빠른 세균의 식별 및 항생제 감수성 테스트를위한 혈액 문화 펠렛의 제조

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Immunology and Infection

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Summary

양성 혈액 배양에서 빠른 박테리아 펠렛 제제는 MALDI-TOF에 의해 식별, 그람 염색, 항생제 감수성 시험 및 PCR-기반 테스트와 같은 애플리케이션을위한 샘플로서 이용 될 수있다. 결과는 급속 혈류 감염으로 고통받는 환자의 결과를 개선하기 위해 임상에 통신 될 수있다.

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Croxatto, A., Prod'hom, G., Durussel, C., Greub, G. Preparation of a Blood Culture Pellet for Rapid Bacterial Identification and Antibiotic Susceptibility Testing. J. Vis. Exp. (92), e51985, doi:10.3791/51985 (2014).

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Abstract

혈류 감염 및 패혈증은 질병률과 사망률의 중요한 원인이다. 균혈증 고통받는 환자의 성공적인 결과는 최적의 항생제 치료를 안내 할 수있는 감염원의 빠른 식별에 따라 달라집니다. 긍정적 인 혈액 배양에서 그람 얼룩의 분석은 신속하게 실시 이미 크게 항생제 처방에 영향을 미칠 수 있습니다. 그러나, 감염원의 정확한 식별은 여전히​​ 최적의 치료 대상을 설정할 필요가있다. 여기서 이러한 디스크 확산 분석에 의한 MALDI-TOF MS, 항생제 감수성 검사 (AST)에 의해 식별 또는 자동화 AST 시스템과 같은 여러 가지 에센셜 하류 애플리케이션 용 시료로 사용 될 수있는 양성 혈액 배양에서 간단하고 빠른 박테리아 펠렛 제제를 제시 그리고 자동으로 진단 검사를 PCR 기반. 혈액 배양 박테리아 펠릿에 직접 적용이 다른 식별 및 AST 시스템의 성능은 매우 SI이며성능 밀라 (milar)는 일반적으로 한천 플레이트에 성장 고립 식민지에서 얻을. 종래의 방법에 비해 박테리아 펠릿 신속한 취득이 크게 식별 및 AST 모두를보고하는 시간을 감소시킨다. 따라서, 다음과 같은 혈액 배양 양성, MALDI-TOF에 의한 식별은 8 내에서 각각 18 시간, 자동화 된 AST 시스템 또는 디스크 확산 분석에 의해 AST의 결과 반면 미만 1 시간 이내에보고 할 수 있습니다. 마찬가지로 신속한 PCR 기반 분석의 결과는 임상의에게 균혈증 리포트 다음, 2 시간 미만을 통신 할 수있다. 함께, 이러한 결과는 혈액 배양 박테리아 펠릿 신속한 준비 식별 및 AST 턴어라운드 시간에 따라서 혈류 감염으로 고통받는 환자의 성공적인 결과에 상당한 영향을 미치고 있음을 보여준다.

Introduction

입원 환자의 혈류 감염 및 패혈증은 질병률과 사망률의 중요한 원인이다. 따라서, 감염 혈액과 관련된 사망률은 입원 환자의 37 %로 약 14 %에서 관찰되며, 중환자 실 환자의 1 ~ 35 %로 증가 할 수 있습니다. 감염원의 신속한 식별 최적 항균 치료를 안내와 항균 치료 4,5의 성공적인 결과를 증가시키는 중추적이다. 양성 혈액 배양에서 그람 얼룩의 신속한 분석은 이미 항균 요법 6,7하지만 감염원의 정확한 식별 적응에 큰 영향을 갖는 환자에게 가장 적합한 항생제 치료를 제공해야한다. 예를 들어, 다른 항생제 치료법은 장내 및 그람 염색으로 구별하기 어려운 구균 균혈증 다음으로 구현되어야한다. 마찬가지로, 종의 식별 레프엘은 8-락탐을 β하기 위해 증가 된 저항성을 염색체의 AmpC 유전자를 코딩하는 그람 음성 장내 세균을 검출하는 데 필요합니다.

긍정적 인 혈액 배양으로, 기존의 진단 방법은 생화학 검사, 다른 선택 배지에 성장과 자동화 된 미생물 식별 시스템을 포함한 다양한 방법으로 추가 배양 전에 식별 몇 시간을 필요로 다른 한천 접시에 감염원을 배양하는 것입니다. 종래의 진단 방법의 결과 시간은 약 1-3일이다.

미생물의 신속한 식별을위한 매트릭스 보조 레이저 탈착 / 이온화 비행 시간 형 질량 분석 (MALDI-TOF) 기술의 출현은 신속 양성 혈액으로부터 직접 또한 아가 플레이트상에서 성장한 콜로니로부터 미생물하지만을 식별하는 새로운 도구를 제공했다 문화 (그림 1) 9-12. 목혈액 배양에서 감염원을 확인하기 MALDI-TOF의 전자의 사용은 크게 몇 분 대신 전통적인 방법에 의해 요구되는 시간과 일에 결과 시간을 단축하고있다. Croxatto 외. (13)에 의해 논의 된 바와 같이, MALDI-TOF 식별 효율은 미생물의 순도 및 양을 포함하여 다른 매개 변수에 의존한다. 이 두 기준은 쉽게 한천 플레이트에 성장 이산 식민지에서 얻은하지만, MALDI-TOF 식별을 방해 할 수있는 여러 세포와 단백질 구성 요소를 포함하는 혈액 배양 등 복잡한 시료에서 세균 농축 및 정제를위한 사전 분석 치료를해야합니다.

혈액 배양에서 다양한 미생물 '분리 방법이 세균 추출 9,14, 혈청 분리 방법 10 사포닌 또는 다른 중성 세제 방법을 포함하여 다수의 연구에서 사용 된, 용해 원심 분리 방법 12 (그림 2) 15를 허용 염화 암모늄 적혈구 - 용해를 기반으로 간단한 혈액 배양 세균 펠렛 제제를 개발했다. 이 혈액 문화 펠릿 준비 또한 그람 염색 등의 직접 다운 스트림 애플리케이션을위한 샘플을 제공, 같은 메티 실린 내성 Staphyloccocus 구균의 신속한 검출 (MRSA)에 대한 POCT-PCR들과 함께 항생제 감수성 검사와 같은 자동화 된 PCR 기반의 진단 테스트 자동화 된 AST 시스템 및 / 또는 한천 플레이트에 디스크 확산 분석 (그림 3)에 의해.

Prod'hom 등에 의해 설명 된 바와 같이이 작품에서, 우리는 혈액 배양 세균 펠렛의 제조를위한 여러 단계를 설명합니다. 15 (그림 4). 우리는 또한 탈 것서기관 혈액 배양 펠릿에서 수행 할 수있는 주요 응용 프로그램의 세 가지에 대한 프로토콜 : 자동 장내 세균에 대한 시스템 16 및 포도상 구균 및 자동 PCR-와 MALDI-TOF 15, 식별 (ID) 및 항생제 감수성 검사 (AST)에 의해 확인 MRSA (17)의 검출에 기초하여 진단 테스트.

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Protocol

이 프로토콜 개발 도구 루틴으로서 구현되기 전에 본원의 연구 개발 프로세스 및 윤리 규칙에 따라 확인되었다.

염화 암모늄 적혈구 - 용균 절차에 의한 혈액 문화 세균 펠렛의 1 준비

  1. 이후 원심 분리에 대한 긍정적 인 혈액 배양의 준비.
    1. 혈액 배양 뚜껑을 소독. 병의 뚜껑에 70 % 에탄올을 추가하고 구울 수 있습니다.
      참고 : 층류 후드에서이 단계를 수행하지 마십시오.
    2. 층류 후드에 병을 이동합니다. 20 G 주사기와 혈액 배양 5 ㎖를 수집합니다.
    3. 멸균 물 (H 2 O)의 45 ML을 포함하는 50 ㎖의 원심 분리 관에 혈액 배양의 5 ML을 추가하고 샘플을 섞는다.
  2. 용해 원심 분리하여 혈액 배양 세균 펠렛의 제조.
    1. RT에서 10 분 동안 1,000 XG에서 샘플을 원심 분리기.
    2. 레모실험실 진공 펌프 (주로 H 2 O 및 혈액 세포를 포함) 상등액을했습니다.
    3. 용액 (0.15 M NH4Cl 등, 1 ㎜ KHCO 3) 용균 수제 암모늄 클로라이드 1 ㎖에 펠렛을 재현 탁. 긁어 튜브 텍싱하여 펠릿을 분해하고 실온에서 10 분 동안 140 XG에서 샘플을 원심 분리기.
    4. 주로 적혈구 파편이 포함 된 상층 액을 버린다.
      1. 펠릿 출혈성 남아 있다면, 상기 잔류 적혈구 세포를 용해하고, 펠릿을 세척 및 멸균 증류수 H 2 0 2 ㎖에 펠렛을 재현 탁. 실온에서 10 분 동안 140 XG에서 샘플을 원심 분리기 상층 액을 버린다.
    5. H 2 O의 200 μL에 펠렛을 재현 탁
  3. 다양한 선택과 비 선택 한천 미디어에 혈액 문화의 하위 문화.
    1. 20 G 주사기와 혈액 배양 1 ㎖를 수집합니다.
    2. 혈액 배양 INT 1 방울을 접종혈액 한천, 초콜릿 한천, McConkey의 한천 Schaedler 한천에 네 사분면 오.
    3. 5 % CO 2 분위기에서 37 ° C에서 혈액 한천와 초콜릿 한천 플레이트를 품어, 정상적인 분위기에서 McConkey 한천 및 혐기성 상태에서 Schaedler 한천 플레이트.
    4. 다른 매체에 세균의 성장을 따르십시오.
    5. 세균의 순도를 확인합니다.

MALDI-TOF MS에 의해 2 식별

  1. 혈액 펠릿에서 직접 확인.
    1. 전송 한 MALDI 대상 접시에 혈액 펠릿의 μL와 42 ° C 가열 플랫폼에서 말리면.
    2. 1 ㎕의 70 % 포름산으로 샘플을 오버레이와 42 ° C 가열 플랫폼에서 말리면.
    3. MALDI 매트릭스의 1 ㎕의 시료를 오버레이 및 42 ° C 가열 플랫폼에서 말리면 (α-시아 노 - 사 - 히드 록 아세토 니트릴 - 2.5 % 트리 플루오로 아세트산 50 %에서 산의 포화 용액).
    4. MAL에 진행제조 업체에 의해 기술 된 바와 같이 MALDI-TOF MS 시스템과 DI-TOF MS 분석.
    5. 식별 점수 (점수 <2 인스턴스) 종 레벨에서 유효하지 않은 경우, 피 펠릿 시료 단백질 추출을 수행한다.
  2. 혈액 배양 펠릿에서 단백질을 추출 후 확인.
    1. RT에서 2 분 동안 13,000 XG에 70 % 에탄올 1 ml의 원심 분리와 펠렛의 20 μl를 섞는다.
    2. 뜨는을 취소하고 70 % 포름산 25 ㎕의 펠릿 100 % 아세토 니트릴의 25 μl를 추가합니다. 소용돌이 적극적으로 펠릿을 재현 탁합니다. 소용돌이로 교반하기 전에 피펫 팁을 나누어서 힘든 알약을 재현 탁.
    3. 실온에서 2 분 동안 13,000 XG에 원심 분리기. 전송 한 MALDI 대상 접시에 뜨는 ㎕의 (추출 된 단백질을 포함한다) 및 42 ° C 가열 플랫폼에서 말리면. 2.1.2에 설명 된대로 진행합니다.

3 세균성 지문을 확인해자동화 된 미생물 시스템과 가스화 및 항생제 감수성 검사

  1. 자동화 된 미생물 시스템과 박테리아 식별 및 AST에 대한 세균 현탁액의 준비.
    1. 자동화 된 미생물 시스템과 호환 멸균 0.45 % NaCl 용액 3 ㎖를 함유하는 플라스틱 관을 준비한다.
    2. 0.6-0.8의 맥팔랜드 탁도에 대응 세균 현탁액을 얻기 위해 0.45 % NaCl 용액으로 혈액 배양 펠렛의 충분한 볼륨. 농도계 기계를 사용하여 탁도를 측정한다.
      참고 : 혈액 배양 세균 펠릿의 부피는 0.6-0.8의 맥팔랜드 탁도를 달성하기 위해 50 ~ 200 μL에 따라 다릅니다.
  2. 제조자에 의해 설명 된대로 식별 자동화 그람 양성 (GP) 또는 그람 음성 (GN) 카드 및 그람 양성 구균 및 그람 음성 세균의 항균 감수성 테스트에 대한 자동화 된 AST 카드를 접종한다.
    참고 : IdentificatioMALDI-TOF MS 식별 점수 값이>이 경우 N GP 또는 GN 카드 적용되지 않습니다. 혈액 한천 (GP와 GN)와 MacConkey 한천 (GN) 접시에 세균 현탁액을 계대 배양하여 세균 현탁액의 순도를 확인합니다.

디스크 확산 분석하여 4 항생제 감수성 검사

디스크 확산 분석은 항균제 감수성 시험 (EUCAST, 버전 3.0 년 4 월 2013 www.eucast.org)에 관한 유럽위원회에 의해 설명된다.

  1. 세균 현탁액을 준비 디스크 확산 분석에 의한 항균제 감수성 시험을 수행 할 수 있습니다.
    1. 멸균 된 0.9 % NaCl 용액 3 ㎖를 함유 유리 튜브를 준비한다.
    2. 0.5 맥팔랜드 탁도에 대응 세균 현탁액을 얻기 위해 0.9 % NaCl 용액에 혈액 배양 펠렛의 충분한 볼륨. 농도계 기계를 사용하여 탁도를 측정한다.
      참고 : 혈액 배양의 부피세균 펠릿은 0.6-0.8의 맥팔랜드 탁도를 달성하기 위해 50 ~ 200 μL에 따라 다릅니다.
    3. 세균 현탁액을 소용돌이.
  2. 뮬러 - 힌튼 한천 (MH) 또는 뮬러 - 힌튼 한천 - 까다로운 생물 한천 (MHF) 위에 세균 현탁액의 예방 접종은 (MH 5 % defibrinated 말의 혈액과 20 밀리그램 / β-니코틴 아미드 아데닌 디 뉴클레오티드의 L 보충).
    1. 세균 현탁액 멸균 면봉을 찍어 부드럽게 유리 튜브의 내부 벽에 면봉을 돌려 초과 액체를 제거합니다.
    2. 세 방향 보라고하거나 자동화 플레이트 회 전자를 사용하여 MH / MHF 한천 플레이트의 전체 표면 상에 고르게 세균 현탁액을 확산.
  3. 접종 한천 접시에 항균 디스크의 응용 프로그램입니다.
    1. 수동 건조 접종 아가 플레이트의 표면 또는 감수성 디스크 디스펜서를 사용하여 밀접하게 디스크를 적용한다.
    2. 해당 템피에서 접시를 품어rature 및 항균제 감수성 시험 EUCAST 디스크 확산법에 설명 된대로 분위기 (버전 3.0 년 4 월 2013 www.eucast.org).

(5) 자동 MRSA의 검출에 대한 진단 검사를 PCR 기반

  1. 마이크로 피펫을 사용하여 20 초 동안 PCR 기반의 진단 테스트 키트와 소용돌이를 자동화 MRSA와 함께 제공되는 샘플 시약 병으로 혈액 배양 펠릿의 50 μl를 전송합니다.
  2. 1 ML의 마이크로 피펫을 사용하여, 카트리지의 시험편 포트에 샘플을 조제. 자동화 된 PCR 시스템에 카트리지를 삽입하고 제조자에 의해 설명 된대로 분석을 시작합니다.

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Representative Results

Prod'hom 외. (15)에 의해 수행 된 연구에서, 78 명의 환자에서 122 양성 혈액 배양의 염화 암모늄의 용해를 원심 분리에 의해 얻어진 박테리아 펠릿은 MALDI-TOF MS로 분석 하였다. 122 긍정적 인 혈액 배양 중, 95 (77.9 %)이 올바르게 속 수준에서 종 수준과 하나 (0.8 %)에서 확인되었다. 나머지 26 (21.3 %), 혈액 배양 펠릿은 MALDI-TOF에 의한 신뢰성있는 식별을주지 않았다. 그 중, 21은 13 연쇄상 구균 및 5 응고 효소 음성 포도 구균을 포함한 그람 양성 세균이었다. 중요한 것은, 13 알 수없는 연쇄 구균 중 10 종종 어려운를 Lyse 캡슐을 소유하고 S. 종에서 거의 구별되는 폐렴 구균했다 MALDI-TOF MS 사용 mitis 그룹입니다. 다섯 그람 음성 박테리아는 네이 어려운를 Lyse이 폐렴 간균 및이 Haemop 포함 종의 박테리아를 캡슐화하는 가운데, MALDI-TOF로 식별되지 않았다hilus 인플루엔자. 따라서, MALDI-TOF에 의한 정확한 식별은 아가 플레이트 (11) 상에 성장 된 박테리아 콜로니 종래의 식별에 의한 식별의 84.1 %에 비해 효율적인 성능을 나타내는 혈액 배양 펠릿의 78.7 %로 수득 하였다.

박테리아 식별 (ID) 및 AST에 대한에 대한 자동화 된 미생물 시스템의 성능은 클러스터 및 그람 음성 세균의 그람 양성 구균 양성 혈액 배양의 278 세균 펠릿에서 테스트되었습니다. 이 결과는 해당 용지 16에 긍정적 인 혈액 배양의 배양 다음 한천 플레이트에 성장 식민지에서 자동화 된 미생물 시스템의 카드를 얻을 기존의 결과를 비교 하였다. MALDI-TOF MS에 의한 세균 펠릿의 식별이 실패한 경우 미생물 식별 시스템의 ID 카드를 사용하여 직접 식별이 사용될 수있다. MALDI-TOF MS, 정확한 식별과에 의해 최종 식별 비교미생물 식별 시스템 ID 카드는 장내 세균의 99 %, 포도상 구균은 74 %, 비 발효 그람 음성 박테리아의 71 %와 기타 그람 양성 구균의 33 %에서 관찰되었다. 세균 펠릿의 8 %가 더 식별을 포기하지 반면 오인는 전체 사례의 11 %에서 관찰되었다. 87 장내 세균과 133 포도상 구균을 포함하여 220 세균 펠릿 총 자동화 된 미생물 시스템 AST GN26와 AST와 AST 580 카드 (16)에 대해 분석 하였다. 결과는 매우 중요한 오류 (VME) 및 주요 오류 (ME)와 같은 거짓 저항으로 허위 감염을 정의 해석 계약 결과를 미국 식품의 약국 (FDA)에 의해 주어진 정의에 따라 분석 하였다. 한천 플레이트에 성장 식민지에서 예방 접종에 비해 혈액 배양 펠릿의 직접 접종에 의한 AST는 0.1 % VME 및 장내 세균에 대한 0.3 % ME를, 0.7 % VME 및 포도상 구균에 대한 0.1 % ME를 보였다. AST의 따라서 성능혈액 배양 펠렛과 직접 접종 카드는 FDA에서 승인 성능 기준과 일치한다.

스파 타겟팅 PCR 기반 핵산 증폭 기술 MRSA 시험 성능 의한 mecASCC 유전자 직접 MALDI-TOF MS (17)에 의해 식별 포도상 구균 혈액 배양 박테리아 펠릿에 도포 하였다. 1백6가지 경우에 따라, 메티 실린 내성 검출 감도 99 % 및 100 %의 특이성을 나타내었다. 흥미롭게도, 시간의 중앙값은 혈액 배양 양성에서 핵산 증폭 기술의 결과를보고하도록했다 유사한 결과는 97 분 (범위와 동등했다보고 MALDI-TOF 식별의 시간의 중앙값 반면, 201 분 (범위 100-430)와 같은 25 - 250).

그림 1
그림 1 사전 및 사후 MALDI-TOF 시대. O / 샘플의 N 하위 문화를 포함 기존의 진단 방법에 비해는 MALDI-TOF MS 식별 진단 실험실에 샘플 공급을 다음과 같은 분 이내에 수행 할 수 있습니다. 여기를 클릭하십시오 이 그림의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다.

그림이
도 MALDI-TOF MS 식별로 샘플링에서 혈액 배양 2 처리 플로. 혈액 배양이 긍정적 인 경우, 세균 펠렛을 염화 암모늄 용해 원심 분리에 의해 제조된다. 이 박테리아 펠릿은 MALDI-TOF MS에 의해 직접 식별하는 데 사용됩니다. MALDI-TOF MS의 식별은 60 분 FO 30 내에서 얻을 수있다 llowing 혈액 배양 양성. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3
이러한 MRSA의 검출에 대한 관리 시험의 PCR 포인트 (POCT-PCR) 등의 자동화 된 시스템 및 / 또는 디스크 확산 분석 및 신속한 PCR 기반의 테스트를 사용하여 그람 염색, MALDI-TOF MS 식별, AST를 포함하여 그림 3과 많은 다운 스트림 응용 프로그램 수 혈액 배양 박테리아 펠릿에서 직접 수행 될 수있다. 박테리아 혈액 배양 펠릿로부터 직접 테스트는 크게 혈류 감염으로 고통받는 환자의 결과를 향상시키기 위해 선회되는 ID 및 AST 결과를보고하기 위해 턴 - 어라운드 시간을 감소시킨다. 5fig3highres.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4
도 4는 염화 암모늄 용해 원심 프로토콜 양성 혈액 배양 브로스로부터 농축 및 정제 된 박테리아 펠릿의 제조를 허용한다. 대장균 양성 혈액 배양 그람 염색, 응고 효소 - 음성 포도상 capitis스트렙토 dysgalactiae 전과의 제조 후에 수행 혈액 배양 세균 펠렛. 클러스터 및 체인에있는 포도상 구균의 고전 모폴로지 더 쉽게 혈액 배양 박테리아 펠릿보다 네이티브 혈액 배양액에서 관찰된다. 스케일 바는 25 μm의 =.= "_ 빈">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

종래 양성 혈액 배양 진단 방법에 비해, 염화 암모늄 용해 원심 분리 방법을 이용하여 세균 펠렛의 빠른 획득은 24 시간 및 48 시간에 24 의한 AST를보고 할 때 (도 1 및 16에 의해 식별을보고하는 시간을 단축 3).

적절한 항생제 치료의 도입은 빠른 혈류 감염으로 고통받는 환자의 결과를 향상시키기 위해 중요한 것이다. 따라서, 약 8-16 시간에서 얻은 빠른 AST 다음에 1 시간 내 감염원의 조기 발견은 패혈증 환자의 임상 관리에 큰 영향을 나타냅니다. 그람 염색의 급속한보고는 이미 항생제 치료에있어 환자의 이환율과 사망률의 6,7의 감소와 함께 큰 영향과 관련되어있다. 혈액 배양 박테리아 펠릿 그람 염색법은 감도를 증가시키기 위해 수행 될 수있는 경우 BL의 그람 염색법짐 우드 배양액은 부정적이거나 약한 양성 (그림 4)입니다. 그러나, 기본 혈액 배양 배지에서 수행 그람 염색은 같은 체인 클러스터에 포도상 구균이나 연쇄상 구균 등의 일반적인 모폴로지를 관찰하는 것이 좋습니다. 그람 염색이 경우 8의 20 % 만 추가로 영향을 미친 반면, 혈류 감염 2백2가지 경우에 수행 된 최근의 전향 적 연구에서 혈액 배양 펠릿에서 MALDI-TOF MS 식별의 경우 35.1 %에서 항생제 치료에 미치는 영향을 보여 주었다. 등의 AmpC 생성 장내 세균과 같은 항생제 내성 증가와 관련된 박테리아는 MALDI-TOF MS에 의해 확인되었다 흥미롭게 임상 관리에 그람 염색 및 MALDI-TOF MS 식별보고 간의 충돌의 최대 차이가 관찰되었다. 이와 유사하게,있는 martiny 등은. MALDI-TOF MS 신속한 식별 향적 스터드 반면의 경우 13.4 %에서 항생제 치료의 적응을 고정 할 수 있음을 보여 주었다Y는 스톤 킹 등에 의해 수행. 균혈증을 일으키는 미생물의 신속한 식별 어느 초기 요법 또는 항생제 (18,19)의 스펙트럼을 줄임에 의해 덮여 있지 추가적인 항생제를 투여하여 케이스의 77 %에서 경험적 치료를 조정하는 데 도움이 될 것을 제안 . 또한, 이러한 핵산 증폭 기술 MRSA와 같은 신속한 PCR 기반 분석의 사용은 다음의 S. 혈액 배양 펠릿에서 MALDI-TOF MS에 의한 구균 식별 S. 앓고있는 환자들에게 4 시간 미만에서 가장 적절한 항생제 치료를 제공하도록 허용 구균 균혈증 17. 페니실린 알레르기 환자를 제외하면, 핵산 증폭 기술의 사용은 MRSA는 26.1 % 내지 20.5 %의 글리코 펩타이드로서 안티 MRSA 항생제 오용의 상당한 감소를 허용했다. 함께, 이러한 데이터는 제안이 그람 염색, MALDI-TOF MS 식별 및 신속한 PCR 기반의 신속한 순차적보고혈액 배양 펠릿으로부터 ssay 크게 항생제 때문에 임상 관리뿐만 아니라, 혈류 감염으로 고통받는 환자의 결과를 개선한다.

MALDI-TOF MS 한천 플레이트에서 자란 순수한 식민지에서 수행 기존의 MALDI-TOF MS에 의해 얻어 84.1 %의 식별의 속도에 비해 매우 좋은 성능입니다 혈액 배양 펠릿의 78.7 % 정확한 식별을 허용했다. 더 많은 것을 혈류 감염의 50 %는 같은 장내 세균, 황색 포도상 구균, 녹농균 및 장내 세균 종에 의해 발생합니다. 이 박테리아가 효율적 가능성에 긍정적 인 혈액 배양 세균 펠릿에서 직접 수행 MALDI-TOF MS 식별의 좋은 성능에 영향을 MALDI-TOF MS로 식별됩니다. MALDI-TOF MS에 의해 일부 박테리아 종의 식별을 위해 낮은 성능은 혈액 배양 펠릿에서 수행을 중심으로 유사한 요인으로 인해한천 플레이트에서 자란 순수한 식민지에서 기존의 식별을 위해 관찰보다. 예를 들어, 연쇄상 구균이 mitis 그룹과 응고 효소 음성 포도 구균에 속하는 여러 미생물 종은 밀접하게 관련 및 MALDI-TOF MS에 의해 낮은 정확도로 식별됩니다. 또한, 그람 양성 세균의 세균 세포벽의 특정 조성물 또는 클렙시 엘라 뉴 모니 아와 같은 세균 종에서 관찰 조밀 캡슐의 존재를 유의하게 용해 효율 때문에 MALDI-TOF MS의 식별 성능을 감소시킨다. 마지막으로, 혐기성 세균의 식별 MALDI-TOF MS의 낮은 성능이 MALDI-TOF 데이터베이스 이들 박테리아의 완전하고 나쁨 표현에 주로 기인한다.

순수한 식민지에서 기존의 식별에 비해 혈액 배양 펠릿에서 MALDI-TOF MS 식별의 작은 성능 저하로 인해 잔여 혈액 단백질 C로 할 수있다omponents 또는 용해 - 원심 분리 후 얻어진 박테리아의 양이 불충분. 마찬가지로, 박테리아의 성장을 방해 할 수있는 그 격리 된 식민지 접종하는 단백질, 혈액 세포와 혈액 매체 화합물 등의 잔류 혈액 배양 구성 요소에 의해 발생할 수 있습니다에 비해 혈액 배양 펠렛과 직접 접종 자동화 된 미생물 시스템 카드로 관찰 된 차이 미생물 시스템 및 카드 자동 식별 및 AST 모두에 상당한 영향을 미칠 수있다. 또한, 자동화 된 미생물 시스템에 의해 얻어진 AST 결과는 종래의 방법에 비해 상당한 차이를 제공하는 것으로 알려진 일부 항생제의 결과를 검증하기 위해 혈액 배양 박테리아 펠렛에서 직접 수행 디스크 확산 분석에 의해 확인 될 필요가있다. 그러나, 혈액 배양 펠렛 자동화 된 미생물 시스템 카드의 직접 접종은 장내 세균과 staphy 모두 우수한 ID 및 AST 성능을 제공합니다lococci.

따라서 양성 혈액 배양의 염화 암모늄 용해 원심 분리에 의해 얻어진 박테리아 펠릿을 직접 종래 방식에 비해 현저히 감소 된 TAT의 ID 및 AST와 같은 필수적인 결과 빠른보고를 허용하는 몇몇 하류 어플리케이션을 수행하기 위해 검증되었습니다. 또한, 이러한 확장 된 스펙트럼 β-락타 마제 (형 ESBL) 테스트와 같은 추가 응용 프로그램이 긍정적 인 혈액 배양 유사한 용해 원심 분리에서 검증 된 그들은 또한이 연구에서 기술 된 프로토콜을 얻은 세균 펠릿에 적용 할 수 있음을 시사한다 20 방법론.

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Disclosures

저자는 그들이 더 경쟁 금전적 이해 관계가 없다고 선언합니다.

Acknowledgments

우리는 실험실에서 기술을 구현하는 그들의 도움을 로잔의 대학 병원 센터의 세균학 연구소의 기술자 감사합니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
20 G needle Terumo, Leuven, Belgium NN-2038R
50 ml Falcon tube BD, Franklin Lakes, NJ, USA 352070 50 ml centrifuge tubes
Ammonium chlorure Merck, Darmstadt, Germany 101145
Potassium hydrogen carbonate Fluka, St. Louis, MO, USA  60340
Formic acid Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA  F0507 Flammable, corrosive
α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid Fluka, St. Louis, MO, USA  70990 Acute toxicity
Acetonitrile Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA  271004 Flammable, acute toxicity
Trifluoroacetic acid Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA  T6508 Corrosive, acute toxicity
Vitek 2 60 instrument Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France 27202 automated microbial system instrument
Vitek 2 Gram-positive (GP) card Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France 21342 automated GP  identification card
Vitek 2 AST-P580 card Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France 22233 automated microbial AST system
Vitek 2 Gram-negative (GN) card Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France 21341 automated GN  identification card
Vitek 2 AST-N242 card Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France 413391 automated microbial AST system
Xpert MRSA Cepheid, Sunnyvale, Ca, USA  GXMRSA-100N-10 nucleic acid amplification technology MRSA
GeneXpert IV instrument Cepheid, Sunnyvale, Ca, USA GXIV-4-D nucleic acid amplification technology instrument
Microflex LT MALDI-TOF MS instrument Bruker Daltonics, Bremen, Germany BDAL microflex LT/SH
MSP 96 target steel BC Bruker Daltonics, Bremen, Germany 280799 MALDI target plate
Densitometer Densicheck instrument Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France 27208
MALDI Sepsityper kit 50 Bruker Daltonics, Bremen, Germany 8270170
Mac Conkey agar Biolife, Milano, Italy 4016702
Mueller-Hinton agar Oxoid, Hampshire, England CM0337 Mueller-Hinton agar (MH) 
MHF agar Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France 43901 Mueller-Hinton agar-fastidious organisms agar (MHF)
BD columbia III agar BD, Franklin Lakes, NJ, USA 254071 blood agar
BD chocolate agar BD, Franklin Lakes, NJ, USA 254089 chocolate agar
BD schaedler agar BD, Franklin Lakes, NJ, USA 254084 Schaedler agar

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References

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