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Non terminale Tecniche di prelievo di sangue in Guinea Pigs

Biology

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Summary

Anche se un modello noto, la cavia rappresenta attualmente una nicchia in scienze animali sperimentali e dati limitati sono disponibili sul esecuzione della maggior parte delle procedure. Qui vi presentiamo quattro diversi approcci alla non-terminale in tecniche di campionamento del sangue in vivo su cavie sia coscienti o anestetizzati.

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Birck, M. M., Tveden-Nyborg, P., Lindblad, M. M., Lykkesfeldt, J. Non-Terminal Blood Sampling Techniques in Guinea Pigs. J. Vis. Exp. (92), e51982, doi:10.3791/51982 (2014).

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Abstract

Le cavie possiedono diverse analogie biologiche per l'uomo e sono convalidati modelli animali sperimentali 1-3. Tuttavia, l'uso di cavie rappresenta attualmente una zona relativamente ristretta dei dati di ricerca e descrittivi sulla metodologia specifica è corrispondentemente scarsa. Le caratteristiche anatomiche di cavie sono leggermente diversi da altri modelli di roditori, quindi la modulazione di tecniche di campionamento per ospitare per specie-specifiche differenze, ad es., Rispetto ai topi e ratti, sono necessari per ottenere campioni di qualità sufficiente e di alta. Per quanto sia lungo e breve termine in studi in vivo spesso richiedono ripetuto sangue campionamento la scelta della tecnica deve essere ben considerato, al fine di ridurre lo stress e il disagio negli animali, ma anche per garantire la sopravvivenza, nonché la conformità con i requisiti di dimensione del campione e accessibilità. Campioni di sangue venoso possono essere ottenuti ad un certo numero di siti in cavie ad es., La safena e giugularevene, ogni tecnica contenente sia vantaggi che svantaggi 4,5. Qui, vi presentiamo quattro diverse tecniche di campionamento del sangue sia per cavie coscienti o anestetizzati. Le procedure sono tutte le procedure non-terminali a condizione che i volumi di campione e il numero di campioni non superino le linee guida per la raccolta del sangue negli animali da laboratorio 6. Tutti i metodi descritti sono stati accuratamente testati e applicati per ripetute in vivo prelievo di sangue in studi all'interno della nostra struttura di ricerca.

Introduction

La cavia è un modello valido e convalidato animale sperimentale a causa di un numero di somiglianze biologiche per l'uomo, come l'esigenza di un approvvigionamento alimentare di vitamina C, lipoproteine ​​plasmatiche paragonabili enzimi che metabolizzano e profili delle lipoproteine, così come similitudini in comune con placentazione umana e sviluppo prenatale 1-3,7,8. Questo rende la cavia un modello attraente e adatto per studiare gli effetti delle malattie dieta associata come la malattia non alcolica steatosi epatica, malattie cardiovascolari e gli effetti putativi di carenza di vitamina C, ma anche l'effetto di esempio., Intervento dietetico materno sulla via di sviluppo prole.

Ripetuto prelievo di sangue è spesso richiesto sia lungo e breve termine in studi in vivo. A causa delle differenze anatomiche specie-specifici è necessaria la modulazione della tecnica di campionamento al fine di ottenere campioni di sangue di cavie rispetto ad altri modelli di roditori 3,9. Questa tecnica permette ripetuta campioni di piccole quantità di sangue (100-400 ml), ad es., Per determinare i marcatori biochimici nel plasma. Se un campione ancora più piccolo è sufficiente (50-100 ml), questo può facilmente essere ottenuto pungere la vena dell'orecchio. Questa tecnica può anche essere effettuata in animali coscienti ed è utile ad esempio quando si misura la glicemia 10,11. Campionamento dalla vena giugulare consente la raccolta di grandi quantità di sangue (1-2 ml), ma richiede l'anestesia.

Qui, vi presentiamo quattro diverse tecniche di campionamento del sangue sia per cavie coscienti o anestetizzati. Il procedures sono tutte le procedure non-terminali a condizione che i volumi di campione e il numero di campioni non superino le linee guida per la raccolta del sangue negli animali da laboratorio 6. E 'nell'interesse della buona scienza, nonché di benessere degli animali che lo stress dovrebbe essere ridotto al minimo. Di conseguenza, solo ben addestrato e personale competente deve eseguire le procedure sugli animali.

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Protocol

Le procedure illustrate sono state eseguite secondo protocolli approvati dal danese Animal Sperimentazione Ispettorato sotto il Ministero dell'alimentazione, dell'agricoltura e della pesca.

1 Prelievo di sangue dal laterale safena o tarsale Vena

  1. Eseguire questa procedura senza anestesia e con l'aiuto di un investigatore, una gestione della cavia, e una raccolta del campione.
  2. Radere la regione tarsale della zampa posteriore con un rasoio elettrico fino a quando le vene sono visibili. Assicurarsi che la zona è abbastanza grande da evitare pelliccia interferire con il sito di puntura.
  3. Posizionare la zampa posteriore in un bagno di acqua tiepida e strofinare delicatamente la gamba, rendendo le vene più dilatati ed evidenti.
  4. Pulire la gamba con un asciugamano pulito e disinfettare il sito di puntura con una garza o un batuffolo di cotone imbevuto di alcool al 70%.
  5. Trattenere la cavia ed estendere la gamba posteriore verso il basso, mentre applicando una leggera pressione immediatamente al di sopra del ginocchio to fornire stasi.
  6. Pungere la vena con un ago 21 G o bisturi. Raccogliere esempio sangue., Utilizzando un tubo di raccolta o capillare. Manipolare delicatamente la gamba per aiutare il flusso di sangue.
  7. Rilasciare stasi, una volta ottenuto il campione. Applicare un pezzo di garza o cotone lana con una leggera pressione sul sito di puntura finché il sanguinamento si è fermato.
  8. Ritorna l'animale nella sua gabbia e monitor per 5-10 minuti al fine di garantire l'emostasi.

2 Prelievo di sangue dalla vena dell'orecchio

  1. Eseguire questa procedura senza anestesia da solo o preferibilmente con l'aiuto di un collega.
  2. Disinfettare la superficie dorsale del padiglione auricolare con una garza o un batuffolo di cotone imbevuto di alcool al 70%.
  3. Applicare una leggera pressione alla base dell'orecchio per fornire stasi.
  4. Pungere la vena con un ago 21 G o bisturi, e raccogliere il sangue.
  5. Rilasciare stasi, una volta ottenuto il campione, Applicare un pezzo di garza o cotone idrofilo con gepressione ntle al sito di puntura finché il sanguinamento si è fermato.
  6. Ritorna l'animale nella sua gabbia e monitor per 5-10 minuti al fine di garantire l'emostasi.

3 Prelievo di sangue dalla giugulare Vena

  1. Effettuare questa procedura utilizzando l'aiuto di un investigatore supplementare; una gestione della cavia e una raccolta del campione.
  2. Anestetizzare la cavia con un anestetico adatto per tutta la durata di questa procedura. Una miscela di tiletamina (0,93 mg / kg), zolazepam (0,93 mg / kg), xilazina (1.49 mg / kg) e butorfanolo (0,06 mg / kg) può essere utilizzato.
  3. Posizionare la cavia anestetizzata sulla sua schiena e ritrarre delicatamente le zampe anteriori caudalmente.
  4. Shave e disinfettare (ad es., Con il 70% di alcol), la parte ventrale del collo.
  5. Rivestire la siringa sia con eparina o EDTA prima del campionamento, al fine di ridurre il rischio di coagulazione.
  6. Palpare la clavicola e inserire un G 25 (o 23 G) ago montato su una siringa da 1 ml approximately 1 centimetro lateralmente alla linea mediana a livello dell'articolazione della spalla. Tenere la siringa in una leggera inclinazione verso l'alto e mediale, mentre applicando una leggera pressione negativa. Evitare di danneggiare le strutture sottostanti come la vena giugulare si trova abbastanza superficiale. Inclinare il collo della cavia leggermente all'indietro per fornire maggiore stasi della vena.
  7. Rilasciare le zampe anteriori quando si ottiene il campione di sangue, e alleviare stasi prima che l'ago viene retratto. Usare un pezzo secco di garza o di cotone per applicare una leggera pressione sul sito di puntura.
  8. Ritorna l'animale in una gabbia di recupero e monitorare al fine di garantire l'emostasi e il recupero dall'anestesia.

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Representative Results

Quattro diversi approcci alla non-terminali vivo tecniche di campionamento del sangue in entrambi in cavie coscienti o anestetizzati sono stati presentati. Figura 1 illustra il corso della safena laterale e vena tarsale nella cavia e possibili siti di puntura. Vene dell'orecchio visibili sulla superficie dorsale di un orecchio cavia sono illustrati nella Figura 2 Queste vene possono essere usate per il prelievo di sangue quando è richiesto solo un volume molto piccolo. La posizione della cavia per la giugulare prelievo di sangue è illustrato nella Figura 3. L'corso della vena giugulare è illustrato dalle frecce con il più alto freccia che punta al sito di puntura raccomandata.

Figura 1
Figura 1 La vena safena e tarsale laterale nella cavia. L'immagine illustra il corso e lasito di puntura per il prelievo di sangue dalla safena laterale (freccia in alto) o la vena tarso (freccia in basso) nella cavia.

Figura 2
Figura 2 vene dell'orecchio. Questa immagine illustra vene dell'orecchio (frecce) visibili sulla superficie dorsale di un orecchio cavia. Queste vene possono essere usate per il prelievo di sangue quando è richiesto solo un volume molto piccolo.

Figura 3
Figura 3 Posizione del cavia per il prelievo di sangue giugulare vena. Ciò illustra la posizione della cavia e il sito di puntura per il prelievo di sangue della vena giugulare. Le frecce indicano il corso della vena giugulare con il più alto freccia che punta verso il sito di puntura raccomandata.

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Discussion

Rispetto ai topi e ratti, cavie sono timorosi per natura e devono essere affrontati con calma e gestite correttamente, al fine di ridurre lo stress. Da un punto di vista del benessere degli animali, agendo con cura è naturalmente una priorità; tuttavia, questo sarà anche ridurre il rischio di effetti di ansia associati sui dati raccolti ad es., aumento dei livelli ematici di corticosteroidi e di glucosio 12. Allo stesso modo, la gestione quotidiana sarà abituare gli animali a procedure normali e può servire a ridurre ulteriormente lo stress. Esperienza pratica in una particolare tecnica di prelievo di sangue deve essere acquisita da prima osservazione di un operatore esperto e, successivamente, condurre la tecnica sotto controllo fino a raggiungere competenza. La tecnica scelta dovrebbe ridurre ideale sia lo stress e disagio al minimo, ma anche per garantire la sopravvivenza, nonché la conformità con i requisiti di dimensione del campione e accessibilità. Per tutti i metodi di campionamento di sangue presentate tecniche asettiche devono essereutilizzato per ridurre al minimo il rischio di infezione e garantire la raccolta di campioni incontaminati.

Gli approcci illustrati a prelievi di sangue assicurano la sopravvivenza dell'animale condizione che il volume del campione e la frequenza è realizzato secondo le linee guida e possono tutti essere applicato per il campionamento ripetuto in entrambi gli studi a breve e lungo termine 6. Questo consente il monitoraggio costante dei singoli animali nel tempo, riducendo così la varianza e il numero di animali inclusi nel rispetto (riduzione) delle 3R '13,14. Le tecniche qui presentate sono diverse gamme di volume di campione ottenibili (pochi microlitri fino a 1-2 ml), che dovrebbe essere considerato prima di iniziare un esperimento. Anche se le procedure per la raccolta di sangue dalla vena giugulare in cavie non-anestetizzato sono state descritte 12, si consiglia vivamente l'uso di anestesia per ridurre lo stress e disagio, per quanto possibile. Nel fare ciò, la scelta di anestesia dovrebbe essere attentoy affrontato, notando che le cavie sono notoriamente difficili da anestetizzare e potrai notevole efficacia variazione di anestetico, nonché una elevata sensibilità verso la respirazione indotta depressione 15,16. Come la vena giugulare in cavie non è né visibile né palpabile l'eventuale riduzione di stasi / dilatazione venosa può aumentare le difficoltà di campionamento, quindi è generalmente raccomandato di evitare agenti vaso costrittivo in anestesia miscele. . Inoltre, gli effetti noti di agenti anestetizzante specifiche che possono interferire con la raccolta di dati ad esempio desiderato, effetti cardiovascolari e / o livelli di glucosio nel sangue aumentati seguenti α 2 - azioni agonisti nei roditori devono essere valutati 16,17. L'uso di anestesia per inalazione, come isoflurano può anche essere un'opzione, ma come intubazione in cavie è un compito molto difficile la cura deve essere presa per evitare interferenze dall'inalazione-maschera con la posizione della testa / collo, in quanto ciò potrebbe complicmangiato la procedura inutilmente. È necessaria anche Generalized anestesia es., Per inalazione per puntura cardiaca, che può prevedere un volume di campione più ampio. Tuttavia, puntura cardiaca è una procedura terminale e quindi non applicabile per campionamento ripetuto e non verrà ulteriormente descritto.

I potenziali effetti negativi, quali emorragie, ematomi, trombosi, infezioni e spaventare possono verificarsi a seguito di puntura di una vena. Nella nostra esperienza, la cavia non presenta un aumento del rischio di tali complicanze indesiderate rispetto ad altri modelli di roditori, a condizione che la procedura viene eseguita come descritto nel manoscritto corrente. Come la vena giugulare non può essere visualizzata dalla superficie esterna, è molto importante per alleviare stasi prima di estrarre l'ago e di fornire un'adeguata emostasi, al fine di minimizzare il rischio di peri-venose emorragia e lividi. In caso di effetti collaterali, il trattamento deve sempre essere richiesto dal responsabile Veterivete-. Per motivi di benessere degli animali e la scienza, gravi considerazioni deve essere data per l'effetto combinato di volume del campione e la frequenza e la scelta della tecnica di campionamento. Tutte le tecniche di campionamento del sangue descritte sono stati accuratamente testati e applicati per ripetute in vivo prelievo di sangue in studi all'interno della nostra struttura di ricerca.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare. Tutte le procedure sono state approvate dalla legge Sperimentazione Animale della Danimarca, che è in accordo con il Consiglio d'Europa Convenzione ETS 123.

Acknowledgments

Riconosciamo il sapiente aiuto di Annie B. Kristensen, Elisabeth V. Andersen, Belinda B. Bringtoft ed i custodi degli animali presso il Dipartimento di Medicina Sperimentale, Frederiksberg Campus, Facoltà di Scienze della Salute e Scienze Mediche, Università di Copenhagen, Danimarca. Jacob Lønholdt viene ringraziato per l'eccellente assistenza tecnica per le riprese delle procedure. Questo studio è stato sostenuto in parte dal Centro LIFEPHARM di Farmacologia in vivo e Università di Copenhagen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Electric shaver Wella (Contura), Denmark 273207 Alternative product may be used. Multiple suppliers
Syringes  B.Braun-Omnifix-F, Germany 9161406V Alternative product may be used. Multiple suppliers
Needles BD Microlance, Spain 301156 Alternative product may be used. Multiple suppliers
Microvette collection tube  Sarstedt, D-51588Nümbrecht, Germany 201,288,100 Alternative product may be used. Multiple suppliers
Accu-Check analyzer Roche A/S Diagnostics, Denmark Alternative product may be used. Multiple suppliers
Heparin 5000 IE/ml LEO Pharma, Denmark Alternative product may be used. Multiple suppliers
Anesthesia Zoletil 50, Chemvet, Denmark Alternative product may be used. Multiple suppliers
Anesthesia Narcoxyl vet 20 mg/ml, Intervet, Denmark Alternative product may be used. Multiple suppliers
Anesthesia Torbugesic vet 10 mg/ml, Scanvet, Denmark Alternative product may be used. Multiple suppliers
Neutral eye ointment Alternative product may be used. Multiple suppliers
Gauze or a cotton swab  Alternative product may be used. Multiple suppliers
Disinfectant (70% alcohol) Alternative product may be used. Multiple suppliers

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