Utarbeidelse av en blodkultur Pellet for Rapid Bakteriell Identifisering og antibiotika resistenstesting

JoVE Journal
Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

En rask bakteriell pellet preparat fra en positiv blodkultur kan anvendes som en prøve for applikasjoner som identifikasjon ved MALDI-TOF, Gram-farging, antibiotisk resistenstesting og PCR-basert test. Resultatene hurtig kan kommuniseres til klinikere for å forbedre resultatet av pasienter som lider av blodet infeksjoner.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Croxatto, A., Prod'hom, G., Durussel, C., Greub, G. Preparation of a Blood Culture Pellet for Rapid Bacterial Identification and Antibiotic Susceptibility Testing. J. Vis. Exp. (92), e51985, doi:10.3791/51985 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Blodet infeksjoner og sepsis er en viktig årsak til sykelighet og dødelighet. Den vellykkede utfall av pasienter som lider av bakteriemi avhengig av en rask identifisering av infeksjonsmidlet for å lede optimal antibiotikabehandling. Analysen av Gram flekker fra positiv blodkultur kan være raskt gjennomført og allerede betydelig innvirkning på antibiotika regime. Imidlertid er den nøyaktige identifikasjon av smittestoffet fremdeles er nødvendig for å etablere den optimale målrettet behandling. Vi presenterer her en enkel og rask bakteriell pellet preparat fra en positiv blodkultur som kan bli brukt som en prøve for flere essensielle nedstrøms applikasjoner som identifikasjon ved MALDI-TOF MS, antibiotisk resistenstest (AST) av platen diffusjon assay eller automatiserte systemer AST og ved automatisert PCR-basert diagnostisk testing. Resultatene av disse ulike identifikasjons og ASAT systemer brukes direkte på blodkulturbakterie pellets er veldig siMilar til ytelsen normalt oppnådd fra isolerte kolonier dyrket på agarplater. Sammenlignet med konvensjonelle tilnærminger, reduserer den raske oppkjøp av en bakteriell pellet betydelig tid til å rapportere både identifisering og AST. Dermed kan følgende blodkultur positivitet, identifisering av MALDI-TOF bli rapportert i løpet av mindre enn en time, mens resultatene av AST fra automatiserte AST systemer eller plate diffusjon analyser innen 8 til 18 timer, henholdsvis. På samme måte kan resultatet av en hurtig PCR-basert assay bli kommunisert til klinikere mindre enn 2 timer etter rapport av en bakteriemi. Sammen utgjør disse resultatene viser at den raske utarbeidelse av en blodkultur bakteriell pellet har en betydelig innvirkning på identifisering og AST behandlingstid og dermed på det vellykkede resultatet av pasienter som lider av blodet infeksjoner.

Introduction

Blodet infeksjoner og sepsis i innlagte pasienter er en viktig årsak til sykelighet og dødelighet. Dermed er dødelighet relatert til blodbanen infeksjoner observert hos ca 14% til 37% av innlagt pasient og kan øke til 35% i intensivavdelinger pasienter 1-3. Den hurtige identifiseringen av infeksjonsmidlet er avgjørende for å lede optimal antimikrobiell behandling, og for å øke det vellykkede utfall av antimikrobiell terapi 4,5. Den raske analyse av Gram flekker fra positiv blodkultur har allerede en betydelig innvirkning på tilpasning av antimikrobiell behandling 6,7 men nøyaktig identifisering av smittestoffet er nødvendig for å gi best tilpasset antibiotikabehandling til pasientene. For eksempel ulike antibiotika behandlingsregimer må gjennomføres etter bakteriemi med enterokokker og streptokokker som er vanskelig å skille fra Gram farging. Tilsvarende identifikasjon på arten umel er nødvendig for å påvise Gram negative enterobakterier som koder for et kromosomalt gen som AmpC gi en øket motstand mot β-laktamer 8.

Med en positiv blodkultur, er den konvensjonelle diagnostiske tilnærming til subkultur smittestoffet på forskjellige agar-plater, som krever flere timers ytterligere inkubering før identifikasjon med forskjellige tilnærminger inkludert biokjemiske tester, vekst på forskjellige selektive medier og automatiserte mikrobiell identifikasjonssystemer. Tiden til resultatene av en konvensjonell diagnostisk metode er av omtrent 1 til 3 dager.

Fremveksten av matrisen-assistert laser desorpsjon / ionisering time-of-flight massespektrometri (MALDI-TOF) teknologi for rask identifisering av mikroorganismer har gitt et nytt verktøy for å raskt identifisere mikroorganismer fra koloniene dyrket på agar plater men også direkte fra positivt blod kulturer (figur 1) 9-12. The bruk av MALDI-TOF å identifisere en smittsom agent fra blodkulturer har redusert tid til resultatene til noen få minutter i stedet for timer og dager som kreves av tradisjonelle metoder. Som diskutert av Croxatto et al. 13. effektiviteten av MALDI-TOF-identifikasjon er avhengig av forskjellige parametre inkludert mikroorganismen renhet og mengde. Disse to kriterier er lett oppnådd fra diskrete kolonier dyrket på agarplater, men kreves en forhånds analytisk behandling av bakteriell anrikning og rensing fra komplekse prøver som blodkultur, som inneholder flere cellulære og protein-komponenter som kan forstyrre MALDI-TOF identifikasjon.

Ulike mikroorganismer 'isolasjon metoder fra blodkultur har blitt brukt i en rekke studier inkludert saponin eller andre milde vaskemidler metode for bakteriell utvinning 9,14, serum separator metode 10, lyse sentrifugeringsmetoder 12 (figur 2) 15. Dette blod-kultur pellet forberedelse også gi et eksempel for andre direkte nedstrøms applikasjoner som Gram farging, automatisert PCR-baserte diagnostiske tester som POCT-PCRs for rask påvisning av meticillinresistente Staphylococcus aureus (MRSA), og antibiotika resistenstesting med AST automatiserte systemer og / eller ved å disk diffusjon Målinger på agarplater (figur 3).

I dette arbeidet, vil vi beskrive de forskjellige trinnene for fremstilling av blod-kultur bakteriell pellet som forklart av Prod'hom et al. 15 (figur 4). Vi vil også utelattskriver protokollene for tre av de viktigste programmene som kan utføres på blodkultur pellet: Identifikasjon av MALDI-TOF 15, identifikasjon (ID) og antibiotika resistenstesting (AST) med automatiserte systemer 16 for Enterobacteriaceae og stafylokokker og automatisert PCR basert diagnostisk test for påvisning av MRSA 17.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Denne protokollen har blitt utviklet og validert følge forskning og utvikling prosesser og etiske regler for vår institusjon før de blir implementert som en rutinemessig verktøy.

1. Utarbeidelse av en blodkultur Bakteriell Pellet av salmiakk Erythrocyte-lyse Prosedyre

  1. Fremstilling av en positiv blodkultur for påfølgende sentrifugering.
    1. Sterilisere cap blodkultur. Legg 70% etanol på hetten på flasken og brenne det.
      MERK: Ikke gjør dette trinnet under en laminær hette.
    2. Beveg flasken til en laminær strømningshette. Samle 5 ml av blodkultur med en 20 G sprøyte.
    3. Tilsett 5 ml av blodkultur i et 50 ml sentrifugerør inneholdende 45 ml sterilt vann (H2O) og bland prøven.
  2. Fremstilling av en blodkultur bakteriell pellet ved sentrifugering lysis.
    1. Sentrifuger prøven ved 1000 xg i 10 min ved RT.
    2. Remove supernatanten (som inneholder for det meste H 2 O og blodceller) med en laboratorievakuumpumpe.
    3. Resuspender pellet i 1 ml av hjemme-laget ammoniumklorid lysende løsning (0,15 M NH4Cl, 1 mM KHCO 3). Bryt ned pellet ved skraping, og ved å virvle den sentrifuger røret og prøven ved 140 xg i 10 min ved RT.
    4. Kast supernatanten som i hovedsak inneholder røde blodceller rusk.
      1. Dersom pelleten forble hemoragisk, resuspender pelleten i 2 ml sterilt destillert og H 2 0 for ytterligere å lyserer gjenværende røde blodceller og for å vaske pelleten. Sentrifuger prøven ved 140 xg i 10 min ved RT og kast supernatant.
    5. Resuspender pelleten i 200 pl H to O
  3. Subkultur av blodkultur på forskjellige selektive og ikke-selektive agar medium.
    1. Samle 1 ml av blodkultur med en 20 G sprøyte.
    2. Vaksinere en dråpe blod kultur into fire kvadranter på blodagar, sjokolade agar, McConkey agar og Schaedler agar.
    3. Inkuber ved 37 ° C på blodagar og sjokolade agarplater i en 5% CO2 atmosfære, McConkey agar i en normal atmosfære og Schaedler agarplate i anaerobe betingelser.
    4. Følg bakterievekst på ulike medier.
    5. Sjekk for bakteriell renhet.

2. Identifisering av MALDI-TOF MS

  1. Direkte identifikasjon fra blodet pellet.
    1. Transfer 1 mL av blod pellet på en MALDI sikteplate og la det tørke på en 42 ° C oppvarming plattform.
    2. Overlegg prøven med en ul 70% maursyre og la det tørke på en 42 ° C oppvarming plattform.
    3. Overlegg av prøven med en pl av MALDI matrise (mettet løsning av α-cyano-4-hydroxycinnamic syre i 50% acetonitril-2,5% trifluoreddiksyre) og la det tørke i en 42 ° C varme plattformen.
    4. Fortsett til MALDI-TOF MS analyse med et MALDI-TOF MS system som beskrevet av produsentene.
    5. Hvis identifikasjons stillingen er ugyldig på artsnivå (for eksempel med en score <2), utføre et protein ekstraksjon av blodprøven pellet.
  2. Identifikasjon etter protein utvinning fra blodkultur pellet.
    1. Bland 20 ul av pellet med 1 ml 70% etanol og sentrifuger ved 13.000 xg i 2 min ved RT.
    2. Kast supernatanten og tilsett 25 pl av 70% maursyre og 25 ul av 100% acetonitril til pelleten. Vortex kraftig for å resuspendere pelleten. Resuspender tøffe pellets ved å bryte dem ned med pipetter før virvling.
    3. Sentrifuger ved 13000 x g i 2 min ved RT. Transfer 1 mL av supernatanten (som inneholder hentet proteiner) på en MALDI sikteplate og la det tørke på en 42 ° C oppvarming plattform. Fortsett som beskrevet i 2.1.2.

3. Bakteriell identification og antibiotika resistenstesting med en Automated Microbial System

  1. Utarbeidelse av en bakteriell suspensjon bakteriell identifikasjon og AST med en automatisert mikrobiell system.
    1. Forbered et plastrør inneholdende 3 ml steril 0,45% NaCl-oppløsning kompatibel med den automatiserte mikrosystemet.
    2. Legg til et tilstrekkelig volum av blodkultur pellet i 0,45% NaCl-løsning for å oppnå en bakteriell suspensjon som svarer til en McFarland turbiditet av 0,6 til 0,8. Mål turbiditet ved hjelp av et densitometer maskin.
      MERK: Volumet av blodkultur bakteriell pellet varierer 50 til 200 pl for å oppnå en McFarland turbiditet av 0,6 til 0,8.
  2. Inokuler de automatiske gram-positive (GP) eller gram-negative (GN) kort for identifikasjon og de automatiserte AST kort for antimikrobiell resistenstesting av Gram-positive kokker og Gram-negative bakterier, som beskrevet av produsenten.
    MERK: Identification med GP eller GN kort ikke brukes hvis MALDI-TOF MS identifikasjon poengsum verdien er> 2. Sjekk renheten av bakteriell suspensjon ved subculturing bakteriell suspensjon på blodagar (GP og GN) og MacConkey agar (GN) plater.

4. Antibiotika resistenstesting av Disk Diffusion Assay

Disken diffusjon analysen er beskrevet av Den europeiske komité for antimikrobiell resistenstesting (EUCAST, versjon 3.0 april 2013 www.eucast.org).

  1. Utarbeidelse av en bakteriell suspensjon for å utføre antimikrobiell resistenstesting av disk diffusjon analysen.
    1. Forbered et glassrør inneholdende 3 ml steril 0,9% NaCl-oppløsning.
    2. Legg til et tilstrekkelig volum av blodkultur pellet i 0,9% NaCl-løsning for å oppnå en bakteriell suspensjon som svarer til en McFarland turbiditet på 0,5. Mål turbiditet ved hjelp av et densitometer maskin.
      MERK: Volumet av blodkulturbakteriell pellet varierer 50-200 pl for å oppnå en McFarland turbiditet av 0,6 til 0,8.
    3. Vortex bakteriell suspensjon.
  2. Inokulering av bakteriesuspensjon på Mueller-Hinton-agar (MH) eller Mueller-Hinton agar-agar kresen organismer (MHF) (MH supplert med 5% defibrinert hesteblod og 20 mg / L av β-nikotinamidadenindinukleotid).
    1. Dypp en steril bomullsdott i den bakterielle suspensjon og forsiktig fjerne overskuddsvæske ved å dreie pinnen på innsiden av veggen i glassrør.
    2. Spre bakteriell suspensjon jevnt på hele overflaten av den MH / MHF agarplate av swabbing i tre retninger eller ved hjelp av en automatisert plate rotator.
  3. Bruk av antimikrobielle disker på inokulerte agar plater.
    1. Påfør tett diskene på overflaten av de tørkede inokulerte agar plater manuelt eller ved hjelp av en dispenser mottakelighet disk.
    2. Inkuber platen ved passende temperatur og atmosfære som beskrevet i den antimikrobielle resistenstesting EUCAST disk diffusjon metode (Versjon 3.0 april 2013 www.eucast.org).

5. Automated PCR-basert diagnostisk test for påvisning av MRSA

  1. Ved hjelp av en mikropipette, overfør 50 pl blodkultur pellets i prøve reagensflasken følger med MRSA automatisert PCR-basert diagnostisk test kit og vortex under 20 sek.
  2. Ved hjelp av en 1 ml mikropipette, dispensere prøven i prøve port av kassetten. Sett kassetten inn i automatisert PCR-systemet og starte analysen som beskrevet av produsenten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

I undersøkelsen utført av Prod'hom et al. 15, ble bakterie pellets fremstilt ved ammoniumklorid lysis sentrifugering av 122 positive blodkultur fra 78 pasienter analyseres med MALDI-TOF MS. Ut fra 122 positive blodkultur, 95 (77,9%) ble korrekt identifisert på artsnivå og en (0,8%) ved slekten nivå. De resterende 26 (21,3%) av blodkultur pellets ga ingen sikker identifikasjon av MALDI-TOF. Blant dem, var 21 gram positive bakterier hvorav 13 streptokokker og 5 koagulase-negative stafylokokker. Viktigere, 10 av de 13 uidentifisert streptokokker var Streptococcus pneumoniae som ofte har en vanskelige å lyse kapsel og er neppe skiller seg fra arten av S. mitis gruppe ved hjelp av MALDI-TOF MS. Fem gram-negative bakterier ble ikke identifisert ved MALDI-TOF, blant hvilke fire er vanskelige å lyse innkapslet bakteriearter inkludert to Klebsiella pneumoniae og to Haemophilus influenzae. Det ble således oppnådd korrekt identifisering av MALDI-TOF oppnådd i 78,7% av blodkultur pellets, noe som representerer en effektiv ytelse i forhold til 84,1% for identifikasjon oppnådd fra konvensjonelle identifikasjon av bakterielle kolonier dyrket på agarplater 11.

Utførelsen av den automatiserte mikro system for bakteriell identifikasjon (ID) og for AST ble testet på 278 bakterielle pellet av positive blodkultur for Gram-positive kokker i klynge og Gram-negative bakterier. Disse resultatene ble sammenlignet med resultatene oppnådd med konvensjonelle automatiserte mikrobielle systemkort fra kolonier dyrket på agarplater etter subkultur av positive blodkultur på egnede medier 16. Direkte identifisering ved hjelp av mikrobiell identifikasjon system ID-kort kan brukes når identifikasjon av bakteriell pellet av MALDI-TOF MS har mislyktes. Sammenlignet med en endelig identifikasjon av MALDI-TOF MS, en riktig identifisering medmikrobielle identifikasjonssystem ID-kort ble observert i 99% av Enterobacteriaceae, 74% av stafylokokker, 71% av ikke-fermentative Gram-negative bakterier og 33% av andre gram-positive kokker. En forveksling ble observert hos 11% av totalt antall tilfeller, mens 8% av bakterielle pellets ga ingen identifikasjon. Totalt 220 bakterielle pellets inkludert 87 Enterobacteriaceae og 133 stafylokokker ble analysert for AST med automatisert mikrobiell system AST GN26 og AST 580 kort 16. Resultatene ble analysert i henhold til definisjoner gitt av US Food and Drug Administration (FDA) for tolknings avtale resultater, som definerte en falsk utsatt som en svært alvorlig feil (VME) og en falsk motstandsdyktig som en stor feil (ME). AST hentet fra direkte inokulering av blodkultur pellet i forhold til vaksinasjon fra koloniene dyrket på agar plater viste 0,1% VME og 0,3% ME for Enterobacteriaceae, og 0,7% VME og 0,1% ME for stafylokokker. Dermed ytelsen ASTkort inokulert direkte med blodkultur pellets er i overensstemmelse med ytelseskriteriene akseptert av FDA.

Utførelsen av PCR-basert nukleinsyre forsterkning teknologi MRSA test rettet mot spa, ble mecA og SCC gener direkte brukes på Staphylococcus aureus blodkultur bakterielle pellets identifisert av MALDI-TOF MS 17. Basert på 106 tilfeller påvisning av methicillin motstand oppviste en 99% følsomhet og en 100% spesifisitet. Interessant, var mediantiden rapportere nukleinsyre forsterkning teknologi resultater fra blodkultur positivitet var lik 201 min (range 100-430), mens median tid fra MALDI-TOF legitimasjon for å rapportere lignende resultater var lik 97 min (range 25- 250).

Figur 1
Figur 1. Pre-og post-MALDI-TOF æra. Sammenlignet med konvensjonelle diagnostiske tilnærminger som inkluderer en O / N subkultur av prøven, kan MALDI-TOF MS identifikasjon utføres innen minutter etter prøvene levering til diagnostisk laboratorium. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2. Arbeidsflyt av blodkultur behandling fra prøvetaking til MALDI-TOF MS identifikasjon. Når blodkulturer er positiv, er en bakteriell pellet utarbeidet av salmiakk lyse sentrifugering. Denne bakterielle pelleten blir så brukt for direkte identifisering av MALDI-TOF-MS. MALDI-TOF MS identifikasjon kan skaffes innen 30 til 60 min fo llowing blodkultur positivitet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3. Mange nedstrøms applikasjoner, inkludert Gram farging, MALDI-TOF MS identifikasjon, AST bruke automatiserte systemer og / eller disk diffusjon analyser og raske PCR-basert testing som pasientnær testing PCRs (POCT-PCR) for påvisning av MRSA kan utføres direkte på blodkultur bakteriell pellet. direkte testing fra de bakterielle blodkultur pellets betydelig redusere omløpstiden for å rapportere ID og AST resultater som er dreibar for å forbedre resultatet av pasienter som lider av blodet infeksjoner. 5fig3highres.jpg "target =" _blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4
Figur 4. ammoniumklorid lysis sentrifuge protokollen tillater fremstilling av en anriket og renset bakteriell pellet fra positive blodkulturbuljonger. Gram-farging positiv blodkultur av Escherichia coli, koagulase-negative Staphylococcus capitis og Streptococcus dysgalactiae utført før og etter fremstilling av blodkultur bakteriell pellet. De klassiske morfologi av stafylokokker i klynger og streptokokker i kjedene er mer lett observeres i den innfødte blodkultur kjøttkraft enn i blodkultur bakteriell pellet. Scale bar = 25 mikrometer.= "_blank"> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Sammenlignet med konvensjonelle positive blodkultur diagnostiske metoder, den raske anskaffelse av en bakteriell pellet ved hjelp av ammoniumklorid lysis sentrifuge tilnærming reduserer tiden for å rapportere identifisering av 16 til 24 timer, og tiden til å rapportere AST etter 24-48 timer (figurene 1 og 3).

Rapid innføring av egnede antibiotika er dreibar for å forbedre resultatet av pasienter som lider av blodet infeksjoner. Dermed tidlig identifisering av smittestoffer innenfor 1 time etterfulgt av en rask AST innhentet i omtrent 8 til 16 timer representerer en stor innvirkning i den kliniske behandlingen av septik pasienter. Den raske rapportering av Gram-farging er allerede knyttet til en stor innvirkning på antimikrobiell behandling og dermed med en nedgang i pasient sykelighet og dødelighet 6,7. Den Gram farging av blodkultur bakteriell pellet kan gjøres for å øke følsomheten ved Gram-farging av blood kultur buljong er negativ eller svakt positiv (figur 4). Imidlertid er Gram farging utført på morsblodkultur buljong anbefales å observere typiske morfologi som stafylokokker i klynger eller streptokokker i lenker. I en fersk prospektiv studie utført på 202 tilfeller av blodet infeksjon, MALDI-TOF MS identifikasjon fra blodkultur pellets viste en innvirkning på antibiotikabehandling i 35,1% av tilfellene, mens Gram flekken hadde bare en ekstra effekt i 20% av tilfellene åtte. Interessant nok var den maksimale forskjellen på virkningen mellom Gram-farging og MALDI-TOF MS identifikasjon rapportering på klinisk styring observert når bakterier assosiert med økt antibiotikaresistens som AmpC-produserende Enterobacteriaceae ble identifisert av MALDI-TOF MS. Tilsvarende Martiny et al. Har vist at MALDI-TOF MS rask identifisering kan feste tilpasning av antibiotikabehandling i 13,4% av tilfellene, mens en retrospektiv tappy utført av Stoneking et al. foreslått at en rask identifisering av mikroorganismer som forårsaker bakteriemi kan bidra til å justere den empiriske terapi i 77% av tilfellene, enten ved å administrere en ytterligere antibiotika som ikke dekkes av den første behandlingsregime, eller ved å redusere spektrum av antibiotika 18,19 . Videre, bruk av en hurtig PCR-basert assay som nukleinsyre forsterkning teknologi MRSA følgende S. aureus identifikasjon ved MALDI-TOF MS fra blodkultur pellets lov til å gi den mest egnede antibiotika i mindre enn 4 timer til pasienter som lider av S. aureus bakteriemi 17. Ved utelatelse av pasienter med penicillinallergi, bruk av nukleinsyren forsterkning teknologi MRSA tillot en betydelig reduksjon av anti-MRSA antibiotika misbruk, for eksempel glykopeptider fra 26,1% til 8,1%. Sammen utgjør disse data tyder på at rask sekvensiell rapportering av Gram-farging, MALDI-TOF MS identifisering og raske PCR-basert enssay fra blodkultur pellets er betydelig bedre antibiotisk terapi og dermed den kliniske behandlingen, så vel som resultatet av pasienter som lider av blodet infeksjoner.

MALDI-TOF MS tillot en 78,7% korrekt identifisering av blodkultur pellets, som er en svært god ytelse i forhold til en sats på 84,1% identifisering oppnås ved konvensjonell MALDI-TOF MS utført på rene kolonier dyrket på agar plater. Mer enn 50% av blodet infeksjoner er forårsaket av bakterielle arter som Enterobacteriaceae, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa og enterokokker. Disse bakteriene er effektivt identifisert av MALDI-TOF MS som trolig positivt påvirke de gode resultatene av MALDI-TOF MS identifikasjon utføres direkte på blodkultur bakterielle pellets. Den lave ytelsen for identifikasjon av enkelte bakteriearter av MALDI-TOF MS utført på blodkultur pellets er hovedsakelig på grunn av lignende faktorerenn de som ble observert for den konvensjonelle identifikasjon fra rene kolonier dyrket på agarplater. For eksempel, flere mikrobielle arter som streptokokker tilhører mitis gruppen og koagulase-negative stafylokokker er nært beslektet og identifisert med lav nøyaktighet ved MALDI-TOF MS. Videre har en bestemt sammensetning av den bakterielle celleveggen av grampositive bakterier, eller nærvær av en tett kapsel observeres i bakteriearter som Klebsiella pneumoniae betydelig redusere lysis effektivitet og dermed ytelsen til MALDI-TOF MS identifikasjon. Til slutt, er den lave ytelse av MALDI-TOF MS for identifisering av anaerobe bakterier i hovedsak på grunn av en ufullstendig og dårlig representasjon av disse bakterier i MALDI-TOF-databasen.

Den lille redusert ytelse MALDI-TOF MS identifikasjon fra blodkultur pellets sammenlignet med konvensjonell identifikasjon fra rene kolonier kan skyldes blodrester protein components eller en utilstrekkelig mengde av bakterier som oppnås etter lysis-sentrifugering. Tilsvarende forskjeller som observeres med de automatiserte mikrobielle system inokulert direkte med blodkultur pellets sammenlignet med de som er inokulert med isolerte kolonier kan være forårsaket av gjenværende blodkultur komponenter som proteiner, blodceller og blodmellom forbindelser som kan interferere med bakterievekst i kortene automatisert mikrobiell systemkort og kan ha en betydelig innvirkning på både identifisering og AST. Videre AST resultatene oppnådd av automatiserte mikrobielle systemer må sjekkes av disk diffusjon analyser også utføres direkte på blodkultur bakterielle pellets for å validere resultatene av noen antibiotika er kjent for å presentere betydelige avvik i forhold til konvensjonelle tilnærminger. Men direkte inokulasjon av automatiserte mikrobielle systemkort med blodkultur pellets presenterer en utmerket ID og AST ytelse for både Enterobacteriaceae og staphylococci.

Således har det bakterielle pelleten oppnådd ved sentrifugering ammoniumklorid lysis av positive blodkulturer blitt validert å direkte utføre flere nedstrøms applikasjoner som tillater en hurtig rapportering av essensielle resultater som for eksempel ID og AST i en betydelig redusert TAT sammenlignet med vanlige tilnærminger. Videre har flere programmer som utvidet-spektrum β-laktamaser (ESBLs) testing er validert på lignende lyse sentrifugering av positiv blodkultur metodikk 20 tyder på at de kunne også brukes på bakteriell pellet oppnådd med protokollen som er beskrevet i dette arbeidet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne hevder at de ikke har noen konkurrerende økonomiske interesser.

Acknowledgments

Vi takker teknikerne i bakteriologi laboratorium ved University Hospital Center of Lausanne for deres hjelp til å implementere teknikker i laboratoriet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
20 G needle Terumo, Leuven, Belgium NN-2038R
50 ml Falcon tube BD, Franklin Lakes, NJ, USA 352070 50 ml centrifuge tubes
Ammonium chlorure Merck, Darmstadt, Germany 101145
Potassium hydrogen carbonate Fluka, St. Louis, MO, USA  60340
Formic acid Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA  F0507 Flammable, corrosive
α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid Fluka, St. Louis, MO, USA  70990 Acute toxicity
Acetonitrile Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA  271004 Flammable, acute toxicity
Trifluoroacetic acid Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA  T6508 Corrosive, acute toxicity
Vitek 2 60 instrument Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France 27202 automated microbial system instrument
Vitek 2 Gram-positive (GP) card Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France 21342 automated GP  identification card
Vitek 2 AST-P580 card Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France 22233 automated microbial AST system
Vitek 2 Gram-negative (GN) card Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France 21341 automated GN  identification card
Vitek 2 AST-N242 card Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France 413391 automated microbial AST system
Xpert MRSA Cepheid, Sunnyvale, Ca, USA  GXMRSA-100N-10 nucleic acid amplification technology MRSA
GeneXpert IV instrument Cepheid, Sunnyvale, Ca, USA GXIV-4-D nucleic acid amplification technology instrument
Microflex LT MALDI-TOF MS instrument Bruker Daltonics, Bremen, Germany BDAL microflex LT/SH
MSP 96 target steel BC Bruker Daltonics, Bremen, Germany 280799 MALDI target plate
Densitometer Densicheck instrument Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France 27208
MALDI Sepsityper kit 50 Bruker Daltonics, Bremen, Germany 8270170
Mac Conkey agar Biolife, Milano, Italy 4016702
Mueller-Hinton agar Oxoid, Hampshire, England CM0337 Mueller-Hinton agar (MH) 
MHF agar Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France 43901 Mueller-Hinton agar-fastidious organisms agar (MHF)
BD columbia III agar BD, Franklin Lakes, NJ, USA 254071 blood agar
BD chocolate agar BD, Franklin Lakes, NJ, USA 254089 chocolate agar
BD schaedler agar BD, Franklin Lakes, NJ, USA 254084 Schaedler agar

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Alberti, C., et al. Epidemiology of sepsis and infection in ICU patients from an international multicentre cohort study. Intensive care medicine. 28, 108-121 (2002).
  2. Angus, D. C., et al. Epidemiology of severe sepsis in the United States: analysis of incidence, outcome, and associated costs of care. Critical care medicine. 29, 1303-1310 (2001).
  3. Vincent, J. L., et al. Sepsis in European intensive care units results of the SOAP study. Critical care medicine. 34, 344-353 (2006).
  4. Micek, S. T., et al. Empiric combination antibiotic therapy is associated with improved outcome against sepsis due to Gram-negative bacteria a retrospective analysis. Antimicrob Agents Chemother. 54, 1742-1748 (2010).
  5. Seifert, H. The clinical importance of microbiological findings in the diagnosis and management of bloodstream infections. Clin Infect Dis. 48, S238-S245 (2009).
  6. Barenfanger, J., et al. Decreased mortality associated with prompt Gram staining of blood cultures. American journal of clinical pathology. 130, 870-876 (2008).
  7. Munson, E. L., Diekema, D. J., Beekmann, S. E., Chapin, K. C., Doern, G. V. Detection and treatment of bloodstream infection: laboratory reporting and antimicrobial management. J Clin Microbiol. 41, 495-497 (2003).
  8. Clerc, O., et al. Impact of matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry on the clinical management of patients with Gram-negative bacteremia a prospective observational study. Clin Infect Dis. 56, 1101-1107 (2013).
  9. Meex, C., et al. Direct identification of bacteria from BacT/ALERT anaerobic positive blood cultures by MALDI-TOF MS MALDI Sepsityper kit versus an in-house saponin method for bacterial extraction. Journal of medical microbiology. 61, 1511-1516 (2012).
  10. Moussaoui, W., et al. Matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry identifies 90% of bacteria directly from blood culture vials. Clin Microbiol Infect. 16, 1631-1638 (2010).
  11. Seng, P., et al. Ongoing revolution in bacteriology routine identification of bacteria by matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry. Clin Infect Dis. 49, 543-551 (2009).
  12. Stevenson, L. G., Drake, S. K., Murray, P. R. Rapid identification of bacteria in positive blood culture broths by matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry. J Clin Microbiol. 48, 444-447 (2010).
  13. Croxatto, A., Prod&34hom, G., Greub, G. Applications of MALDI-TOF mass spectrometry in clinical diagnostic microbiology. FEMS Microbiol Rev. 36, 380-407 (2012).
  14. Chen, J. H., et al. Direct bacterial identification in positive blood cultures by use of two commercial matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry systems. J Clin Microbiol. 51, 1733-1739 (2013).
  15. Prod&34hom, G., Bizzini, A., Durussel, C., Bille, J., Greub, G. Matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry for direct bacterial identification from positive blood culture pellets. J Clin Microbiol. 48, 1481-1483 (2010).
  16. Prod&34hom, G., Durussel, C., Greub, G. A simple blood-culture bacterial pellet preparation for faster accurate direct bacterial identification and antibiotic susceptibility testing with the VITEK 2 system. Journal of medical microbiology. 62, 773-777 (2013).
  17. Clerc, O., et al. Matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry and PCR-based rapid diagnosis of Staphylococcus aureus bacteraemia. Clin Microbiol Infect. (2013).
  18. Martiny, D., et al. Impact of rapid microbial identification directly from positive blood cultures using matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry on patient management. Clin Microbiol Infect. 19, E568-E581 (2013).
  19. Stoneking, L. R., et al. Would earlier microbe identification alter antibiotic therapy in bacteremic emergency department patients. The Journal of emergency medicine. 44, 1-8 (2013).
  20. Nordmann, P., Dortet, L., Poirel, L. Rapid detection of extended-spectrum-beta-lactamase-producing Enterobacteriaceae. J Clin Microbiol. 50, 3016-3022 (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.

    Usage Statistics