Abbildungsintrazellulären Ca
1Department of Physiology, University of California Los Angeles, 2Department of Neurobiology, University of California Los Angeles

Neuroscience

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Jiang, R., Haustein, M. D., Sofroniew, M. V., Khakh, B. S. Imaging Intracellular Ca2+ Signals in Striatal Astrocytes from Adult Mice Using Genetically-encoded Calcium Indicators. J. Vis. Exp. (93), e51972, doi:10.3791/51972 (2014).

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Abstract

Introduction

Astrozyten sind allgegenwärtig und reichlich Gliazellen des Gehirns. Es ist gut bekannt, dass Astrozyten dienen wichtige Unterstützung und homöostatischen Rollen einschließlich Pufferung der K + -Konzentration in den extrazellulären Raum, Aufnahme von Neurotransmittern sowie Bereitstellung von Nährstoffen. Neuere Studien zeigen jedoch, dass sie [Ca 2+] i-Signale, die spontan auftreten und werden durch neuronale Aktivität 1 erhöht zeigen auch. Die Existenz von Astrocyten [Ca 2+] i-Signalisierung wurde immer angenommen, dass die Kommunikation mit den Neuronen auslösen, und hat als solche als eine Form von "Ca 2+ Erregbarkeit" in Astrozyten interpretiert. Die verfügbaren Daten über die letzten zwei Jahrzehnte deuten zwei Einstellungen in dem Astrozyten und Neuronen kommunizieren kann, vielleicht in einer bidirektionalen Art und Weise. Ersten, Astrozyten reagieren häufig mit einer Zunahme der [Ca 2+] i, wenn sie von Neurotransmittern und AktivNeuromodulatoren von Neuronen 2 veröffentlicht. Zweitens [Ca 2+] i steigt innerhalb Astrozyten bewirken die Freisetzung von Signalmolekülen aus Astrozyten, die wiederum Nervenzellen und Blutgefäße beeinflussen. Hinweise darauf, dass Moleküle aus Astrozyten Freigabe über Astrozyten-to-Neuron Signalisierungs Änderungen in den Funktionen der Synapsen, Schaltungen und schließlich 3-5 Verhalten führen. Allerdings bleibt diese eine sich schnell entwickelnde Forschungsgebiet, und es wurde argumentiert, dass eine bessere und detailliertes Verständnis der Astrozyten [Ca 2+] i wird benötigt, um einige der derzeitigen Unsicherheiten 6 lösen.

In früheren Arbeiten wurde gezeigt, dass das Laden von mehreren organischen Ca 2+ Indikatorfarbstoffe in Astrozyten nicht zuverlässig zu erfassen [Ca 2+] i-Signale innerhalb gesamte Astrozyten in der Kultur und in situ 7-10. Diese Ergebnisse wurden von uns und anderen 6,11,12 diskutiert. Die Emerging Bild ist, dass [Ca 2+] i-Signale innerhalb Astrozyten Verfahren (zum Beispiel, Zweige und Ästchen), die die primären Standorte für Interaktionen mit Neuronen und Blutgefäße sind, haben nur selten im Detail erforscht. Vor kurzem hat die Anwendung genetisch kodierte Kalzium-Indikatoren (GeCIS) wie zytosolischen GCaMP3, GCaMP5G und GCaMP6 und Plasmamembran tethered Versionen (zB Lck-GCaMP3) hat das Studium der [Ca2 +] i-Signale in kleine Fächer von Astrozyten wie erlaubt so dünn Prozesse, in der Nähe der Plasmamembran und im gesamten Hoheitsgebiet zu 7,8. Allerdings GeCIS einen Nachteil gegenüber organischen Ca 2+ Indikatorfarbstoffe und das ist die Voraussetzung für genetische Methoden, um die kodierenden Gene selektiv Astrozyten in vivo für Zeiträume von Wochen zu liefern für die GeCIS angemessen sein ausgedrückt. Expression in vivo wird typischerweise unter Verwendung von transgenen Mäusen erreicht, knock-in Mäuse oder mit Virus basierte Auslieferung AppKakerlaken. In der vorliegenden JoVE Artikel berichten wir Methoden und Verfahren eingesetzt, um GeCIS zu striatalen Astrozyten mit Adeno-assoziierten Viren liefern. Wir konzentrieren uns auf Cyto-GCaMP3 als ein Beispiel, aber die gleichen grundlegenden Verfahren funktioniert für jede andere GECI oder fluoreszierendes Protein basierten Reporter.

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Protocol

Alle Tier Protokolle waren in Übereinstimmung mit den US National Institutes of Health Guide für die Pflege und Verwendung von Labortieren und wurden von der Institutional Animal Care und Use Committee an der UCLA genehmigt.

1.1) Bereiten Mikropipette und AAV2 / 5 Virus Loading

  1. Verwenden Fein Borsilikatglas-Mikropipetten für die Injektion des Virus. Ziehen die Mikropipette unter Verwendung eines zweistufigen Zieh Programm mit einer vertikalen Magnet. Kegel die Pipette in einem Winkel von 40 ° unter Verwendung einer Pipette Mühle. Die Pipette, die ideal für den Einsatz ist wird einen Spitzendurchmesser von 20 bis 40 um und eine Schaftlänge von 6 - 7 mm. Autoklavieren der Pipette und chirurgische Instrumente. Der Bohrer wird durch Abwischen mit 70% Ethanol sterilisiert.
  2. Speichern des Virus AAV2 / 5-GfaABC 1 D.cyto-GCaMP3.SV40 (1,5 x 10 13 gc / ml), bei -80 ° C in 10 & mgr; l Aliquots. Kurz vor der Operation, nehmen Sie die Aliquots aus dem Gefrierfach und Lagerung auf Eis, bis zum Füllen th verwendete-Mikropipette.
  3. Füllen Sie die Mikropipette mit Virus mit einer Spritzenpumpe. Dicht verbinden Sie ein Ende eines Rohrstück, durch einen entsprechend dimensionierten Rohr Klemmverschraubung, auf eine Glasspritze mit einem verstärkten Kolben. Befestigen Sie die autoklaviert Mikropipette mit dem anderen Ende des Rohrstück durch einen entsprechend dimensionierten abnehmbare Nadelklemmfitting.
  4. Vor dem Beladen des viralen Vektor, entfernen Luftblasen aus dem Pumpsystem einschließlich Schlauch, Spritze und Mikropipette durch Befüllen des Systems mit Mineralöl mit Sudanrot IV (~ 1 mg / 50 ml) in einer 1-ml-Spritze mit einer Nadel gefärbt (27 G ).
  5. Ein sauberes Stück Parafilm unter der Glas-Mikropipette, und Abgeben von 5 bis 10 & mgr; l der Virusvektors auf die Parafilm.
  6. Saugen den viralen Vektor, der durch Bewegen des Kolbens der Spritze nach hinten in 0.5 & mgr; l / min, und markieren die Grenze zwischen dem Vektor und dem Öl auf der Glaspipette.

1.2) Anästhesie, Haarschneide, Head Fixierung und Vorbereitung zur Kraniotomie

  1. Eine Maus (P49-63, C57BL / 6) in die Kammer mit N 2 O und O 2 und 5% Isofluran gefüllt. Beurteilen Sie die Narkosetiefe durch den Verlust der zielBewegung und einer verlangsamte Atemfrequenz (~ 60-90 / min). Schneiden Sie Haare auf dem Kopf, wenn die Maus betäubt.
  2. Setzen Sie die Maus in die stereotaktischen Rahmen, mit seinem Kopf durch stumpfe Ohr Bars und seine Nase in eine Anästhesie- und Beatmungssystem platziert gesichert. Pflegen kontinuierliche Isofluran bei 2 - 3%. Künstliche Tränen Salbe auf beiden Augen, da Mäuse verlieren ihre Lidschlussreflexes unter Narkose.
  3. Verwalten 0,05 ml Buprenorphin (0,1 mg / ml) durch subkutane Injektion zur Schmerzlinderung.
  4. Sauberen Operationsbereich mit 10% Povidon-Jod und 70% Alkohol dreimal abwechselnd zwischen den beiden Lösungen besteht und mit Povidon-Iod. Starten Sie von vorne und wischen nach hinten, um alle bereits geschnittenen Haare zu entfernen.
  5. Machen Sie eine Hautschnitt an der Spitze of der Kopf, der zwischen den Augen beginnt und endet zwischen den Ohren.

1.3) Kraniotomie und Mikroinjektionen

  1. Entfernen Sie die Knochenhaut durch Streichen mit einem Wattestäbchen und dann trocknen Sie die Oberfläche des Schädels mit Zahnwattebällchen. Machen Sie eine Markierung an der Injektionsstelle, und bohren um den Rand der Marke mit einem kleinen Stahl Grat angetrieben von einem High-Speed-Bohrer.
  2. Entfernen Sie die Knochen und reinigen Sie die Oberfläche mit Kochsalzlösung.
  3. Platzieren Sie die Pipette in die linke Rücken seitlich mit den folgenden Koordinaten (mm) Striatum: anterior-posterioren 0,8, medial-lateral: 2,0, dorsal-ventrale vom Pia-Oberfläche: -2,4 13. Beachten Sie, dass diese Koordinaten bedeutet, dass die Spitze der Mikroinjektionsnadel sitzt direkt über dem dorsolateralen Striatum (1A, B), was bedeutet, dass er nur geringfügig innerhalb dieses Kerns eindringt. Vermeiden schädlicher Blutgefäße. Wenn die Pipette passiert zu sein Recht auf ein Blutgefäß, leicht einzustellen dasKoordinaten von ~ 0.1 - 0.2 mm.
  4. Starten Einspritzung mit Einspritzrate bei 0,2 ml / min eingestellt, und in der Regel zu injizieren 1 bis 1,5 & mgr; l-Virus.
  5. Verlassen Sie die Pipette anstelle nach der Injektion für 10 Minuten, und dann langsam zurückziehen der Pipette.
  6. Beenden Sie durch Schließen der Operationswunde mit fortlaufenden Naht externen Nylonnaht.

1.4) Wiederherstellung

  1. Setzen Sie die Maus in einem sauberen Käfig auf einem Heizkissen für 24 Stunden. Sie eine Maus, die Operation, um der Gesellschaft von anderen Tieren unterzogen wurde, bis vollständig erholt nicht zurück. Lassen Sie die Maus unbeaufsichtigt, bis es ausreichend das Bewusstsein wiedererlangt, um Brustlage zu halten.
  2. In Trimethoprim Sulfamethoxiazole (5 ml pro 500 ml Wasser, das 40 mg Trimethoprim und 200 mg sulfamethoxiazole) im Wasser für eine Woche. Verwaltung Buprenorphin zweimal pro Tag für bis zu 3 Tage nach der Operation.
  3. Pflegen Sie die Maus auf einem 12 Stunden Licht-Dunkel-Zyklus, gefüttert und täglich bewässert, einnd wird einmal pro Tag bis zu 3 Tage nach der Operation gewichtet. In diesen 3 Tagen wird jede Maus mit einem Verlust von mehr als 10% Körpergewicht gelten als gefährdet und werden anstatt an Versuchen unterworfen eingeschläfert werden.
  4. Getrennt, ändern Sie die Maus Käfig zweimal pro Woche, und mindestens einmal pro Tag zu überwachen für die allgemeine Gesundheit. 3 Wochen nach der stereotaktischen Mikroinjektionen - Typischerweise wird die Maus innerhalb von 2 verwendet.

2. akuten Hirnschnittpräparat für die konfokale Ca 2+ Imaging

2.1) Herstellung von Schnitt- und Recording Solutions.

  1. Vorbereitung Schneid Lösung aus (mM): 194 Sucrose, 30 NaCl, 4.5 KCl, 10 D-Glucose, 1 MgCl 2, 1,2 NaH 2 PO 4 und 26 NaHCO 3, mit 95% O 2 und 5% CO 2 gesättigt.
  2. Vorbereitung Aufzeichnungslösung, umfassend (mM): 124 NaCl, 4,5 KCl, 1 MgCl 2, 10 D-Glucose, 2 CaCl 2, 1,2 NaH 2 PO 4 3; pH 7,3 bis 7,4, 290 bis 295 mOsm, mit 95% O 2 und 5% CO 2 gesättigt. Füllen Sie den Hirnschnitt hält Becher mit Aufzeichnungslösung, und halten Sie sie bei 34 ° C.

2.2) Slicing

  1. Zwei bis drei Wochen nach der stereotaktischen Mikroinjektionen, tief und unheilbar betäuben die Maus und dann enthaupten es.
  2. Extrahieren Sie das Gehirn, und verwenden Sie ein Messer, um die injizierten rechten Hemisphäre zu entfernen, und montieren Sie die linke auf die Vibratom Tablett mit Superkleber. Füllen Sie den Vibratom Tablett mit eiskaltem Schneid Puffer und halten sättigt sie mit 95% O 2 und 5% CO 2.
  3. Schneiden koronaler oder sagittaler striatalen Hirnschnitten bei 300 & mgr; m Dicke. Normalerweise 4-5 koronalen oder 6 - 7 können sagittale striatalen Scheiben gesammelt werden.
  4. Übertragen Sie die Scheiben auf die Scheibe Holdingbecher erwärmt bei 34 ° C, und es halten sie für 30 Minuten vor dem Ablegen bei Raumtemperatur für nachfolgende recording.
  5. Inkubieren der Hirnschnitten in oxygenierten Aufzeichnungspuffer bei Raumtemperatur für mindestens 30 min vor der [Ca 2+] i-Bildgebung.

3. Immunhistochemie (IHC)

  1. Zwei Wochen nach Virusinjektion, perfuse die Maus transkardial mit PBS, gefolgt von 10% Formalin in PBS.
  2. Entfernen, post-fix über Nacht, und cryoprotect das Gehirn in gepufferten 30% Saccharose für mindestens 2 Tage.
  3. Bereiten Sie 40 um Abschnitte mit einem Kryostat-Mikrotom.
  4. Spülen Sie den Abschnitten 3 mal mit PBS bei 10 min-Intervall.
  5. Abschnitte Inkubation für 1 h in PBS mit 10% normalem Ziegenserum und 0,5% Triton X-100.
  6. Abschnitte über Nacht Inkubation bei 4 ° C in primären Antikörpers in PBS mit 0,5% Triton X-100 hergestellt. Die primären Antikörper verwendet wurden, waren wie folgt: Huhn anti-GFP 1: 1.000, Maus anti-S100β 1: 400, Maus-anti-NeuN 1: 600, Maus-Anti-Glutamin-Synthetase 1: 300.
  7. Spülen Sie den Abschnitten 3 mal mit PBS auf 10 min Intervallen.
  8. Inkubieren Abschnitte mit den sekundären Antikörpern in PBS mit 10% normalem Ziegenserum für 2 Stunden bei Raumtemperatur hergestellt. Der zweite Antikörper waren wie folgt: Ziege anti-Maus Alexa546 1: 500, Ziege-Anti-Huhn Alexa488 1: 500.
  9. Montieren Sie die Teile auf Glasobjektträger, trocken und mehrere Tropfen Antifade Eindeckmediums, dann langsam decken die Schnitte mit einem Deckglas. Lagern Sie die Folien bei 4 ° C.
  10. Nehmen Bilder auf einem konfokalen Mikroskop mit einem 40x-Ölimmersionsobjektiv mit einer numerischen Apertur von 1,3.

4. Die konfokale [Ca 2+] i Imaging

HINWEIS: [Ca 2 +] i-Bildgebung erfolgte mit einem konfokalen Mikroskop mit einem 40x Wasserimmersionsobjektivlinse mit einer numerischen Apertur von 0,8.

  1. Zwischen 1 und 5 Stunden nach dem Schneiden, Ort Scheibe im Aufnahmeraum und superfuse mit sauerstoffAufzeichnungsPuffer bei Raumtemperatur mit Durchflussrate von 1-2 ml proMinute Dann legen Sie eine Platin Harfe mit Nylonsaiten auf der Oberseite der Scheibe, um die Bewegung während des Experiments zu minimieren.
  2. Visualisieren und suchen Sie das dorsale Striatum mit Hellfeld Lumineszenz unter einem 10X Wasserimmersionsobjektiv.
  3. Wechseln Sie auf die 40X Wasserimmersionsobjektiv Objektiv, und schalten Sie den 488-nm-Linie des Argon-Laser. Durch die Veränderung der Brennebene, finden Zellen etwa 20 & mgr; m unterhalb der Scheibenoberfläche befindet, zeigt basale Fluoreszenz in Soma, Niederlassungen und Zweigstellen. Zu beachten ist, kompromittiert Zellen zeigen meist Fluoreszenzniveau über dem Durchschnitt, die vermieden werden sollten.
  4. Verwenden Sie Modus 'Bildabtastintervalle', um das Scannen zu starten. Üblicherweise wird die Laserintensität auf 0,5 eingestellt - 5% des maximalen Ausgangs ausreicht, um Bild [Ca 2+] i mit Zyto-GCaMP3. Zur Überwachung [Ca 2+] i Dynamik im gesamten Gebiet der Astrozyten ist die "Rahmenscan 'mit einer Abtastrate von 1 Sekunde pro Frame oder schneller EMPFEHLUNDED, aber das muss je nach Experiment in Frage entschieden werden.
  5. Wenn nötig, um die Bild [Ca 2+] i in Prozessen verwenden digitale Vergrößerung von 2 - 3 fach zu überwachen 1-2 Astrozyten im gesamten Sichtfeld.
  6. Zu gesättigten Pixel bei einer Aufnahme zu vermeiden, verwenden Lookup-Modus "Hilo", um die Zellen Pseudocolor. Immer mit einem "Pilot Aufnahme" für ca. 5 min zu starten, um zu testen, ob rote Farbe erscheint als Hinweis auf Sättigung. Wenn dem so ist, senken Sie die Laserausgangsleistung, oder senken Sie die PMT / Gain / Offset-Werte und führen Sie eine weitere Pilotaufzeichnung zu testen die Pixelwerte im nicht gesättigten Bereich. Typischerweise für die Bildgebung Astrozyten verwendet die kombinierten Parameter [Ca 2+] i im Striatum sind wie folgt: Laserausgangsleistung von 0,5 bis 5% (von 10 mW), PMT 550-650 Volt, Gewinn 2,0 - 3.5X und Offset 0 - 5%.

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Representative Results

Für Astrozyten spezifische Expression von Cyto-GCaMP3 im Striatum, verwendeten wir Adeno-assoziierten Virus (AAV) des Serotyp 5 und die GFAP GfaABC 1 D-Promotors (1A), die zuvor gezeigt wurde, robuste und GCaMP3 Reportergen fahren Expression in hippokampalen und kortikalen Astrozyten 8,14. Zwei Wochen nach der Virusmikroinjektion in die Maus-Striatum wurde die Maus (~ 10 Wochen alt) perfundiert und IHC auf dünnen Hirnschnitten durchgeführt, um Cyto-GCaMP3 Expression im Striatum (1B) zu bewerten. Wir haben festgestellt Zyto-GCaMP3 mit GFP Antikörper und auch gefärbt die Scheiben mit einer bekannten Astrozyten Marker, S100β. Cyto-GCaMP3 Expression wurde nur in S100β positiven Zellen gefunden. Keine Expression wurde in Neuronen mit NeuN (2A und 2B) visualisiert gefunden, was darauf hindeutet, Astrozyten spezifische Expression. Wichtig ist, dass Zyto-GCaMP3 Ausdruck in ~ 60% der S100β positiven Zellen (Fi erkanntAbbildung 2C).

Astrozyten antworten Gehirn Beleidigungen wie Verletzungen, Ischämie und Infektion durch die Anzeige ändert, die sich als Astrozyten Reaktivität, die ein Spektrum von möglichen Änderungen von leichten bis schweren 15 stellt gekannt haben. Wir versuchten zu beurteilen, ob Virus Mikroinjektion verursacht offenkundige Astrozyten Reaktivität. Es wurde zuvor gezeigt, dass eine reduzierte Expression von Glutamin-Synthetase (GS) mit den reaktiven Astrozyten 16,17 verbunden. Daher wurde GS-Expression im Striatum von WT und Viren injizierten Mäusen verglichen. Wir fanden keine signifikanten Veränderungen in der GS-Expression in striatalen Astrozyten folgenden Virusinjektion (3A - C), was keinen offenkundigen Astrozyten Reaktivität mit GS Ebenen als Metrik. Dieser allgemeine Ansatz könnte in der künftigen Arbeit mit anderen Markern der Reaktivität erweitert Astrozyten Reaktivität zu bewerten. Beachten Sie jedoch, dass GFAP Ebenen kann kein geeigneter Weg, um Reaktivität in striat messenal Astrozyten, weil GFAP nicht in nachweisbaren Mengen in den meisten striatalen Astrozyten unter basalen Bedingungen 18 ausgedrückt. Zusammenfassend mithilfe IHC wir schließen Zyto-GCaMP3 Ausdruck war robust und speziell für Astrozyten im Striatum, und das Virusinjektion nicht verursacht Astrozyten Reaktivität wie GS Änderungen Expressionsniveau beurteilt.

Wir nächsten vorbereitet akuten Hirnschnitten von Virus injizierten Mäusen zu Bild [Ca 2+] i in striatalen Astrozyten. Akuter 300 um dicke sagittale oder koronale Schnitte wurden hergestellt, und nach einer Erholungsphase wurden die Schnitte in einer Aufzeichnungskammer auf einem konfokalen Mikroskop für [Ca 2+] i Abbilden unter Verwendung der 488 nm-Linie eines Argon-Lasers angeordnet. Wie sie zeigten sichtbare grüne Fluoreszenz in Zellen, die mit deutlich buschige Morphologie (Abbildung 4 - striatalen Astrozyten Cyto-GCaMP3 exprimieren konnte leicht in den meisten (normalerweise alle) der striatalen Scheiben (slices 7 pro Maus ~ 6) identifiziert werden, 4A gezeigt ist; mindestens 10 Astrozyten Anzeige Zyto-GCaMP3 konnte abgebildet werden und sind in Abbildung 4A als Regions of Interest (ROI) aufgetragen. Stärkere Vergrößerung Bildgebung mit einer zusätzlichen digitalen Zoom von 2,0 - 3,0 war notwendig, um Einzel Astrozyten (4B) zu identifizieren. Unter diesen Umständen wurden ganze Astrozyten Territorien Zyto-GCaMP3 Expression zeigte, wie in 4B gezeigt. Spontane Ca 2+ Signale wurden einfach in den Somata sowie in den Niederlassungen und Zweigstellen von Astrozyten 6 gemessen.

Figur 1
Abbildung 1: Viral Lieferung GeCIS (zB Zyto-GCaMP3) von AAV2 / 5 in den erwachsenen Maus Striatum. A. Schematische zeigt das Protokoll für AAV2 / 5 Mikroinjektionen in den dorsolateralen Striatum.B. zeigt die ungefähre Position der Mikroinjektionsnadel in Bezug auf das Striatum und den für die stereotaktische Injektionen verwendet Koordinaten. Das Bild einer Nissl-gefärbte Scheibe in Panel B wurde von ALLEN BRAIN ATLAS heruntergeladen.

Figur 2
Abbildung 2: Cyto-GCaMP3 Ausdruck war spezifisch für striatalen Astrozyten. A - B. Repräsentative Bilder zeigen, dass Zyto-GCaMP3 Expression kolokalisiert mit einem Marker für Astrozyten (S100β) (B), aber nicht mit einem Marker für Neuronen (NeuN) (A) C. Zusammenfassung Bargraph für Kolokalisationsexperimenten wie sie gezeigt. in A und B.

Figur 3
Figur 3: Cyto-GCaMP3 Expression innerhalb striatalen Astrozyten keine Änderungen in der Expression von GS verursachen.A - B. Repräsentative Bilder der GCaMP3 und GS IHC von Mäusen, die AAV2 / 5 für GCaMP3 erhalten hatte. Images für die Steuerung nicht injizierten Mäusen werden auch gezeigt. C. Bargraph fasst Ergebnisse von Experimenten, wie die in A und B (ns zeigt nicht signifikant mit einem ungepaarten Student t-Test, p <0,05).

Figur 4
Abbildung 4: Repräsentative Beispiele von [Ca2 +] i-Signale von striatalen Astrozyten mit Zyto-GCaMP3 aufgezeichnet. Z-Stapel-Bild zeigt 10 Astrozyten (nummeriert von 1 bis 10) A. Ein abgeflachter .Die Spuren unten zeigen [Ca 2+] i-Signale über 5 min von den 10 in A B. A gezeigten Zellen aufgezeichnet abgeflacht und vergrößerten z. -stack Bild für eine einzelne astrocyte.The Spuren unten zeigen [Ca 2+] iSignale über 5 min für die in B gezeigten Einzelzelle aufgezeichnet.

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Discussion

Die hier beschriebenen Verfahren haben uns erlaubt, Zyto-GCaMP3 in striatalen Astrozyten in vivo für die anschließende [Ca 2+] i-Bildgebung in situ auszudrücken. Dieses Verfahren hat Vorteile gegenüber der Verwendung von transgenen oder Knockout-Mäusen, wie robust der Expression des Zielproteins, Geschwindigkeit und Flexibilität der experimentellen Durchführung und anatomischen Besonderheiten. Der Ausdruck GCaMP3 mit AAV2 / 5 wurde als spezifisch und robust. Die Kombination von GFAP GfaABC 1 D-Promotor mit der AAV-Serotyp 5 ist kritisch, um die Spezifität zu erzielen. Eine Einschränkung des hier beschriebenen Verfahrens ist, dass Virusinfektion und Chirurgie Verfahren kann Astrozyten Reaktivität führen, insbesondere mit hohem Titer Viren 19. Wichtig ist, dass in der aktuellen Studie, AAV2 / 5 Mikroinjektionen mit einer relativen niedrigem Titer nicht verursacht Abnahme der GS, die mit Astrozyten Reaktivität 19 in Verbindung gebracht wurden. Ähnliche Kontrollen für hipp gemeldetocampal Astrozyten 8. Jedoch ist es wichtig, die Notwendigkeit dieser Regler für jeden Gehirnbereich zu unterstreichen, nicht zuletzt wegen Astrozyten sind heterogene 20, und weil sie wahrscheinlich unterschiedliche Funktionen in unterschiedlichen Regionen des Gehirns.

Einer der wichtigen Faktoren, die die Robustheit des Zielgen-Expression unter Verwendung der Mikroinjektion Virus beeinflusst, ist die Koordinaten im Einsatz, die unter den verschiedenen Mausstämmen und verändert sich über die Entwicklung der Tiere variiert. Nur C57BL / 6-Mäuse von ~ 8 Wochen wurden in dieser Studie verwendet. Es wurde auch gezeigt, dass die virale Expression von GFP in striatalen Neuronen und Astrozyten der Ratte nachgewiesen werden 4 Tage nach der Injektion erreichte ein Plateau von 2 - 4 Wochen nach der Injektion, und blieb dann für 9 Monate stabil nach der Injektion 21. Der zeitliche Verlauf der Zyto-GCaMP3 Ausdruck wurde nicht gerade hier bestimmt, sondern mindestens zwei Wochen für Virus-Expressions sindempfohlen.

Der Ansatz der Verwendung von AAV2 / 5-vermittelten Expression von GeCIS in striatalen Astrozyten können nun verwendet werden, um besser zu verstehen, Astrozyten [Ca 2+] i Signalisierung im Striatum werden. Insbesondere ist Zyto-GCaMP3 Expressionsniveau ausreichend hoch, um Bildgebung von [Ca2 +] i-Signale in kleinen Populationen von Astrozyten (~ 10 Zellen) und innerhalb der gesamten Gebiete der einzelnen Astrozyten zu ermöglichen. Die detaillierte Analyse der [Ca 2+] i-Signale noch nicht abgeschlossen, doch bisher [Ca 2+] i Signale von distal Prozesse soweit ~ 50 & mgr; m entfernt von der Soma (4) erfasst wurde. Ausführliche Experimente an Astrozyten [Ca 2+] i-Signale und deren korrelative und verursachenden Funktionen im Striatum sind denkbar. In der Zukunft, raffinierte Ansätze (dh Promotoren) sind notwendig, um GeCIS genetisch definierten Populationen von Astrozyten zu liefern, so dass manerkunden Calcium-Signalgebung in verschiedenen Bevölkerungsgruppen von Astrozyten 20.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Acknowledgements

Der Großteil der Arbeit und die beteiligten Mitarbeiter wurden von NIH Zuschusses NS060677 und teilweise durch NIH gewährt MH099559 und MH104069 (BSK) unterstützt. Ein Teil der Arbeit wurde auch von der CHDI Foundation unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Syringe Pump Harvard Apparatus 704506
Glass Capillaries World Precision Instruments 1B100-4
Micropipette puller Narishige PC-10
Micropipette grinder Narishige EG-40
pZac2.1 GfaABC1D.cyto-GCaMP3 Addgene 44331 a plasmid sent to UPenn Vector Core for virus packaging
1 ml syringe BD 309628
syringe needle BD 305109
AAV2/5 virus UPenn vector core NA
Sudan red IV Sigma-Aldrich 67386
Mineral oil CVS Pharmacy 152355
Cryostat Leica CM3050 S
Stereotaxic instrument David Kopf Instruments 900LS
High Speed Rotary Micromotor Kit FOREDOM K.1070
Paraformaldehyde Santa cruz biotechnology sc-281692
Super Glue Krazy®Glue KG925
Microslicer Ted Pella DTK-Zero 1
Confocal microscopes Olympus FV300 and FV1000
Normal goat serum Vector S-1000
chicken anti-GFP Abcam ab13970
mouse anti-s100β Sigma-Aldrich S2532
mouse anti-NeuN Millipore MAB377
mouse anti-glutamine synthetase Millipore MAB302
goat anti-mouse-Alexa546 Invitrogen A11003
goat anti-chicken-Alexa488 Invitrogen A11039
Microscope Slides Fisher Scientific 12-550-15
Cover Glass Fisher Scientific 12-548-5J
Mounting Medium Vector H-1000

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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1 Comment

  1. What kind of drug you use to anesthetize the mouse before decapitation? Thank´s

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 23, 2016 - 6:27 PM

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