इन विट्रो मेथिलिकरण परख में प्रोटीन Arginine मेथिलिकरण अध्ययन

1Department of Pulmonary, Critical Care, Sleep, and Allergy, University of Illinois at Chicago, 2Department of Hematology and Oncology, University of Illinois at Chicago, 3Jesse Brown Veterans Affairs Medical Center
Published 10/05/2014
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Biology

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Summary

प्रोटीन arginine मेथिलिकरण, एंजाइमों अर्थात के एक वर्ग द्वारा उत्प्रेरित., प्रोटीन arginine मिथाइल transferases (PRMTs), प्रोटीन के भीतर arginines को मिथाइल समूह (एस) के enzymatic अलावा की प्रक्रिया है. इन विट्रो मेथिलिकरण परख ज्ञात या उपन्यास PRMT substrates के मेथिलिकरण स्थिति का आकलन करने के लिए सबसे भरोसेमंद उपकरण है.

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Bikkavilli, R. K., Avasarala, S., Van Scoyk, M., Karuppusamy Rathinam, M. K., Tauler, J., Borowicz, S., et al. In vitro Methylation Assay to Study Protein Arginine Methylation. J. Vis. Exp. (92), e51997, doi:10.3791/51997 (2014).

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Abstract

प्रोटीन arginine मेथिलिकरण नाभिक में सबसे प्रचुर बाद translational संशोधनों में से एक है. प्रोटीन arginine मेथिलिकरण पहचान और / या प्रोटिओमिक दृष्टिकोण के माध्यम से निर्धारित किया, और / या मिथाइल-arginine विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ Immunoblotting किया जा सकता है. हालांकि, इन तकनीकों कभी कभी भ्रामक हो सकते हैं और अक्सर झूठी सकारात्मक परिणाम प्रदान करते हैं. सबसे महत्वपूर्ण बात, इन तकनीकों मेथिलिकरण assays, दूसरी ओर, संवेदनशील होते हैं जो उपयोगी जैव रासायनिक assays, हैं इन विट्रो. PRMT सब्सट्रेट विशिष्टता के समर्थन में प्रत्यक्ष सबूत नहीं प्रदान कर सकते हैं, और पहचान प्रोटीन वास्तव में PRMT substrates हैं अगर लगातार प्रकट करते हैं. एक ठेठ इन विट्रो मेथिलिकरण परख शुद्ध, सक्रिय PRMTs, शुद्ध सब्सट्रेट और एक रेडियो आइसोटोप लेबल मिथाइल दाता (एस adenosyl-एल [methyl- 3 एच] methionine) शामिल हैं. यहाँ हम catalytically सक्रिय PRMT1, एक सर्वत्र व्यक्त PRMT परिवार के सदस्य अलग करने के लिए एक कदम दर कदम प्रोटोकॉल का वर्णन. मुझेशुद्ध PRMT1 की thyl ट्रांस्फ़्रेज़ गतिविधियों बाद में एस adenosyl-एल मिथाइल दाता के रूप में [methyl- 3 एच] methionine की उपस्थिति में, प्रोटीन 1 (G3BP1) बाध्यकारी रास-GTPase को सक्रिय प्रोटीन, एक ज्ञात PRMT सब्सट्रेट पर परीक्षण किया गया. इस प्रोटोकॉल उपन्यास शारीरिक PRMT1 substrates के मेथिलिकरण स्थिति स्थापित करने के लिए, लेकिन यह भी प्रोटीन arginine मेथिलिकरण के बुनियादी तंत्र को समझने के लिए न केवल रोजगार प्राप्त किया जा सकता है.

Introduction

प्रोटीन मेथिलिकरण पहले 1968 1 में वर्णित किया गया था. यह शोधकर्ताओं 2 इस बाद translational संशोधन के महत्व की सराहना करने के लिए शुरू किया है कि 1996 में PRMT1 की पहली क्लोनिंग तक नहीं था. दिलचस्प बात यह है कि परमाणु अर्क के प्रोटीन में arginine अवशेषों के बारे में 2% इस संशोधन की बहुतायत का संकेत, 3 methylated रहे हैं. Arginine हो सकता है arginine के पक्ष श्रृंखला के भीतर एक बुनियादी पक्ष श्रृंखला और नाइट्रोजन / एस के साथ एक सकारात्मक आरोप लगाया एमिनो एसिड होता है के बाद translationally एक मिथाइल समूह, arginine मेथिलिकरण 4-6 के रूप में जाना जाता प्रक्रिया के अलावा के माध्यम से संशोधित. Arginine मेथिलिकरण एंजाइमों अर्थात के एक वर्ग द्वारा उत्प्रेरित कर रहा है., प्रोटीन arginine मिथाइल transferases (PRMTs). Arginines monomethylated या dimethylated और बाद की प्रक्रिया 4-6 उत्प्रेरित PRMTs के प्रकार पर निर्भर करता है सममित या विषम या तो हो सकता है हो सकता है.

Arginin प्रदर्शित प्रोटीन है किई ग्लाइसिन अमीर रूपांकनों PRMT की मध्यस्थता कटैलिसीस के लिए संभावित लक्ष्य हैं. Substrates के PRMT की मध्यस्थता मेथिलिकरण सामान्य सेलुलर homeostasis 7-9 के लिए महत्वपूर्ण हैं, जो सभी के प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत, प्रोटीन न्यूक्लिक एसिड बातचीत, प्रोटीन समारोह, जीन अभिव्यक्ति, और / या सेलुलर संकेत, व्यवस्थित करने के लिए दिखाया गया है. प्रोटीन arginine मेथिलिकरण की जैविक भूमिका को समझने के लिए, सटीक, कुशल, और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य assays पहचान PRMT substrates के मेथिलिकरण स्थिति स्थापित करने के लिए आवश्यक हैं.

उनके substrates के मेथिलिकरण को उत्प्रेरित करने के लिए शुद्ध PRMTs की क्षमताओं का मूल्यांकन करता है, जो इन विट्रो मेथिलिकरण परख, में, arginine मेथिलिकरण 10-12 के अध्ययन के लिए एक अच्छी तरह से स्वीकार कर लिया परख है. इस परख के समग्र सफलता काफी हद तक शुद्ध PRMTs की गतिविधि पर निर्भर करता है. PRMTs व्यक्त की और बैक्टीरिया, या स्तनधारी कोशिकाओं 10,11 से शुद्ध किया जा सकता है. डी के रूप में यह इन विट्रो मेथिलिकरण परख,प्रोटोकॉल अनुभाग में etailed, मूल रूप Tini और उनके सहयोगियों ने 10 से वर्णित एक विधि पर आधारित है. इस प्रोटोकॉल में, हम विस्तार में स्तनधारी कोशिकाओं में PRMT1 की अभिव्यक्ति और शोधन में शामिल कदम दिखा. प्रोटीन बाध्यकारी प्रोटीन 1 (G3BP1), एक ज्ञात PRMT सब्सट्रेट 8, को सक्रिय रास-GTPase पर मेथिलिकरण को उत्प्रेरित करने के लिए शुद्ध PRMT1 की क्षमता बाद में के रूप में एस adenosyl-एल [methyl- 3 एच] methionine की उपस्थिति में मूल्यांकन किया गया था मिथाइल दाता. इस परख का उपयोग करना, हम मज़बूती से प्रोटीन arginine मेथिलिकरण के अध्ययन में एक प्राथमिक कदम है जो methylate उपन्यास या ज्ञात substrates, को PRMTs की क्षमताओं को परिभाषित कर सकते हैं.

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Protocol

अभिव्यक्ति constructs के 1. तैयारी

  1. प्रोटोकॉल शुरू करने से पहले, एक एन टर्मिनल मिलान टैग (MYC या हेक्टेयर), और बैक्टीरिया कोशिका से उच्च स्तरीय प्रोटीन अभिव्यक्ति और शुद्धि के लिए सब्सट्रेट में फ्रेम glutathione-S-transferase (जीएसटी) के साथ साथ स्तनधारी अभिव्यक्ति वैक्टर में क्लोन PRMTs मानक आणविक जैविक तकनीक का उपयोग lysates,.

PRMTs के 2 शोधन

  1. मानव ब्रोन्कियल उपकला कोशिकाओं (Beas2B) बनाए रखने के लिए 100 मिमी संस्कृति बर्तन का प्रयोग करें. पारित होने कोशिकाओं हर 3 दिन और उन्हें संगम को बढ़ने न दें.
  2. अभिकर्मक से पहले दिन में, एक 100 मिमी संस्कृति डिश में 10 मिलीलीटर संस्कृति माध्यम में 7.5 x 10 5 कोशिकाओं बीज. भंवर में समान रूप से कोशिकाओं को फैलाने, और एक 5% humidified सीओ 2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं.
  3. अगले दिन, मीडिया aspirate और सीरम और एंटीबायोटिक दवाओं के बिना संस्कृति मीडिया के 5 मिलीलीटर जोड़ें. भंवर और मध्यम aspirate. इस चरण को दोहराएँ एकअधिक समय है, और अंत में सीरम / एंटीबायोटिक मुक्त माध्यम के 5 मिलीलीटर जोड़ने और अभिकर्मक के लिए आगे बढ़ें.
  4. एक बाँझ 1.5 एमएल प्लास्टिक अपकेंद्रित्र ट्यूब में सीरम मुक्त माध्यम के 750 μl में प्लास्मिड डीएनए की 6 ग्राम पतला.
  5. एक और 1.5 एमएल प्लास्टिक अपकेंद्रित्र ट्यूब में, सीरम मुक्त माध्यम के 750 μl में अभिकर्मक अभिकर्मक के 30 μl पतला.
  6. पतला डीएनए (2.4 चरण) युक्त ट्यूब को पतला अभिकर्मक अभिकर्मक समाधान (2.5 कदम) स्थानांतरण. ऊपर pipetting द्वारा और कई बार नीचे धीरे मिलाएं.
  7. 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर अभिकर्मक मिश्रण सेते हैं.
  8. 15 मिनट के बाद, कोशिकाओं पर धीरे अभिकर्मक मिश्रण पिपेट, ज़ुल्फ़ समान रूप से मिश्रण है, और एक 5% humidified सीओ 2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं.
  9. 3 घंटे के बाद, कोशिकाओं से अभिकर्मक मिश्रण युक्त मध्यम aspirate. सीरम और एंटीबायोटिक दवाओं के साथ पूरक ताजा सेल संस्कृति के माध्यम जोड़ें.
  10. एक 5% humidified सीओ 2 में 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते48 घंटे के लिए इनक्यूबेटर.
  11. 48 घंटे बाद, lysis बफर के 1 मिलीलीटर में कोशिकाओं lyse (1x फॉस्फेट बफर खारा, 1% Nonidet पी -40, 0.5% सोडियम deoxycholate, 0.1% सोडियम dodecyl सल्फेट, और 1 ग्राम / मिलीलीटर phenlymethyl sulphonyl फ्लोराइड). एक सेल चोर के साथ एक प्लास्टिक अपकेंद्रित्र ट्यूब में lysates लीजिए और 30 मिनट के लिए बर्फ पर lysates सेते हैं.
  12. सेल मलबे से lysates खाली करने के लिए एक बेंच शीर्ष अपकेंद्रित्र पर 10 मिनट के लिए 15,000 XG पर lysates अपकेंद्रित्र. [* यह अत्यधिक मेथिलिकरण परख के लिए एंजाइम की शुद्धि के लिए आगे बढ़ने से पहले विरोधी हा एंटीबॉडी के साथ lysates, के एक विभाज्य की immunoblotting माध्यम हा PRMT1 की अभिव्यक्ति की पुष्टि करने के लिए सिफारिश की है.]
  13. PRMTs की शुद्धि के लिए, फॉस्फेट बफर खारा में विरोधी हा आत्मीयता मैट्रिक्स के 50:50 निलंबन के 30 μl (पीबीएस) के साथ सेल lysates के 3 मिलीग्राम सेते हैं, और एक ट्यूब रोटेटर में 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर बारी बारी से.
  14. अगले दिन, इकट्ठा करने के लिए 2 मिनट के लिए एक बेंच शीर्ष अपकेंद्रित्र पर 14,000 XG पर ट्यूब स्पिनमोती. सतह पर तैरनेवाला त्यागें और 2 के लिए 14,000 XG पर centrifugation द्वारा पीछा धोने मोती [20 मिमी Tris (8.0 पीएच), 150 मिमी NaCl, 5 मिमी EDTA और 1% ट्राइटन X-100] प्रत्येक में बफर RIPA के 1 एमएल के साथ 3x धोने मि. तीसरे धोने के बाद, मेथिलिकरण बफर के 100 μl के साथ एक बार मोती धोने (50 मिमी Tris पीएच 8.5, 20 मिमी KCl, 10 मिमी 2 MgCl, 1 मिमी β-mercaptoethanol, 100 मिमी सूक्रोज). Centrifugation के बाद, सतह पर तैरनेवाला हटायें. स्थिर PRMTs युक्त मोती मेथिलिकरण परख में इस्तेमाल किया जा करने के लिए तैयार हैं. [* यह अत्यधिक मेथिलिकरण परख में तुरंत स्थिर PRMTs उपयोग करने के लिए सिफारिश की है.]

सब्सट्रेट के 3 शोधन

  1. जीएसटी G3BP1 की एक कॉलोनी में 100 माइक्रोग्राम / एमएल एम्पीसिलीन युक्त Luria-Bertani (पौंड) माध्यम के 5 मिलीलीटर में BL21 तब्दील टीका लगाना. 250 rpm पर झटकों के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात संस्कृतियों आगे बढ़ें.
  2. अगले दिन, ताजा लेग मध्यम और शेष भाग के 50 एमएल के लिए रातोंरात संस्कृति का स्थानांतरणinue (इसके बारे में 2 घंटे लगते हैं) एक आयुध डिपो 0.5-0.7 से 600 को विकसित करने के लिए.
  3. आयुध डिपो 600 0.5-0.7 तक पहुँच जाता है, 250 rpm पर झटकों के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर अतिरिक्त 4 घंटे के लिए संस्कृति के लिए 1 मिमी की एक अंतिम एकाग्रता के लिए isopropyl-β-D-thiogalactoside (IPTG) जोड़ने के लिए और जारी है.
  4. 10 मिनट के लिए 1500 XG पर centrifugation द्वारा कोशिकाओं फसल, और -80 डिग्री सेल्सियस पर जीएसटी शुद्धि या दुकान के लिए गोली प्रक्रिया.
  5. Lysis बफर के 5 एमएल में बैक्टीरिया गोली पुनः निलंबित (protease inhibitors, lysozyme की 100 माइक्रोग्राम / एमएल, और साथ 1x पीबीएस 0.1% ट्राइटन X-100) और 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर lysates सेते हैं. इस समय lysates कारण बैक्टीरियल जीनोमिक डीएनए की रिहाई के लिए परेशान और चिपचिपा दिखाई देगा.
  6. Sonication द्वारा जीनोमिक डीएनए (1 सेकंड में 30% की एक आयाम के साथ प्रत्येक के 10 दालों) कतरनी.
  7. 10 मिनट के लिए 15,000 XG पर centrifugation द्वारा lysates साफ़ और एक 15 मिलीलीटर ट्यूब को स्पष्ट सतह पर तैरनेवाला हस्तांतरण. सतह पर तैरनेवाला स्पष्ट नहीं है Centrifu दोहरानेgation प्रक्रिया एक बार.
  8. इस बीच, बर्फ ठंड पीबीएस के साथ दो बार जीएसटी sepharose मोती धोने और पीबीएस में जीएसटी sepharose के 50:50 निलंबन बनाने. मंजूरी दे दी बैक्टीरियल सेल lysate को जीएसटी sepharose निलंबन की 200 μl जोड़ें और 1 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर बारी बारी से.
  9. 1 घंटे बाद, मोती एकत्र करने के लिए 3 मिनट के लिए 500 XG पर ट्यूब अपकेंद्रित्र. मोती बर्फ ठंड पीबीएस के साथ 3x धो लें.
  10. अंतिम धोने के बाद, क्षालन बफर (50 मिमी Tris पीएच 8.0, 150 मिमी NaCl, 30 मिमी glutathione) के 100 μl में मोती resuspend और 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर बारी बारी से.
  11. 2 मिनट के लिए 15,000 XG पर ट्यूब अपकेंद्रित्र और एक अन्य प्लास्टिक अपकेंद्रित्र ट्यूब में शुद्ध प्रोटीन युक्त सतह पर तैरनेवाला हस्तांतरण. शुद्ध प्रोटीन की एकाग्रता का अनुमान लगाने के गोजातीय सीरम albumin (बीएसए) की ज्ञात मात्रा के साथ शुद्ध प्रोटीन की 5 μl पर एसडीएस polyacrylamide जेल वैद्युतकणसंचलन (एसडीएस पृष्ठ) विश्लेषण बाहर ले जाने.

4 मेथिलिकरण परख

नोट: रेडियो आइसोटोप काम के लिए और रेडियोधर्मी आइसोटोप के साथ प्रयोगों प्रदर्शन पर संस्था के प्रोटोकॉल के अनुपालन में नामित एक अलग क्षेत्र में निम्नलिखित चरणों का प्रदर्शन.

  1. शुद्ध जीएसटी सब्सट्रेट और 1x मेथिलिकरण बफर (50 मिमी Tris पीएच 8.5, 20 मिमी KCl, 10 मिमी 2 MgCl, 1 मिमी β-mercaptoethanol, 100 मिमी सूक्रोज), 1 μCi युक्त एक मास्टर मिश्रण के 2 ग्राम जोड़ें एस adenosyl- एल [methyl- 3 एच] methionine, और पानी स्थिर PRMTs (कदम 2.13) को 10 μl के अंतिम मात्रा करने के लिए और 1 घंटे के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर प्रतिक्रिया सेते हैं.
  2. 1 घंटे बाद, 2x एसडीएस नमूना बफर के 10 μl जोड़कर प्रतिक्रिया बंद करो. 10 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर नमूनों का विकृतीकरण के बाद, एक एसडीएस पृष्ठ जेल पर नमूने अलग.
  3. बाद में, एक अर्द्ध शुष्क electrophoretic स्थानांतरण का उपयोग करके nitrocellulose झिल्ली पर एसडीएस जेल से अलग प्रोटीन हस्तांतरण.
  4. स्थानांतरण के बाद, एक साथ झिल्ली को कवरutofluor (एक autoradiographic छवि intensifier), और धीरे कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए रॉक. 2 घंटे के बाद, autofluor टपकना और बाद में उपयोग के लिए बरकरार रखें. [* रेडियोधर्मी सामग्री के रूप में ट्यूब लेबल]
  5. जल्दी से हवा, एक फिल्टर पेपर पर झिल्ली सूखी एक प्लास्टिक की थैली में इसे सील और -20 डिग्री सेल्सियस पर एक एक्स रे फिल्म के लिए झिल्ली का पर्दाफाश. पर्याप्त जोखिम समय 5-30 दिनों के बीच चलता है.

PRMT अभिव्यक्ति और सब्सट्रेट के समान लोड हो रहा है 5 पुष्टि

  1. पर्याप्त जोखिम प्राप्त करने के बाद, अवरुद्ध बफर युक्त एक प्लास्टिक का डिब्बा [बीच 20 (TBST + 3% गैर वसा दूध) के साथ Tris बफर खारा] को झिल्ली हस्तांतरण और धीरे 1 घंटे के लिए रॉक.
  2. रेडियोधर्मी कचरे के रूप में अवरुद्ध बफर त्यागें. 4 में रात भर TBST में: (1000 कमजोर पड़ने 1) विरोधी हा एंटीबॉडी के साथ झिल्ली सेते कोमल कमाल के साथ डिग्री सेल्सियस,.
  3. TBST 3x साथ झिल्ली धो लें और एचआरपी लेबल विरोधी माउस माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ झिल्ली सेतेकोमल कमाल के साथ 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर TBST में: (1 5,000 कमजोर पड़ने).
  4. 1 घंटे बाद, TBST 3x साथ झिल्ली धो लें और एक एचआरपी सब्सट्रेट के साथ प्रोटीन की chemiluminiscence पता लगाने प्रदर्शन करते हैं.
  5. हा टैग PRMTs का पता लगाने के बाद, कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए Ponseau एस धुंधला समाधान के साथ झिल्ली सेते हैं. जल्दी जीएसटी टैग substrates पता लगाने के लिए पानी के साथ झिल्ली 3x धो लो. छवि स्कैन.

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Representative Results

जीएसटी G3BP1 methylate को हा PRMT1 की क्षमताओं इन विट्रो मेथिलिकरण परख द्वारा निर्धारित किया गया है. Beas2B सेल lysates से शुद्ध हा टैग PRMT1 जीएसटी G3BP1 युक्त एक मेथिलिकरण प्रतिक्रिया में कार्यरत था, और एक मिथाइल दाता के रूप में एस adenosyl-एल [methyl- 3 एच] methionine के 1 μCi,. PRMT1 कुशलता जीएसटी G3BP1 (चित्रा 1, ऊपरी पैनल) की मेथिलिकरण को उत्प्रेरित कर सकता है. एक नकारात्मक नियंत्रण (चित्रा 1, ऊपरी पैनल, लेन 1) के रूप में सेवा खाली वेक्टर ट्रांसफ़ेक्ट Beas2B कोशिकाओं की lysates पर प्रदर्शन पुल चढ़ाव का उपयोग मेथिलिकरण प्रतिक्रियाओं. PRMT1 की अभिव्यक्ति विरोधी हा एंटीबॉडी के साथ पुष्टि Immunoblotting (चित्रा 1, मध्यम पैनल). Ponseau एस धुंधला प्रतिक्रियाओं दोनों में जीएसटी G3BP1 के बराबर लोड हो रहा है (चित्रा 1, कम पैनल) प्रदर्शित करने के लिए इस्तेमाल किया गया था.

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चित्रा 1 PRMT1 methylates G3BP1. PRMT1 की मध्यस्थता G3BP1 मेथिलिकरण से शुद्ध Beas2B सेल lysates, जीएसटी G3BP1 से शुद्ध हा टैग PRMT1 शामिल है कि इन विट्रो मेथिलिकरण प्रतिक्रिया का उपयोग करके मूल्यांकन किया गया था कोलाई, और एक मिथाइल दाता के रूप में एस adenosyl-एल [methyl- 3 एच] methionine,. ऊपरी पैनल G3BP1 मेथिलिकरण के लिए fluorograph का प्रतिनिधित्व करता है. मध्य पैनल हा टैग PRMT1 की अभिव्यक्ति की पुष्टि immunoblot का प्रतिनिधित्व करता है. और, कम पैनल सब्सट्रेट (जीएसटी G3BP1) के बराबर लोडिंग का निर्धारण करने के लिए Ponseau एस दाग धब्बा का प्रतिनिधित्व करता है.

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Discussion

इस के साथ साथ वर्णित प्रोटोकॉल नियमित पहचान PRMT substrates के मेथिलिकरण स्थिति स्थापित करने के लिए प्रयोग किया जाता है. यह मजबूत है, और लगातार परख भी उनके substrates के लिए PRMTs की विशिष्टता पर निश्चित सबूत प्रदान करेगा. इस परख की सफलता के लिए महत्वपूर्ण घटक हैं: स्तनधारी कोशिकाओं में PRMTs 1. अभिव्यक्ति, शुद्ध PRMTs के 2 गतिविधि, 3 अभिव्यक्ति और सब्सट्रेट की शुद्धि, और nitrocellulose झिल्ली के लिए प्रोटीन की 4 पूरा पश्चिमी हस्तांतरण.

संयोजक PRMTs व्यक्त की, और बैक्टीरिया से शुद्ध भी इन विट्रो मेथिलिकरण प्रतिक्रियाओं 10,11,13 में इस्तेमाल किया जा सकता है. प्रत्येक PRMT अलग शुद्धि रणनीतियों, भंडारण की स्थिति, और भंडारण तापमान की आवश्यकता होती है हालांकि, बाद में पुनः संयोजक PRMTs के उपयोग में इन विट्रो मेथिलिकरण प्रतिक्रियाओं आदर्श नहीं हो सकता. इसके अलावा, पुनः संयोजक PRMTs भी अल्पकालिक 11 हैं. इन चुनौतियों को देखते हुए, हम उस पुर माननास्तनधारी कोशिकाओं से PRMTs की ification इन विट्रो मेथिलिकरण प्रतिक्रियाओं प्रदर्शन करने के लिए सुविधाजनक है, और लगातार है. स्तनधारी कोशिकाओं में PRMTs की क्षणिक अभिव्यक्ति असुविधाजनक हो गया लगता है, तो वैकल्पिक रूप से, एक PRMTs के लिए स्थिर सेल लाइनों बनाने पर विचार कर सकते हैं. सबसे महत्वपूर्ण बात, स्तनधारी कोशिकाओं में PRMTs की अभिव्यक्ति जैसे, वृद्धि कारकों, साइटोकिन्स, आदि उत्तेजनाओं के जवाब में PRMT उत्प्रेरक गतिविधियों का निर्धारण करने के लिए उपलब्ध एकमात्र रास्ता है

स्तनधारी स्रोतों से शुद्ध PRMTs का उपयोग करने का प्रमुख सीमा शोधन प्रक्रिया के दौरान अन्य PRMTs साथ संदूषण है. हालांकि, एक अतिरिक्त नियंत्रण के रूप में मिथाइल ट्रांस्फ़्रेज़ गतिविधियों से रहित हैं कि PRMTs के उत्परिवर्ती निर्माणों इस्तेमाल कर सकते हैं. जांच के तहत PRMTs homodimers फार्म कर सकते हैं, तो उत्परिवर्ती निर्माणों अच्छा नियंत्रण नहीं हो सकता है. वैकल्पिक रूप से, एक एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में लक्ष्य PRMTs के समाप्त कोशिकाओं से शुद्ध PRMTs उपयोग करने पर विचार या पुनः संयोजक उपयोग कर सकते हैंबैक्टीरियल स्रोतों से PRMTs. प्रस्तुत प्रोटोकॉल प्रोटीन arginine मेथिलिकरण की जांच के लिए एक सरल, सुविधाजनक, और लगातार परख का वर्णन है. वर्णित विधि से न केवल उपन्यास PRMT substrates के मेथिलिकरण स्थिति की पहचान और स्थापना के लिए आवश्यक है, लेकिन यह भी प्रोटीन arginine मेथिलिकरण के तंत्र के बारे में हमारी बुनियादी समझ के लिए.

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgements

इस अध्ययन दिग्गजों मामलों के अमेरिकी विभाग से एक मेरिट पुरस्कार द्वारा समर्थित है, और एक एनआईएच आरडब्ल्यू को R01CA138528 अनुदान दिया गया था.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
S-adenosyl-L-[methyl-3H] methionine Perkin Elmer
Ecoscint ultra  National Diagnostics LS-270
Bottle top dispenser National Diagnostics LS-900
AutoFluor National Diagnostics LS-315
6 ml Scintillation Vials National Diagnostics SKU:SVC-06
GST-sepharose GE Life Sciences
L-Glutathione Reduced Sigma G4251
Lipofectamine Invitrogen Transfection reagent
Beas2B ATCC
Optimem Invitrogen
NP-40 US-Biologicals
SDS Sigma
Sodium deoxycholate Sigma
PMSF Sigma
anti-HA affinity matrix Roche
Tris Sigma
Nacl Sigma
Bio-rad gel doc Bio Rad
anti-HA antibody roche
Ponseau S Fisher Scientific

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References

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