체외 메틸화 분석에서 단백질 아르기닌 메틸화를 공부합니다

1Department of Pulmonary, Critical Care, Sleep, and Allergy, University of Illinois at Chicago, 2Department of Hematology and Oncology, University of Illinois at Chicago, 3Jesse Brown Veterans Affairs Medical Center
Published 10/05/2014
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Biology

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Summary

단백질 아르기닌 메틸화, 효소의 클래스에 의해 촉매. 단백질 아르기닌 메틸 트랜스퍼 (PRMTs)는 단백질 내의 아르기닌에 메틸기 (들)의 첨가의 효소 과정이다. 체외 메틸화 분석은 공지 또는 신규 PRMT 기판의 메틸화 상태를 평가하기위한 가장 신뢰할 도구이다.

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Bikkavilli, R. K., Avasarala, S., Van Scoyk, M., Karuppusamy Rathinam, M. K., Tauler, J., Borowicz, S., et al. In vitro Methylation Assay to Study Protein Arginine Methylation. J. Vis. Exp. (92), e51997, doi:10.3791/51997 (2014).

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Abstract

단백질 아르기닌 메틸화는 핵에서 가장 풍부하게 번역 후 변형 중 하나이다. 단백질 아르기닌 메틸화는 식별 및 / 또는 프로테오믹스 방법을 통해 결정, 및 / 또는 메틸 아르기닌 특이 항체 발현 수준으로 할 수있다. 그러나, 이러한 기술은 때때로 오해의 소지가 될 수 있으며 종종 거짓 긍정적 인 결과를 제공한다. 가장 중요한 것은, 이들 기술은 메틸화 분석법은, 반면에, 민감한 유용한 생화학 분석법이다 체외. PRMT의 기질 특이성을 지원하는 직접적인 증거를 제공 할 수 있고, 식별 된 단백질이 실제로 PRMT 기판 인 경우 일관 공개. 전형적인 관내 메틸화 분석은 정제 된 활성 PRMTs 정제 기판과 방사성 동위 원소 표지 된 메틸 공여체 (S-아데노 실-L-[메틸 3 H] 메티오닌)을 포함한다. 여기에서 우리는 촉매 활성 PRMT1, 재하 표현 PRMT의 가족을 분리하는 단계별 프로토콜을 설명합니다. 나정제 PRMT1의로 메틸 트랜스퍼 활동 이후 S-아데노 실-L-메틸 공여체로서 [메틸 3 H] 메티오닌의 존재하에, 단백질 1 (G3BP1)를 결합 라스-GTPase 활성화 단백질, 공지 PRMT 기판 상에 시험 하였다. 이 프로토콜은 새로운 생리 PRMT1 기판의 메틸화 상태를 설정하기위한,뿐만 아니라 단백질 아르기닌 메틸화의 기본 메커니즘을 이해하기 위해 단지 사용될 수있다.

Introduction

단백질의 메틸화는 첫째 1968 일에 설명했다. 그것은 연구자들이이이 번역 후 변형의 중요성을 인식하기 시작, 1996 년 PRMT1의 첫 번째 복제까지되지 않았습니다. 흥미롭게도, 핵 추출물의 단백질 아르기닌 잔기의 약 2 %는이 수정의 풍요 로움을 나타내는 3 메틸화된다. 아르기닌 될 수 아르기닌 측쇄 내의 염기성 측쇄와 질소 / s와 양전하를 띤 아미노산 포스트 병진 메틸기, 아르기닌 메틸화 4-6로 알려진 프로세스를 추가로 변경됨. 아르기닌 메틸화 효소 즉의 클래스에 의해 촉매된다. 단백질 아르기닌 메틸 트랜스퍼 (PRMTs). 아르기닌은 monomethylated 또는 dimethylated 후자는 공정 4-6 PRMTs 촉매의 종류에 따라 대칭 또는 비대칭이 될 수 될 수 있습니다.

arginin 표시 단백질전자 글리신이 풍부한 모티브 PRMT 매개 촉매에 대한 잠재적 인 대상이다. 기판 PRMT 매개 메틸화 정상 세포 항상성 7-9에 중요한 모두의 단백질 - 단백질 상호 작용, 단백질 - 핵산 상호 작용, 단백질 기능, 유전자 발현 및 / 또는 세포 신호 전달을 조절하는 것으로 나타났다. 단백질 아르기닌 메틸화의 생물학적 역할을 이해하기 위해서는, 정확한 효율과 재현성이 분석법은 식별 PRMT 기판의 메틸화 상태를 설정하기 위해 필요하다.

자신의 기판의 메틸화를 촉진하기 위해 정제 PRMTs의 능력을 평가하는 시험 관내 메틸화 분석에서, 아르기닌 메틸화 10-12 연구를위한 잘 받아 분석이다. 이 분석의 전반적인 성공은 대부분 정제 된 PRMTs의 활동에 따라 달라집니다. PRMTs 표현 박테리아 나 포유류 세포 10,11로부터 정제 할 수있다. D 등이 체외 메틸화 분석,프로토콜 절에 etailed 원래 티니와 동료 (10)에 의해 설명 된 방법에 기초한다. 이 프로토콜에서는 상세히 PRMT1 포유류 세포에서의 발현 및 정제하는 단계를 나타낸다. 단백질 결합 단백질 1 (G3BP1), 공지 PRMT 기판 (8)를 활성화하는 라스-GTPase에 메틸화를 촉진하는 정제 PRMT1의 능력은 이상과 같은 S-아데노 실-L-[메틸 3 H] 메티오닌의 존재하에 평가 하였다 메틸 공여체. 이 분석을 사용하여, 우리는 확실하게 단백질 아르기닌 메틸화 연구에서 주요 단계 메틸 레이트 신규 또는 공지 된 기판에 PRMTs의 능력을 정의 할 수있다.

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Protocol

식 구조의 1 준비

  1. 프로토콜을 시작하기 전에, N-말단 에피토프 태그 (Myc와 또는 HA), 및 박테리아 세포에서 높은 수준의 단백질 발현 및 정제를위한 기판에서 프레임 글루타치온-S-전이 효소 (GST)와 함께 포유 동물 발현 벡터에 클론 PRMTs 표준 분자 생물학적 기술을 이용하여 용 해물.

PRMTs의 2 정제

  1. 인간 기관지 상피 세포 (Beas2B)을 유지하기 위해 100mm 배양 접시를 사용합니다. 통로 세포를 3 일마다 그들을 합류로 성장할 수 있도록하지 않습니다.
  2. 형질 감염 전날에, 100mm 배양 접시에 10 ml의 배지에 7.5 × 105 세포를 시드. 소용돌이 균일하게 세포를 분산하고, 5 % 가습 CO 2 배양기에서 37 ° C에서 배양한다.
  3. 다음날, 미디어를 대기음 혈청과 항생제없이 배양 배지 5 ㎖를 추가합니다. 소용돌이와 매체를 대기음. 이 단계를 반복 한더 많은 시간, 최종적 혈청 / 항생 배지 5 ㎖를 추가로 진행 형질.
  4. 멸균 된 1.5 ㎖의 플라스틱 원심 분리기 튜브에서 무 혈청 배지 750 μL로 플라스미드 DNA 6 μg을 희석.
  5. 또 다른 1.5ml의 플라스틱 원심 분리기 튜브에서, 무 혈청 배지 750 μL로 형질 감염 시약 30 μL 희석.
  6. 희석 DNA (단계 2.4)을 함유하는 튜브로 희석 형질 감염 시약 용액 (단계 2.5)을 전송. 피펫 팅에 의해 여러 번 아래로 부드럽게 섞는다.
  7. 15 분 동안 실온에서 형질 전환 혼합물을 배양한다.
  8. 15 분 후, 세포 위에 가볍게 형질 전환 혼합물을 피펫, 소용돌이 균일하게 혼합하고, 5 % 가습 CO 2 배양기에서 37 ° C에서 배양한다.
  9. 3 시간 후, 세포로부터 형질 전환 혼합물을 함유하는 배지를 흡인. 혈청과 항생제로 보충 신선한 세포 배양 배지를 추가합니다.
  10. 5 % 가습 CO 2에서 37 ° C에서 품어48 시간 동안 인큐베이터.
  11. 48 시간 후, 용해 완충액 1 ㎖로 세포를 용해 (1X 인산 완충 생리 식염수, 1 % Nonidet P-40, 0.5 % 나트륨 데 옥시 콜레이트, 0.1 % 나트륨 도데 실 설페이트, 1 μg / ml의 phenlymethyl 술 포닐 플루오 라이드). 셀 리프터와 플라스틱 원심 분리 튜브에 수집하고, 용 해물을 30 분 동안 얼음 위에서 배양 용 해물.
  12. 세포 파편에서 해물을 취소 벤치 탑 원심 분리기에서 10 분 동안 15,000 XG에 해물을 원심 분리기. [* 이것은 고도로 메틸화 분석 용 효소의 정제를 진행하기 전에 항-HA 항체와 해물의 분취 량 면역 블로 통해 HA-PRMT1의 발현을 확인하기 위해 추천된다.]
  13. PRMTs의 정화를 들어, 인산염 완충 생리 식염수에 항-HA 친 화성 기질의 50:50 현탁액 30 μL (PBS)와 세포 용 해물의 3 mg의 배양 및 튜브 회전에서 4 ° C에서 하룻밤 회전합니다.
  14. 다음 날, 수집 2 분 동안 벤치 탑 원심 분리기에서 14,000 XG에서 튜브를 회전구슬. 뜨는을 취소하고이 14,000 XG에서 원심 분리 씻어 비즈 [20 mM 트리스 (산도 8.0), 150 mM의 염화나트륨, 5 mM의 EDTA, 1 % 트리톤 X-100] 각 버퍼 RIPA의 1 ㎖로 3 배 씻어 분. 셋째 세척 한 후, 메틸화 버퍼 100 ㎕ 한 번 구슬을 씻는다 (50 mM 트리스의 pH 8.5, 20 mM의의 KCl, 10 mM의 MgCl2를, 1 ㎜의 β-머 캅토 에탄올, 100 MM의 자당). 원심 분리 후, 상층 액을 제거합니다. 고정화 PRMTs 함유 구슬 메틸화 분석에 사용될 준비가되었다. [*이 높은 메틸화 분석에 즉시 고정 PRMTs를 사용하는 것이 좋습니다.]

기판의 3 정화

  1. GST-G3BP1의 단일 콜로니가 100 μg / ml의 암피실린을 함유하는 루리아 - 베르 타니 (LB) 배지 5 ㎖에 접종 BL21 변형. 250 rpm에서 진탕 37 ° C에서 하룻밤 문화를 성장.
  2. 다음 날, 신선한 LB 배지 및 계속 50 ㎖에 하룻밤 문화를 전송inue는 (그것은 약 2 시간 소요) OD 0.5-0.7의 600로 증가합니다.
  3. OD 600이 0.5 ~ 0.7에 도달 할 때, 250 rpm에서 진탕 37 ° C에서 추가로 4 시간 동안 배양 한 mm의 최종 농도 이소 프로필-β-D-티오 갈 락토 시드 (IPTG)를 추가하고 계속하십시오.
  4. 10 분 동안 1,500 XG에서 원심 분리하여 세포를 수확하고, -80 ° C에서 GST 정화 또는 저장소의 펠렛을 처리합니다.
  5. 용해 완충액 5 ㎖의 세균 펠릿 다시 중단 (단백질 분해 효소 억제제, 라이소자임의 100 μg / ml의와 1X PBS를 0.1 % 트리톤 X-100) 및 30 분 동안 37 ° C에서 해물을 품어. 이 때 해물 인해 세균 게놈 DNA의 출시로 혼탁 한 점성이 나타납니다.
  6. 초음파에 의한 게놈 DNA (1 초 30 %의 진폭을 가진 각각의 10 펄스) 전단.
  7. 10 분 동안 15,000 XG에서 원심 분리 용 해물을 취소하고 15 ML 튜브에 맑은 상층 액을 전송합니다. 상층 액이 명확하지 않은 경우 centrifu를 반복gation 과정을 한 번 더.
  8. 한편, 얼음 차가운 PBS로 두 번 GST-세 파로스 비드를 세척하고 PBS에서 GST-세 파로스 50:50 서스펜션을합니다. 삭제 박테리아 세포 용 해물에 GST-세 파로스 현탁액 200 μl를 추가하고 1 시간 동안 4 ° C에서 회전합니다.
  9. 1 시간 후, 비드를 수집하는 3 분 동안 500 XG에서 튜브를 원심 분리. 구슬이 얼음 차가운 PBS로 3 배 씻으십시오.
  10. 최종 세척 한 후, 용출 버퍼 (50 mM 트리스 산도 8.0, 150 밀리미터의 NaCl, 30 mM의 글루타티온) 100 ㎕에 구슬을 재현 탁하고 10 분 동안 4 ° C에서 회전합니다.
  11. 2 분 동안 15,000 XG에 튜브를 원심 분리기 및 다른 플라스틱 원심 분리 관에 정제 된 단백질을 포함하는 상층 액을 전송합니다. 정제 된 단백질의 농도를 추정하기 위해 소 혈청 알부민 (BSA)의 공지 된 양 함께 정제 된 단백질의 5 μL를 SDS 폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동 (SDS-PAGE) 분석을 수행한다.

4 메틸화 분석

주 : 방사성 동위 원소 작업 및 방사성 동위 원소 실험을 수행하기에 기관의 프로토콜을 준수 지정된 별도의 영역에서 다음 단계를 수행합니다.

  1. 정제 된 GST-기판과 1X 메틸화 버퍼 (50 mM 트리스의 pH 8.5, 20 mM의의 KCl, 10 mM의 MgCl2를, 1 ㎜의 β-머 캅토 에탄올, 100 MM의 자당)의 1 μCi 포함하는 마스터 믹스의 2 μg 추가 S를 - adenosyl- L - [메틸 3 H] 메티오닌, 물 고정 PRMTs (단계 2.13)에 10 μL의 최종 볼륨과 1 시간 동안 30 ° C에서 반응을 품어.
  2. 1 시간 후, 2X SDS 샘플 완충액 10 μl를 첨가하여 반응을 정지. 10 분 동안 95 ° C에서의 시료의 변성 후, SDS-PAGE 겔에서 샘플을 구분합니다.
  3. 나중에, 반 건조 전기 전송을 사용하여 니트로 셀룰로오스 막에 SDS 겔에서 분리 된 단백질을 전송합니다.
  4. 전사 후, 함께 막을 덮utofluor (방사 법적 화상 압기)가 부드럽게 실온에서 2 시간 동안 흔들어. 2 시간 후, autofluor을 부어 나중에 사용하기 위해 보관합니다. [* 방사성 물질로 튜브를 레이블]
  5. 빨리 공기는, 여과지를 건조 막 플라스틱 백에 밀봉하고 -20 ° C에서 X-선 필름에 노출을 막. 충분한 노출 시간 5~30일 사이의 범위.

PRMT 식 및 기판의 평등로드의 5 확인

  1. 충분한 노출을 달성 한 후, 차단 버퍼가 포함 된 플라스틱 상자 [트윈 20 (TBST + 3 % 무 지방 우유)과 트리스 완충 식염수를]에 멤브레인을 전송하고 부드럽게 한 시간 동안 바위.
  2. 방사성 폐기물로 차단 버퍼를 폐기하십시오. 사에서 밤새 TBST에서 : (1000 희석 1) 항-HA 항체와 함께 막을 배양 부드러운 락과 ° C,.
  3. TBST 배와 멤브레인을 세척하고 HRP 표지 항 마우스 이차 항체로 막을 배양부드러운 락을 1 시간 동안 실온에서 TBST에서 (한 5,000 희석).
  4. 1 시간 후, TBST 배와 멤브레인을 세척하고, HRP의 기질과 단백질의 chemiluminiscence 검출을 수행합니다.
  5. HA-태그 PRMTs의 검출 후, 실온에서 5 분 동안 Ponseau-S 염색 용액과 함께 막을 배양한다. 신속하게 GST-태그 기판을 감지하는 물을 막 배를 씻는다. 이미지를 스캔합니다.

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Representative Results

GST-G3BP1 메틸화하는 HA-PRMT1의 능력은 체외 메틸화 분석에 의해 결정되었다. Beas2B 세포 용 해물로부터 정제 HA-태그 PRMT1는 GST-G3BP1를 포함하는 메틸화 반응에 고용되었다 메틸 공여체 S-아데노 실-L-[메틸 3 H] 메티오닌 1 μCi. PRMT1 효율적 GST-G3BP1 (그림 1, 상단 패널)의 메틸화를 촉진 할 수있다. 음성 대조군 (그림 1, 상판, 차선 1)을 역임 빈 벡터 형질 Beas2B 세포의 용 해물을 수행 풀다운을 사용하여 메틸화 반응. PRMT1의 발현이 항-HA 항체와 면역 블로 확인했다 (그림 1, 가운데 패널). Ponseau-S 염색 반응은 모두 GST-G3BP1 동등한 하중 (도 1, 하부 패널)을 입증하기 위해 사용되었다.

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도 1의 PRMT1 methylates의 G3BP1. PRMT1 매개 G3BP1 메틸화는 E.로부터 정제 Beas2B 세포 용 해물, GST-G3BP1로부터 정제 HA-태그를 포함 PRMT1 체외 메틸화 반응을 사용하여 평가 하였다 콜라이, 및 메틸 공여체로서 S-아데노 실-L-[메틸 3 H] 메티오닌. 상단 패널은 G3BP1 메틸화에 대한 fluorograph을 나타냅니다. 중앙 패널은 HA-태그 PRMT1의 발현을 확인하는 면역을 나타냅니다. 그리고, 상기 하부 패널은 기판 (GST-G3BP1) 동등한 부하를 결정 Ponseau-S 염색 얼룩을 나타낸다.

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Discussion

본원에 기재된 프로토콜은 통상적으로 식별 PRMT 기판의 메틸화 상태를 설정하는 데 사용된다. 이 강력하고 일관성있는 분석은 또한 기판에 대한 PRMTs의 특이성에 대한 결정적인 증거를 제공 할 것입니다. 이 분석의 성공을위한 핵심 구성 요소는 다음과 같습니다 포유 동물 세포에서 PRMTs의 1 식, 정제 PRMTs의 2 활동, 3 식 및 기판의 정제 및 니트로 셀룰로오스 막에 단백질의 4 완료 서부 전송.

재조합 PRMTs 표현 및 세균으로부터 정제는 또한 시험관 10,11,13 메틸화 반응에서 사용될 수있다. 각 PRMT 다른 정제 전략, 저장 조건 및 저장 온도를 필요로하기 때문에, 재조합 PRMTs의 사용은 시험 관내 메틸화 반응은 적합하지 않을 수있다. 또한, 재조합 PRMTs는 단명 (11)이다. 이러한 문제를 고려하면, 우리는 끝까지 마음을 믿는다포유 동물 세포에서 PRMTs의 동북 아시아의 평화와 번영은 체외 메틸화 반응을 수행하는 것이 편리하고, 일치한다. 포유 동물 세포에서 PRMTs의 일시적 발현이 불편할 것 같으면, 또는, 하나는 PRMTs 안정 세포주을 고려할 수 있습니다. 가장 중요한 것은 포유 동물 세포에서의 발현은 PRMTs 예, 성장 인자, 사이토 카인 등을 자극에 응답하여 PRMT 촉매 활성을 결정하기 위해 사용할 수있는 유일한 방법이다

포유 동물 소스로부터 정제 PRMTs 사용의 주요 제한은 정제 과정 중에 다른 PRMTs으로 오염된다. 그러나, 하나는 추가 컨트롤 메틸 전이 활동은없는 아르 PRMTs의 돌연변이 구조를 사용할 수 있습니다. 조사중인 PRMTs가 동종이 량체를 형성 할 수 있다면, 돌연변이 구조는 잘 컨트롤하지 않을 수 있습니다. 또한, 하나는 음성 대조군으로 대상 PRMTs 고갈 세포로부터 정제 PRMTs 사용을 고려하거나 재조합을 사용할 수 있습니다세균 소스 PRMTs. 제시된 프로토콜은 단백질 아르기닌 메틸화를 조사 할 수있는 간단하고 편리하고 일관성있는 분석을 설명합니다. 기재된 방법뿐만 아니라 신규 PRMT 기판의 메틸화 상태의 식별 및 설립을 위해 필수적이지만, 또한 단백질 아르기닌 메틸화기구의 고객에 대한 기본적인 이해.

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Disclosures

저자가 공개하는 게 없다.

Acknowledgements

본 연구는 재향 군인의 미국학과에서 우수상 지원하고, NIH는 RW하는 R01CA138528을 부여했다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
S-adenosyl-L-[methyl-3H] methionine Perkin Elmer
Ecoscint ultra  National Diagnostics LS-270
Bottle top dispenser National Diagnostics LS-900
AutoFluor National Diagnostics LS-315
6 ml Scintillation Vials National Diagnostics SKU:SVC-06
GST-sepharose GE Life Sciences
L-Glutathione Reduced Sigma G4251
Lipofectamine Invitrogen Transfection reagent
Beas2B ATCC
Optimem Invitrogen
NP-40 US-Biologicals
SDS Sigma
Sodium deoxycholate Sigma
PMSF Sigma
anti-HA affinity matrix Roche
Tris Sigma
Nacl Sigma
Bio-rad gel doc Bio Rad
anti-HA antibody roche
Ponseau S Fisher Scientific

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References

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