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Préparation du Rat Serum Convient pour la culture d'embryons de mammifères entier

Biology

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Takahashi, M., Makino, S., Kikkawa, T., Osumi, N. Preparation of Rat Serum Suitable for Mammalian Whole Embryo Culture. J. Vis. Exp. (90), e51969, doi:10.3791/51969 (2014).

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Abstract

Introduction

Une variété de modèles animaux sont utilisés en biologie du développement pour étudier les mécanismes de développement aux niveaux moléculaires et cellulaires. Par exemple, les espèces d'amphibiens et d'oiseaux ont été largement utilisés comme animaux modèles classiques qui sont appropriés pour la manipulation directe d'embryons parce que ces embryons se développent en dehors de la mère. Contrairement à ces animaux, les embryons de mammifères se développent dans l'utérus de la mère, et la croissance à des stades ultérieurs dépend essentiellement de la fonction de l'utérus. Par conséquent, il est souvent difficile de manipuler directement les embryons de mammifères, tels que ceux de la souris et le rat à des stades précoces. Dans les années 1960, Denis New établi une culture d'embryons total de mammifère (CME) de la technique utilisant des appareils WEC avec un apport d'oxygène et d'un contrôle de chaleur 1. En WEC, souris et rats embryons peuvent se développer ex vivo, (c'est à dire, en dehors de l'utérus). Bien que la technique du CME a été souvent utilisé en tératologie en ajoutant divers chemiccomposés al dans le milieu de culture, cette technique a également été utilisée dans plusieurs études de biologie du développement à examiner les mécanismes de développement uniques chez les mammifères 2-4. Par exemple, le CME est combiné avec d'autres techniques, telles que le marquage cellulaire, dans le type sauvage et mutantes embryons en utilisant un colorant fluorescent 5, 6 transplantation de cellules, et l'introduction de gène par l'intermédiaire de lipofection et d'électroporation 7 13.8.

Récemment, dans la manipulation de l'utérus a été utilisé pour analyser les processus de développement des embryons de rongeurs à des stades ultérieurs et a été combiné avec des techniques d'électroporation 14-16. Cependant, ces techniques ne sont pas appropriées pour la manipulation de post-implantation d'embryons et midgestation raison de la difficulté à atteindre injection locale précise de la solution d'ADN dans des embryons à un stade précoce. Bien que la transplantation de cellules guidée par ultrasons et l'injection de vecteurs viraux dans des embryons précoces (à savoir, E8.5-E-9.5 chez la souris) in utero ont été rapportés précédemment 17,18, d'excellentes compétences sont nécessaires pour effectuer ces expériences avec un taux de réussite élevé. Par conséquent, le WEC avec une grande accessibilité ex vivo présente des avantages par rapport à la manipulation de la souris et du rat des embryons.

Immédiatement centrifugé (IC) de sérum de rat préparée à partir de rats mâles est souvent utilisé pour les moyennes du CME. Lorsque les embryons sont mis en culture au stade de la post-implantation (par exemple, plus tôt que E8.0 chez la souris E10.0 ou chez le rat), d'un mélange de milieu synthétique et du sérum de rat IC est souvent utilisé comme un moyen pour WEC 19. Cependant, les embryons de la culture à la mi-gestation (c'est à dire., E8.0-12.5 dans des embryons de souris E10.0 ou E14.5-dans des embryons de rat), 100% de sérum doit être utilisé comme un moyen car aucune médias alternatifs actuellement disponibles permet embryons de se développer normalement in vitro depuis plus de 2 jours.

La préparation de sérum de rat de haute qualité estune étape cruciale pour atteindre la reproductibilité des expériences WEC. Par rapport à une centrifugation retardée, IC a l'avantage de réduire l'hémolyse lorsque le sérum est recueilli en serrant le caillot de fibrine parce que la plupart des cellules rouges du sang ont déjà été séparé du caillot de fibrine. Comme le sérum de rat hémolytique ne parvient pas à soutenir la croissance normale des embryons de rats et de souris, la préparation du sérum par centrifugation immédiate est préférable de préparation en utilisant la centrifugation retardée. Notre protocole comprend deux étapes supplémentaires par rapport à d'autres protocoles de 18 à 20 (c.-à-., Stocker le sang recueilli sur de la glace avant la première centrifugation et de maintenir les échantillons de sang prélevés pendant 2 heures à 4 ° C après la première centrifugation). L'ex-étape peut retarder la formation du caillot de sang, et la dernière étape favorise la solidification du caillot de fibrine pour la compression simple. Par conséquent, notre protocole peut être utilisé par les débutants. Toutefois, la reproduction et la collecte de sérum sanguinextraction avec précision par simple référence aux livres de protocole est extrêmement difficile 19-21. Dans cet article, vidéo, nous démontrons notre protocole standard pour la préparation de sérum de rat IC optimal, qui comprend la collecte de sang à partir de l'aorte abdominale de rats mâles et extraction du sérum par centrifugation.

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Protocol

REMARQUE: Les expérimentations animales ont été menées en conformité avec les National Institutes of Health Guide pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire. Le Comité pour l'expérimentation animale de l'École de médecine de l'Université du Tohoku a approuvé les procédures expérimentales décrites ici.

1. Anesthésie et laparotomie

  1. Pour la collecte de sang, utiliser des rats mâles spécifiques exemptes d'agents pathogènes Sprague-Dawley. Jeûner les rats pendant au moins 18 heures tout en fournissant de l'eau. Utilisez rats mâles reproducteurs retraités à 6-8 mois (550-650 g) pour la collecte de sang.
  2. Débit de 2,5 à 4,0% d'isoflurane, qui est un anesthésique par inhalation, dans une boîte reliée à un appareil d'anesthésie pour introduire anesthésie à 2,0 à 3,5 L / min pendant 10 min. Transfert des rats dans la boîte à introduire l'anesthésie.
    1. Confirmer l'anesthésie par la vérification de la perte de la réponse à la stimulation sur les pattes avec une pince. Couvrir le nez du rat with un masque relié à un appareil d'anesthésie anesthésier profondément les rats lors de la collecte de sang. La concentration et le débit est maintenu à 2,5 à 4,0% et de 2,0 à 3,5 L / min, respectivement.
      NOTE: L'halothane doit pas être utilisé pour l'anesthésie par inhalation car embryons mis en culture dans le sérum qui est recueillie à partir de rats anesthésiés avec ce réactif présentent un retard dans le développement embryonnaire par rapport aux embryons cultivés dans le sérum obtenu à partir de rats anesthésiés avec de l'isoflurane 22.
  3. Pour éviter la contamination de la fourrure, à désinfecter la peau en versant 70% d'éthanol sur l'abdomen du rat anesthésié. Choisir la peau et la paroi abdominale désinfecté à la partie inférieure avec une paire de forceps et couper ces couches simultanément en direction de la région du thorax d'une paire de grands ciseaux pour exposer les organes internes. Tenir compte de l'intestin à l'extérieur de la cavité abdominale avec une paire de forceps.
  4. Coupez la peau et la paroi abdominale vers les membres postérieurs avec unpaire de grands ciseaux pour exposer davantage la région abdominale postérieure. Refléter la graisse supplémentaire en dehors de la cavité abdominale avec une paire de pinces.
  5. Choisir la graisse viscérale sur la ligne médiane à l'aide de deux paires de pinces et de diviser la matière grasse avec soin dans une direction parallèle à exposer l'aorte abdominale. Répéter ce procédé pour diviser la graisse viscérale dans une direction longitudinale pour identifier facilement la bifurcation de l'aorte abdominale. En outre, l'aorte est pulsatile et peut être distinguée de la veine cave adjacente à l'aide de cette caractéristique.
  6. Choisir la matière grasse autour de l'aorte abdominale et la bifurcation soigneusement avec deux paires de pinces et séparer la graisse de l'aorte abdominale.

2. Collecte de sang

  1. Insérer avec précaution la pointe d'une aiguille 21 G raccordée à une seringue de 20 ml immédiatement crânienne à la bifurcation de l'aorte, avec le biseau vers le bas. Tenez la seringue avec unmain, et tirez lentement la seringue pour recueillir 15 ml de sang d'un rat mâle.
  2. Retirez l'aiguille de la seringue, et verser le sang en deux 10 ml tubes à essai stériles glacées (figure 1A). Conserver les tubes sur de la glace jusqu'à ce que la centrifugation pour retarder la formation du caillot de sang. Réduire le temps de centrifugation par centrifugation de plusieurs tubes à la fois.
  3. Euthanasier le rat anesthésié par thoracotomie et couper le coeur ou la décapitation.

3. Sérum de rat Préparation

  1. Centrifuger le sang recueilli pendant 5 min à 1200 x g et à température ambiante (RT) pour séparer le sang en couches supérieure et inférieure (figure 1C).
  2. Gardez les tubes à 4 ° C pendant 1,5-2 heures à fixer le caillot de fibrine.
  3. Relever le caillot de fibrine dans la couche supérieure à l'aide d'une paire de forceps incurvés, et presser le caillot de fibrine pour séparer le sérum. Ensuite, appuyez sur le caillot de fibrine avec les pinces courbes face downwards proches de l'interface entre les deux couches (Figure 1D).
  4. Répétez l'étape 3.3 de détacher davantage le caillot de fibrine.
  5. Centrifuger les tubes à essai pendant 5 minutes à 1200 xg et RT (figure 1E).
  6. Soigneusement transférer le sérum dans un tube stérile de 15 ml à l'aide d'une pipette stérile dans une armoire flux d'air laminaire.
  7. Centrifuger le sérum de rat recueillies pendant 5 min à 1200 xg et RT pour enlever les globules rouges restants.
  8. Regrouper le sérum avec précaution dans un nouveau tube de 15 ml stérilisés à l'aide d'une pipette stérile pour éviter la contamination par les globules rouges résiduels dans le fond du tube (Figure 1F).
  9. Faire incuber le sérum dans un bain d'eau à 56 ° C pendant 30 minutes pour inactiver le système du complément.
  10. Refroidir les tubes de sérum de rat à la température ambiante dans l'armoire flux d'air laminaire. Le sérum doit être aliquote de 10 ml dans des tubes stériles individuels. Conserver les tubes à -20 ° C jusqu'à utilisation (figure 1H).

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Representative Results

La figure 1 montre les résultats représentatifs des modes opératoires décrits pour la séparation des cellules du sang et le sérum. On obtient typiquement 15 ml de sang d'un rat mâle retiré (Figure 1A). Par centrifugation, le sang collecté peut être séparé en une couche supérieure contenant du sérum et du caillot de fibrine, ce qui est indiqué par une flèche, et une couche inférieure contenant les cellules sanguines (figure 1C). Fait important, les échantillons de sang non hémolytiques peuvent être séparés en couches sérum et de sang (Figure 1B). Après avoir quitté le tube à 4 ° C pendant 2 h, le caillot de fibrine devient solide. Cette solidification est pratique pour la séparation du sérum du caillot de fibrine en utilisant une paire de forceps incurvés (Figure 1D). Le tube à essai a ensuite été centrifugé. Le caillot de fibrine est visible à l'interface entre le sérum et les couches de cellules sanguines (figure 1E). Le sérum provenant des deux tubes à essai ont été recueillies enun nouveau tube à l'aide d'une pipette jetable. Nous pouvons obtenir environ 6 ml de sérum d'un rat mâle si l'ensemble de la procédure est réussie. Pour éliminer davantage de globules rouges, le sérum recueilli est centrifugé à nouveau. Toutes les globules rouges restants précipités au fond du tube (Figure 1F). Nous avons transféré le surnageant dans un nouveau tube et vérifié la couleur du sérum purifié de juger du degré d'hémolyse, même si nous sommes en mesure de recueillir le sérum de la couche supérieure après centrifugation. Le sérum de rat idéal pour WEC présente généralement une couleur jaune clair (tube de gauche de la figure 1G), tandis que le sérum de rat à une hémolyse légère présente une couleur rose (tube droit dans la figure 1G). De sérum de rat IC peut être stockée pendant au moins 6 à 12 mois à -20 ° C (à gauche sur la figure 1H). Le sérum à une hémolyse légère présentait une couleur plus foncée que le sérum idéal en cas de gel (à gauche sur la figure 1H).


Figure 1. Procédures de centrifugation du sang et de la préparation de sérum provenant de rats mâles. A) Les échantillons de sang prélevés sur un rat mâle sont répartis également en deux tubes à essai pour la centrifugation. B, C) ​​Échantillon non séparé (B) et la séparation idéal dans la couche supérieure contenant le sérum et le caillot de fibrine (flèche en C) et la couche inférieure contenant des globules après la première centrifugation. D) Le caillot de fibrine est pressé à l'aide d'une paire de forceps. E) Les couches de sérum et de cellules de sang après la seconde centrifugation. Le caillot de fibrine est observée à l'interface (pointes de flèches). F) Précipitation de globules après la troisième centrifugation (flèche). G) Le tube de gauche montre le sérum de rat idéal avec une couleur légèrement jaunâtre. Le tube de droite montre le sérum de rat à une hémolyse légère.

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Discussion

Des résultats reproductibles lors des expérimentations WEC dépendent de l'utilisation de sérum de rat IC de haute qualité et de précision technique embryon de dissection 3. Ne pas raccourcir la période de jeûne avant la collecte de sang, car le jeûne est nécessaire de normaliser les concentrations de glucose dans le sang. Des rats femelles doivent pas être utilisés pour la préparation de sérum parce que les niveaux d'hormones chez les animaux femelles changent en fonction du cycle oestral, et de tels changements dans les hormones estradiol ne conviennent pas pour des cultures d'embryons. En outre, des rats mâles très gras ne devraient pas être utilisés pour la préparation de sérum pour éviter une grande quantité de contamination de lipides dans le sang.

Lors de la collecte du sang, d'abord s'assurer que la couleur du sang artériel est une couleur rouge vif, reflétant la respiration normale sous anesthésie. Diminution de la respiration conduit à une réduction de la quantité de sang recueilli. Pour récupérer dans de tels cas, de réduire temporairement la vitesse à laquelle la seringue est pulled. Le problème le plus critique dans la préparation du sérum est l'hémolyse. Si les échantillons de sang prélevés présentent une hémolyse sévère, le sang ne parvient pas à être séparé en deux couches par centrifugation. Parce que le sérum légèrement hémolyse peut soutenir le développement sous-optimal, comme le sérum doit être jeté. Comme hémolyse tend à être induite par une pression forcée, la seringue doit être tiré lentement lors de la collecte du sang. Il est important d'éviter le bullage du sang lorsque les échantillons de sang collectés sont versés dans des tubes à essai, ce qui augmente l'hémolyse.

Pour les embryons de souris de la culture, IC sérum prélevé chez des souris mâle peut être idéal; Toutefois, cette exigence n'est pas pratique parce que nous ne pouvons pas obtenir un volume suffisant de sang d'une souris. Lorsque nous préparons le sérum de rat, nous préparons au moins 10 à la retraite reproduction des rats mâles. Dans notre laboratoire, la collecte de sang est systématiquement effectué par au moins deux personnes: la personne qui reçoit le sang et l'anesthésiant individu et l'exécution dupremière centrifugation.

À ce jour, plusieurs études utilisant du sérum de rat dans du commerce WEC en combinant un milieu défini chimiquement ont été rapportés 23 à 25. Par exemple, un mélange de 50% de sérum de rat disponibles dans le commerce et 50% de DMEM soutient la croissance normale des embryons E8.5 de souris pendant 36 heures 23 et de la croissance normale des embryons de souris E9.75 pendant 40 heures 24. Dans un autre protocole, un mélange composé de sérum de rat à 50% disponible auprès de l'autre société et le milieu F12 additionné de 50% avec le N-2 supporte également la bonne croissance de E7.5 et E8.5 souris embryons pour 24 h 25. Cependant, il reste difficile de savoir si ces médias combinatoires sont adaptés à la culture d'embryons de rats et de souris à des stades ultérieurs, tels que E11.5 E12.5-E13.5 chez la souris et chez le rat-E14.5. WEC études utilisant différents médias alternatifs au lieu de sérum de rat ont également été signalés 26-28. Par exemple, une combinaison de DMEM/F12 et 20% de sérum bovin fœtal (FBS) prend en charge le développement des embryons de rat de E11.5 pour 28 h 26. Cependant, ce milieu ne convient pas pour la culture d'embryons de rat de E10.5 pour 28 h 26. Par conséquent, nous pensons que la croissance normale des embryons dans un milieu contenant FBS dépend du stade embryonnaire des embryons.

CME en utilisant des milieux de culture sans sérum comprenant uniquement des réactifs définis, y compris des supports disponibles dans le commerce sur les cellules souches embryonnaires, de l'albumine de sérum bovin, et supplément N-2 ont été rapportés. Ce milieu soutient la culture d'embryons de souris E10.5 pour 16-40 h 27, 28. Morre-Scott, et al. Ont démontré que la taille de couronne à la croupe d'embryons de souris en culture pendant 24 heures est nettement inférieur à celui de E11 0,5 embryons cultivés in utero. Cependant, les principales structures, telles que les somites et les ganglions rachidiens, semblent normaux dans ces embryons cultivés. D'autre part, Kalaskar Lauderdale et ont rapporté que 60% des embryons testés dans ce milieu présentait normedéveloppement al 18 heures plus tard, mais le taux de bon développement des embryons en culture pour un 20-22 heures supplémentaires a chuté à 30-40%. Contrairement à ces études, nous pouvons réussir à reproduire un bon développement de souris et de rats embryons cultivés dans 100% de sérum de rat IC produits en utilisant notre protocole pour deux jours (c'est à dire., Environ 48 heures) à partir de E12.5 chez les rats 6 ou E10.5 8 chez la souris en changeant le milieu une fois à 24 h. Ces résultats suggèrent que notre procédé pour préparer du sérum de rat IC est utile pour une variété d'expériences d'application de mammifères WECat différents stades embryonnaires. Par conséquent, nous espérons que notre protocole vidéo aidera les nouveaux chercheurs introduisent des expériences utilisant WEC à leurs laboratoires.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Isoflurane Abbott B506 For rat anesthesia.
Large scissors Napox B-7H Stelized scissors for cutting the skin and muscle of rats. 
Curved forceps Napox A-3-2 Stelized forceps for picking up the skin of rats and squeezing the fibrin clot.
Sprague-Dawley (SD) rat Charles Rivers Laboratories Retired male rats from colony in the lab or purchased retired male rats.
Syringe (20 ml) TERUMO SS-29ESZ
Needle (21 G x 5/8") TERUMO NN-2116R
Sterile test (spitz) tube (10 ml) ASIAKIZAI 1101C000B-10 For collection of boold
Sterile disposable pipette Eiken Chemical CD2000 No.4
Sterilie disposable tube (15 ml)  Falcon 2196

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References

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