Isolamento de mesenquimais humanas células-tronco e seu cultivo na matriz óssea Porous

Developmental Biology
 

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Rodríguez-Fuentes, N., Reynoso-Ducoing, O., Rodríguez-Hernández, A., Ambrosio-Hernández, J. R., Piña-Barba, M. C., Zepeda-Rodríguez, A., Cerbón-Cervantes, M. A., Tapia-Ramírez, J., Alcantara-Quintana, L. E. Isolation of Human Mesenchymal Stem Cells and their Cultivation on the Porous Bone Matrix. J. Vis. Exp. (96), e51999, doi:10.3791/51999 (2015).

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Abstract

Introduction

Há emparelhar e regeneração de tissuesis um dos objectivos themain da ciência médica porque uma lesão num ororgan tecido pode ser incapacitante e, em alguns casos, letais. No contexto, os profissionais de saúde e pesquisadores estão constantemente à procura de técnicas, métodos e ferramentas para fornecer novo Alternativas terapêutico promover lá processo pair-regeneração do tecido danificado. Portanto, ciências biomédicas têm-se centrado no estudo das células-tronco mesenquimais (MSCs), especialmente as células-tronco adultas, pois esta linhagem de células representa um modelo ideal para estudar o processo de regeneração dos tecidos, devido ao seu potencial para diferenciar a ectodérmica, mesodérmica, e endodermal linhagens de células No entanto, para fazer terapia com CTMs uma realidade, a caracterização do potencial thetherapeutic de MSCs deve ser acompanhada pela implementação de novas técnicas de cultura de células, utilizando biomateriais e carreadores celulares que garantem o comportamento desejado dos CTMs no tecido do hospedeiro.

in vitro, mas não para a extrapolação e aplicação em sistemas abertos complexos, tais como humana ou em ensaios in vivo. As técnicas que se concentram em assegurar a adesão celular a topografias aleatórios, tais como materiais porosos osso, têm sido estudados por a adesão do material para a parte inferior dos poços de cultura e colagénios e polímeros de agarose empregue. Para esses métodos, as células que foram semeados sobre a superfície foram retidas nos poros e na superfície de topo. No entanto, este aspecto não pode ser garantida em um in vivosistema, em que os fluidos corporais circundantes o biomaterial pode arrastar as células a partir do local desejado em matrizes porosas, é a utilização de estimulação de ultra-sons, o que requer equipamento sofisticado, mas promove a expressão de marcadores osteoblásticas em ensaios in vitro 5. O uso de culturas contínuas requer biorreactores, o que garante uma distribuição homogénea de nutrientes no meio de cultura; no entanto, uma percentagem significativa das células cultivadas é perdida quando se substitui o meio de cultura, devido à taxa de fluxo que é utilizado nesta técnica e a forma aderente às paredes do equipamento. Estes problemas aumentam a massa celular, que é necessário para este tipo de cultura e o tempo para a obtenção de um número suficiente de células 7. Assim, a metodologia apresentada neste trabalho representa uma técnica que devem ser extrapolados para sistemas in vivo porque as células são semeadas em placas de micro-massa sobre um material de superfície de topo, e depois a aproComeram tempos de incubação, 60% da massa celular inicial é aderida. Além disso, esta técnica não exige a adição de indutores osteoblásticas (por exemplo, dexametasona, ácido ascórbico, ou beta-glicerofosfato) ou estímulos de ultra-sons para induzir a diferenciação dos osteoblastos e a manutenção do fenótipo osteoblasto NKB porque é um osteocondutor e osteo andaimes 8, o método para a cultura de MSCs a partir da membrana amniótica humana (hMSCs-AM) no biomaterial de osso macroporosa apresentada neste trabalho representsapossibility para inserir células no tecido do osso danificado e induzir a diferenciação para a linhagem osteoblástica.

Protocol

Esta pesquisa foi realizada em conformidade com a Declaração da Associação Médica Mundial de Helsinki sobre a conduta ética dos seres humanos de investigação envolvendo e foi aprovado pelo Conselho de Ética da Faculdade de Medicina, UNAM (número do projeto 101-2012) Research.

1. Isolamento de mesenquimais humanas Stem Cell

  1. Preparação do reagente
    1. Preparar a solução salina tamponada com fosfato (PBS) e suplemento com solução de antibiótico-antimicótico a 1%.
    2. Prepare Meio de Eagle Modificado de Dulbecco, glicose elevada (DMEM-HG), e adicionar 10% de soro fetal bovino (FBS) e 1% de antibiótico-antimicótico solution.Sterilize este meio de cultura por filtração através de um filtro de 0,2 um.
    3. Prepara-se uma solução de colagenase II a 100 U / ml em DMEM-HG sem FBS ou solução de antibiótico-antimicótico.
    4. Esterilizar os seguintes instrumentos cirúrgicos, que são necessários para o isolamento, por tratamento em autoclave: tesoura padrãos, pinça de dissecção simples, de ponta fina e uma pinça de dentes e um cabo de bisturi (# 4).
  2. O isolamento de células estaminais mesenquimais de membrana amniótica humana
    1. Segure o cordão umbilical com uma mão e com a outra mão, retire a membrana amniótica (AM), que se parece com uma folha translúcida, para obter um fragmento de aproximadamente 5 cm 2. Se a secção córion está presente na amostra, separar o cório subjacente por dissecção manual como a secção córion é mais espessa do que o âmnio.
    2. Retirar sangue residual com três lavagens de 5 ml de PBS e remover coágulos com a pinça simples. Faça um pequeno corte no AM com o bisturi para gerar fragmentos de aproximadamente 0,5 cm2.
  3. A digestão enzimática de membrana amniótica
    1. Incubar a AM com 5 ml de 0,125% de tripsina / 0,5 mM de solução de EDTA a 37 ° C durante 30 minutos em um tubo de 50 ml a 37 ° C numa atmosfera de CO2 a 5%. Centrifugar a 250xg e 25 ° C durante 5 min e, em seguida, remover a solução de tripsina, descartando o sobrenadante.
    2. Adicionar 15 ml de solução de colagenase tipo II e incubar durante 2 horas a 37 ° C numa atmosfera de CO2 a 5% com agitação ocasional de acordo com Leyva et al. 9
    3. Imediatamente após a digestão com colagenase II, adicionar 15 ml de PBS e centrifugar a 250 xg e 25 ° C durante 10 min.
    4. Descartar o sobrenadante e lavar o sedimento celular com 15 ml de solução de PBS e centrifugar a 250 xg e 25 ° C durante 15 min. Descartar o sobrenadante.
    5. Ressuspender o sedimento celular em 10 ml de HG-DMEM agitando suavemente.
  4. Expansão de células-tronco mesenquimais
    1. Semente de 2 ml de suspensão de células (1 x 4 10 células / cm2) em frasco de cultura, e adicionar 2 ml de DMEM-HG e incubar as células a 37 ° C numa atmosfera de CO2 a 5%. Eliminar a de células não-aderentes, alterando o meio de cultura após 5-7dias.
    2. Após este tempo, mudar o meio de cultura a cada 3 dias durante um período adicional de 7-10 dias para se obter uma confluência celular de 90%.
    3. Recuperar as células e incubar durante 5 min a 37 ° C numa atmosfera de CO2 a 5%, com uma solução de tripsina / EDTA a 0,125% (tripsinização).
    4. Imediatamente após tripsinização, recolher as células com uma pipeta de transferência e a um tubo de 15 ml e centrifugar a 250 xg durante 5 min.
    5. Descartar o sobrenadante e ressuspender o sedimento celular em 10 ml de HG-DMEM.
    6. Cultura de suspensão celular em dois frascos de 75 cm2 de cultura (5 mL em cada frasco), e manter a cultura até 90% de confluência.
    7. Repita os passos 1.4.3. a 1.4.6, até o dia 9 de passagem ou subcultura.
    8. Recuperar as células por tripsinização como nos passos 1.4.3 a 1.4.5 de citometria de fluxo ou outros estudos.

2. Preparação do disco poroso matriz óssea (NKB)

  1. Para molhar os discos NKB(Diâmetro de 12 mm; espessura, 2 mm)., Incubar cada disco durante a noite com 3 ml de DMEM-HG sem FBS numa atmosfera humidificada de 5% de CO2 a 37 ° C, de acordo com Fassina et al 5
  2. Após o processo de humedecimento, colocar o disco em um tubo de 50 ml e centrifugação a 250 xg durante 5 min para remover o excesso de meio de cultura. Colocar o disco na placa de 24 poços de cultura de células.
    1. Adicionar 500 ul de HG-DMEM e incubar durante 30 min a 25 ° C. Certifique-se de que não há bolhas estão presentes no disco NKB para favorecer a distribuição correcta de nutrientes e as células.
    2. Se as bolhas são observados no disco, agitar e adicionar 300 uL de meio de cultura e incuba-se durante 15 min numa atmosfera humidificada de 5% de CO2 a 37 ° C. Após este tempo, remover a 300 ul de meio de cultura de sucção através da parede de poço de cultura de células e confirmar que não há formação de bolhas.
  3. Colocar o disco numa nova placa de 24 poços usando uma pinça simples.

  1. Semente de uma suspensão celular (5 x 10 5 AM-hMSCs em 100 ul de DMEM-HG) a partir de três subculturas, na superfície do disco biomaterial pré-humedecida e incubar durante 30 min numa atmosfera humidificada de 5% de CO 2 a 37 ° C. Executar este passo lentamente e continuamente sobre a face superior do biomaterial para permitir que as células para interagir com a topografia de todos andaime. Nota: Este procedimento realiza a 60% das células fixadas sobre o biomaterial mostrado na Tabela 1.
  2. Adicionar 1,5 ml de DMEM-HG a 37 ° C, e manter a cultura durante 3 dias numa atmosfera humidificada de 5% de CO2 a 37 ° C. Não gerar turbulência na adição de meio de cultura para evitar que a deposição de células sobre a parte inferior de placa de cultura de prato. Este é o tempo inicial.

4. marcadores de superfície celular Caracterização pela Flow Cytometry

  1. Retire as células da subcultura antes da semeadura-los no disco matriz. Use 0,25% de tripsina / EDTA a 1 mM e corrigi-los durante 30 min em gelo frio a 2% de formaldeído. Após a fixação, lavar as células uma vez com PBS, 0,05%.
  2. Bloquear a ligação não específica através da incubação das células com imunoglobulina humana a 20% durante 3 min em gelo e incubar 0,1 x 10 6 aliquotas de células com ficoeritrina (PerCP) conjugado a mAb contra CD73, conjugado com FITC CD90 MAb, MAb conjugado com PE contra CD34 , conjugado com FITC e CD45 MAb conjugado com PE CD105 MAb durante 1 hora a 25 ° C no escuro. Isotipo conjugado com FITC MAb, MAb conjugado com PE andPerCP conjugado MAb irá servir como controlos negativos.
  3. Calcular os níveis dos marcadores de superfície utilizando o software de aquisição de dados e análise de expressão.

5. celular Detecção de Adesão por Microscopia Eletrônica de Varredura

  1. Lavar as amostras de células de disco em 3 dias de cultura, duas vezes com PBSe fixthe amostras com 4% (v / v) de glutaraldeído solutionin um tampão M de Na-cacodilato 0,1 (pH 7,2).
  2. Preparar as amostras para observação microscópica, como descrito anteriormente por Rivera-N et al. 10 e observar usando um microscópio eletrônico de varredura em um potencial elétrico de 15 kV e com uma ampliação de 500X e 2000X.

6. Ensaio de proliferação celular

  1. Para as amostras de células de disco contendo 1,5 ml de meio de cultura, adicionar 150 ul de corante vital (AB) de acordo com as instruções do fabricante e incubar as células numa atmosfera humidificada de 5% de CO2 a 37 ° C.
  2. Imediatamente após a adição de AB (0 h) e cada 24 horas até atingir 7 dias de cultura de células, medir a absorvência a 570 nm com um comprimento de onda de referência de 600 nm.

7. Unidades Formadoras de Colônias (UFC) 11

  1. Cultura de células 100 por 100 milímetros de cultura de tecido DMEM-HG Diskin e incubar por 14dias numa atmosfera humidificada de 5% de CO2 a 37 ° C.
  2. Lava-se a cultura com PBS e mancha com 0,5% de violeta de cristal em metanol durante 5-10 min à temperatura ambiente.
  3. Lavar as placas com PBS duas vezes e contar as colónias visíveis usando um hemocitômetro.

Representative Results

Mesenquimais humanas isolamento de células estaminais

Após a separação mecânica do AM a partir do cório utilizando uma dissecção romba (Figura 1), uma população de células aderentes foi obtido por digestão de tripsina e colagenase II. Estas populações de células ligados na placa de cultura presenta morfologia celular tipo fibroblasto em 3 dias após o isolamento, como mostrado na micrografia óptica (Figura 2A) e micrografia electrónica por varrimento (Figura 2B) .Os placentas utilizadas neste trabalho foram obtidas de doadores saudáveis ​​mães withprevious consentimento informado.

Caracterização celular por citometria de fluxo

A população de células que foi obtido a partir de AM foi fortemente reactivo com a marcadores mesenquimais superfície CD90 + (93,5% ± 6,85) e CD73 + e CD105 + (79% ± 3,46) e mostrou uma reacção negativa para marcadores hematopoiéticos, tais como CD34- e CD45. Assim,AM-hMSCs utilizadas neste trabalho foram mesenquimal, em informação accordancewith anteriormente relatado por Leyva et al. (Figura 3). Além disso, este resultado coincide com as características imunofenotipagem que foram estabelecidas pela Sociedade Internacional de Terapia Celular (ISCT) para as células-tronco mesenquimais.

A adesão celular na matriz óssea

As micrografias de varredura mostram o comportamento das AM-hMSCs sete dias após a disposição em camadas sobre a NKB. A superfície do biomaterial foi coberto com células esféricas (um dia), e algumas células de espalhamento aparentemente ligados à superfície da matriz de bovino no sétimo dia. Na maior ampliação, as células se espalhando parecia estar em estreito contacto via processos filipodial (FL) (Figura 4).

A proliferação celular na matriz óssea

Os resultados do ensaio de AB mostraram uma pequena diminuição na absorvância relativa u lêndeas (RAU) da condição da matriz (matriz óssea +) bovina após 1 dia de incubação e, em seguida, no quinto dia, a presença do andaime induz um aumento na proliferação celular estatisticamente significativo em comparação com a cultura realizada na ausência de bovino matriz (matriz -bone) (Figura 5).

Unidades Formadoras de Colônias

O UFC é um ensaio tradicional de células estaminais. As hMSCs-AM isolados neste trabalho preservada a sua capacidade para formar colónias discretas em 14 dias em cultura.

Figura 1
Figura 1: Isolamento de membrana amniótica. (A) O cordão umbilical (UC) é realizada com uma só mão para identificar a região em que a membrana amniótica é obtido. (B) A membrana amniótica (MA) assemelha-se a uma película translúcida sem inervação do sangue.

ve_content "fo: manter-together.within-page =" always "> Figura 2
Figura 2:. As características morfológicas das células estaminais a partir de membrana amniótica humana culturas AM-hMSC em 3 dias após o isolamento foram observadas utilizando um microscópio óptico e mostrado a morfologia do tipo fibroblastos.

Figura 3
Figura 3:. Citometria de fluxo As células caracterização de membrana amniótica humana eram maioritariamente células mesenquimais, porque eles foram positivas para os marcadores mesenquimais (CD73, CD90, CD105), como mostrado pelo deslocamento do histograma para a direita, e negativo para os marcadores hematopoiéticas (CD34 e CD45), tal como confirmado pelo deslocamento do histograma para a esquerda. Os antigénios são mostrados como histogramas vermelhos, enquanto que o controlo isotypesfor os fluorocromos de FITC e PE são observados empreto.

Figura 4
Figura 4:.. A adesão celular na matriz óssea bovina Uma série de imagens que mostram SEM fixação das células para pores do biomaterial (A) visão panorâmica de um poro NKB com várias células aderidas ao biomaterial no estado esférica (CS) e achatada (CF) sobre a superfície do biomaterial, também é possível apreciar o osso lacuna indica como (Lac) em três dias de cultura na matriz de bovino. (B) Amplificação da célula no processo de adaptação para a superfície de o material através de projeções filipodial (C) Interação entre duas células aderidas e achatadas na matriz bovina (C1, célula 1 e C2, celular 2).. Por favor, clique aqui para vIEW uma versão maior desta figura.

Figura 5
Figura 5:. A proliferação das células em proliferação celular bovina matriz óssea foi avaliado por redução AB e expressa em unidades de absorvância em relação ao longo de 7 dias de cultivo. Os resultados são mostrados a influência da matriz óssea (+ matriz óssea) na proliferação AM-hMSCs que foi estaticamente diferente em comparação com o estado negativo (matriz -bone). (* P <0,05)

Figura 6
Figura 6: Ensaio de CFU das MSCs inicialmente plaqueadas a diferentes densidades e incubados durante 14 dias (média * / - DP, n = 10).

Células aderidas A adesão celular (%)
As células na parte inferior 187.667 ± 1,208 62,47
Células no andaime 312.333 ± 1,208 37,53

Tabela 1:. Eficiência de aderência em matriz bovina As células que aderiram ao fundo da placa de prato e as células aderentes no andaime foram contadas por hemocitómetro após ser recuperado por trypsinization.The dados apresentados na tabela correspondem a duas experiências independentes para triplicado ± desvio-padrão

Discussion

As células estaminais que foram obtidos a partir de membrana amniótica humana (Figura 1) mostrou uma morfologia do tipo fibroblastos, semelhante às células mesenquimais (Figura 2) e eram, principalmente, as MSCs. Além disso, ensaios de citometria de fluxo revelou que estas células eram positivas para os marcadores de células mesenquimais (CD73, CD90, CD105 e) e negativo para os marcadores de linhagem hematopoiéticas (CD34, CD45) (Figura 3). Além disso, as hMSCs-AM isolados neste trabalho apresentar a capacidade de formar UFCs (Figura 6). Do mesmo modo, as células estaminais mesenquimais isoladas nesta forma reteve a capacidade de prender a biomaterial ósteoindutor (Figura 4), ​​e proliferar no andaime (Figura 5).

Por estas razões, o processo de cultura de hMSCs-AM em biomaterial osso macroporosa que foi utilizada neste trabalho representa uma oportunidade para inserir células no tecido osso lesionado e induzir a sua diferenntiation à linhagem osteoblástica. Este sistema de cultura não requer a adição de indutores osteoblásticas para manter o processo de diferenciação dos osteoblastos e fenótipo osteoblástico NKB porque é um material osteocondutor andosteoinductive 8. A utilização de tecidos de resíduos, tais como placenta humana, representa uma alternativa simples e ético para aceder a uma população de células estaminais com o potencial para se diferenciarem em MSCs, em comparação com outras fontes, que frequentemente envolvem métodos invasivos ou baixo rendimento celular.

O método proposto de cultura poderia ser extrapolado para sistemas in vivo porque as células são semeadas em placas de micro-massa no material da superfície de topo, e as células de colonizar e aderir a toda a superfície do biomaterial após os tempos de incubação apropriados. Além disso, não são necessários reagentes sofisticado, equipamentos e procedimentos, ao contrário dos métodos existentes ao implementar esta técnica são as cultureas micro-massa bem como adeposição lenta e constante da alíquota celular sobre o material para assegurar que as células interagem preferencialmente com o biomaterial, e não com a parte inferior da placa. Um outro ponto crítico é a utilização de materiais pré-humedecido antes da cultura das células, como este assegura que as células terão os nutrientes necessários a partir do meio de cultura, quando eles estão integrados no material de que são independentemente se na superfície ou dentro dos poros. Finalmente, a utilização de um biomaterial de osteoindutora é crítica para este processo porque evita a adição de factores externos para induzir e manter a diferenciação dos osteoblastos. A limitação da técnica é que ele é baseado no potencial osteoindutor da matriz de bovino; no entanto, o sistema proposto cultura pode ser extrapolada a qualquer material poroso com uma distribuição de poros de 20 a 200 um. Portanto, o processo apresentado neste trabalho é um método alternativo para a cultura de células estaminais mesenquimais em vários materiais tchapéu são empregados para a engenharia de tecidos, especialmente para a regeneração óssea.

Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgments

Reconhecemos a bolsa de estudos e apoio financeiro fornecido pelo Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT No.49887), Facultad de Medicina-UNAM DGAPA IN201510 e DGAPA IN216213; Salvador Correa de Instituto Nacional de Perinatologia para obter ajuda com o material biológico; e Biocriss, SA de C. V para doar Nukbone. Também agradeço a Ing. Héctor Martínez de IIM, UNAM e M en C Fabiola Gonzalez de CINVESTAV para assistência técnica.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
sterile phosphate buffered saline GIBCO,LIFE TECHNOLOGIES 10010023 cell culture
penicillin-streptomycin GIBCO,LIFE TECHNOLOGIES 10378016 cell culture
FBS GIBCO,LIFE TECHNOLOGIES 26140111 cell culture
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) with high glucose GIBCO,LIFE TECHNOLOGIES 11965118 cell culture
collagenase type II GIBCO,LIFE TECHNOLOGIES 17101015 cell culture
3 mM calcium chloride SIGMA_ALDRICH C5670 cell culture
trypsin/0.5 mM EDTA solution GIBCO,LIFE TECHNOLOGIES R001100 cell culture
Trypan Blue solution GIBCO,LIFE TECHNOLOGIES 15250061 cell culture
phycoerythrin (PerCP)-conjugated CD73 BD Pharmigen 562245 cytomery
FITC- CD90, BD Pharmigen 562245 cytomery
PE-CD34 BD Pharmigen 562245 cytomery
FITC-CD45 BD Pharmigen 562245 cytomery
PE-CD105 BD Pharmigen 562245 cytomery
BD FACSCalibur Flow Cytometer BD Pharmigen BD FACSCalibur cytomery
alamarBlue (AB) LIFE TECHNOLOGIES DAL1025 proliferation cell assay
SUNRISE-reader TECAN, Germany Sunrise proliferation cell assay

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References

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