Author Produced

إعداد الجرذ مصل مناسب للالثدييات الجامع الثقافة الأجنة

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Takahashi, M., Makino, S., Kikkawa, T., Osumi, N. Preparation of Rat Serum Suitable for Mammalian Whole Embryo Culture. J. Vis. Exp. (90), e51969, doi:10.3791/51969 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

وتستخدم مجموعة متنوعة من الحيوانات النموذج في البيولوجيا التطورية للتحقيق في الآليات التنموية على المستويين الجزيئي والخلوي. على سبيل المثال، استخدمت على نطاق واسع نوعا من البرمائيات والطيور كحيوانات النموذج الكلاسيكي التي هي مناسبة للتلاعب مباشرة من الأجنة لأن هذه الأجنة تطوير خارج الأم. وعلى النقيض من هذه الحيوانات، أجنة الثدييات ينمو في رحم الأم، والنمو في مراحل لاحقة تعتمد بشكل حاسم على وظيفة الرحم. وبالتالي، فمن الصعب عادة لمعالجة الأجنة مباشرة الثدييات مثل تلك التي من الماوس والفئران في مراحل مبكرة. في 1960s، التي أنشئت دينيس جديد الثدييات ثقافة الجنين كله (WEC) باستخدام تقنية الأجهزة WEC مع امدادات الاوكسجين المستمر ومراقبة الحرارة 1. في WEC، يمكن أن الماوس والفئران الأجنة تنمو خارج الجسم، (أي خارج الرحم). على الرغم من أن تقنية WEC كثيرا ما كان يستخدم في المسخ عن طريق إضافة مختلف كيميائيآل مركبات في مستنبت، كما تم استخدام هذه التقنية في مختلف الدراسات البيولوجيا التطورية لدراسة الآليات التنموية الفريدة في الثدييات 2-4. على سبيل المثال، يتم الجمع بين WEC مع تقنيات أخرى، مثل وضع العلامات الخلية، في البرية من نوع ومتحولة الأجنة باستخدام صبغة الفلورسنت 5، 6 زرع الخلايا، وإدخال الجين عبر lipofection 7 و electroporation 8-13.

في الآونة الأخيرة، في التلاعب الرحم وقد استخدمت لتحليل العمليات التنموية في الأجنة القوارض في مراحل لاحقة، وقد تم دمجها مع تقنيات التثقيب الكهربائي 14-16. ولكن هذه التقنيات ليست مناسبة للتلاعب من الأجنة postimplantation وmidgestation بسبب صعوبات تحقيق الحقن المحلية دقيقة من الحل الحمض النووي في الأجنة في المراحل المبكرة. على الرغم من أن زرع الخلايا الموجهة بالأمواج فوق الصوتية وحقن النواقل الفيروسية في الأجنة في وقت مبكر (أي، تم الإبلاغ عن E8.5-E-9.5 في الماوس) في الرحم سابقا 17،18، يطلب من مهارات ممتازة لتنفيذ هذه التجارب مع نسبة نجاح عالية. وبالتالي، مع إمكانية الوصول WEC عالية فيفو السابقين مزاياه فيما يتعلق التلاعب الماوس والفئران الأجنة.

وكثيرا ما يستخدم طرد فورا (IC) مصل الفئران المحضرة من الفئران الذكور لمتوسطة WEC. عند الأجنة هي مثقف في مرحلة postimplantation (أي، في وقت سابق من E8.0 في الماوس أو E10.0 في الفئران)، وغالبا ما يتم استخدام خليط من المتوسطة الاصطناعية وIC مصل الفئران كوسيلة للWEC 19. ولكن، لأجنة الثقافة في منتصف الحمل (أي.، E8.0-12.5 في أجنة الفئران أو E10.0-E14.5 في الأجنة الفئران)، ينبغي استخدام 100٪ مصل كوسيلة لأنه لا يوجد وسائل الإعلام البديلة المتاحة حاليا تسمح أجنة تنمو عادة في المختبر لأكثر من 2 أيام.

إعداد عالية الجودة مصل الفئرانخطوة حاسمة لتحقيق استنساخ التجارب في WEC. مقارنة تأخر الطرد المركزي، IC له فائدة في الحد من انحلال الدم عندما يتم جمع الدم عن طريق الضغط على تجلط الليفين لأن معظم خلايا الدم الحمراء وقد تم بالفعل فصل من جلطة الفيبرين. كما فشل مصل الفئران الانحلالي لدعم النمو الطبيعي للأجنة الجرذان والفئران، وإعداد المصل باستخدام الطرد المركزي المباشر هو الأفضل لإعداد باستخدام تأخر الطرد المركزي. بروتوكول لدينا يحتوي على اثنين من خطوات إضافية مقارنة مع غيرها من البروتوكولات 18-20 (مثال. وتخزين الدم التي تم جمعها على الجليد قبل الطرد المركزي الأول والحفاظ على عينات الدم التي تم جمعها لمدة 2 ساعة في 4 درجات مئوية بعد الطرد المركزي الأول). الخطوة السابقة يمكن تأخير تشكيل تجلط الدم، والخطوة الأخيرة تعزز التصلب من جلطة الليفين لسهولة الضغط. لذلك، لدينا بروتوكول يمكن استخدامها من قبل المبتدئين. ومع ذلك، استنساخ جمع الدم والمصلاستخراج بدقة بمجرد اشارة الى الكتب البروتوكول هو في غاية الصعوبة 19-21. في هذه المقالة الفيديو، علينا أن نظهر بروتوكول لدينا معيار لإعداد الأمثل مصل الفئران IC، والذي يتضمن جمع الدم من الشريان الأورطي البطني من الفئران الذكور واستخراج المصل بواسطة الطرد المركزي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ملاحظة: تم إجراء التجارب على الحيوانات وفقا للمعاهد الوطنية للصحة دليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية. وافقت اللجنة لتجارب على الحيوانات في مدرسة جامعة توهوكو للطب الإجراءات التجريبية الموصوفة هنا.

1. التخدير وفتح البطن

  1. لجمع الدم، واستخدام الذكور الفئران معينة خالية من مسببات الأمراض سبراغ داولي. صيام الفئران لمدة 18 ساعة على الأقل مع توفير المياه. استخدام الفئران مربي متقاعد الذكور في 6-8 أشهر من العمر (550-650 ز) لجمع الدم.
  2. تدفق 2،5-4،0٪ isoflurane و، وهو مخدر الاستنشاق، في مربع متصلا جهاز التخدير لإدخال التخدير في 2،0-3،5 لتر / دقيقة لمدة 10 دقيقة. نقل الفئران في خانة لإدخال التخدير.
    1. تأكيد التخدير عن طريق التحقق من فقدان ردا على التحفيز على الكفوف بالملقط. تغطية الأنف من واي الفئرانال قناع متصلة جهاز التخدير لتخدير عميق الفئران خلال جمع الدم. يتم الحفاظ على تركيز وتدفق في 2،5-4،0٪ و2،0-3،5 لتر / دقيقة، على التوالي.
      ملاحظة: هالوثان لا ينبغي أن تستخدم للتخدير استنشاق لأن الأجنة مثقف في المصل التي تم تجميعها من الفئران تخدير مع هذا كاشف المعرض تأخير في التطور الجنيني مقارنة مع الأجنة مثقف في المصل تم الحصول عليها من الفئران تخدير مع isoflurane و22.
  3. لتجنب التلوث من الفراء، وتطهير الجلد عن طريق سكب الايثانول 70٪ على البطن من الفئران تخدير. التقاط الجلد تطهيرها وجدار البطن في المنطقة السفلية مع زوج من ملقط وقطع هذه الطبقات في وقت واحد تجاه المنطقة الصدر مع زوج من مقص كبير لفضح الأعضاء الداخلية. تعكس الأمعاء خارج تجويف البطن مع زوج من الملقط.
  4. قطع الجلد وجدار البطن في اتجاه أطرافه الخلفية معزوج من مقص كبير لمواصلة فضح منطقة البطن الخلفي. تعكس الدهون الزائدة خارج تجويف البطن مع زوج من الملقط.
  5. التقاط الدهون الحشوية في خط الوسط باستخدام اثنين من أزواج من ملقط وتقسيم الدهون بعناية في اتجاه مواز لفضح الشريان الأورطي البطني. كرر هذا الإجراء لتقسيم الدهون الحشوية في الاتجاه الطولي لتحديد بسهولة والتشعب من الشريان الأورطي البطني. بالإضافة إلى ذلك، الشريان الأورطي هو نابض ويمكن تمييزها من الوريد الأجوف المجاورة باستخدام هذه الخاصية.
  6. التقاط الدهون حول الشريان الأورطي البطني والتشعب بعناية مع اثنين من أزواج من ملقط وفصل الدهون في الشريان الأورطي البطني.

2. جمع الدم

  1. إدراج بعناية غيض من الإبرة G 21 متصلة حقنة 20 مل الجمجمة على الفور إلى التشعب من الشريان الأورطي، مع شطبة في اتجاه نزولي. عقد حقنة واحدةجهة، وسحب المحقنة ببطء لجمع 15 مل من الدم من الفئران الذكور.
  2. إزالة الإبرة من الحقنة، وتصب الدم في كل منهما 10 مل أنابيب الاختبار العقيمة الجليد الباردة (الشكل 1A). إبقاء الأنابيب على الجليد حتى الطرد المركزي لتأخير تشكيل تجلط الدم. تقليل الوقت الطرد المركزي بواسطة الطرد المركزي أنابيب عدة في وقت واحد.
  3. الموت ببطء الفئران تخدير عن طريق بضع الصدر وقطع القلب أو قطع الرأس.

3. الجرذ سيروم إعداد

  1. أجهزة الطرد المركزي الدم التي تم جمعها لمدة 5 دقائق عند 1،200 x ج ودرجة حرارة الغرفة (RT) لفصل الدم إلى الطبقات العليا والسفلي (الشكل 1C).
  2. إبقاء الأنابيب في 4 درجة مئوية لمدة ساعة 1.5-2 لإصلاح جلطة الفيبرين.
  3. التقاط جلطة الليفين في الطبقة العليا باستخدام زوج من ملقط المنحني، والضغط على تجلط الليفين لفصل المصل. ثم، اضغط على تجلط الليفين مع ملقط المنحني التي تواجه تأليفwnwards بالقرب من واجهة بين طبقتين (1D الشكل).
  4. كرر الخطوة 3.3 لمزيد من فصل جلطة الفيبرين.
  5. أجهزة الطرد المركزي أنابيب الاختبار لمدة 5 دقائق عند 1،200 x ج وRT (الشكل 1E).
  6. نقل بعناية المصل في أنبوب 15 مل العقيمة باستخدام ماصة معقمة في الصفحي مجلس الوزراء تدفق الهواء.
  7. أجهزة الطرد المركزي في مصل الفئران التي تم جمعها لمدة 5 دقائق عند 1،200 x ج وRT لإزالة أي خلايا الدم الحمراء المتبقية.
  8. تجميع المصل بعناية إلى الجديد 15 مل أنبوب تعقيم باستخدام ماصة معقمة لتجنب تلوث الخلايا الحمراء المتبقية في الجزء السفلي من الأنبوب (الشكل 1F).
  9. احتضان المصل في حمام الماء عند 56 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة إلى تعطيل نظام المتممة.
  10. تبريد أنابيب المصل الفئران لRT في الصفحي مجلس الوزراء تدفق الهواء. وينبغي aliquoted المصل إلى 10 مل في أنابيب معقمة الفردية. تخزين الأنابيب في -20 درجة مئوية حتى استخدامها (الشكل 1H).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ويبين الشكل 1 نتائج ممثل الإجراءات الموضحة لفصل خلايا الدم والمصل. نحن عادة الحصول على 15 مل من الدم من الفئران الذكور متقاعد (الشكل 1A). بواسطة الطرد المركزي، ويمكن فصل الدم التي تم جمعها إلى الطبقة العليا التي تحتوي على مصل وجلطة الليفين، والتي يشار مع سهم، والطبقة السفلى تحتوي على خلايا الدم (الشكل 1C). الأهم من ذلك، لا يمكن فصل عينات الدم الانحلالي في مصل الدم وطبقات (الشكل 1B). بعد خروجه من أنبوب في 4 درجات مئوية لمدة 2 ساعة، يصبح جلطة الليفين الصلبة. هذا هو ترسيخ مريحة لفصل المصل من جلطة الليفين باستخدام زوج من ملقط المنحني (الشكل 1D). تم طرد أنبوب الاختبار في وقت لاحق. الجلطة الليفين مرئيا في واجهة بين المصل وطبقات خلايا الدم (الشكل 1E). وقد جمعت المصل من اثنين من أنابيب الاختبار في أنبوب جديد باستخدام ماصة للتصرف. يمكننا الحصول على ما يقرب من 6 مل من المصل من الفئران الذكور إذا كان الإجراء بأكمله بنجاح. لمزيد من إزالة خلايا الدم الحمراء، وطرد المصل جمعها مرة أخرى. عجلت أي خلايا الدم الحمراء المتبقية في الجزء السفلي من الأنبوب (الشكل 1F). نقلنا طاف لأنبوب جديد ودققت في اللون من المصل المنقى للحكم على درجة انحلال الدم على الرغم من أننا قادرون على جمع المصل من الطبقة العليا بعد الطرد المركزي. مصل الفئران مثالية لWEC عادة يسلك لون أصفر فاتح (من اليسار أنبوب في الشكل 1G)، في حين أن مصل الفئران مع انحلال الدم المعتدل يسلك لون وردي (أنبوب الحق في الشكل 1G). ويمكن تخزين IC مصل الفئران لمدة 6-12 أشهر على الأقل عند درجة حرارة -20 درجة مئوية (من اليسار في الشكل 1H). المصل مع انحلال الدم المعتدل أظهرت اللون أعمق من المصل مثالية عندما جمدت (من اليسار في الشكل 1H).

her.within صفحة = "دائما"> الشكل 1
الشكل 1. إجراءات الطرد المركزي الدم وإعداد المصل من الفئران الذكور. A) وتنقسم عينات الدم التي تم جمعها من الفئران الذكور على قدم المساواة إلى قسمين أنابيب الاختبار للالطرد المركزي. B، C) عينة غير مفصولة (B) والفصل المثالي في الطبقة العليا التي تحتوي على مصل وجلطة الفيبرين (سهم في C) والطبقة السفلى تحتوي على خلايا الدم بعد الطرد المركزي الأول. D) محشورة وجلطة الليفين باستخدام زوج من الملقط. E) طبقات المصل وخلايا الدم بعد الطرد المركزي الثاني. ويلاحظ الجلطة الليفين في واجهة (السهام). F) هطول الأمطار من خلايا الدم بعد الطرد المركزي الثالث (السهم). G) ويظهر أنبوب المصل اليسرى الفئران مثالية مع الضوء لون مصفر. أنبوب اليمين يظهر مصل الفئران مع انحلال الدم المعتدل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

النتائج استنساخه في التجارب WEC تعتمد على استخدام ذات جودة عالية IC مصل الفئران ودقيقة تقنية الجنين تشريح 3. لا تقصير فترة الصيام قبل جمع الدم بسبب الصيام هو ضروري لتوحيد تركيزات الجلوكوز في الدم. لا ينبغي أن تستخدم إناث الفئران من أجل إعداد المصل لأن مستويات هرمون تغيير في إناث الحيوانات وفقا لدورة ودقي، وهذه التغيرات في الهرمونات استراديول غير مناسبة للثقافات الجنين. بالإضافة إلى ذلك، لا ينبغي أن تستخدم الفئران الذكور الدهنية للغاية لإعداد مصل لتجنب كمية كبيرة من التلوث الدهون في الدم.

عند جمع الدم، أولا التأكد من أن لون الدم الشرياني هو اللون الأحمر الفاتح، والتي تعكس التنفس الطبيعي تحت التخدير. انخفضت التنفس يؤدي إلى الحد من كمية الدم التي تم جمعها. لاسترداد في مثل هذه الحالات، والحد مؤقتا السرعة التي الحقنة هو بوlled. المشكلة الأكثر أهمية في إعداد المصل هو انحلال الدم. إذا كانت عينات الدم التي تم جمعها تظهر انحلال الدم الحاد، فشل في الدم لا بد من فصل إلى طبقتين بواسطة الطرد المركزي. لأن المصل hemolyzed أقل ما يقال قد دعم التنمية دون المستوى الأمثل، يجب التخلص من هذه المصل. كما يميل إلى انحلال الدم الناجم عن الضغط يكون القسري، ينبغي سحب المحقنة ببطء عند جمع الدم. من المهم تجنب محتدما الدم عندما يتم سكب عينات الدم التي تم جمعها في أنابيب الاختبار، مما يزيد انحلال الدم.

إلى الأجنة الثقافة الماوس، IC مصل جمعت من ذكور الفئران قد تكون مثالية؛ ومع ذلك، وهذا الشرط هو غير عملي لأننا لا نستطيع الحصول على حجم كبير بما فيه الكفاية من الدم من الماوس. عندما نستعد مصل الفئران، ونحن نستعد لا يقل عن 10 متقاعد تربية ذكور الفئران. في مختبرنا، يتم تنفيذ جمع الدم بشكل روتيني من قبل اثنين على الأقل من الأفراد: الفرد جمع الدم والتخدير الفردية وأداءالطرد المركزي الأول.

حتى الآن، تم الإبلاغ عن العديد من الدراسات باستخدام مصل الفئران التجارية في WEC من خلال الجمع بين متوسطة محددة كيميائيا 23-25. على سبيل المثال، وهي مزيج من 50٪ مصل الفئران المتاحة تجاريا، و 50٪ DMEM يدعم النمو الطبيعي للأجنة E8.5 الماوس لمدة 36 ساعة 23 و النمو الطبيعي للE9.75 أجنة الفئران لمدة 40 ساعة 24. في بروتوكول آخر، وهو خليط يتكون من 50٪ مصل الفئران المتاحة من شركة أخرى و 50٪ متوسطة F12 تستكمل مع N-2 كما يدعم النمو السليم للE7.5 E8.5 والماوس الأجنة لمدة 24 ساعة 25. ومع ذلك، فإنه لا يزال من غير الواضح ما إذا كانت هذه الوسائط اندماجي هي مناسبة لثقافة الجرذان والفئران أجنة في مراحل لاحقة، مثل E11.5-E12.5 في الفئران وE13.5-E14.5 في الفئران. كما تم الإبلاغ عن الدراسات WEC باستخدام مختلف وسائل الإعلام البديلة بدلا من مصل الفئران 26-28. على سبيل المثال، وهو مزيج من DMEM/F12 و 20٪ مصل بقري جنيني (FBS) يدعم جمعةopment من أجنة الفئران من E11.5 لمدة 28 ساعة 26. ومع ذلك، هذه الوسيلة ليست مناسبة للثقافة الجنين من الفئران لمدة 28 ساعة E10.5 26. وبالتالي، فإننا نعتقد أن النمو الطبيعي للأجنة في المتوسط ​​تحتوي على FBS يعتمد على المرحلة الجنينية من الأجنة.

WEC باستخدام المصل خالية سائل الإعلام والثقافة تتألف فقط من الكواشف محددة، بما في ذلك وسائل الإعلام المتاحة تجاريا الخلايا الجذعية الجنينية، ألبومين المصل البقري، وN-2 تكملة تم الإبلاغ عنها. هذه الوسيلة يدعم ثقافة الأجنة E10.5 الماوس ل16-40 ساعة 27 و 28. Morre سكوت، وآخرون. أثبتت أن حجم تاج إلى الردف من أجنة الفئران مثقف لمدة 24 ساعة هو أصغر بكثير من E11 .5 الأجنة نمت في الرحم. ومع ذلك، فإن الهياكل الأساسية، مثل somites والظهرية العقد الجذرية، تبدو طبيعية في هذه الأجنة مثقف. من ناحية أخرى، ذكرت وKalaskar لودرديل أن 60٪ من الأجنة اختبار هذه الوسيلة في معارضها القاعدةفي وقت لاحق تطوير آل 18 ساعة، ولكن معدل تطور جيد في أجنة مثقف ل20-22 ساعة إضافية انخفضت إلى 30-40٪. وعلى النقيض من هذه الدراسات، ونحن يمكن أن تتكاثر بنجاح تطور جيد من الماوس والفئران مثقف الأجنة في 100٪ IC مصل الفئران المنتجة باستخدام بروتوكول لدينا لمدة يومين (أي.، ما يقرب من 48 ساعة) من E12.5 في الفئران 6 أو E10.5 في الفئران 8 عن طريق تغيير متوسطة مرة واحدة على مدار 24 ساعة. هذه النتائج تشير إلى أن لدينا وسيلة لإعداد IC مصل الفئران مفيد لمجموعة متنوعة من التجارب تطبيق WECat مختلف المراحل الجنينية لدى الثدييات. لذا، فإننا نأمل أن بروتوكول الفيديو لدينا وسوف تساعد الباحثين جديد أعرض التجارب باستخدام WEC إلى مختبراتها.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Isoflurane Abbott B506 For rat anesthesia.
Large scissors Napox B-7H Stelized scissors for cutting the skin and muscle of rats. 
Curved forceps Napox A-3-2 Stelized forceps for picking up the skin of rats and squeezing the fibrin clot.
Sprague-Dawley (SD) rat Charles Rivers Laboratories Retired male rats from colony in the lab or purchased retired male rats.
Syringe (20 ml) TERUMO SS-29ESZ
Needle (21 G x 5/8") TERUMO NN-2116R
Sterile test (spitz) tube (10 ml) ASIAKIZAI 1101C000B-10 For collection of boold
Sterile disposable pipette Eiken Chemical CD2000 No.4
Sterilie disposable tube (15 ml)  Falcon 2196

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. New, D. A. T. Introduction. Mammalian Postimplantation Embryos. A Practical Approach. Copp, A. J., Cockroft, D. L. IRL Press. Oxford, UK. 1-14 (1990).
  2. Eto, K., Takakubo, F. Improved development of rat embryos in culture during the period of craniofacial morphogenesis. J Craniofac Genet Dev Biol. 5, 351-355 (1985).
  3. Takahashi, M., Osumi, N. The method of rodent whole embryo culture using the rotator-type bottle culture system. J Vis Exp. (42), e2170 (2010).
  4. New, D. A. Whole embryo culture, teratogenesis, and the estimation of teratologic risk. Teratology. 42, 635-642 (1990).
  5. Matsuo, T., et al. A mutation in the Pax-6 gene in rat small eye is associated with impaired migration of midbrain crest cells. Nat Genet. 3, 299-304 (1993).
  6. Nomura, T., Holmberg, J., Frisen, J., Osumi, N. Pax6-dependent boundary defines alignment of migrating olfactory cortex neurons via the repulsive activity of ephrin A5. Development. 133, 1335-1345 (2006).
  7. Yamamoto, M., et al. Nodal antagonists regulate formation of the anteroposterior axis of the mouse embryo. Nature. 428, 387-392 (2004).
  8. Inoue, T., et al. Role of cadherins in maintaining the compartment boundary between the cortex and striatum during development. Development. 128, 561-569 (2001).
  9. Takahashi, M., Osumi, N. Pax6 regulates specification of ventral neurone subtypes in the hindbrain by establishing progenitor domains. Development. 129, 1327-1338 (2002).
  10. Calegari, F., Haubensak, W., Yang, D., Huttner, W. B., Buchholz, F. Tissue-specific RNA interference in postimplantation mouse embryos with endoribonuclease-prepared short interfering RNA. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 14236-14240 (2002).
  11. Takahashi, M., Nomura, T., Osumi, N. Transferring genes into cultured mammalian embryos by electroporation. Dev Growth Differ. 50, 485-497 (2008).
  12. Pryor, S. E., Massa, V., Savery, D., Greene, N. D., Copp, A. J. Convergent extension analysis in mouse whole embryo culture. Methods Mol Biol. 839, 133-146 (2012).
  13. Kikkawa, T., et al. Dmrta1 regulates proneural gene expression downstream of Pax6 in the mammalian telencephalon. Genes Cells. 18, 636-649 (2013).
  14. Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103, 865-872 (2001).
  15. Fukuchi-Shimogori, T., Grove, E. A. Neocortex patterning by the secreted signaling molecule FGF8. Science. 294, 1071-1074 (2001).
  16. Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Dev Biol. 240, 237-246 (2001).
  17. Turnbull, D. H. Ultrasound backscatter microscopy of mouse embryos. Methods Mol Biol. 135, 235-243 (2000).
  18. Pierfelice, T. J., Gaiano, N. Ultrasound-guided microinjection into the mouse forebrain in utero at E9.5. J Vis Exp. (45), e2047 (2010).
  19. Quinlan, G. A., Khoo, P. L., Wong, N., Trainor, P. A., Tam, P. P. Cell grafting and labeling in postimplantation mouse embryos. Methods Mol Biol. 461, 47-70 (2008).
  20. Nagy, A., Gertsenstein, M., Vinterstein, K., Behringer, R. Roller culture of postimplantation embryos. Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual. Nagy, A., Gertsenstein, M., Vinterstein, K., Behringer, R. 3rd ed, CSH Press. New York, New York. 237-241 (2003).
  21. Garcia, M. D., Udan, R. S., Hadjantonakis, A. K., Dickinson, M. E. Preparation of rat serum for culturing mouse embryos. Cold Spring Harb Protoc. 2011, 391-393 (2011).
  22. Brown-Woodman, P. D., Ritchie, H. E., Korabelnikoff, A., Emmanuel, C. Replacement of ether with alternate volatile anesthetics for collection of rat serum used in embryo culture. Toxicol In Vitro. 18, 719-724 (2004).
  23. Gray, J., Ross, M. E. Neural tube closure in mouse whole embryo culture. J Vis Exp. (56), e3132 (2011).
  24. Machado, C. B., et al. Reconstruction of phrenic neuron identity in embryonic stem cell-derived motor neurons. Development. 141, 784-794 (2014).
  25. Glanville-Jones, H. C., Woo, N., Arkell, R. M. Successful whole embryo culture with commercially available reagents. Int J Dev Biol. 57, 61-67 (2013).
  26. Ornoy, A., Yacobi, S., Yaffee, P. A simple method of culture of 11.5-day-old rat embryos in DMEM/F12 and 20% fetal bovine serum. J Anat. 203, 419-423 (2003).
  27. Moore-Scott, B. A., Gordon, J., Blackburn, C. C., Condie, B. G., Manley, N. R. New serum-free in vitro culture technique for midgestation mouse embryos. Genesis. 35, 164-168 (2003).
  28. Kalaskar, V. K., Lauderdale, J. D. Mouse Embryonic Development in a Serum-free Whole Embryo Culture System. J Vis Exp. (85), e50308 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics