Изображений внутриклеточный Ca
1Department of Physiology, University of California Los Angeles, 2Department of Neurobiology, University of California Los Angeles

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Jiang, R., Haustein, M. D., Sofroniew, M. V., Khakh, B. S. Imaging Intracellular Ca2+ Signals in Striatal Astrocytes from Adult Mice Using Genetically-encoded Calcium Indicators. J. Vis. Exp. (93), e51972, doi:10.3791/51972 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Астроциты являются вездесущие и обильные глиальные клетки головного мозга. Хорошо известно, что астроциты служат жизненно важную поддержку и гомеостатическую роль в том числе буферизации концентрации К + во внеклеточном пространстве, поглощение нейротрансмиттеров, а также обеспечивающих питательных веществ. Тем не менее, последние исследования показывают, что они также отображать [Ca 2+] Я сигналы, которые возникают спонтанно и увеличиваются на нейронной активности 1. Существование астроцитов [Ca 2+] сигнализация я все чаще думал, чтобы вызвать их связь с нейронами, и как таковой было истолковано как форма «Са 2+ возбудимости» в астроциты. Имеющиеся данные за последние два десятилетия предложить два варианта настройки, в котором астроциты и нейроны могут общаться, возможно, в двунаправленного образом. Во-первых, астроциты часто реагируют с увеличением [Ca2 +] я при активации нейротрансмиттеров инейромодуляторы освобожденные из нейронов 2. Во-вторых, [Ca 2+] I Увеличивает пределах астроцитов вызвать высвобождение сигнальных молекул из астроцитов, что, в свою очередь, может повлиять на нейроны и кровеносные сосуды. Опыт показывает, что молекулы, высвобождаемые из астроцитов привести к изменениям в функциях синапсов, схем и, в конечном счете поведение 3-5 через астроцитов-на-нейрона сигнализации. Тем не менее, это по-прежнему быстро развивается область исследований, и было доказано, что лучше и детальное понимание астроцитов [Ca 2+], необходимо, чтобы решить некоторые из существующих неопределенностей 6.

В прошлой работе было показано, что основная погрузка органических Ca 2+ индикаторных красителей в астроциты не удается надежно обнаруживать [Ca 2+] Я сигналы в целых астроцитов в культуре и в месте 7-10. Эти выводы были обсуждены нами и другими 6,11,12. Emerginг картина такова, что [Ca 2+], сигналы в астроцитов процессов (например, филиалов и веточки), которые являются основными местами для взаимодействия с нейронами и кровеносными сосудами, которые редко были изучены подробно. В последнее время использование генетически кодируемых показателей кальция (GECIs), таких как цитозольный GCaMP3, GCaMP5G и GCaMP6 и плазменной мембране привязные версии (например, ЛКК-GCaMP3) позволило изучение [Ca 2+] Я сигналов в небольших отсеках астроцитов таких в виде тонких процессы, вблизи плазматической мембране и в течение всей территории 7,8. Тем не менее, GECIs есть один недостаток над органических Ca 2+ индикаторных красителей и это требование генетические методы, чтобы доставить гены, кодирующие избирательно астроцитов в естественных условиях в течение периодов недель для GECIs быть соответствующим образом выразил. Выражение в естественных условиях, как правило, достигается с помощью трансгенных мышей, домино у мышей или с вирусом основан приложение доставкиплотва. В настоящей статье Юпитер мы сообщаем методы и процедуры, используемые для доставки GECIs в полосатой астроциты с помощью аденоассоциированные вирусы. Мы сосредоточены на цито-GCaMP3 в качестве примера, но то же самое основное процедура работает для любой другой Geci или флуоресцентный белок репортера основе.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все протоколы животных были в соответствии с Национальными институтами Руководство здравоохранения по уходу и использованию лабораторных животных и были утверждены уходу и использованию комитета Институциональная животных в Лос-Анджелесе на.

1.1) Подготовка микропипетка и AAV2 / 5 Virus Loading

  1. Используйте мелкие боросиликатного стекла микропипетки для инъекции вируса. Потяните микропипетку помощью программы потянув двухступенчатый с вертикальной съемника. Конические пипетка под углом 40 ° с помощью пипетки дробилку. Пипетка, которая идеально подходит для использования будет иметь диаметр кончика 20 - 40 мкм и длиной хвостовика 6 - 7 мм. Автоклав пипетку и хирургических инструментов. Сверло стерилизуют вытирая с 70% этанола.
  2. Хранить вирус AAV2 / 5-GfaABC 1 D.cyto-GCaMP3.SV40 (1,5 х 10 13 GC / мл), при -80 ° С в 10 мкл аликвоты. Просто до операции, выньте аликвот из морозильника и хранить на льду, пока не используется для заполнения ее микропипетка.
  3. Заполните микропипетку с вирусом с помощью шприца. Плотно подключите один конец куска трубы, через соответствующего размера сжатия трубки фитинга, чтобы стеклянный шприц с усиленным поршнем. Закрепить автоклавного микропипетки к другому концу части трубки через соответствующего размера сжатия съемный установки иглы.
  4. Перед загрузкой вирусного вектора, удалить пузырьки воздуха из насосной системы, включая насосно-компрессорных труб, шприц и микропипетки, заполнив систему с минерального масла, окрашенного красным Судан IV (~ 1 мг / 50 мл) в 1 мл шприца с иглой (27 г ).
  5. Поместите чистый листок парафином под стеклянной микропипетки, и обойтись 5 - 10 мкл вирусного вектора на парафином.
  6. Сосать вирусного вектора, перемещая поршень шприца назад на 0,5 мкл / мин, и отметить границу между вектором и масла на стеклянной пипетки.

1.2) Анестезия, стричь волосы, HСвинец Фиксация и подготовка к трепанации черепа

  1. Положите мышь (P49-63, C57BL / 6) в камере, заполненной N 2 O и O 2, и 5% изофлуран. Оцените глубину анестезии потерей целенаправленное движение и замедленно частоты дыхания (~ 60 - 90 об / мин). Вырезать волосы на голове, когда мышь находится под наркозом.
  2. Установите курсор в стереотаксической рамы, с его головы обеспечены тупыми баров уха и носа, размещенных в анестезии и вентиляции. Поддержание постоянного изофлурана на 2 - 3%. Применить искусственные слезы мазь для обоих глаз, так как мыши теряют рефлекс моргания под наркозом.
  3. Администрирование 0,05 мл бупренорфина (0,1 мг / мл) путем подкожной инъекции для облегчения боли.
  4. Чистый хирургической области с 10% повидон-йода и 70% спиртом три раза, чередуя двух растворов и начиная с повидон иод. Начните с фронта и протрите по направлению к задней, чтобы удалить любые уже вырезать волосы.
  5. Сделайте разрез кожи на верхнем Oе головы, которая начинается между глаз и заканчивается между ушами.

1.3) Краниотомия и Микроинъекции

  1. Снимите надкостницы, проводя ватным тампоном, а затем высушить поверхность черепа с зубных ватные шарики. Сделайте отметку вокруг места инъекции, и пробурить около край знака с использованием небольшого стали заусенцы на питание от высокоскоростного сверла.
  2. Удалить кости и очистить поверхность с физиологическим раствором.
  3. Поместите пипетку в левой спинной боковой стриатуме с координатами (мм): передне-задней 0,8, медиальная-боковых: 2,0, спинной-вентральной из мягкой мозговой поверхности: -2,4 13. Обратите внимание, что эти координаты в виду, что кончик иглы микроинъекции сидит чуть выше дорсолатеральной полосатом теле (рис 1а, б), а это означает, что оно лишь немного проникает в пределах этого ядра. Во избежание повреждения кровеносных сосудов. Если пипетка, случается, прямо на кровеносном сосуде, слегка скорректироватькоординирует на ~ 0,1 - 0,2 мм.
  4. Начало впрыска с частотой впрыска, установленной на 0,2 мкл / мин, и, как правило, вводят от 1 до 1,5 мкл вируса.
  5. Оставьте пипетки в месте после инъекции в течение 10 мин, а затем вывести пипетку медленно.
  6. Закончить, закрыв хирургической раны с непрерывным швом внешний нейлоновой нити.

1.4) Recovery

  1. Поставьте курсор в чистом клетке на грелку в течение 24 часов. Не вернуть мышь, которая претерпела операцию в компании других животных, пока полностью не восстановился. Не оставляйте мышь без присмотра, пока он не восстановил достаточное сознание поддерживать грудины лежачее положение.
  2. Добавить триметоприм Sulfamethoxiazole (5 мл на 500 мл воды, содержащие 40 мг триметоприма и 200 мг sulfamethoxiazole) в воде в течение недели. Администрирование бупренорфина два раза в день на срок до 3-х дней после операции.
  3. Поддержание мыши на 12 ч цикле свет-темнота, кормили и поили ежедневно, а,й взвешивается раз в день до 3-х дней после операции. В этих 3-х дней, любая мышь с потерей более 10% массы тела считается угрозой, и будут умерщвлены, а подвергнуться экспериментов.
  4. Отдельно изменить клетку мыши два раза в неделю, и следить за общим состоянием здоровья, по крайней мере один раз в день. Как правило, используется мышь в течение 2 - 3 недель после стереотаксической микроинъекций.

2. Острая мозга Кусочек Подготовка к конфокальной Ca 2+ изображений

2.1) Подготовка резки и записи решения.

  1. Приготовьте раствор, содержащий резки (мм): 194 сахарозу, 30 NaCl, 4,5 KCl, 10 D-глюкозу, 1 MgCl 2, 1,2 NaH 2 PO 4, 26 и NaHCO 3, насыщенным смесью 95% O 2 и 5% CO 2.
  2. Подготовьте записи раствора, содержащего (мм): 124 NaCl, 4,5 KCl, 1 MgCl 2, 10 D-глюкозы, 2 CaCl 2, 1,2 NaH 2 PO 4 3; рН 7,3 - 7,4, 290 - 295 мОсм, насыщенный 95% O 2 и 5% CO 2. Заполните мозга срез держит стакан с раствором записи, и держать его при 34 ° С.

2.2) для нарезки

  1. Два-три недели после стереотаксической микроинъекций, глубоко и неизлечимо обезболить мыши, а затем обезглавить его.
  2. Выписка мозг, и использовать лезвие, чтобы удалить неинъецированных правое полушарие, и монтировать левую один на vibratome лоток, используя супер клей. Заполните vibratome поднос с ледяным резки буфера, и держать насыщая ее с 95% O 2 и 5% CO 2.
  3. Вырезать корональных или сагиттальных стриарные срезах мозга при толщине 300 мкм. Как правило, 4 - 5 корональной или 6 - 7 сагиттальной полосатого ломтики могут быть собраны.
  4. Трансфер ломтики на срез холдинга стакане подогретой на 34 ° С, и держать их там в течение 30 минут прежде, чем сохранить их при комнатной температуре в течение последующего recordiнг.
  5. Выдержите кусочки мозга в окисленной буфера записи при комнатной температуре в течение не менее 30 мин до [Ca 2+] Я визуализации.

3. Иммуногистохимия (IHC)

  1. Через две недели после инъекции вируса, заливать мыши транскардиальную с PBS, а затем 10% -ным формалином в PBS.
  2. Удалить, после исправить в одночасье, и cryoprotect мозг в буферном 30% сахарозы не менее 2 дней.
  3. Подготовьте 40 мкм разделы использованием криостата микротом.
  4. Промыть разделы 3 раза PBS при 10-минутного интервала.
  5. Инкубировать срезы в течение 1 ч в PBS с 10% нормальной козьей сыворотки и 0,5% Triton X-100.
  6. Инкубируйте разделы течение ночи при 4 ° С в первичных антител, приготовленного в PBS с 0,5% Triton X-100. В качестве первичных антител были следующие: куриное анти-GFP 1: 1000, мышиное анти-S100β 1: 400, мышиное анти-NeuN 1: 600, мышиное анти-глутамин-синтетазы 1: 300.
  7. Промыть разделы 3 раза PBS на 10 мв интервалах.
  8. Инкубировать срезы с вторичных антител, приготовленных в PBS с 10% нормальной козьей сывороткой в ​​течение 2 ч при комнатной температуре. Вторые антитела были следующими: козы против мышиного Alexa546 1: 500, козы против курицы Alexa488 1: 500.
  9. Установите разделы о стеклах, сухих и применить несколько капель из antifade монтажной среды, затем медленно покрывать участки с покровным стеклом. Хранить слайды на 4 ° С.
  10. Возьмите изображения на конфокальной микроскопии с иммерсионным объектива 40X с числовой апертурой 1,3.

4. конфокальной [Ca 2+], изображений

Примечание: [Са 2+], визуализации было сделано с использованием конфокальной микроскопии с погружением в воду 40X объектива с числовой апертурой 0,8.

  1. Между 1 и 5 ч после нарезки, место ломтик в камере записи и superfuse с кислородом буфере записи при комнатной температуре со скоростью потока 1 - 2 мл наминимум Затем поместите платиновый гусли с нейлоновыми струнами на верхней части среза, чтобы минимизировать движение в ходе эксперимента.
  2. Визуализация и найдите спинной полосатое тело с ярким свечением поля под 10X глубоководное погружение цели.
  3. Переключитесь на 40X погружения в воду объектива, и включите 488 нм линии лазера Аргон. Изменяя фокальной плоскости, найти клетки, расположенные примерно в 20 мкм от поверхности среза, показывая базальной флуоресценции в сомы, филиалов и веточек. Следует отметить, что взломанные клетки обычно отображается уровень флуоресценции выше среднего, которые следует избегать.
  4. Используйте режим «кадр сканирования», чтобы начать сканирование. Как правило, интенсивность лазерного доводят до 0,5 - 5% от максимальной мощности достаточно, чтобы изображение [Ca 2+], с цито-GCaMP3. Для мониторинга [Ca 2+] Я динамику на всей территории астроцитов, "рамка сканирования" с скоростью сканирования 1 сек на кадр или быстрее это recommended, но это должно быть решено в зависимости от эксперимента в вопросе.
  5. При необходимости, чтобы изображение [Ca 2+], в процессах, использовать цифровой увеличение на 2 - 3 раза для контроля 1 - 2 астроцитов в всему полю зрения.
  6. Чтобы избежать насыщенные пиксели во время записи, использовать режим поиска «Хило», чтобы псевдоцвете клетки. Всегда начинайте с «пилотного записи" в течение примерно 5 мин, чтобы проверить, если красный цвет, как указанием насыщения. Если это так, опустите выходной мощности лазера, или понизить PMT / Gain / смещение ценностей и выполнения другой пилот запись, чтобы проверить значения пикселов находятся в не насыщенных диапазоне. Как правило, объединенные параметры используются для формирования изображения астроцитов [Са 2+], в полосатом теле, следующие: выходная мощность лазера 0,5 - 5% (от 10 мВт), PMT 550 - 650 вольт, усиление 2,0 - 3.5X, и смещение 0 - 5%.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Для астроцитов специфическую экспрессию цито-GCaMP3 в полосатом теле, мы использовали адено-ассоциированный вирус (AAV) от 5 серотипа, и GFAP GfaABC 1 D промотора (Фигура 1А), которое было показано ранее, привод надежную GCaMP3 и ген-репортер выражение в гиппокампе и коры астроцитов 8,14. Через две недели после вирусной микроинъекции в стриатуме мышей, мыши (~ 10 недель) был озарен и IHC проводили на тонких срезах мозга, чтобы оценить цито-GCaMP3 выражение в стриатуме (рис 1В). Мы обнаружили, CYTO-GCaMP3 помощью GFP антител, а также окрашенных ломтики с известным астроцитов маркера, S100β. Выражение Cyto-GCaMP3 было найти только в S100β положительных клеток. Нет выражение не было найдено в нейронах визуализированных с NeuN (фиг.2А и 2В), предполагая, астроцитов специфическую экспрессию. Важно отметить, что выражение цито-GCaMP3 был обнаружен в ~ 60% S100β положительных клеток (Fiцифра 2C).

Астроциты реагируют на мозговых инсультов, таких как травмы, ишемии и инфекции, отображая изменения, которые стали известны как астроцитов реактивности, который представляет собой спектр потенциальных изменений от легкой до тяжелой 15. Мы стремились оценить, если вирус микроинъекции вызвало откровенное астроцитов реактивность. Ранее было показано, что более низкие уровни экспрессии глутаминсинтетазы (GS) были связаны с реактивных астроцитов 16,17. Поэтому, GS выражение в стриатуме WT и вирусных вводят мышам сравнивали. Мы не нашли никаких существенных изменений в ГС выражения в полосатой астроцитов следующих вирусов инъекции (рис 3А - C), что указывает на отсутствие явных астроцитов реактивность, используя уровни GS как метрика. Этот общий подход может быть расширен в будущей работе, чтобы оценить астроцитов реактивность с помощью других маркеров реактивности. Тем не менее, обратите внимание, что уровни GFAP не может быть подходящим способом измерения реактивности в striatаль астроциты, потому что GFAP не выражается в обнаружению уровней в большинстве стриарных астроцитов при базальных условиях 18. Таким образом, с помощью IHC заключаем выражение цито-GCaMP3 был надежный и специфическими для астроцитов в стриатуме, и что вирус инъекции не вызывают астроцитов реактивность по оценке изменений уровня экспрессии GS.

Мы рядом подготовлен острые кусочки мозга от вирусных вводили мышам с изображением [Ca 2+], в полосатой астроцитов. Острые 300 мкм сагиттальной или корональные срезы готовили, и после периода восстановления срезы помещают в камеру для записи на конфокальной микроскопии для [Са 2+], визуализации с использованием 488 нм линию аргонового лазера. Стриарные астроциты, экспрессирующие цито-GCaMP3 может быть легко идентифицированы в большинстве (как правило, все) из полосатого тела ломтиками (~ 6 - 7 ломтики на мышь), так как они показали заметную зеленую флуоресценцию в клетках с четко густой морфологии (фиг.4 рисунке 4A; по крайней мере, 10 астроциты, отображающие CYTO-GCaMP3 могли быть отображены и представлены на рисунке 4A как области интереса (ROI). Высшее увеличения изображения с дополнительным цифровым зумом 2,0 - 3,0 необходимо выявить отдельные астроцитов (рис 4б). В этих условиях, целые территории астроцитов были выявлены выражением цито-GCaMP3, как показано на рисунке 4В. Спонтанное Са 2+ сигналы легко измерить в somata а также в филиалах и веточек астроцитов 6.

Рисунок 1
Рисунок 1: Вирусный доставка GECIs (например цито-GCaMP3) по AAV2 / 5 в полосатом теле взрослых мышей. А. Схематическое иллюстрирует протокол для AAV2 / 5 микроинъекций в дорсолатеральной стриатуме.B. Показывает приблизительное положение микроинъекции иглы по отношению к стриатуме и координат, используемых для стереотаксической инъекции. Образ Нисслю окрашенных ломтик в панели В скачан из ALLEN МОЗГА ATLAS.

Рисунок 2
Рисунок 2: Cyto-GCaMP3 выражение конкретно в полосатой астроцитов. A - B. Типичные изображения, показывающие, что выражение цито-GCaMP3 локализуется с маркера астроцитов (S100β) (B), но не с маркера нейронов (NeuN) (а) C. Краткое гистограммы для колокализации экспериментов так, как показано. в А и В.

Рисунок 3
Рисунок 3: Cyto-GCaMP3 выражение в полосатой астроциты не вызывают изменения в экспрессии GS.- Б. Типичные изображения GCaMP3 и GS IHC от мышей, которые получали AAV2 / 5 для GCaMP3. Изображения для контроля не вводили мышам также показаны. С. Гистограмма суммирует результаты экспериментов, таких, как те, в А и В (нс указывает не значительным использованием критерия Стьюдента непарный Стьюдента, р <0,05).

Рисунок 4
Рисунок 4: Типичные примеры [Ca 2+] Я сигналов, записанных с полосатой астроцитов с цито-GCaMP3. А. плоский г-стека изображение, показывающее 10 астроциты (с номерами 1 - 10) .The отслеживает ниже, показывают [Ca 2+], сигналы записываются в течение 5 мин от 10 клеток, показанных на Б. А плоские и увеличенной в г. -stack изображение для одного astrocyte.The прослеживает ниже, показывают [Ca 2+],сигналы, записанные в течение 5 мин для одной ячейки, показанной на B.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Методы, описанные здесь, позволили нам высказать CYTO-GCaMP3 в полосатой астроцитов в естественных условиях для последующего [Ca 2+], визуализации на месте. Этот метод имеет преимущества перед использованием трансгенных или нокаут в мышей, в том числе надежной выражения целевой белок, быстротой и гибкостью экспериментального внедрения и анатомической спецификой. Выражение GCaMP3 использованием AAV2 / 5 Было обнаружено, что специфический и надежный. Сочетание GFAP GfaABC 1 D промотора с AAV серотипа 5 имеет решающее значение для достижения специфичности. Одним из ограничений методике, описанной здесь является то, что вирусная инфекция и процедура операция может привести к реакционной астроцитов, особенно с высоким титром вируса 19. Важно отметить, что в данном исследовании, AAV2 / 5 микроинъекции с относительной низким титром не вызывает уменьшения в GS, которые были связаны с астроцитов реактивности 19. Подобные элементы управления были зарегистрированы для Hippocampal астроциты 8. Тем не менее, важно подчеркнуть необходимость этих элементов управления для каждой области головного мозга должны быть изучены, не в последнюю очередь потому, что астроциты являются гетерогенными 20, и потому, что они, вероятно, имеют другие функции в различных областях головного мозга.

Одним из важных факторов, которые могут повлиять на надежность выражения целевой генов с использованием вируса микроинъекции является координаты в использовании, которая изменяется среди различных штаммов мыши и изменений в течение развития животных. Только C57BL / 6 мышей из ~ 8 недель были использованы в данном исследовании. Было также показано, что вирусный выражением GFP в полосатого тела нейронов и астроцитов у крыс может быть обнаружено 4 дней после инъекции, достигало плато на 2 - 4 недель после инъекции, а затем оставалась стабильной в течение 9 месяцев после инъекции 21. Временной ход выражения цито-GCaMP3 точно не определено здесь, но по крайней мере две недели для выражения вируса являютсярекомендуется.

Подход с использованием AAV2 / 5 опосредованную экспрессию GECIs в астроциты полосатого тела теперь может быть использован, чтобы лучше понять астроцитов [Са 2+], сигнализации в полосатом теле. В частности, уровень экспрессии цито-GCaMP3 достаточно высока, чтобы позволить визуализации [Ca 2+] Я сигналов в небольших популяциях астроцитов (~ 10 клеток) и в течение всего территорий отдельных астроцитов. Детальный анализ [Ca 2+] Я сигналов продолжается до сих пор, но на сегодняшний день [Ca 2+] Я сигналы были обнаружены от дистальных процессов, насколько ~ 50 мкм от сомы (рисунок 4). Подробные эксперименты по астроцитов [Ca 2+] Я сигналов и их коррелятивных и причинных функций в стриатуме осуществимы. В будущем, изысканные подходы (т.е., промоутеры) необходимы для проведения GECIs генетически определенных популяций астроциты, так что можноисследовать сигнализацию кальция в различных популяциях астроцитов 20.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Acknowledgements

Большинство работ и персонал, участвующий были поддержаны NIH грант NS060677 и частично NIH предоставляет MH099559 и MH104069 (для БСК). Часть работ была также поддержана CHDI фонда.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Syringe Pump Harvard Apparatus 704506
Glass Capillaries World Precision Instruments 1B100-4
Micropipette puller Narishige PC-10
Micropipette grinder Narishige EG-40
pZac2.1 GfaABC1D.cyto-GCaMP3 Addgene 44331 a plasmid sent to UPenn Vector Core for virus packaging
1 ml syringe BD 309628
syringe needle BD 305109
AAV2/5 virus UPenn vector core NA
Sudan red IV Sigma-Aldrich 67386
Mineral oil CVS Pharmacy 152355
Cryostat Leica CM3050 S
Stereotaxic instrument David Kopf Instruments 900LS
High Speed Rotary Micromotor Kit FOREDOM K.1070
Paraformaldehyde Santa cruz biotechnology sc-281692
Super Glue Krazy®Glue KG925
Microslicer Ted Pella DTK-Zero 1
Confocal microscopes Olympus FV300 and FV1000
Normal goat serum Vector S-1000
chicken anti-GFP Abcam ab13970
mouse anti-s100β Sigma-Aldrich S2532
mouse anti-NeuN Millipore MAB377
mouse anti-glutamine synthetase Millipore MAB302
goat anti-mouse-Alexa546 Invitrogen A11003
goat anti-chicken-Alexa488 Invitrogen A11039
Microscope Slides Fisher Scientific 12-550-15
Cover Glass Fisher Scientific 12-548-5J
Mounting Medium Vector H-1000

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Agulhon, C., et al. What is the role of astrocyte calcium in neurophysiology. Neuron. 59, 932-946 (2008).
  2. Khakh, B. S., North, R. A. Neuromodulation by extracellular ATP and P2X receptors in the CNS. Neuron. 76, 51-69 (2012).
  3. Gourine, A. V., et al. Astrocytes control breathing through pH-dependent release of ATP. Science. 329, 571-575 (2010).
  4. Florian, C., Vecsey, C. G., Halassa, M. M., Haydon, P. G., Abel, T. Astrocyte-derived adenosine and A1 receptor activity contribute to sleep loss-induced deficits in hippocampal synaptic plasticity and memory in mice. J Neurosci. 31, 6956-6962 (2011).
  5. Shigetomi, E., Jackson-Weaver, O., Huckstepp, R. T., O'Dell, T. J., Khakh, B. S. TRPA1 channels are regulators of astrocyte basal calcium levels and long-term potentiation via constitutive D-serine release. J Neurosci. 33, 10143-10153 (2013).
  6. Tong, X., Shigetomi, E., Looger, L. L., Khakh, B. S. Genetically encoded calcium indicators and astrocyte calcium microdomains. Neuroscientist. 19, 274-291 (2013).
  7. Shigetomi, E., Kracun, S., Sofroniew, M. V., Khakh, B. S. A genetically targeted optical sensor to monitor calcium signals in astrocyte processes. Nat Neurosci. 13, 759-766 (2010).
  8. Shigetomi, E., et al. Imaging calcium microdomains within entire astrocyte territories and endfeet with GCaMPs expressed using adeno-associated viruses. J Gen Physiol. 141, 633-647 (2013).
  9. Shigetomi, E., Khakh, B. S. Measuring near plasma membrane and global intracellular calcium dynamics in astrocytes. J Vis Exp. 26, (2009).
  10. Reeves, A. M., Shigetomi, E., Khakh, B. S. Bulk loading of calcium indicator dyes to study astrocyte physiology: key limitations and improvements using morphological maps. J Neurosci. 31, 9353-9358 (2011).
  11. Li, D. D., Agulhon, C., Schmidt, E., Oheim, M., Ropert, N. New tools for investigating astrocyte-to-neuron communication. Frontiers in Cellular Neuroscience. 7, (2013).
  12. Davila, D., Thibault, K., Fiacco, T. A., Agulhon, C. Recent molecular approaches to understanding astrocyte function in vivo. Front Cell Neurosci. 7, 272 (2013).
  13. Paxinos, G., Franklin, K. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. Academic Press. Waltham, MA. (2012).
  14. Perea, G., Yang, A., Boyden, E. S., Sur, M. Optogenetic astrocyte activation modulates response selectivity of visual cortex neurons in vivo. Nat Commun. 5, 3262 (2014).
  15. Sofroniew, M. V., Vinters, H. V. Astrocytes: biology and pathology. Acta Neuropathol. 119, 7-35 (2010).
  16. Eid, T., et al. Loss of glutamine synthetase in the human epileptogenic hippocampus: possible mechanism for raised extracellular glutamate in mesial temporal lobe epilepsy. Lancet. 363, 28-37 (2004).
  17. Eid, T., Williamson, A., Lee, T. S., Petroff, O. A., de Lanerolle, N. C. Glutamate and astrocytes--key players in human mesial temporal lobe epilepsy. Epilepsia. 49 Suppl 2, 42-52 (2008).
  18. Tong, X., et al. Astrocyte Kir4.1 ion channel deficits contribute to neuronal dysfunction in Huntington's disease model mice. Nat Neurosci. 17, 694-703 (2014).
  19. Ortinski, P. I., et al. Selective induction of astrocytic gliosis generates deficits in neuronal inhibition. Nat Neurosci. 13, 584-591 (2010).
  20. Zhang, Y., Barres, B. A. Astrocyte heterogeneity: an underappreciated topic in neurobiology. Curr Opin Neurobiol. 20, 588-594 (2010).
  21. Reimsnider, S., Manfredsson, F. P., Muzyczka, N., Mandel, R. J. Time course of transgene expression after intrastriatal pseudotyped rAAV2/1, rAAV2/2, rAAV2/5, and rAAV2/8 transduction in the rat. Mol Ther. 15, 1504-1511 (2007).

Comments

1 Comment

  1. What kind of drug you use to anesthetize the mouse before decapitation? Thank´s

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 23, 2016 - 6:27 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics