रैपिड बैक्टीरियल पहचान और एंटीबायोटिक संवेदनशीलता परीक्षण के लिए एक रक्त संस्कृति गोली की तैयारी

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Immunology and Infection

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Summary

एक सकारात्मक रक्त संस्कृति से एक तेजी से बैक्टीरिया गोली तैयारी ऐसी MALDI-TOF द्वारा पहचान, ग्राम धुंधला, एंटीबायोटिक संवेदनशीलता परीक्षण और पीसीआर आधारित परीक्षण के रूप में आवेदन के लिए एक नमूना के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है. परिणाम तेजी से खून में संक्रमण से पीड़ित रोगियों के परिणाम में सुधार करने के लिए चिकित्सकों को सूचित किया जा सकता है.

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Croxatto, A., Prod'hom, G., Durussel, C., Greub, G. Preparation of a Blood Culture Pellet for Rapid Bacterial Identification and Antibiotic Susceptibility Testing. J. Vis. Exp. (92), e51985, doi:10.3791/51985 (2014).

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Abstract

खून में संक्रमण और पूति रुग्णता और मृत्यु दर का एक प्रमुख कारण हैं. bacteremia से पीड़ित रोगियों का सफल परिणाम इष्टतम एंटीबायोटिक उपचार मार्गदर्शन करने के लिए संक्रामक एजेंट की एक तेजी से पहचान पर निर्भर करता है. सकारात्मक रक्त संस्कृति से ग्राम दाग का विश्लेषण तेजी से किया और पहले से ही काफी एंटीबायोटिक आहार को प्रभावित किया जा सकता है. हालांकि, संक्रामक एजेंट की सटीक पहचान अभी भी इष्टतम लक्षित उपचार की स्थापना के लिए आवश्यक है. हम यहां ऐसे डिस्क प्रसार परख द्वारा MALDI-TOF एमएस, एंटीबायोटिक संवेदनशीलता परीक्षण (AST) द्वारा पहचान या स्वचालित AST सिस्टम के रूप में कई आवश्यक बहाव के अनुप्रयोगों के लिए एक नमूना के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है कि एक सकारात्मक रक्त संस्कृति से एक सरल और तेजी से बैक्टीरिया गोली तैयारी पेश और स्वचालित द्वारा नैदानिक ​​परीक्षण पीसीआर आधारित. रक्त संस्कृति बैक्टीरियल छर्रों पर सीधे लागू इन अलग पहचान और AST सिस्टम के प्रदर्शन को बहुत एसआई हैप्रदर्शन करने milar सामान्य रूप से अगर प्लेट पर हो अलग कालोनियों से प्राप्त की. परंपरागत तरीके की तुलना में, एक जीवाणु गोली का तेजी से अधिग्रहण काफी पहचान और AST दोनों रिपोर्ट करने के लिए समय कम कर देता है. इस प्रकार, निम्न रक्त संस्कृति सकारात्मकता, MALDI-TOF द्वारा पहचान 8 के भीतर क्रमशः 18 घंटा, स्वचालित AST सिस्टम या डिस्क प्रसार assays के द्वारा AST का परिणाम है जबकि कम से कम 1 घंटा के भीतर सूचित किया जा सकता है. इसी तरह, एक तेजी से पीसीआर आधारित परख के परिणामों चिकित्सकों के लिए एक bacteremia की रिपोर्ट के बाद कम से कम 2 घंटे भेजी जा सकती है. साथ में, इन परिणामों के एक रक्त संस्कृति बैक्टीरिया गोली का तेजी से तैयारी की पहचान और AST वापसी समय पर और इस तरह खून में संक्रमण से पीड़ित रोगियों का सफल परिणाम पर एक महत्वपूर्ण प्रभाव पड़ता है कि प्रदर्शित करता है.

Introduction

अस्पताल में भर्ती रोगियों में खून में संक्रमण और पूति रुग्णता और मृत्यु दर का एक प्रमुख कारण हैं. इस प्रकार, संक्रमण खून से संबंधित मृत्यु दर अस्पताल में भर्ती मरीज ​​के 37% के बारे में 14% में मनाया जाता है और गहन देखभाल इकाइयों रोगियों 1-3 में 35% तक की वृद्धि हो सकती है. संक्रामक एजेंट की तेजी से पहचान इष्टतम रोगाणुरोधी उपचार मार्गदर्शन करने के लिए और रोगाणुरोधी चिकित्सा 4,5 के सफल परिणाम को बढ़ाने के लिए निर्णायक है. सकारात्मक रक्त संस्कृति से ग्राम दाग का तेजी से विश्लेषण पहले से ही रोगाणुरोधी चिकित्सा 6,7 लेकिन संक्रामक एजेंट की सटीक पहचान के अनुकूलन पर एक महत्वपूर्ण प्रभाव पड़ता है रोगियों को सर्वश्रेष्ठ रूपांतरित एंटीबायोटिक उपचार प्रदान करने के लिए आवश्यक है. उदाहरण के लिए, विभिन्न एंटीबायोटिक उपचार परहेज enterococci और ग्राम धुंधला द्वारा अंतर करना मुश्किल हो जाता है कि स्ट्रेप्टोकोक्की साथ bacteremia निम्नलिखित कार्यान्वित किया जाना है. इसी तरह, प्रजातियों पर पहचान लेवएल 8 lactams β के लिए एक बढ़ा प्रतिरोध प्रदान जो एक गुणसूत्र एएमपीसी जीन एन्कोडिंग ग्राम नकारात्मक enterobacteria का पता लगाने के लिए आवश्यक है.

एक सकारात्मक रक्त संस्कृति के साथ, पारंपरिक नैदानिक ​​दृष्टिकोण जैव रासायनिक परीक्षण, विभिन्न चयनात्मक मीडिया पर विकास और स्वचालित माइक्रोबियल पहचान प्रणाली सहित विभिन्न दृष्टिकोण के साथ अतिरिक्त ऊष्मायन से पहले पहचान के कई घंटे की आवश्यकता है जो विभिन्न अगर प्लेटों पर संक्रामक एजेंट, उपसंस्कृति के लिए है. एक पारंपरिक नैदानिक ​​दृष्टिकोण के परिणामों के समय के बारे में 1 से 3 दिन की है.

सूक्ष्मजीवों की तेजी से पहचान के लिए मैट्रिक्स की मदद से लेजर desorption / आयनीकरण समय की उड़ान मास स्पेक्ट्रोमेट्री (MALDI-TOF) प्रौद्योगिकी के उद्भव जल्दी से सकारात्मक रक्त से सीधे भी अगर प्लेट पर हो कालोनियों से सूक्ष्मजीवों लेकिन पहचान करने के लिए एक नए उपकरण प्रदान की गई है संस्कृतियों (चित्रा 1) 9-12. गुरक्त संस्कृतियों से एक संक्रामक एजेंट की पहचान करने के लिए MALDI-TOF के ई उपयोग काफी कुछ मिनट के बजाय पारंपरिक तरीकों से आवश्यक घंटे और दिन के लिए परिणाम के लिए समय कम हो गया है. Croxatto एट अल. 13 से चर्चा की, MALDI-TOF पहचान की दक्षता सूक्ष्मजीव की पवित्रता और मात्रा सहित विभिन्न मापदंडों पर निर्भर करता है. इन दो मानदंडों को आसानी से अगर प्लेट पर हो असतत कालोनियों से प्राप्त लेकिन MALDI-TOF पहचान के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं कि कई सेलुलर और प्रोटीन घटक होते हैं जो रक्त संस्कृति के रूप में जटिल नमूने से जीवाणु संवर्धन और शुद्धि के लिए एक पूर्व विश्लेषणात्मक उपचार के लिए आवश्यक हैं.

रक्त संस्कृति से विभिन्न सूक्ष्मजीवों 'अलगाव तरीकों बैक्टीरियल निकासी 9,14, सीरम विभाजक विधि 10 के लिए सैपोनिन या अन्य हल्के डिटर्जेंट विधि सहित अध्ययन की एक संख्या में इस्तेमाल किया गया है, lysis centrifugation तरीकों 12 (चित्रा 2) 15 जो की अनुमति अमोनियम क्लोराइड एरिथ्रोसाइट-सेल पर आधारित एक साधारण रक्त संस्कृति बैक्टीरिया गोली तैयारी विकसित की है. यह रक्त संस्कृति गोली तैयारी भी ऐसी ग्राम धुंधला के रूप में अन्य प्रत्यक्ष बहाव के अनुप्रयोगों के लिए एक नमूना प्रदान करते हैं, इस तरह के मेथिसिलिन प्रतिरोधी Staphyloccocus ऑरियस का तेजी से पता लगाने (मरसा) के लिए POCT-PCRs, और साथ एंटीबायोटिक संवेदनशीलता परीक्षण के रूप में स्वचालित पीसीआर आधारित नैदानिक ​​परीक्षण स्वचालित AST सिस्टम और / या अगर प्लेट पर डिस्क प्रसार assays (चित्रा 3) के द्वारा.

Prod'hom एट अल द्वारा समझाया के रूप में इस काम में, हम खून संस्कृति बैक्टीरिया गोली की तैयारी के लिए विभिन्न चरणों का वर्णन. 15 (चित्रा 4). हम यह भी डे जाएगामुंशी रक्त संस्कृति गोली पर किया जा सकता है कि मुख्य आवेदन के तीन के लिए प्रोटोकॉल: स्वचालित Enterobacteriaceae के लिए सिस्टम 16 और staphylococci और स्वचालित PCR- साथ MALDI-TOF 15, पहचान (आईडी) और एंटीबायोटिक संवेदनशीलता परीक्षण (AST) द्वारा पहचान मरसा 17 का पता लगाने के लिए आधारित नैदानिक ​​परीक्षण.

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Protocol

इस प्रोटोकॉल विकसित की है और एक नियमित उपकरण के रूप में लागू किए जाने से पहले हमारी संस्था के अनुसंधान और विकास प्रक्रियाओं और नैतिक नियमों का पालन मान्य किया गया है.

अमोनियम क्लोराइड एरिथ्रोसाइट-lysing प्रक्रिया द्वारा एक रक्त संस्कृति बैक्टीरिया गोली से 1 की तैयारी

  1. बाद centrifugation के लिए एक सकारात्मक रक्त संस्कृति की तैयारी.
    1. रक्त संस्कृति टोपी जीवाणुरहित. बोतल की टोपी पर 70% इथेनॉल जोड़ें और इसे जला.
      नोट: एक लामिना का प्रवाह हुड के तहत यह कदम प्रदर्शन नहीं करते.
    2. एक लामिना का प्रवाह हुड के लिए बोतल ले जाएं. एक 20 जी सिरिंज से खून संस्कृति के 5 मिलीलीटर लीजिए.
    3. बाँझ पानी (एच 2 ओ) के 45 मिलीलीटर युक्त एक 50 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में रक्त संस्कृति के 5 मिलीलीटर जोड़ें और नमूना मिश्रण.
  2. सेल centrifugation द्वारा एक रक्त संस्कृति बैक्टीरिया गोली तैयार करना.
    1. आरटी पर 10 मिनट के लिए 1000 XG पर नमूना अपकेंद्रित्र.
    2. रेमोएक प्रयोगशाला वैक्यूम पंप के साथ (मुख्य रूप से एच 2 ओ और रक्त कोशिकाओं शामिल है) पर तैरनेवाला किया है.
    3. समाधान (0.15 एम एनएच 4 सीएल, 1 मिमी KHCO 3) lysing घर का बना अमोनियम क्लोराइड के 1 मिलीलीटर में गोली Resuspend. Scraping द्वारा और ट्यूब vortexing द्वारा गोली टूट और आरटी पर 10 मिनट के लिए 140 XG पर नमूना अपकेंद्रित्र.
    4. मुख्य रूप से लाल रक्त कोशिकाओं मलबे जिसमें सतह पर तैरनेवाला त्यागें.
      1. गोली रक्तस्रावी बने रहे, तो आगे अवशिष्ट लाल रक्त कोशिकाओं lyse करने और गोली धोने के लिए बाँझ और आसुत एच 2 0 2 मिलीलीटर में गोली resuspend. आरटी पर 10 मिनट के लिए 140 XG पर नमूना अपकेंद्रित्र और सतह पर तैरनेवाला त्यागें.
    5. एच 2 ओ के 200 μl में गोली Resuspend
  3. विभिन्न चयनात्मक और गैर चयनात्मक अगर मीडिया पर रक्त संस्कृति के उपसंस्कृति.
    1. एक 20 जी सिरिंज से खून संस्कृति के 1 मिलीलीटर लीजिए.
    2. रक्त संस्कृति पूर्णांक की 1 बूंद टीका लगानारक्त अगर, चॉकलेट अग्रवाल, McConkey अगर और Schaedler अगर पर चार quadrants ओ.
    3. एक 5% सीओ 2 माहौल में 37 डिग्री सेल्सियस पर रक्त अगर और चॉकलेट अगर प्लेटों सेते हैं, एक सामान्य वातावरण में McConkey अगर और अवायवीय स्थितियों में Schaedler अगर प्लेट.
    4. विभिन्न मीडिया पर बैक्टीरिया विकास का पालन करें.
    5. बैक्टीरियल शुद्धता के लिए जाँच करें.

MALDI-TOF एमएस द्वारा 2. पहचान

  1. रक्त गोली से प्रत्यक्ष पहचान.
    1. स्थानांतरण 1 एक MALDI लक्ष्य थाली पर रक्त गोली की μl और एक 42 डिग्री सेल्सियस ताप मंच पर इसे सूखा.
    2. 1 μl 70% फार्मिक एसिड के साथ नमूना ओवरले और 42 डिग्री सेल्सियस ताप मंच पर इसे सूखा.
    3. MALDI मैट्रिक्स की 1 μl के साथ नमूना ओवरले और 42 डिग्री सेल्सियस ताप मंच पर इसे सूखा (α-cyano-4-hydroxycinnamic acetonitrile-2.5% trifluoroacetic एसिड 50% में एसिड का समाधान संतृप्त).
    4. मल के लिए आगे बढ़ेंनिर्माताओं द्वारा वर्णित के रूप में एक MALDI-TOF एमएस प्रणाली के साथ डि-TOF एमएस विश्लेषण.
    5. पहचान स्कोर (एक स्कोर <2 के साथ उदाहरण के लिए) प्रजाति के स्तर पर अमान्य है, तो रक्त गोली नमूना के एक प्रोटीन निकासी करते हैं.
  2. रक्त संस्कृति गोली से प्रोटीन निकालने के बाद पहचान.
    1. आरटी पर 2 मिनट के लिए 13,000 XG पर 70% इथेनॉल और अपकेंद्रित्र के 1 मिलीलीटर के साथ गोली की 20 μl मिलाएं.
    2. सतह पर तैरनेवाला त्यागें और 70% फार्मिक एसिड के 25 μl और गोली के लिए 100% acetonitrile के 25 μl जोड़ें. भंवर सख्ती छर्रों resuspend. Vortexing से पहले पिपेट सुझावों के साथ उन्हें नीचे तोड़ने से कठिन छर्रों Resuspend.
    3. आरटी पर 2 मिनट के लिए 13,000 XG पर अपकेंद्रित्र. स्थानांतरण 1 एक MALDI लक्ष्य थाली पर सतह पर तैरनेवाला के μl (निकाले प्रोटीन होते हैं) और एक 42 डिग्री सेल्सियस ताप मंच पर इसे सूखा. 2.1.2 में वर्णित के रूप में आगे बढ़ें.

3 बैक्टीरियल identifएक स्वचालित माइक्रोबियल सिस्टम के साथ ication और एंटीबायोटिक संवेदनशीलता परीक्षण

  1. एक स्वचालित सूक्ष्म प्रणाली के साथ बैक्टीरिया की पहचान और AST के लिए एक जीवाणु निलंबन की तैयारी.
    1. स्वचालित माइक्रोबियल सिस्टम के साथ संगत बाँझ 0.45% NaCl समाधान के 3 मिलीलीटर युक्त एक प्लास्टिक ट्यूब तैयार करें.
    2. 0.6-0.8 की एक मैकफ़ारलैंड मैलापन को इसी एक जीवाणु निलंबन प्राप्त करने के लिए 0.45% NaCl समाधान में रक्त संस्कृति गोली की पर्याप्त मात्रा में जोड़ें. एक densitometer मशीन का उपयोग मैलापन उपाय.
      नोट: रक्त संस्कृति बैक्टीरिया गोली की मात्रा 0.6-0.8 की एक मैकफ़ारलैंड मैलापन प्राप्त करने के लिए 50 से 200 μl से भिन्न होता है.
  2. निर्माता द्वारा वर्णित के रूप में पहचान के लिए स्वचालित ग्राम पॉजिटिव (जीपी) या ग्राम नकारात्मक (जीएन) कार्ड और ग्राम पॉजिटिव COCCI और ग्राम नकारात्मक बैक्टीरिया के रोगाणुरोधी संवेदनशीलता परीक्षण के लिए स्वचालित AST कार्ड टीका लगाना.
    नोट: IdentificatioMALDI-TOF एमएस पहचान स्कोर मूल्य> 2 अगर n जीपी या जीएन कार्ड के साथ लागू नहीं है. रक्त अगर (जीपी और जीएन) और MacConkey अगर (जीएन) प्लेटों पर जीवाणु निलंबन subculturing द्वारा जीवाणु निलंबन की शुद्धता की जाँच करें.

डिस्क प्रसार परख द्वारा 4 एंटीबायोटिक संवेदनशीलता परीक्षण

डिस्क प्रसार परख रोगाणुरोधी संवेदनशीलता परीक्षण (EUCAST, संस्करण 3.0, अप्रैल 2013, www.eucast.org) पर यूरोपीय समिति द्वारा वर्णित है.

  1. एक जीवाणु निलंबन की तैयारी डिस्क प्रसार परख द्वारा रोगाणुरोधी संवेदनशीलता परीक्षण करने के लिए.
    1. बाँझ 0.9% NaCl समाधान के 3 मिलीलीटर युक्त एक ग्लास ट्यूब तैयार करें.
    2. 0.5 की एक मैकफ़ारलैंड मैलापन को इसी एक जीवाणु निलंबन प्राप्त करने के लिए 0.9% NaCl समाधान में रक्त संस्कृति गोली की पर्याप्त मात्रा में जोड़ें. एक densitometer मशीन का उपयोग मैलापन उपाय.
      नोट: रक्त संस्कृति की मात्राबैक्टीरियल गोली 0.6-0.8 की एक मैकफ़ारलैंड मैलापन प्राप्त करने के लिए 50 से 200 μl से भिन्न होता है.
    3. जीवाणु निलंबन भंवर.
  2. म्यूएलर-हिंटन अगर (महाराष्ट्र) या म्यूएलर-हिंटन अग्रवाल दुराराध्य जीवों अगर (MHF) पर जीवाणु निलंबन की टीका (महाराष्ट्र 5% Defibrinated घोड़े रक्त और 20 मिलीग्राम / β-निकोटिनामाइड एडीनाइन डाईन्यूक्लियोटाइड की एल के साथ पूरक).
    1. बैक्टीरियल निलंबन में एक बाँझ कपास झाड़ू डुबकी और धीरे ग्लास ट्यूब के अंदर दीवार पर झाड़ू मोड़ से अधिक तरल पदार्थ को हटा दें.
    2. तीन दिशाओं में swabbing द्वारा या एक स्वचालित थाली रोटेटर का उपयोग करके महाराष्ट्र / MHF अगर प्लेट की पूरी सतह पर समान रूप से जीवाणु निलंबन बिखरा हुआ है.
  3. टीका अगर प्लेटों पर रोगाणुरोधी डिस्क के अनुप्रयोग.
    1. मैन्युअल सूखे टीका अगर प्लेटों की सतह पर या एक संवेदनशीलता डिस्क मशीन का उपयोग करके बारीकी डिस्क लागू करें.
    2. उचित Tempe पर थाली सेतेrature और रोगाणुरोधी संवेदनशीलता परीक्षण EUCAST डिस्क प्रसार विधि में वर्णित के रूप में वातावरण (संस्करण 3.0, अप्रैल 2013, www.eucast.org).

5 स्वचालित मरसा की जांच के लिए नैदानिक ​​परीक्षण पीसीआर आधारित

  1. एक micropipette का प्रयोग, 20 सेकंड के दौरान पीसीआर आधारित नैदानिक ​​परीक्षण किट और भंवर स्वचालित मरसा के साथ प्रदान नमूना अभिकर्मक शीशी में खून संस्कृति गोली के 50 μl हस्तांतरण.
  2. एक 1 मिलीलीटर micropipette का प्रयोग, कारतूस का नमूना पोर्ट में नमूना बांटना. स्वचालित पीसीआर प्रणाली में कारतूस डालें और निर्माता के रूप में वर्णित परख शुरू.

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Representative Results

Prod'hom एट अल. 15 द्वारा निष्पादित अध्ययन में, 78 रोगियों से 122 सकारात्मक रक्त संस्कृति की अमोनियम क्लोराइड सेल centrifugation द्वारा प्राप्त बैक्टीरियल छर्रों MALDI-TOF एमएस द्वारा विश्लेषण किया गया. 122 सकारात्मक रक्त संस्कृति में से 95 (77.9%) सही ढंग से जीनस स्तर पर प्रजातियों स्तर और एक (0.8%) में पहचान की गई. शेष 26 (21.3%) रक्त संस्कृति छर्रों MALDI-TOF से कोई विश्वसनीय पहचान दे दी है. उन लोगों के बीच, 21 13 स्ट्रेप्टोकोक्की और 5 coagulase नकारात्मक staphylococci सहित ग्राम सकारात्मक बैक्टीरिया थे. महत्वपूर्ण बात है, 13 अज्ञात streptococci के बाहर 10 अक्सर एक मुश्किल को Lyse कैप्सूल के अधिकारी और एस की प्रजातियों से शायद ही प्रतिष्ठित हैं जो स्ट्रैपटोकोकस निमोनिया थे MALDI-TOF एमएस का उपयोग mitis समूह. पांच ग्राम नकारात्मक बैक्टीरिया चार मुश्किल को Lyse दो क्लेबसिएला निमोनिया और दो ​​Haemop सहित बैक्टीरियल प्रजातियों समझाया जो बीच, MALDI-TOF से पहचान नहीं गयाhilus इन्फ़्लुएन्ज़ा. इस प्रकार, MALDI-TOF द्वारा सही पहचान अगर प्लेट 11 पर हो बैक्टीरियल कालोनियों की परंपरागत पहचान से प्राप्त पहचान के 84.1% की तुलना में एक कुशल प्रदर्शन का प्रतिनिधित्व करता है जो रक्त संस्कृति छर्रों के 78.7%, में प्राप्त हुई थी.

बैक्टीरियल पहचान (आईडी) और AST के लिए के लिए स्वचालित सूक्ष्म प्रणाली के प्रदर्शन क्लस्टर और ग्राम नकारात्मक बैक्टीरिया में ग्राम पॉजिटिव COCCI के लिए सकारात्मक रक्त संस्कृति की 278 बैक्टीरियल छर्रों पर परीक्षण किया गया था. इन परिणामों उपयुक्त मीडिया 16 पर सकारात्मक रक्त संस्कृति के उपसंस्कृति निम्नलिखित अगर प्लेट पर हो कालोनियों से स्वचालित सूक्ष्म प्रणाली कार्ड के साथ प्राप्त की पारंपरिक परिणामों की तुलना में थे. MALDI-TOF एमएस द्वारा बैक्टीरिया गोली की पहचान में विफल रहा है जब माइक्रोबियल पहचान प्रणाली आईडी कार्ड का उपयोग प्रत्यक्ष पहचान इस्तेमाल किया जा सकता है. MALDI-TOF एमएस, एक सही पहचान के साथ द्वारा एक अंतिम पहचान की तुलनामाइक्रोबियल पहचान प्रणाली आईडी कार्ड Enterobacteriaceae के 99%, staphylococci के 74%, गैर fermentative ग्राम नकारात्मक बैक्टीरिया की 71% और अन्य ग्राम पॉजिटिव COCCI के 33% में मनाया गया. बैक्टीरियल छर्रों का 8% कोई पहचान दे दी है, जबकि एक गलत पहचान कुल मामलों के 11% में मनाया गया. 87 Enterobacteriaceae और 133 staphylococci सहित 220 बैक्टीरियल छर्रों की कुल स्वचालित सूक्ष्म प्रणाली AST GN26 साथ AST और AST 580 कार्ड 16 के लिए विश्लेषण किया गया. परिणाम एक बहुत बड़ी त्रुटि (VME) और एक प्रमुख त्रुटि (इ) के रूप में एक झूठी प्रतिरोधी के रूप में एक झूठी अतिसंवेदनशील परिभाषित जो व्याख्यात्मक समझौते के परिणाम के लिए अमेरिकी खाद्य एवं औषधि प्रशासन (एफडीए) द्वारा दी गई परिभाषा के अनुसार विश्लेषण किया गया. अगर प्लेट पर हो कालोनियों से टीका की तुलना में रक्त संस्कृति गोली का सीधा टीका से प्राप्त AST 0.1% VME और Enterobacteriaceae के लिए 0.3% इ, और 0.7% VME और staphylococci के लिए 0.1% मुझे दिखाया. AST के इस प्रकार प्रदर्शनरक्त संस्कृति छर्रों के साथ सीधे टीका कार्ड एफडीए द्वारा स्वीकार प्रदर्शन मापदंड के साथ समझौता कर रहे हैं.

स्पा को लक्षित पीसीआर आधारित न्यूक्लिक एसिड प्रवर्धन प्रौद्योगिकी मरसा परीक्षण का प्रदर्शन, Meca और एस सी सी जीन सीधे MALDI-TOF एमएस 17 से पहचान Staphylococcus aureus रक्त संस्कृति बैक्टीरियल छर्रों पर लागू किया गया था. 106 मामलों के आधार पर, मेथिसिलिन प्रतिरोध का पता लगाने के एक 99% संवेदनशीलता और एक 100% विशिष्टता का प्रदर्शन किया. दिलचस्प है, मंझला समय रक्त संस्कृति सकारात्मकता से न्यूक्लिक एसिड प्रवर्धन प्रौद्योगिकी परिणाम की रिपोर्ट करने के लिए किया गया था इसी तरह के परिणाम 97 मिनट (रेंज के बराबर था रिपोर्ट करने के लिए MALDI-TOF पहचान से मंझला समय जबकि 201 मिनट (रेंज 100-430) के बराबर 25 250).

चित्रा 1
चित्रा 1 पूर्व और बाद MALDI-TOF युग. एक हे / नमूना के एन उपसंस्कृति में शामिल हैं जो पारंपरिक नैदानिक ​​दृष्टिकोण की तुलना में, MALDI-TOF एमएस पहचान निदान प्रयोगशाला को नमूने प्रसव के बाद मिनटों में किया जा सकता है. यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए.

चित्रा 2
चित्रा MALDI-TOF एमएस पहचान करने के लिए नमूने से खून संस्कृति प्रसंस्करण के 2 कार्यप्रवाह. रक्त संस्कृतियों सकारात्मक रहे हैं, एक जीवाणु गोली अमोनियम क्लोराइड सेल centrifugation द्वारा तैयार किया जाता है. इस बैक्टीरिया गोली तो MALDI-TOF एमएस द्वारा प्रत्यक्ष पहचान के लिए प्रयोग किया जाता है. MALDI-TOF एमएस पहचान 60 मिनट के लिए 30 के भीतर प्राप्त किया जा सकता है llowing रक्त संस्कृति सकारात्मकता. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 3
ऐसे मरसा का पता लगाने के लिए देखभाल परीक्षण PCRs के बिंदु (POCT पीसीआर) के रूप में स्वचालित प्रणाली और / या डिस्क प्रसार assays और तेजी से पीसीआर आधारित परीक्षण का उपयोग ग्राम धुंधला, MALDI-TOF एमएस पहचान, AST सहित 3 चित्र कई बहाव के अनुप्रयोगों कर सकते हैं रक्त संस्कृति बैक्टीरिया गोली पर सीधे प्रदर्शन किया. जीवाणु रक्त संस्कृति छर्रों से प्रत्यक्ष परीक्षण काफी खून में संक्रमण से पीड़ित रोगियों के परिणाम में सुधार करने के लिए निर्णायक है जो आईडी और AST परिणाम की रिपोर्ट करने के लिए बारी के आसपास समय कम. 5fig3highres.jpg "लक्ष्य =" _blank "> इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 4
चित्रा 4 अमोनियम क्लोराइड सेल centrifugation प्रोटोकॉल सकारात्मक रक्त संस्कृति बतख से एक समृद्ध और शुद्ध बैक्टीरियल गोली की तैयारी की अनुमति देता है. Escherichia कोलाई की सकारात्मक रक्त संस्कृति के ग्राम धुंधला, coagulase नकारात्मक Staphylococcus कैपिटिस और स्ट्रैपटोकोकस dysgalactiae से पहले और की तैयारी के बाद प्रदर्शन रक्त संस्कृति बैक्टीरिया गोली. समूहों और जंजीरों में स्ट्रेप्टोकोक्की में staphylococci की शास्त्रीय morphologies अधिक आसानी से खून संस्कृति बैक्टीरिया गोली की तुलना में देशी रक्त संस्कृति शोरबा में मनाया जाता है. स्केल बार 25 माइक्रोन =.= "_blank"> इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

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Discussion

पारंपरिक सकारात्मक रक्त संस्कृति नैदानिक ​​दृष्टिकोण की तुलना में, अमोनियम क्लोराइड सेल centrifugation के दृष्टिकोण का उपयोग कर एक जीवाणु गोली का तेजी से अधिग्रहण 24 घंटे और 48 घंटे के लिए 24 से AST रिपोर्ट करने के लिए समय (आंकड़े 1 और 16 से पहचान रिपोर्ट करने के लिए समय कम 3).

उचित एंटीबायोटिक चिकित्सा के तेज शुरूआत के खून में संक्रमण से पीड़ित रोगियों के परिणाम में सुधार करने के लिए निर्णायक है. इस प्रकार, के बारे में 8 से 16 घंटे में प्राप्त एक तेजी से AST द्वारा पीछा 1 घंटा के भीतर संक्रामक एजेंटों की जल्दी पहचान सेप्टिक रोगियों के नैदानिक ​​प्रबंधन में एक प्रमुख प्रभाव का प्रतिनिधित्व करता है. ग्राम धुंधला का तेजी से रिपोर्टिंग पहले ही रोगाणुरोधी चिकित्सा पर और इस प्रकार रोगी रुग्णता और मृत्यु दर 6,7 में कमी के साथ एक महान प्रभाव के साथ संबद्ध किया गया है. रक्त संस्कृति बैक्टीरिया गोली की ग्राम धुंधला संवेदनशीलता को बढ़ाने के लिए किया जा सकता है जब बीएल के ग्राम धुंधलाई संस्कृति शोरबा नकारात्मक या दुर्बलता से सकारात्मक (चित्रा 4) है. हालांकि, देशी रक्त संस्कृति शोरबा पर प्रदर्शन ग्राम धुंधला ऐसे जंजीरों में समूहों में staphylococci या streptococci के रूप में विशिष्ट morphologies निरीक्षण करने के लिए सिफारिश की है. ग्राम दाग मामलों 8 के 20% में केवल एक अतिरिक्त प्रभाव पड़ा जबकि खून के संक्रमण के 202 मामलों पर प्रदर्शन हाल ही में एक भावी अध्ययन में, रक्त संस्कृति छर्रों से MALDI-TOF एमएस पहचान मामलों की 35.1% में एंटीबायोटिक चिकित्सा में एक प्रभाव दिखाया. ऐसे एएमपीसी उत्पादक Enterobacteriaceae के रूप में वृद्धि एंटीबायोटिक प्रतिरोध के साथ जुड़े बैक्टीरिया MALDI-TOF एमएस द्वारा की पहचान की गई है जब दिलचस्प है, नैदानिक ​​प्रबंधन पर ग्राम धुंधला और MALDI-TOF एमएस पहचान रिपोर्टिंग के बीच प्रभाव का अधिकतम अंतर मनाया गया. इसी तरह, Martiny एट अल. MALDI-TOF एमएस तेजी से पहचान एक पूर्वव्यापी संवर्धन जबकि मामलों की 13.4% में एंटीबायोटिक चिकित्सा के अनुकूलन जकड़ना सकता है कि पता चला हैवाई Stoneking एट अल द्वारा प्रदर्शन किया. bacteremia के कारण सूक्ष्मजीवों की एक तेजी से पहचान या तो प्रारंभिक आहार द्वारा या एंटीबायोटिक दवाओं 18,19 के स्पेक्ट्रम को कम करने के द्वारा कवर नहीं एक अतिरिक्त एंटीबायोटिक administrating द्वारा मामलों के 77% में अनुभवजन्य चिकित्सा एडजस्ट करने में मदद मिल सकती है कि सुझाव . इसके अलावा, इस तरह के न्यूक्लिक एसिड प्रवर्धन प्रौद्योगिकी मरसा के रूप में एक तेजी से पीसीआर आधारित परख का उपयोग एस निम्नलिखित रक्त संस्कृति छर्रों से MALDI-TOF एमएस द्वारा ऑरियस पहचान एस से पीड़ित रोगियों के लिए कम से कम 4 घंटे में सबसे उपयुक्त एंटीबायोटिक चिकित्सा प्रदान करने की अनुमति दी ऑरियस bacteremia 17. पेनिसिलिन एलर्जी के साथ रोगियों को छोड़कर जब, न्यूक्लिक एसिड प्रवर्धन प्रौद्योगिकी के उपयोग मरसा ऐसी 26.1% से 8.1% तक glycopeptides के रूप में विरोधी मरसा एंटीबायोटिक दवाओं के दुरुपयोग का एक महत्वपूर्ण कमी की अनुमति दी. साथ में, इन आंकड़ों का सुझाव है कि ग्राम धुंधला, MALDI-TOF एमएस पहचान और तेजी से पीसीआर आधारित एक की तेजी अनुक्रमिक रिपोर्टिंगरक्त संस्कृति छर्रों से ssay काफी एंटीबायोटिक चिकित्सा और इस तरह चिकित्सीय प्रबंधन के साथ ही खून में संक्रमण से पीड़ित रोगियों के परिणाम में सुधार कर रहे हैं.

MALDI-TOF एमएस अगर प्लेट पर हो शुद्ध कालोनियों पर प्रदर्शन पारंपरिक MALDI-TOF एमएस द्वारा प्राप्त 84.1% पहचान की दर की तुलना में एक बहुत अच्छा प्रदर्शन है, जो रक्त संस्कृति छर्रों के 78.7% सही पहचान की अनुमति दी. अधिक है कि खून में संक्रमण के 50% ऐसे Enterobacteriaceae, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa और enterococci के रूप में बैक्टीरियल प्रजातियों के कारण होता है. ये बैक्टीरिया कुशलता संभावना सकारात्मक रक्त संस्कृति बैक्टीरियल छर्रों पर सीधे प्रदर्शन MALDI-TOF एमएस पहचान के अच्छे प्रदर्शन को प्रभावित जो MALDI-TOF एमएस द्वारा पहचाने जाते हैं. MALDI-TOF एमएस द्वारा कुछ बैक्टीरियल प्रजातियों की पहचान के लिए कम प्रदर्शन है खून संस्कृति छर्रों पर प्रदर्शन मुख्य रूप से इसी तरह के कारकों की वजह सेअगर प्लेट पर हो शुद्ध कालोनियों से परंपरागत पहचान के लिए मनाया उन लोगों की तुलना में. उदाहरण के लिए, ऐसे streptococci mitis समूह और coagulase नकारात्मक staphylococci के लिए संबंधित के रूप में कई सूक्ष्म जैविक प्रजातियों बारीकी से संबंधित और MALDI-TOF एमएस से कम सटीकता के साथ की पहचान कर रहे हैं. इसके अलावा, ग्राम पॉजिटिव बैक्टीरिया के बैक्टीरिया कोशिका दीवार की एक विशेष रचना या ऐसे क्लेबसिएला निमोनिया के रूप में बैक्टीरियल प्रजातियों में मनाया एक घने कैप्सूल की उपस्थिति काफी सेल दक्षता और इस तरह MALDI-TOF एमएस पहचान की कार्यक्षमता कम हो. अंत में, anaerobic बैक्टीरिया की पहचान के लिए MALDI-TOF एमएस के कम प्रदर्शन MALDI-TOF डेटाबेस में इन बैक्टीरिया की एक अधूरी और गरीब प्रतिनिधित्व करने के लिए मुख्य कारण है.

शुद्ध कालोनियों से पारंपरिक पहचान की तुलना में रक्त संस्कृति छर्रों से MALDI-TOF एमएस पहचान के छोटे कम प्रदर्शन के कारण अवशिष्ट रक्त प्रोटीन सी के लिए हो सकता हैomponents या सेल-centrifugation के बाद प्राप्त जीवाणुओं की एक अपर्याप्त राशि के लिए. इसी तरह, में बैक्टीरिया विकास के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं कि अलग कालोनियों के साथ inoculated उन जैसे, प्रोटीन, रक्त कोशिकाओं और रक्त मध्यम यौगिकों के रूप में अवशिष्ट रक्त संस्कृति घटकों के कारण हो सकता है की तुलना में रक्त संस्कृति छर्रों के साथ सीधे टीका स्वचालित सूक्ष्म प्रणाली कार्ड के साथ मनाया मतभेद सूक्ष्म प्रणाली कार्ड स्वचालित और पहचान और AST दोनों पर एक महत्वपूर्ण प्रभाव पड़ सकता है. इसके अलावा, स्वचालित माइक्रोबियल सिस्टम के द्वारा प्राप्त AST परिणाम भी परंपरागत तरीके की तुलना में महत्वपूर्ण विसंगतियों पेश करने के लिए जाना जाता है कुछ एंटीबायोटिक दवाओं के परिणामों को मान्य करने के लिए रक्त संस्कृति बैक्टीरियल छर्रों पर सीधे प्रदर्शन डिस्क प्रसार assays के द्वारा जांच की जानी चाहिए. हालांकि, रक्त संस्कृति छर्रों के साथ स्वचालित सूक्ष्म प्रणाली कार्ड का सीधा टीका Enterobacteriaceae और staphy दोनों के लिए एक शानदार आईडी और AST प्रदर्शन प्रस्तुत करता हैlococci.

इस प्रकार, सकारात्मक रक्त संस्कृतियों की अमोनियम क्लोराइड सेल centrifugation द्वारा प्राप्त बैक्टीरिया गोली सीधे इस तरह के पारंपरिक तरीकों की तुलना में एक काफी कम बुनना में आईडी और AST के रूप में आवश्यक परिणामों की एक तेजी से रिपोर्टिंग की अनुमति कई बहाव के अनुप्रयोगों प्रदर्शन करने के लिए मान्य किया गया है. इसके अलावा, इस तरह बढ़ाया स्पेक्ट्रम β-lactamases (ESBLs) परीक्षण के रूप में अतिरिक्त अनुप्रयोगों सकारात्मक रक्त संस्कृति के समान सेल centrifugation पर मान्य किया गया है कि वे भी इस काम में वर्णित प्रोटोकॉल के साथ प्राप्त बैक्टीरिया गोली पर लागू किया जा सकता है, सुझाव है कि 20 के तरीके.

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Disclosures

लेखकों वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि घोषणा.

Acknowledgments

हम प्रयोगशाला में तकनीकों को लागू करने के लिए उनकी मदद के लिए लुसाने विश्वविद्यालय अस्पताल केंद्र के जीवाणु विज्ञान प्रयोगशाला के तकनीशियनों को धन्यवाद.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
20 G needle Terumo, Leuven, Belgium NN-2038R
50 ml Falcon tube BD, Franklin Lakes, NJ, USA 352070 50 ml centrifuge tubes
Ammonium chlorure Merck, Darmstadt, Germany 101145
Potassium hydrogen carbonate Fluka, St. Louis, MO, USA  60340
Formic acid Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA  F0507 Flammable, corrosive
α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid Fluka, St. Louis, MO, USA  70990 Acute toxicity
Acetonitrile Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA  271004 Flammable, acute toxicity
Trifluoroacetic acid Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA  T6508 Corrosive, acute toxicity
Vitek 2 60 instrument Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France 27202 automated microbial system instrument
Vitek 2 Gram-positive (GP) card Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France 21342 automated GP  identification card
Vitek 2 AST-P580 card Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France 22233 automated microbial AST system
Vitek 2 Gram-negative (GN) card Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France 21341 automated GN  identification card
Vitek 2 AST-N242 card Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France 413391 automated microbial AST system
Xpert MRSA Cepheid, Sunnyvale, Ca, USA  GXMRSA-100N-10 nucleic acid amplification technology MRSA
GeneXpert IV instrument Cepheid, Sunnyvale, Ca, USA GXIV-4-D nucleic acid amplification technology instrument
Microflex LT MALDI-TOF MS instrument Bruker Daltonics, Bremen, Germany BDAL microflex LT/SH
MSP 96 target steel BC Bruker Daltonics, Bremen, Germany 280799 MALDI target plate
Densitometer Densicheck instrument Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France 27208
MALDI Sepsityper kit 50 Bruker Daltonics, Bremen, Germany 8270170
Mac Conkey agar Biolife, Milano, Italy 4016702
Mueller-Hinton agar Oxoid, Hampshire, England CM0337 Mueller-Hinton agar (MH) 
MHF agar Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France 43901 Mueller-Hinton agar-fastidious organisms agar (MHF)
BD columbia III agar BD, Franklin Lakes, NJ, USA 254071 blood agar
BD chocolate agar BD, Franklin Lakes, NJ, USA 254089 chocolate agar
BD schaedler agar BD, Franklin Lakes, NJ, USA 254084 Schaedler agar

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References

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