent, les cellules apoptotiques peuvent subir Anastasis après la libération du cytochrome c mitochondrial.

Amplification des caspases de DEVD clivage en aval est généralement supposé être le «point de non-retour" dans l'apoptose 2,5. Par conséquent, nous avons utilisé une caspase biocapteur NES-DEVD-YFP-NLS exprEssed partir d'un plasmide 13, ce qui rend possible la détection de cellules survivantes qui ont déjà eu activité de la caspase (figure 3A). Ce biocapteur de caspase est un polypeptide avec un signal N-terminal exclusion nucléaire (NES), un segment de liaison avec la caspase-3/7 consensus site de clivage (DEVD) 26,42,43, suivi par une protéine fluorescente jaune (YFP) et une signal de localisation nucléaire C-terminal (NLS). Dans les cellules saines, ce biocapteur localise principalement dans le cytosol en fonction de la NES (figures 3BI, Ci-IV, et D) 13. Au cours de l'apoptose, les caspases activées clivent le motif DEVD, libérant YFP-NLS, qui subit une translocation efficace du cytosol vers le noyau dans des cellules qui simultanément ou par la suite, présentent d'autres caractéristiques de l'apoptose telles que l'ADN / condensation de la chromatine et le rétrécissement des cellules (Figures 3B ii -IV, et D) 13. Ainsi, laCells SE conservent la fonction d'import nucléaire suite à l'activation de la caspase. Après élimination de l'inducteur d'apoptose, les cellules qui subissent affichage anastasis récupération morphologique, même après l'activation des caspases est produite (figures 3Bv-x, et D) 13, apparemment inverser l'apoptose de stade tardif. Lors de la récupération de la morphologie normale, le signal YFP nucléaire diminue en intensité dans certaines cellules quand ils commencent à inverser l'apoptose après élimination du stimulus de mort (figures 3Bv-x, Cell 1) 13, ce qui suggère que les cellules se dégradent le biocapteur de la caspase-clivé, éventuellement par le même mécanisme utilisé pour supprimer les autres produits de la caspase-clivée pendant et après Anastasis.

Anastasis peut également être détectée sans microscopie de cellules vivantes. Ceci peut être réalisé en utilisant l'annexine V marquée par fluorescence 38,44, qui se lie marques et extériorisés phosphatidylsérine (PS) à une étape précoce de l'apoptose ( (figure 4B) 13, tel que la phosphatidylsérine est limitée à le feuillet interne de la membrane plasmique des cellules saines 38. En revanche, les cellules mourantes apoptotiques induites par l'éthanol exposent la phosphatidylsérine sur la surface cellulaire (figure 4B) 13 et, par conséquent, peuvent être marqués avec l'annexine V 38,44 fluorescent. Sensiblement, des cellules annexine V marquée peut retrouver une morphologie normale après élimination des stimuli de mort, ce qui suggère que les cardiomyocytes primaires ont inversé l'apoptose (figure 4B) 13. D'autres ont déjà appliqué une stratégie similaire à suggérer que la récupération de l'apoptose peut se produire in vivo. Dans un modèle in vivo d'une lésion ischémique transitoire, dépend de la caspase-annexine V étiquetage de cardiomyocytes dans des lapins et des souris semble reconsultés dans l'internalisation de l'annexine V par les cellules survivant après une ischémie transitoire 45, suggérant que anastasis pourrait se produire dans les animaux vivants. En outre, deux autres études ont utilisé tri pour identifier une fraction d'annexine BCL de souris V marqué une .3B3 des cellules de lymphome B (exposées à des anticorps anti-immunoglobuline qui induisent l'apoptose dans BCL une .3B3) et le carcinome mammaire de la souris cellules MOD exprimant température cellule p53 -sensible (qui provoque l'apoptose après incubé dessous de la température permissive) a continué à proliférer après qu'ils ont été renvoyés à des conditions normales de culture 14,15. Collectivement, ces études suggèrent que l'annexine V est utile pour déterminer le sort des cellules qui ont renversé l'apoptose sans microscopie imagerie en temps réel des cellules. Cependant, il existe des mises en garde à cette stratégie, comme l'annexine V fluorescence ne est pas permanente (figure 4B) 13, qui reste détectable pendant seulement quelques heures après l'élimination du stimulus de mort, de sorte queces méthodes ne peuvent pas fournir à long terme le suivi de cellules qui inversés apoptose.

Figure 1
Figure 1: Suivi inversion de l'apoptose par imagerie des cellules vivantes. (Reproduit avec la permission de Tang et al, MBOC 23, 13 2240-2252, pour les figures 1A -. D et G). (A) Méthode pour induire l'apoptose et par la suite permettent aux cellules cultivées de se rétablir après élimination par lavage de l'inducteur de l'apoptose. (B) time-lapse microscopie à contraste de phase de cellules vivantes des cellules hépatiques de souris primaires sains (non traité), le même groupe de cellules qui ont été traitées avec de l'éthanol à 4,5% dans du milieu de culture (volume / volume) pendant 5 heures (traité), puis lavées et en outre incubées avec du milieu de culture frais pendant 24 heures (lavé). La barre d'échelle, 100 um. (C) continue time-lapse cellules vivantes épi-microscopie de fluorescence de la même cellule primitif du foie de souris avant ethatraitement nol (i), aux temps indiqués après traitement avec 4,5% d'éthanol dans le milieu de culture de cellules pendant 2,5 heures (ii et iii), et après le lavage et l'incubation avec un milieu frais pour permettre la récupération pendant 1 h (iv - vi). Images fusionnées de mitochondries MitoTracker colorées (rouge) et le noyau Hoechst teinté (bleu) ont été visualisées par microscopie épi-fluorescence, et la morphologie cellulaire par microscopie DIC. La barre d'échelle, 10 um. (D) des images de fluorescence fusionnées seulement (sans DIC) à partir du panneau C révéler morphologies des organites. (E) continue time-lapse cellules vivantes microscopie confocale des petites cellules de carcinome du poumon de H446 humaines avant le traitement de l'éthanol (i) , après traitement à l'éthanol à 3,8% dans du milieu de culture cellulaire pendant 2 h 28 min (II-VI), et après le lavage et l'incubation avec un milieu frais pour permettre la récupération (v-xi). Images fusionnées de mitochondries MitoTracker colorées (rouge) et les noyaux Hoechst colorés (bleus) ont été visualisées par microscopie confocale, et c ell morphologie par microscopie DIC. Les flèches blanches indiquent un noyau fragmenté en corps apoptotiques (VI). La barre d'échelle, 10 um. (F) Fusionné images de fluorescence seulement (sans DIC) à partir du panneau E révéler morphologies organites. (G) continue time-lapse cellules vivantes microscopie épi-fluorescence pour l'imagerie nucléaire Hoechst monochrome teinté d'une seule cellule HeLa qui subit la division cellulaire imprécise. Avant traitement à l'éthanol (i), le traitement avec 4,3% d'éthanol dans le milieu de culture de cellules pendant 5 heures (ii) et après le retrait de l'éthanol (lavé, iii-vi). Panneaux iv révèle divisions cellulaires anormales. Les flèches rouges indiquent les principaux noyaux dans les cellules divisées (IV à VI). La barre d'échelle, 30 um. Les temps sont indiqués comme hr: min. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Figure 2: Détection de l'inversion de l'apoptose après la libération du cytochrome c mitochondrial (A) continue time-lapse cellules vivantes microscopie confocale de cellules HeLa exprimant de façon stable cytochrome c GFP (GFP Cyto C) avant de (i), pendant (II-III) et après (iii-vii) l'exposition à 3,9% d'éthanol dans le milieu de culture cellulaire. Images confocales fusionnées de CytoC-GFP (vert), les mitochondries MitoTracker colorées (rouge), et les noyaux Hoechst colorées (bleu) sont combinés avec des images DIC (panneau de gauche). Versions non fusionnées sont présentés séparément pour CytoC-GFP, présenté comme une carte de chaleur de l'intensité du signal (panneau du milieu à gauche), image monochrome de CytoC-GFP (panneau du milieu), et l'image monochrome des mitochondries (panneau au milieu à droite). Images fusionnées de CytoC-GFP et les mitochondries (panneau de droite). (B) Le changement de la cytochrome c cytosolique-GFP intensité du signal des cellules, Cell 1 et Cell 2, comme indiqué dans l'image monochrome CytoC-GFP au Panneau de Ai. Les temps sont indiqués comme hr: min. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3
Figure 3: Détection de l'inversion de l'apoptose après l'activation de la caspase (Reproduit avec la permission de Tang et al, MBOC 23, 13 2240-2252, pour les figures 3A - D.). (A) Schéma de la protéine de fusion caspase biocapteur composé d'un signal d'export nucléaire (NES), le site DEVD de caspase de clivage, la protéine fluorescente jaune (YFP), et le signal de localisation nucléaire (NLS). (B) continue time-lapse en direct cellulaire microscopie confocale de cellules HeLa exprimant les caspases biocapteurs NES-DEVD-YFP-NLS (i) avant, pendant (ii à iv) et après (vx) l'exposition à 4,3% d'éthanol dans le milieu de culture cellulaire. Images confocales fusionnées du biocapteur de caspase (vert), les noyaux Hoechst colorés (bleus) et des images DIC (panneau de gauche), une des images monochromes de signaux YFP (panneau du milieu), et une carte de chaleur indiquant l'intensité du signal YFP (panneau de droite) . (C) des contrôles non traités sont analysés comme dans la partie B. (D) chiffrés intensités de fluorescence pour le biocapteur de caspase nucléaire activé dans des cellules individuelles (numérotés 1 et 2 dans le panneau Bi) avant, pendant et après l'exposition d'éthanol, et dans les contrôles non traités (numérotée 3 et 4 dans le panneau Ci) ont été calculées en pour cent de la YFP présent dans le noyau (nucléaire / intensité totale du signal cellulaire YFP x 100%). Les temps sont indiqués comme hr: min. La barre d'échelle, 10 um. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

ays "> Figure 4
Figure 4: Détection de l'inversion de l'apoptose par marquage fluorescent annexine V (Reproduit avec la permission de Tang et al, MBOC 23, 13 2240-2252, pour les figures 4A - B.). (A) Schéma de la V-FITC dosage de anastasis de l'annexine utilisée dans la partie B. (B) de rat néonatal des myocytes ventriculaires cardiaques primaires ont été exposés à de l'éthanol à 4,5% dans du milieu de culture de cellules pendant 5 heures, puis incubées avec de l'annexine V-FITC à 10 min avant le retrait du milieu de l'éthanol. Les cellules ont été soit corrigés immédiatement (traités), ou fixées après la réalimentation avec un milieu frais pour une reprise de 2 heures supplémentaires (lavés). Cellules non traitées qui ont été exposés annexine V-FITC servent de témoin (non traitée). Mitochondries MitoTracker colorées (rouges), Hoechst noyaux colorés (bleu) et annexine V-FITC (vert) ont été visualisées par microscopie confocale, et la morphologie cellulaire a été visualisées par microscopie DIC. Caroline du Sudbar à bière, 10 um. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Discussion

Anastasis désigne le phénomène où les cellules qui ont activés voie de mort cellulaire inverse par la suite le processus de la mort et de survivre. Ici, nous avons démontré que l'imagerie des cellules vivantes peut être utilisée pour confirmer que les mêmes cellules individuelles en fait peuvent inverser apoptotique processus de mort cellulaire à un stade tardif, et puis continuer survivant et la reproduction. Nos protocoles décrivent différentes conditions de traitement spécifiques d'un type cellulaire optimisée pour induire l'apoptose et de permettre une grande proportion des cellules à subir l'inversion de l'apoptose surveillé avec plusieurs biomarqueurs de vérification. En ce qui concerne les questions techniques, plats à fond de verre ont été utilisés pour des cellules de culture pour l'imagerie 12,13, en raison de la verre mince hautement transparent entre les cellules et l'objectif du microscope, qui permet longues distances de travail pour confocal de haute qualité ou la microscopie épi-fluorescence dans un fort grossissement, facilite l'observation de l'apoptose classique y compris la fragmentation mitochondriale, La libération de cytochrome c, et la condensation nucléaire et la fragmentation. Verre aussi ne fausse pas la polarité de la lumière, pour permettre de haute qualité microscopie DIC pour la surveillance de bourgeonnement de la membrane, le rétrécissement des cellules des cellules et la formation de corps apoptotiques cours de l'apoptose. DIC microscopie a des avantages sur microscopie à contraste de phase d'observer ces caractéristiques morphologiques de l'apoptose, comme DIC améliore le contraste d'échantillons de cellules non colorées et transparentes, ce qui améliore la détection des morphologies cellulaires. Si DIC et microscopie à contraste de phase ne sont pas disponibles, CellTracker peut être utilisé pour colorer le cytosol de décrire la morphologie des cellules vivantes pour la microscopie confocale ou épi-fluorescence et de contrôler la morphologie des cellules.

L'application de doses appropriées de stimuli de mort et les stratégies de l'élimination des stimuli sont des étapes essentielles pour la détection de Anastasis. Nous avons choisi d'utiliser de faibles concentrations de l'éthanol comme un stimulus de mort pour les expériences described ici parce que un grand pour cent des cellules traitées peut uniforme apoptose et peut récupérer de cela, potentiellement plus doux, la mort stimulus. Néanmoins, ces approches peuvent aussi être appliqués avec succès avec d'autres stimuli de mort, comme nous l'avons rapporté 12,13. Toutefois, certains stimuli de mort sont intrinsèquement plus difficile que d'autres, tels que la staurosporine (STS), un agent induisant l'apoptose couramment utilisé. Peut-être parce qu'il se lie ses substrats avec une haute affinité 46-48, lavages répétés sont essentiels, mais peuvent toujours pas éliminer efficacement STS à partir des cellules. Dans ce cas, en utilisant des concentrations plus faibles de drogue et la réduction du temps d'incubation médicaments qui peuvent encore activer processus de mort apoptotique pourrait être utile pour permettre plus de cellules pour inverser l'apoptose. Re-alimentation des cellules avec un milieu conditionné de culture cellulaire peut également renforcer l'inversion de l'apoptose mieux que le milieu de culture cellulaire frais. Les cellules apoptotiques sont généralement fixés de manière lâche à la surface de la boîte de culture en particulier sur du verre survisages, donc il est important de laver les inducteurs d'apoptose doucement pour éviter de détacher les cellules. Revêtement plats en verre avec de la poly-D-lysine, le collagène et / ou de la fibronectine pourrait augmenter l'adhérence des cellules pour permettre à certains types de cellules, telles que les cardiomyocytes 37, pour fixer correctement sur ​​la surface du verre de boîtes de culture cellulaire, en particulier après exposition des cellules à un relance de mort.

Le processus de l'apoptose, et probablement l'inversion de l'apoptose, dépend des activités enzymatiques qui peuvent être influencées par la température. Par conséquent, le maintien des cellules à 37 ° C ou à leur condition de culture normal est important tout au long du processus de formation d'image en temps réel pour garantir la reproductibilité des résultats expérimentaux. Microscope préchauffer avant de commencer imagerie des cellules vivantes est également une étape cruciale qui permet aux composants de microscope pour atteindre thermo-équilibre. Cela permet d'éviter la dérive du décalage de mise au point et le plan xy du fait de la dilatation thermique et la contraction ducomposants pendant imagerie des cellules vivantes. Application ou enlèvement de la relance de la mort en changeant le milieu une boîte de culture soit avec une pipette ou par perfusion dans le système de microscopie préchauffé pendant l'imagerie time-lapse peut encore provoquer une dérive de concentration en raison de changements de température ou le volume du milieu. Acquisition Z-pile peut aider à cellules d'image dans le plan focal correct, mais augmente le risque de phototoxicité due à une exposition supplémentaire de cellules fluorescentes aux lasers. Alternativement, l'utilisation de systèmes de compensation de la dérive de mise au point, comme un système de correction automatique point à base de laser infrarouge, peut maintenir les cellules en même plan focal lors de time-lapse imagerie des cellules vivantes par le maintien de la distance entre le cellules / verre et l'objectif sans supplémentaires exposition des cellules à courte longueur d'onde, la fluorescence phototoxique.

Libération de protéines mitochondriales apoptogènes tels que le cytochrome c et l'activation de caspases effectrices, telles que la / effet en avalou la caspase-3 et la caspase-7, ont été généralement considéré comme le «point de non-retour" dans le processus apoptotique de la mort cellulaire 2,5,6. Western blots ont été utilisées pour détecter le clivage (activation) de la caspase-3 et ses substrats tels que le poly (ADP) -ribose polymérase-1 (PARP) et DFF45 / CISD dans l'ensemble de la population cellulaire au cours de l'induction apoptotique et après enlèvement de apoptotique stimuli, et a révélé que la caspase-3 clivée, la CISD et PARP est présenté dans les cellules lors de l'exposition à des stimuli de mort, mais a disparu après que les cellules ont été re-alimentation avec un milieu de culture frais 13. Cependant, ces procédés montrent l'état général de la population cellulaire, mais ne permettent pas de distinguer les cellules individuelles qui seront finalement mourir de ceux qui inverser l'apoptose et survivre. Fractionnement biochimique d'analyser libération de cytochrome c mitochondrial a mises en garde similaires. Par conséquent, pour suivre le destin des cellules individuelles après libération du cytochrome c et la caspase-acvation, deux des caractéristiques les plus reconnus de l'apoptose 2,5,6, GFP-tagged cytochrome c (Cyto C-GFP) et un biocapteur de caspase, tel que celui utilisé ici NES-DEVD-YFP-NLS, combiné avec des cellules vivantes microscopie contourner ces problèmes en observant directement reprise morphologique et la translocation du biocapteur Cyto C-GFP dans les mêmes cellules. Ces résultats indiquent la réversibilité de l'apoptose après cytochrome c mitochondrial libération et l'activation des caspases.

Le défi actuel pour étudier Anastasis est le manque de techniques de marquage pour détecter les cellules qui ont subi Anastasis à tout moment de leur vie, in vivo ou in vitro. L'expression stable de la caspase biocapteurs NES-DEVD-YFP-NLS permet également la détection de l'activité de la caspase si caspases sont activées à nouveau dans l'avenir, mais ne enregistre pas en permanence l'activité de la caspase que le biocapteur activé sera dégradée sans Sustaactivité de la caspase INED 13. Autres biocapteurs de caspases précédemment rapportés, tels que les biocapteurs SCAT FRET (par exemple ECFP- [DEVD] -Venus) 26,49 ainsi que les journalistes fluorescentes Apoliner (CD8-RFP- [DQVD] GFP) 50 et CPV (par exemple CD8 - [DEVD] -Venus) 51,52, peut être utilisé pour détecter l'activité de la caspase dans des animaux entiers et dans des cellules en culture, mais ont des limitations similaires. De même, Cyto C GFP ne peut pas être utilisé pour suivre les cellules qui inversent l'apoptose dans long terme, comme il est libéré à partir de mitochondries dans le cytosol lors de l'apoptose et est ensuite dégradé. Étiquetage Annexin V a été utilisé pour suivre les cellules qui inversent l'apoptose, mais l'intensité du signal diminue aussi avec le temps, ne est donc pas utile pour le suivi à long terme des Anastasis 13,45. Continue à long terme dans l'imagerie in vivo pourrait être utilisé pour suivre le sort des mêmes cellules après une exposition de stimuli de mort. Cependant, à long terme l'imagerie in vivo est encore difficile to effectuer dans la plupart des animaux vivants. Par conséquent les approches supplémentaires sont nécessaires pour étendre la recherche de Anastasis des études animales, entières, et pour le criblage de médicaments qui pourraient favoriser ou inhiber anastasis en utilisant des cellules de culture de tissus

Dans l'avenir, les nouveaux protocoles et techniques qui suivent le destin des cellules à long terme sont nécessaires pour développer et tester les implications physiologiques, pathologiques et thérapeutiques de Anastasis. Nous avons proposé que anastasis pourrait être un mécanisme général de la survie cellulaire pour sauver les cellules blessées qui sont difficiles à remplacer, comme les neurones matures et des cellules cardiaques 13. Cependant, anastasis des cellules cancéreuses apoptotiques après les traitements chimiothérapeutiques pourrait entraîner la récupération des cellules dangereuses conduisant à récurrence de tumeurs résistantes 12,13. Anastasis pourrait aussi être un mécanisme important de la tumorigenèse, que certaines cellules affichent transformation oncogénique après inversés apoptose 13. Par conséquent, l'amélioration de Anastasis pourrait être une nouvelle Therastratégie théra- pour inhiber la neurodégénérescence et l'insuffisance cardiaque, tout en supprimant Anastasis comme une nouvelle façon pour prévenir ou traiter les cancers. Développer biocapteurs pour suivre l'inversion de l'apoptose dans des systèmes modèles de la maladie va progresser la compréhension des mécanismes de survie cellulaire de Anastasis, et des thérapies potentielles pour maladies incurables en modulant Anastasis.

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Acknowledgments

Nous remercions le Révérend Dr. Ralph Bohlmann et le révérend Dr James Voelz pour suggérer le mot "Anastasis" pour décrire l'inversion de l'apoptose; Douglas R. Green pour les cellules HeLa exprimant de façon stable cytochrome c GFP; Charles M. Rudin et Eric E. Gardner pour H446 cellules; Heather Lamb d'assistance en dessin animé à la vidéo; Yee Hui Yeo de discussion précieuse de ce manuscrit. Ce travail a été soutenu par un Sir Edward Youde Memorial Fellowship (HLT), la bourse Dr Walter Szeto Memorial (HLT), bourse Fulbright 007-2009 (HLT), Fondation Life Science Research Fellowship (HLT), NIH accorde NS037402 (JMH) et NS083373 (JMH), et le Comité de la Hong Kong University Grants AoE / B-07/99 (MCF). Ho Lam Tang est une Fondation Shurl et Kay Curci Fellow de la Fondation de recherche en sciences de la vie.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
LSM780 confocal microscopy Carl Zeiss
Glass bottom culture dish MatTek Corporation P35G-0-14-C
Transparent CultFoi Carl Zeiss 000000-1116-084
CO2 independent medium Life Technologies 18045-088
CellTracker Life Technologies C34552
Mitotracker Red CMXRos Life Technologies M-7512
Hoechst 33342 Life Technologies H1399
Fluorescently labeled annexin V Biovision K201

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References

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