प्राथमिक सेल संस्कृति अध्ययन के लिए चिकी retinas में कुशल जीन स्थानांतरण: एक

Developmental Biology

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Summary

भ्रूण लड़की रेटिना सेल संस्कृतियों फोटोरिसेप्टर जीव विज्ञान के अध्ययन के लिए मूल्यवान उपकरण का गठन। हम संस्कृति के लिए पहले रेटिना की प्लाज्मिड इलेक्ट्रोपोरेशन ओवो पूर्व के आधार पर एक कुशल जीन स्थानांतरण तकनीक विकसित की है। इस तकनीक में काफी इस प्रणाली के लिए संभव आनुवंशिक हेरफेर कर रही है, वर्तमान में उपलब्ध प्रोटोकॉल पर अभिकर्मक क्षमता बढ़ जाती है।

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Vergara, M. N., Gutierrez, C., Canto-Soler, M. V. Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach. J. Vis. Exp. (105), e52002, doi:10.3791/52002 (2015).

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Abstract

भ्रूण लड़की रेटिना से निकाली गई कोन फोटोरिसेप्टर समृद्ध संस्कृतियों रेटिना न्यूरॉन्स, विशेष रूप से फोटोरिसेप्टर के जीव विज्ञान का अध्ययन करने के लिए दुनिया भर के शोधकर्ताओं के लिए एक अनिवार्य उपकरण बन गए हैं। वे आसानी से दवा के विकास के लिए उच्च throughput प्रौद्योगिकियों के लिए अनुकूलित किया जा सकता के रूप में इस प्रणाली के आवेदन, बुनियादी अनुसंधान से परे जाना। हालांकि, इन संस्कृतियों में रेटिना फोटोरिसेप्टर की आनुवंशिक हेरफेर प्रणाली की उपयोगिता के लिए एक महत्वपूर्ण सीमा में प्रस्तुत है, बहुत ही चुनौतीपूर्ण साबित हो गया है। हमने हाल ही में विकसित की है और अन्य वर्तमान में उपलब्ध प्रोटोकॉल 1 की तुलना में पांच गुना से इन संस्कृतियों में रेटिना की कोशिकाओं के अभिकर्मक की दर बढ़ जाती है कि प्लाज्मिड electroporation तकनीक ओवो एक पूर्व पुष्टि की है। इस विधि में भ्रूण लड़की आंखों RPE निकाल दिया जाता है, चरण 27 पर enucleated रहे हैं, और रेटिना कप एक प्लाज्मिड युक्त घोल में रखा जाता है और आसानी से निर्माण कस्टम का उपयोग कर Electroporatedबनाया इलेक्ट्रोड। रेटिना तो अलग और सुसंस्कृत मानक प्रक्रियाओं का उपयोग कर रहे हैं। इस तकनीक सामान्यतः फोटोरिसेप्टर जनसंख्या का 25% में transgene अभिव्यक्ति को प्राप्त करने, प्लाज्मिड संचालित आरएनएआई प्रौद्योगिकी के उपयोग के माध्यम से उदाहरण के लिए, overexpression के अध्ययन के लिए और साथ ही जीन अभिव्यक्ति की डाउनरेगुलेशन के लिए लागू किया जा सकता है। वर्तमान प्रकाशन के वीडियो प्रारूप प्राथमिक रेटिना संस्कृतियों में जीन समारोह के अध्ययन को सक्षम, क्षेत्र में शोधकर्ताओं के लिए इस तकनीक को आसानी से सुलभ बनाना होगा। हम यह भी एक सफल परिणाम और reproducibility के लिए इस प्रक्रिया के महत्वपूर्ण कदम की विस्तृत व्याख्या को शामिल किया है।

Introduction

भ्रूण लड़की रेटिना से अलग सेल संस्कृतियों व्यापक रूप से उनके अस्तित्व 2-9, भेदभाव 10-12, neurite परिणाम 13, और अधिक सहित फोटोरिसेप्टर कोशिका जीव विज्ञान के विभिन्न पहलुओं का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। रूबेन एडलर और सहयोगियों द्वारा 1980 के दशक में विकसित किया है और उसकी और अन्य समूहों 14-20, द्वारा सिद्ध इस प्रणाली का लाभ, एक पशु मॉडल 21 के रूप में लड़की के आंतरिक विशेषताओं में रहते हैं। यहां तक ​​कि भ्रूण चरणों में लड़की आंख के बड़े आकार, संस्कृतियों के लिए सामग्री की बड़ी मात्रा में प्रदान करता है। संस्कृतियों भ्रूण दिन (ईडी) 5 का उपयोग कर प्रदर्शन कर रहे हैं इसके अलावा, जब - 6 रेटिना, 55 - इस जानवर में फोटोरिसेप्टर का लगभग 86% हैं के बाद से उनके पूर्वज कोशिकाओं के 80% फोटोरिसेप्टर 14,15,18,22,23 के रूप में अंतर है, और शंकु 24, इन संस्कृतियों इस सेल प्रकार पर ध्यान केंद्रित अध्ययन के लिए विशेष रूप से उपयुक्त हैं।

हमने हाल ही में विकास हैped और इस प्रकार आनुवंशिक missexpression अध्ययनों एक सुविधाजनक बनाने के द्वारा इस प्रणाली की उपयोगिता को व्यापक बनाने, इन संस्कृतियों में कोशिकाओं की उच्च दक्षता प्लाज्मिड अभिकर्मक के लिए अनुमति देता है कि एक सरल तकनीक होती है। इस तकनीक के विकास के लिए एक सेल स्वायत्त तरीके में जीन समारोह के अध्ययन के लिए अनुमति देने के लिए अभिकर्मक का एक स्वीकार्य स्तर प्रदान करेगा कि तरीकों में से वैज्ञानिक साहित्य में एक शून्य से प्रभावित था। प्राथमिक neuronal संस्कृतियों 25,26 transfect करने के लिए बेहद मेहनत कर रहे हैं, क्योंकि इस हिस्से में है। इस उद्देश्य के लिए पहले से उपलब्ध सबसे अधिक इस्तेमाल किया तकनीकों में से कुछ 3-5% के क्रम में क्षमता में परिणाम और काफी विषाक्तता 27-32 लागू कर सकते हैं, जो इस तरह lipofection या कैल्शियम फास्फेट की मध्यस्थता अभिकर्मक के रूप में रासायनिक अभिकर्मक तरीकों, शामिल थे। एक enzymatic संवाददाता प्रणाली के साथ प्लास्मिडों के उपयोग के संकेत amplifying द्वारा गरीब अभिकर्मक दक्षता की समस्या को दरकिनार कर सकते हैं, भले ही वे नहीं करतेसेल विशिष्ट प्रभाव भेदभाव, और उनके परिणामों पूरा का प्रतिनिधि नहीं हो सकता कि एक छोटे से सेल की आबादी पर आधारित हैं। लड़की में एक और व्यापक रूप से इस्तेमाल किया विधि, RCAs वायरस के संक्रमण, proliferating कोशिकाओं के लिए ही लागू है और इस प्राथमिक रेटिना संस्कृति प्रणाली 33 के लिए इस प्रकार उपयुक्त नहीं है।

वर्तमान प्रोटोकॉल में भ्रूण लड़की आंखों चरण 27 (ईडी 5), रेटिनल पिगमेंट उपकला (RPE) निकाल दिया जाता है, और रेटिना कप एक प्लाज्मिड युक्त समाधान के साथ भरा एक इलेक्ट्रोपोरेशन कक्ष में रखा गया है पर enucleated और का उपयोग कर रहे हैं electroporated कस्टम बनाया मानक तकनीक 21 का उपयोग रेटिना हदबंदी और संस्कृति के द्वारा पीछा इलेक्ट्रोड,। इस प्रक्रिया के अनुकूलन के बाद हम के अस्तित्व और भेदभाव विशेषताओं से समझौता किए बिना लगातार, संस्कृति में कोशिकाओं और अकेले फोटोरिसेप्टर आबादी के भीतर 25% की कुल संख्या का 22% के आदेश पर अभिकर्मक क्षमता हासिल करने के लिए सक्षम किया गया हैसंस्कृतियों 1। यहाँ हम इस तकनीक की सफलता और reproducibility सुनिश्चित करने के लिए इस प्रक्रिया के सभी महत्वपूर्ण कदम रूपरेखा एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं।

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Protocol

इस काम में वर्णित सभी प्रक्रियाओं जॉन्स हॉपकिन्स विश्वविद्यालय में पशु की देखभाल और उपयोग समिति द्वारा सिफारिश की दिशा निर्देशों के अनुसार प्रदर्शन किया गया।

समय से आगे: 1. उपकरण, अभिकर्मकों और व्यंजनों की तैयारी

  1. अंडे की तैयारी: एक अंडे इनक्यूबेटर में 5 दिनों के लिए 37.5 डिग्री सेल्सियस और 60% सापेक्ष आर्द्रता में निषेचित व्हाइट लिवोमो चिकन अंडे सेते हैं।
    नोट: मानकीकरण और भ्रूण विकास सिंक्रनाइज़ करने के लिए सहायक हो सकता क्षमता कमाल की है, लेकिन कमाल के साथ एक मशीन इस प्रोटोकॉल के परिणाम के लिए सख्ती जरूरी नहीं है।
  2. प्लाज्मिड तैयारी:
    1. जरूरत के रूप में डिजाइन प्लाज्मिड (आरएनएआई प्रौद्योगिकी 1,34 के प्रयोग के माध्यम से उदाहरण के लिए) जीन overexpression या डाउनरेगुलेशन के लिए निर्माण। जब भी संभव निर्माण में एक पत्रकार जीन (जैसे EGFP, आरएफपी या lacZ) के रूप में शामिल करें।
      नोट: इस तरह के सीएमवी के रूप में कुछ अधिक इस्तेमाल प्रमोटरों, समय के बाद खामोश हो सकते हैं। कैग promotईआर (चिकन बीटा actin सीएमवी बढ़ाने के साथ प्रमोटर) ब्याज 35-37 के जीन की कुशल दीर्घकालिक अभिव्यक्ति प्रदान करने, एक बहुत अच्छा विकल्प है।
    2. बाँझ पीबीएस में 1.5 माइक्रोग्राम / μl की एकाग्रता में एक प्लाज्मिड समाधान तैयार है। वैकल्पिक: समय के आगे प्लाज्मिड समाधान तैयार है और यह स्थिर का उपयोग करने के लिए तैयार है जब तक दुकान।
      नोट: उच्च प्लाज्मिड सांद्रता का उपयोग जबकि निचले प्लाज्मिड सांद्रता अभिकर्मक दक्षता 1 कम, क्षमता में उल्लेखनीय वृद्धि का परिणाम नहीं है।
  3. इलेक्ट्रोड:
    1. एनोड उपयोग के लिए एक मोटी सोने (विशिष्ट सामग्री / उपकरण की तालिका देखें) इलेक्ट्रोड इत्तला दे दी। 70% इथेनॉल के साथ साफ साफ कर लें।
      नोट: सोने के इन्सुलेशन उजागर लगभग 0.5 मिमी छोड़ने इलेक्ट्रोड इत्तला दे दी, विद्युत प्रवाह के रिसाव को कम करने के लिए सलाह दी जाती है। सामग्री इन्सुलेट के लिए जानकारी विशिष्ट सामग्री की तालिका में पाया जा सकता है।
    2. एक 2.5 मिमी वर्ग बी के बाहर एक कैथोड बनाओ(सामान्य रूप से micropipette खींचने में प्रयुक्त) 4.5 मिमी चौड़ा बैल रेशा,। संदंश की सहायता के साथ, चौकोर बॉक्स पूर्ववत और एक लंबी पट्टी में रेशा सीधा। फिर, विच्छेदन माइक्रोस्कोप और एक गाइड के रूप में एक शासक का उपयोग कर के तहत, के आधार पर 3 मिमी लंबे समय से एक वर्ग 'यू' आकार में रेशा मोड़ और दूसरी तरफ फिलामेंट की शेष लंबाई (चित्रा 1 के साथ एक पक्ष में 2 मिमी उच्च , सी - डी)। संदंश का प्रयोग, 96% इथेनॉल और लौ में इलेक्ट्रोड बाँझ डुबकी। तब इलेक्ट्रोड की लंबी बांह के लिए एक छोटे मगरमच्छ क्लिप के साथ एक बिजली के नेतृत्व देते हैं।
  4. Electroporation चैंबर सेटअप:
    1. एक 100 मिमी पेट्री डिश का उपयोग कर टेप (चित्रा 1E) के लिए, नीचे, फ्लैट की ओर से यह एक बाँझ 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब के ढक्कन काटने और affixing द्वारा इलेक्ट्रोपोरेशन कक्ष तैयार।
      नोट: काम करेगा समान आकार की एक अच्छी तरह के रूप में अन्य कंटेनर; हालांकि, एक microcentrifuge ट्यूब ढक्कन आसानी से सुलभ और autoclavable है। अच्छी तरह सेप्लाज्मिड समाधान की बर्बादी में परिणाम के रूप में एक लड़की की आंख और कैथोड इलेक्ट्रोड घर के लिए काफी बड़ा है, लेकिन इतना बड़ा नहीं होना चाहिए।

2. पूर्व ओवो electroporation प्रक्रिया

  1. उपकरण की तैयारी:
    1. माइक्रो-विच्छेदन उपकरण जीवाणुरहित सूई से (अंडे के गोले खोलने और भ्रूण, RPE हटाने के लिए ड्यूमॉन्ट चिमटी घुमावदार ठीक टिप के 2 जोड़ी बाहर scooping के लिए बड़ी घुमावदार Moloney संदंश की 2 जोड़े, बॉन की एक जोड़ी को हटाने के लेंस और शीशे के लिए संदंश दांतेदार) 96% इथेनॉल और ज्वलंत में सुझाव दिए गए। 70% इथेनॉल में डूबा हुआ है पोंछे का उपयोग साफ विच्छेदन गुंजाइश। एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में बाँझ कैल्शियम मैग्नीशियम मुक्त हांक बैलेंस्ड नमक समाधान (सीएमएफ-HbSS) की एक बोतल गर्म। गर्म सीएमएफ-HBSS के साथ पूर्ण 3/4 के लिए 100 मिमी बाँझ पेट्री डिश भरें।
    2. एक और साफ विच्छेदन खुर्दबीन के नीचे इलेक्ट्रोपोरेशन कक्ष रखें और प्लाज्मिड समाधान के 120 μl के साथ भरें। , इलेक्ट्रोपोरेशन तंत्र के लिए इलेक्ट्रोड कनेक्ट कर रही हैयकीन है कि कस्टम बनाया इलेक्ट्रोड नकारात्मक पोल से जुड़ा है और सोने के सकारात्मक पोल करने के लिए इलेक्ट्रोड इत्तला दे दी है।
  2. भ्रूण संग्रह:
    1. 70% इथेनॉल में गीला पोंछे के साथ गोले पोंछते द्वारा अंडे साफ करें। संस्कृतियों में प्रदूषण को ले जाने से बचने के लिए प्रोटोकॉल के बाकी भर बाँझ प्रक्रिया को बनाए रखें। बड़ी घुमावदार Moloney संदंश का प्रयोग सावधानी से धीरे (हवा कक्ष से अधिक) एक अंडे के गोल टिप पर दोहन और फिर मनोरंजक और खोल टुकड़े बाहर खींच कर अंडे का खोल में एक छेद खुला।
    2. संदंश की एक और जोड़ी झिल्ली को हटा दें और अंडे से बाहर यह scooping द्वारा भ्रूण इकट्ठा के साथ (सावधान किया जा रहा भ्रूण को नुकसान नहीं है)। सीएमएफ-HBSS के साथ एक डिश में जगह है।
      नोट: 2.4.4 के रूप में निर्दिष्ट electroporation के लिए रेटिना कप की वांछित संख्या प्राप्त करने के लिए आवश्यक के रूप में के रूप में कई भ्रूण लीजिए
    3. महत्वपूर्ण कदम: हैम्बर्गर और हैमिल्टन 38 के अनुसार भ्रूण चरण में है।
      नोट: अधिकतम क्षमता भ्रूण प्राप्त करने के लिएचरण 27 (2A चित्रा) पर होना चाहिए।
    4. Moloney संदंश का उपयोग कत्ल द्वारा भ्रूण euthanize।
  3. रेटिना कप प्राप्त:
    1. ठीक ड्यूमॉन्ट चिमटी का प्रयोग, ध्यान से आंखों पता लगाना और एक नया सीएमएफ-HBSS डिश को हस्तांतरण।
    2. ऑप्टिक तंत्रिका सिर के पास हर आंख के पीछे भाग से शुरू, और दो ठीक ड्यूमॉन्ट चिमटी का उपयोग कर, तंत्रिका नुकसान नहीं RPE सतर्क किया जा रहा काटना तंत्रिका रेटिना और RPE और सावधानी के बीच चिमटी के प्रत्येक जोड़ी में से एक टिप परिचय रेटिना (चित्रा 2 बी)।
      नोट: RPE में मदद मिलेगी समाधान में सीए 2 और 2 मिलीग्राम + की कमी और अधिक आसानी से तंत्रिका रेटिना से अलग।
  4. Electroporation:
    1. 15 वोल्ट, 50 मिसे अवधि, और 950 मिसे के अंतराल के 5 वर्ग दालों देने के लिए electroporator के मापदंडों को निर्धारित करें। प्लेस 'यू' इलेक्ट्रोपोरेशन कक्ष (microcentrifuge ढक्कन भरने के अंदर नकारात्मक इलेक्ट्रोड के आकार काप्लाज्मिड युक्त समाधान के 120 μl) के साथ एड।
    2. का प्रयोग घुमावदार ड्यूमॉन्ट चिमटी (, नहीं scooping दबाकर) इलेक्ट्रोपोरेशन कक्ष के लिए एक रेटिना कप हस्तांतरण, और इलेक्ट्रोड के नीचे और ऊपर की ओर का सामना करना पड़ लेंस की दिशा में रेटिना के पीछे भाग के साथ, 'यू' आकार इलेक्ट्रोड के अंदर जगह ( चित्रा 2 डी)।
    3. यह लेंस के बगल में, आंख की पूर्वकाल हिस्सा छू लेती है, और electroporator के पैर पेडल बिजली दालों देने का उपयोग करते हुए इतना है कि एनोड रखें।
    4. सीएमएफ-HBSS के साथ एक नया पेट्री डिश के लिए electroporated रेटिना कप स्थानांतरण और शेष रेटिना कप से प्रत्येक के साथ electroporation प्रक्रिया को दोहराएँ।
      नोट: 6 रेटिना कप के लिए ऊपर अभिकर्मक दक्षता में एक महत्वपूर्ण कमी के बिना ही प्लाज्मिड समाधान के साथ electroporated जा सकता है।
    5. बॉन दांतेदार संदंश के साथ उन्हें मनोरंजक और धीरे टी के माध्यम से खींच कर प्रत्येक electroporated रेटिना कप के लेंस और कांच का शरीर निकालेंघुमावदार ड्यूमॉन्ट चिमटी के पीछे के साथ जगह में आंख धारण करते हुए उन्होंने उद्घाटन शिष्य।
    6. मानक प्रक्रियाओं का पालन electroporated रेटिना की कोशिकाओं की हदबंदी और संस्कृति के लिए आगे बढ़ें।
      नोट: लड़की रेटिना की कोशिकाओं की हदबंदी और संस्कृति पर एक विस्तृत प्रोटोकॉल के लिए Vergara और सर्ग-सोलेर, 2012, अतिरिक्त फ़ाइल 4 21 का उल्लेख कर इस प्रोटोकॉल में कोशिकाओं polyornithine लेपित 6 अच्छी तरह प्लेटें या 35 पर कम घनत्व वरीयता प्राप्त कर रहे हैं। -mm व्यंजन (6 x 10 5 कोशिकाओं / 35 मिमी व्यास अच्छी तरह से या पकवान)। इस्तेमाल किया माध्यम पेनिसिलिन / glutamine, 10% भ्रूण बछड़ा सीरम (एफसीएस), और 100 माइक्रोग्राम / मिलीलीटर में लिनोलेनिक एसिड-बीएसए के साथ 199 माध्यम है। संस्कृतियों 5% सीओ 2 के साथ एक humidified 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में रखा जाता है। इस प्रक्रिया का उपयोग करना, 5-6 एक्स 10 6 कोशिकाओं को आमतौर पर प्रत्येक चरण 27 electroporated आंख प्रति प्राप्त किया जा सकता है।
      नोट: आदर्श रूप में, से अधिक नहीं 3 घंटा भ्रूण संग्रह और सेल चढ़ाना के बीच पारित करना चाहिए, अच्छा सेल अस्तित्व को सुनिश्चित करने के लिएऔर तनाव को कम। अवलोकन और आगे के विश्लेषण के लिए एक विशिष्ट समय में इस बिंदु पर कोशिकाओं अच्छा रूपात्मक और आणविक भेदभाव हासिल किया है और अस्तित्व अभी भी अधिक है, के बाद से संस्कृति में 4 दिनों के बाद है।

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Representative Results

यहाँ हम बाद में अलग सेल संस्कृति के लिए enucleated लड़की रेटिना कप में प्लाज्मिड अभिकर्मक के लिए एक सरल प्रोटोकॉल उपस्थित थे। अभिकर्मक कस्टम इलेक्ट्रोड (- 2 आंकड़े 1) बनाने के लिए आसान का उपयोग कर electroporation द्वारा हासिल की है। इस प्रोटोकॉल में वर्णित मापदंडों के% के बीच 20 और 27 (चित्रा 3 डी) (22% की एक औसत के साथ) कि सीमा अभिकर्मक क्षमता प्राप्त करने के लिए अनुकूलित किया गया है। जैसा कि ऊपर कहा कारणों के लिए, इन परिणामों संस्कृति में 4 दिनों के बाद मात्रा निर्धारित कर रहे हैं, कि नोटिस। इस संदर्भ में, अभिकर्मक दक्षता कुल सेल आबादी के भीतर ट्रांस्जीन कि एक्सप्रेस कोशिकाओं का प्रतिशत को दर्शाता है। केवल फोटोरिसेप्टर आबादी माना जाता है, अभिकर्मक क्षमता 25% की एक औसत (चित्रा 3 डी) के लिए वृद्धि हुई है। संस्कृतियों के इन प्रकार मुख्य रूप से फोटोरिसेप्टर अध्ययन करने के लिए उपयोग किया जाता है, क्योंकि यह एक महत्वपूर्ण विशेषता है।

Electroporat कर दिया गया है कि सेल संस्कृतियों इस तकनीक का उपयोग एड डीआईसी रोशनी, सेल अस्तित्व विशेषताओं, और इस तरह के visinin (एक व्यापक रूप से इस्तेमाल फोटोरिसेप्टर के मार्कर) और Pax6 1 के रूप में आणविक मार्कर की अभिव्यक्ति के तहत उनकी आकृति विज्ञान में उनके गैर electroporated समकक्षों से पृथक कर रहे हैं।

चित्र 1
इलेक्ट्रोड के 1. मेकिंग चित्रा। (ए - डी) कैथोड एक वर्ग 'यू' आकार में संदंश के साथ पहली बार सीधा है, जो एक चौकोर बॉक्स रेशा (ए), (ख) और फिर से तुला से बाहर कर दिया जाता है (सी - डी)। एनोड एक मोटी सोने इलेक्ट्रोड (डी) इत्तला दे दी है; टिप अवगत कराया। (ई) electroporation सेटअप का केवल 0.5 मिमी छोड़ने एनोड इलेक्ट्रोड के आसपास इन्सुलेशन सूचना है। इनसेट बॉक्सिंग क्षेत्र की उच्च वृद्धि से पता चलता है।पीजी "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
Electroporation के लिए रेटिना कप की चित्रा 2. तैयारी। RPE ध्यान से तेज ड्यूमॉन्ट चिमटी का उपयोग कर enucleated आँखों से निकाल दिया जाता है हैम्बर्गर और हैमिल्टन भ्रूण चरण 27 (बी) (ए) लड़की भ्रूण। (सी) सही पर रेटिना कप RPE से रहित और electroporation के लिए तैयार है। (डी ) कैथोड इलेक्ट्रोड प्लाज्मिड समाधान के साथ भरा एक 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब ढक्कन से बाहर किए गए एक इलेक्ट्रोपोरेशन कक्ष के अंदर तैनात है। रेटिना कप को ध्यान से ऊपर की ओर का सामना करना पड़ कैथोड में स्थानांतरित किया है, और एनोड इलेक्ट्रोड लेंस के बगल में, शीर्ष पर रखा गया है। एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करेंयह आंकड़ा की।

चित्र तीन
बाद संवर्धित कोशिकाओं में transgene अभिव्यक्ति की चित्रा 3. क्षमता electroporation (एक - सी)। रेटिना कप अलग और 4 दिनों के लिए सुसंस्कृत, एक GFP अभिव्यक्ति प्लाज्मिड के साथ electroporated थे। प्रतिदीप्ति micrographs DAPI दाग नाभिक (ए) और GFP व्यक्त रेटिना की कोशिकाओं (बी) दिखा। एंटी Visinin एंटीबॉडी धुंधला (सी) फोटोरिसेप्टर कोशिकाओं की पहचान करने के लिए किया गया था। (डी) ग्राफ़ कुल सेल आबादी (सकारात्मक DAPI), बीच में या फोटोरिसेप्टर के बीच कोशिकाओं को व्यक्त GFP के प्रतिशत के रूप में प्रतिनिधित्व इलेक्ट्रोपोरेशन ओवो पूर्व के द्वारा प्राप्त अभिकर्मक दक्षता, illustrating विशेष रूप से जनसंख्या (Visinin सकारात्मक)। परिणाम 5 स्वतंत्र प्रयोगों के SEM ± मतलब प्रतिनिधित्व करते हैं। में स्केल पट्टी (एक - सी)। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

इस प्रोटोकॉल की सफलता के लिए सबसे महत्वपूर्ण कदम भ्रूण के उचित मंच का चयन होता है। पिछले प्रकाशनों में, भ्रूण चरणों की एक श्रृंखला के लिए आम तौर पर ऊष्मायन या भ्रूण दिनों का दिन (ईडी) द्वारा परिभाषित, इन संस्कृतियों के लिए दिया जाता है; इस प्रकार यह आम तौर पर प्रवर्तन निदेशालय को 6 भ्रूण प्रवर्तन निदेशालय 5 का उपयोग कर बराबर परिणाम निकलेगा कि माना जाता है। हालांकि हम जैसा कि ऊपर कहा चरण 27 (ईडी) 5 पर, अभिकर्मक दक्षता, कुल सेल की आबादी का लगभग 22% हो जाएगा कि मिल गया है; अभी तक दक्षता चरण चरण 29 से 28 भ्रूण (ईडी 5.5), और 12% करने के लिए (ईडी 6) का उपयोग करता है, तो 16% तक कम हो 1। जाएगा अन्य महत्वपूर्ण कदम प्रक्रिया के दौरान बाँझ शर्तों बनाए रखना शामिल है; आवश्यक मैनुअल निपुणता प्राप्त करने विच्छेदन और electroporation दौरान रेटिना को नुकसान पहुँचाए से बचने के लिए; और सेल चढ़ाना के समय के लिए भ्रूण संग्रह के समय से लंबे अंतराल से परहेज।

एक अन्य महत्वपूर्ण विचार अच्छा अभिकर्मक दक्षता सुनिश्चित करने के लिएCies प्लाज्मिड युक्त समाधान की एकाग्रता है: सिफारिश 1.5 माइक्रोग्राम / μl हम दक्षता में कमी में परिणाम नहीं था कि परीक्षण किया है कि सबसे कम एकाग्रता है। रेटिना कप कि समाधान में स्नान कर रहे हैं जब विचार है कि यह एकाग्रता प्लाज्मिड सामग्री का एक उच्च राशि में तब्दील हो। (जैसे एक microcentrifuge ट्यूब ढक्कन के रूप में) आँखों को समायोजित करेगा कि छोटे आकार में अच्छी तरह से उपयोग कर इस समस्या को कम कर सकते हैं। इसके अलावा, कई आंखें एक ही समाधान का उपयोग electroporated जा सकता है; एक ही प्लाज्मिड समाधान में लगातार 6 रेटिना कप के लिए ऊपर electroporating जब हम दक्षता में कमी नहीं देखा है, और अधिक संभवतः प्रदर्शन किया जा सकता है, लेकिन हम उसके बाद दक्षता में अंतर करने के लिए attest नहीं कर सकते।

पहले प्रकाशित प्रोटोकॉल आम तौर पर संस्कृति के इस प्रकार के जीन स्थानांतरण की कम क्षमता प्रदान की है, और इस तरह वे अक्सर एक सेल एल पर एंजाइमी प्रतिक्रियाओं के उत्पाद उपाय है कि तकनीक पर निर्भर होना पड़ासंवेदनशीलता को बढ़ाने के क्रम में ysate। इस तरह के एक दृष्टिकोण सेल प्रकार के भेदभाव के लिए और हमेशा बड़ा सेल की आबादी के व्यवहार को प्रतिबिंबित नहीं हो सकता है, जो मनाया परिणाम के लिए जिम्मेदार होने की कोशिकाओं की कम संख्या पर भरोसा करने के लिए अनुमति नहीं दे का नुकसान है। कम क्षमता की समस्या को नाकाम करने के लिए एक अन्य तरीका से पहले आंख स्पष्टीकरण और संस्कृति के लिए, विवो में जीन अभिकर्मक प्रदर्शन करने के लिए है। यह एक व्यावहारिक दृष्टिकोण है लेकिन प्लाज्मिड electroporation और RCAs वायरस के संक्रमण (लड़की में एक आम जीन पारगमन वेक्टर) दोनों को आम तौर पर पहले विकास के चरणों में प्रदर्शन करने की आवश्यकता के बाद से यह आमतौर पर दोनों के बीच एक समय अंतराल बनाने, केवल विशिष्ट प्रयोगात्मक मानदंड को लागू किया जा सकता अभिकर्मक और संस्कृति। उस समय अंतराल के दौरान कोशिकाओं को बाह्य microenvironment के साथ ही इंट्रासेल्युलर दोनों कारकों के प्रभाव को उजागर कर रहे हैं, क्योंकि यह ऍक्स्प की व्याख्या में महत्वपूर्ण प्रभाव होने, एक महत्वपूर्ण विचार हैerimental का परिणाम है। इसके विपरीत, electroporation दृष्टिकोण ओवो पूर्व के साथ हासिल की जीन स्थानांतरण क्षमता में पर्याप्त वृद्धि एक सेल आंतरिक ढंग से जीन समारोह के अध्ययन के लिए अनुमति देता है। स्वचालित उच्च throughput सेल विश्लेषण 1 के साथ संयोजन के रूप में प्रयोग किया जाता है इसके अलावा, जब इस उच्च अभिकर्मक दर का लाभ आगे बढ़ाया जा सकता है।

इस तकनीक के विकास के प्रारंभिक चरण में, हम विभिन्न परिस्थितियों 1 के साथ हासिल की electroporation की दक्षता का मूल्यांकन करने के लिए 24 घंटे के लिए संस्कृति में RPE-विहीन आंख कप electroporated बनाए रखा। हम समय की लंबी अवधि के लिए संस्कृति उन्हें करने का प्रयास नहीं किया है, हमारे अनुभव के साथ साथ वर्णित प्रोटोकॉल भी उचित लंबी अवधि explant संस्कृति की स्थिति में इस्तेमाल कर रहे हैं, बशर्ते रेटिना organotypic explants पर भरोसा अध्ययन के लिए लागू किया जा सकता है कि इंगित करता है।

अंत में, यह वीं की प्रयोज्यता का विस्तार करना संभव होगाअन्य पशु मॉडल को electroporation दृष्टिकोण ओवो पूर्व है। इस प्रोटोकॉल का उपयोग प्रसव के बाद दिन 1 या 4 पर माउस आँखों के हमारे अनुभव अभिकर्मक में उदाहरण के लिए explant संस्कृतियों में गुणात्मक अच्छा परिणाम सामने आए हैं, लेकिन अलग सेल संस्कृतियों का प्रयास कर रहे थे जब अभिकर्मक दक्षता अन्य तकनीकों के समान 6%, के आदेश पर किया गया था। इस प्रकार, यह इस पशु मॉडल के लिए अन्य प्रोटोकॉल के लिए एक सरल विकल्प हो सकता है, लेकिन यह उच्च क्षमता की आवश्यकता होती है, तो विशेष प्रणाली के लिए अनुकूलित किया जाना आवश्यक होगा। ध्यान से, जैसा कि ऊपर कहा, इलेक्ट्रोपोरेशन के समय में भ्रूण अवस्था लड़की में प्राप्त उच्च दक्षता परिणाम के लिए महत्वपूर्ण था, इसलिए अन्य मॉडलों की तकनीक को लागू करते समय इस पैरामीटर ध्यान से विचार किया जाना चाहिए।

शक्तिशाली उपकरण vivo अध्ययन में पूरक के रूप में अंत में, electroporation तकनीक ओवो पूर्व एन प्रसाद, इन विट्रो रेटिना सिस्टम के लागू विस्तार कर सकते हैंरेटिना अनुसंधान के लिए ईडब्ल्यू संभावनाओं।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
ECM 830 Electro Square Porator BTX/ Harvard Apparatus 45-0052
Genetrode, L-Shaped, 5 mm Gold Tip BTX/ Harvard Apparatus 45-0115 model 512 Gold tipped electrode used as anode
Polyimide Tubing Vention Medical custom made Internal Diameter: 0.5 mm/wall thickness: 0.15 - 0.2 mm. Used for insulating gold tiped electrode
2.5 mm square box filament, 4.5 mm wide Sutter Instrument Company FB245B Used to make cathode electrode
HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red Gibco - Life Technologies 14175-095
Moloney forceps Roboz RS-8254 Serrated; Slight Curve; 4.5" Length
Dumont tweezers 5/45 Roboz RS-5058 Pattern #5, 45 Degree Angle; .10 X .06mm Tip Size; 109mm Length
Bonn micro forceps, 1x2 teeth Roboz RS-5172 Tying Platform; 1x2 Teeth, 0.12 mm Teeth; 3.75" Length; 0.3 mm Tip Width

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References

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