Transferência de Gene eficiente em retinas pintainho para célula primária Estudos de Cultura: An

Developmental Biology

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Summary

Culturas de células da retina pintinho embrionárias constituem ferramentas importantes para o estudo da biologia de fotorreceptores. Nós desenvolvemos uma técnica de transferência de gene eficiente com base em ex ovo plasmídeo electroporação das retinas antes da cultura. Esta técnica aumenta consideravelmente a eficiência de transfecção através de protocolos disponíveis atualmente, fazendo a manipulação genética viável para este sistema.

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Vergara, M. N., Gutierrez, C., Canto-Soler, M. V. Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach. J. Vis. Exp. (105), e52002, doi:10.3791/52002 (2015).

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Abstract

As culturas enriquecidas com cone fotorreceptoras da retina derivadas de bico embrionárias tornaram-se uma ferramenta indispensável para pesquisadores de todo o mundo que estudam a biologia dos neurônios da retina, particularmente fotorreceptores. As aplicações deste sistema excede investigação fundamental, uma vez que podem ser facilmente adaptados às tecnologias de elevado rendimento para o desenvolvimento de drogas. No entanto, a manipulação genética de fotorreceptores da retina nestas culturas tem provado ser muito desafiador, que levanta uma importante limitação para a utilidade do sistema. Temos recentemente desenvolvido e validado um ex ovo técnica de electroporação plasmídeo que aumenta a taxa de transfecção de células de retina nestas culturas por cinco vezes em comparação com outros protocolos actualmente disponíveis 1. Neste método pinto embrionário olhos são enucleados no estágio 27, o RPE é removido, ea taça da retina é colocado em uma solução contendo plasmídeo e electroporado usando custom- facilmente construídosfeitos eléctrodos. As retinas são então dissociados e cultivadas utilizando procedimentos padrão. Esta técnica pode ser aplicada a estudos sobre-expressão, bem como para a regulação negativa da expressão do gene, por exemplo, através da utilização de tecnologia RNAi-driven plasmídeo, geralmente atingir a expressão do transgene em 25% da população de fotorreceptores. O formato de vídeo da presente publicação irá tornar esta tecnologia de fácil acesso para os pesquisadores da área, permitindo o estudo da função dos genes em culturas de retina primários. Incluímos também explicações detalhadas sobre as etapas críticas de este procedimento para um resultado de sucesso e reprodutibilidade.

Introduction

Culturas de células dissociadas de retinas de pintainho embrionário têm sido amplamente utilizados para o estudo de vários aspectos da biologia celular de fotorreceptores, incluindo a sua sobrevivência 2-9, 10-12 diferenciação, crescimento de neuritos 13, e mais. As vantagens deste sistema, desenvolvido na década de 1980 por Ruben Adler e colaboradores e aperfeiçoados por suas e de outros grupos 14-20, residem nas características intrínsecas do pinto como um modelo animal 21. O grande tamanho do olho do pintainho, mesmo em estádios embrionários, fornece grandes quantidades de material para culturas. Além disso, quando as culturas são realizadas utilizando dia embrionário (ED) 5 - 6 retinas, 55 - 80% das suas células progenitoras diferenciam como fotorreceptores 14,15,18,22,23, e desde cerca de 86% dos fotorreceptores nesse animal são 24 cones, estas culturas são particularmente adequados para estudos que focalizam o tipo de célula.

Temos recentemente desenPED e caracterizada uma técnica simples que permite um processo de alta eficiência de transfecção de plasmídeo das células nestas culturas, alargando assim a utilidade deste sistema, facilitando estudos missexpression genética 1. O desenvolvimento desta técnica resultou de um vazio na literatura científica de métodos que proporcionem um nível aceitável de transfecção para permitir o estudo da função dos genes de uma maneira autónoma da célula. Isto é em parte porque as culturas primárias neuronais são notoriamente difíceis de transfectar 25,26. Algumas das técnicas mais comumente usadas anteriormente disponíveis para o efeito métodos de transfecção incluiu químicos, tais como lipofecção ou cálcio transfecção mediada por fosfato, que resultam em eficácia na ordem de 3-5% e pode exercer toxicidade considerável 27-32. Embora a utilização de plasmídeos com um sistema de repórter enzimático pode contornar o problema da falta de eficiência de transfecção por amplificação do sinal, eles não fazemdiscriminar efeitos específicos de células, e os seus resultados são baseados em uma população de células pequenas que podem não ser representativas do conjunto. Outro método amplamente utilizado na pintinho, infecção por vírus RCAS, só é aplicável a células em proliferação e, portanto, não é adequado para este sistema de cultura de retina primário 33.

No protocolo de corrente pintainho embrionário olhos são enucleados na fase 27 (ED 5), o epitélio pigmentado da retina (RPE) é removido, e o copo da retina é colocado numa câmara de electroporação preenchido com uma solução contendo o plasmídeo e electroporadas utilizando feito por encomenda eléctrodos, seguido pela dissociação da retina e de cultura usando técnicas convencionais. 21 Depois de optimizar este procedimento, temos sido capazes de conseguir de forma consistente eficiências de transfecção na ordem de 22% do número total de células em cultura e de 25% na população de fotorreceptores por si só, sem comprometer as características de sobrevivência e diferenciação de aculturas 1. Aqui nós fornecemos um protocolo detalhado descrevendo todas as etapas importantes deste processo, a fim de garantir o sucesso e reprodutibilidade desta técnica.

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Protocol

Todos os procedimentos descritos neste trabalho foram realizadas de acordo com as orientações recomendadas pelo Animal Care e do Comitê Use da Universidade Johns Hopkins.

1. Ahead of Time: preparação de instrumentos, reagentes e pratos

  1. Preparação de Ovos: ovos de galinha fertilizados Incubar Leghorn branco a 37,5 ° C e 60% de humidade relativa durante 5 dias numa incubadora de ovos.
    NOTA: Uma incubadora com capacidade de balanço pode ser útil para padronizar e sincronizar o desenvolvimento embrionário, mas de balanço não é estritamente necessário para o resultado do presente protocolo.
  2. O plasmídeo Preparação:
    1. Design O plasmídeo para construir a sobre-expressão ou infra-regulação de genes (por exemplo, através da utilização de tecnologia RNAi 1,34), conforme necessário. Incluir um gene repórter (por exemplo, EGFP, RFP ou LacZ) na construção, sempre que possível.
      Nota: Alguns promotores vulgarmente utilizados tais como CMV, pode tornar-se silenciado após o tempo. O promot CAGer (beta-actina de galinha com promotor de CMV) é uma boa alternativa, proporcionando a expressão eficiente a longo prazo do gene de interesse 35-37.
    2. Prepara-se uma solução de plasmídeo a uma concentração de 1,5 mg / mL em PBS estéril. OPCIONAL: Preparar a solução de plasmídeo antes do tempo e armazená-lo congelado até que esteja pronto para uso.
      NOTA: Superior concentrações plasmídeo não resultar num aumento significativo da eficiência, enquanto que utilizando concentrações mais baixas de plasmídeo diminuir a eficiência de transfecção 1.
  3. Eletrodos:
    1. Para o uso ânodo uma grossa de ouro com ponta do eletrodo (ver Tabela de Específico materiais / equipamentos). Limpe com etanol 70%.
      NOTA: Isolamento do eléctrodo de ouro derrubado, deixando cerca de 0,5 mm expostos, é aconselhável minimizar o vazamento da corrente eléctrica. Informações para material isolante podem ser encontrados na tabela de materiais específicos.
    2. Faça um cátodo de um 2,5 milímetros quadrados bfilamento boi, 4,5 mm de largura (normalmente usado em puxadores micropipeta). Com o auxílio de uma pinça, desfazer a caixa quadrada e endireitar filamento em uma longa faixa. Em seguida, sob microscópio de dissecção e utilizando uma régua como guia, dobrar o filamento em um quadrado 'U' 3 mm de comprimento na base e 2 mm de altura num lado, com o outro lado do restante comprimento do filamento (Figura 1 , C - D). Utilizando uma pinça, mergulhe o arame em etanol a 96% e chama para esterilizar. Em seguida, anexar um condutor eléctrico com um pequeno jacaré para o braço mais comprido do eletrodo.
  4. Setup Eletroporação Câmara:
    1. Preparar a câmara de electroporação por corte da tampa de um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml estéril e aposição, o lado plano para baixo, para uma placa de Petri de 100 mm utilizando uma fita (Figura 1E).
      NOTA: Outro recipiente sob a forma de um poço de tamanho semelhante funciona; No entanto, um tubo de microcentrífuga de tampa é facilmente acessível e autoclavável. O bemdeve ser o suficiente para abrigar um eletrodo pintinho olho e cátodo grande, mas não tão grande quanto a resultar em uma perda de solução de plasmídeo.

2. Ex ovo Eletroporação Procedimento

  1. Preparação de instrumentos:
    1. Esterilizar ferramentas micro-dissecção (2 pares de grandes pinças Moloney curvas para abrir cascas de ovos e escavar para fora embriões, 2 pares de fine-ponta curvada pinças Dumont para a remoção de RPE, um par de Bonn dentada pinças para remoção da lente e vítreo) por imersão do dicas em etanol a 96% e flamejante. Escopo de dissecação limpa usando lenços mergulhados em etanol a 70%. Aquecer uma garrafa de Solução Salina Equilibrada de cálcio e de magnésio estéril livre de Hank (HBSS-CMF) em um banho de água a 37 ° C. Preencha 100 mm placas de Petri estéreis para 3/4 com warm-CMF HBSS.
    2. Coloque câmara de eletroporação sob outro microscópio de dissecação limpa e encha com 120 ml de solução de plasmídeo. Conectar eléctrodos para electroporação aparelho, tornandoCertifique-se eletrodo feito sob medida está ligado ao pólo negativo e eletrodo de ouro derrubado ao pólo positivo.
  2. Colheita de embriões:
    1. Limpe os ovos, limpando conchas com toalhetes humedecidos em etanol a 70%. Manter procedimento estéril em todo o resto do protocolo para evitar contaminação levando para as culturas. Usando grandes pinças Moloney curvas abrir cuidadosamente um buraco na casca do ovo batendo suavemente na ponta arredondada de um ovo (através da câmara de ar) e, em seguida, agarrando e puxando pedaços de casca.
    2. Com outro par de fórceps remover membranas e coletar embriões escavando-lo para fora do ovo (tomando cuidado para não danificar o embrião). Coloque-o em um prato com CMF-HBSS.
      NOTA: como coletar muitos embriões conforme necessário para obter o número desejado de copos da retina para eletroporação, conforme especificado no 2.4.4
    3. Passo crítico: Estágio os embriões de acordo com Hamburger e Hamilton 38.
      NOTA: Para obter máxima eficiência embriõesdeve estar na fase 27 (Figura 2A).
    4. Euthanize os embriões por decapitação usando uma pinça Moloney.
  3. Obtenção de Copas da retina:
    1. Com uma pinça Dumont finas, enuclear cuidadosamente os olhos e transferir para um novo CMF-HBSS prato.
    2. A partir da parte posterior de cada olho, perto da cabeça do nervo óptico, e usando duas pinças Dumont finas, introduzir uma ponta de cada par de pinças entre a retina neural e RPE e dissecar cuidadosamente para fora do RPE sendo cauteloso para não danificar o neural retina (Figura 2B).
      NOTA: A falta de Ca 2+ e Mg 2+ na solução vai ajudar a separar EPR da retina neural mais facilmente.
  4. Eletroporação:
    1. Configurar os parâmetros de electroporador para entregar 5 pulsos quadrados de 15 Volts, 50 ms, duração e intervalo de 950 ms. Place 'U' em forma eletrodo negativo interior da câmara de eletroporação (microcentrifuge tampa de enchimentoed com 120 ul de solução contendo plasmídeo-).
    2. Usando uma pinça Dumont curvas transferir uma xícara de retina para a câmara de eletroporação (por escavar, não prensagem), e colocá-lo dentro do eletrodo em forma de "U", com a parte posterior da retina para a parte inferior do eléctrodo e a lente virada para cima ( Figura 2D).
    3. Coloque o ânodo de modo que toque a parte anterior do olho, próximo da lente, e usando o pedal do electroporador entregar os impulsos eléctricos.
    4. Transferir electroporadas copo da retina para uma nova placa de Petri com CMF-HBSS e repete procedimento de electroporação com cada um dos restantes copos da retina.
      NOTA: Até 6 copos da retina pode ser electroporada com a mesma solução de plasmídeo sem uma diminuição significativa da eficiência da transfecção.
    5. Retire a lente e corpo vítreo de cada copo de retina electroporated agarrando-os com uma pinça de Bona dentadas e puxando suavemente através de tele pupila abertura, mantendo o olho no lugar com a volta das pinças Dumont curvas.
    6. Proceder à dissociação e cultura das células da retina electroporated seguintes procedimentos padrão.
      NOTA: Para obter um protocolo detalhado sobre a dissociação e cultura de células da retina pintinho referem-se a Vergara e Canto-Soler, 2012, arquivo adicionais 4 21 Neste protocolo, as células são semeadas a baixa densidade em placas de 6 poços revestidos por poliornitina ou 35. pratos -mm (6 x 10 5 células / 35 mm de diâmetro bem ou prato). O meio utilizado é o meio 199 com penicilina / glutamina, 10% de soro fetal de vitelo (FCS), e ácido linoleico-BSA a 100 ng / ml. As culturas são mantidas numa atmosfera humidificada a 37 ° C incubadora com 5% de CO 2. Utilizando este procedimento, a 5 - 6 6 x 10 células podem ser obtidas tipicamente por cada fase 27 do olho electroporadas.
      NOTA: O ideal é não mais do que 3 horas devem passar entre colheita e chapeamento de celular, para garantir uma boa sobrevivência celulare minimizar o estresse. Um tempo típico para observação e análise posterior é após 4 dias em cultura, uma vez que neste momento as células têm alcançado boa diferenciação morfológica e molecular e sobrevivência ainda é alta.

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Representative Results

Aqui apresentamos um protocolo simples para o plasmídeo transfecção em copos de bico da retina enucleados para posterior cultura de células dissociadas. Transfecção é obtida por eletroporação usando fácil de fazer eletrodos personalizados (Figuras 1 - 2). Os parâmetros descritos neste protocolo foram otimizados para obter eficiências de transfecção que variam entre 20 e 27% (com uma média de 22%) (Figura 3D). Note-se que, pelas razões acima expostas, estes resultados são quantificados após 4 dias em cultura. Neste contexto, a eficiência de transfecção refere-se à percentagem de células que expressam o transgene dentro da população total de células. Se apenas a população de fotorreceptores é considerado, aumentar eficiências de transfecção para uma média de 25% (Figura 3D). Esta é uma característica importante uma vez que estes tipos de culturas são usadas principalmente para estudar fotorreceptores.

As culturas de células que foram electroporat Ed usando esta técnica são indistinguíveis dos seus homólogos não-electroporadas na sua morfologia, sob iluminação DIC, características de sobrevivência celular, e a expressão dos marcadores moleculares, tais como visinin (um marcador amplamente utilizado de fotorreceptores) e Pax6 1.

figura 1
Figura 1. Making of os eletrodos. (A - D) O cátodo é feito de um filamento caixa quadrada (A), que é esticado primeiro (B) e, em seguida dobrado com uma pinça em um quadrado 'U' (C - D). O ânodo é uma grossa de ouro com ponta do eletrodo (D); Observe o isolamento ao redor do ânodo, deixando apenas 0,5 mm da ponta exposta. Configuração (E) Eletroporação. O encarte mostra maior ampliação da área de box.pg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2
Figura 2. Preparação de Copas da retina para Eletroporação. (A) Pintinho do embrião no Hamburger e Hamilton fase embrionária 27. (B) O EPR é cuidadosamente removido dos olhos enucleados usando uma pinça Dumont afiadas. (C) A taça da retina à direita é desprovido de RPE e pronto para eletroporação. (D ) O eléctrodo de cátodo está posicionado dentro de uma câmara de electroporação feita de uma tampa de 1,5 mL de microcentrífuga de tubo cheio com a solução de plasmídeo. A taça da retina é cuidadosamente transferido para o cátodo virado para cima, eo ânodo é colocado no topo, ao lado da lente. Por favor clique aqui para ver uma versão maiordesta figura.

Figura 3
Figura 3. Eficiência de Expressão transgénica em células em cultura após a electroporação (A - C). Copos retinianas foram electroporadas com um plasmídeo de expressão de GFP, dissociados e cultivadas durante 4 dias. Micrografias de fluorescência mostram DAPI núcleos corados (A) e GFP expressando células da retina (B). Coloração com anticorpo anti-Visinin foi realizada para identificar as células fotorreceptoras (C). (D) gráfico que ilustra a eficiência de transfecção obtida por ex ovo electroporação, representada como a percentagem de GFP expressando células na população celular total (DAPI positivo), ou entre os fotorreceptores população em particular (Visinin positivo). Os resultados representam a média ± SEM de 5 experiências independentes. Barra de escala em (A - C). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

O passo mais crítico para o sucesso deste protocolo é a selecção do estágio apropriado dos embriões. Em publicações anteriores, uma série de estágios embrionários é dada para estas culturas, tipicamente, definida pelos dias de incubação ou embrionárias dias (ED); portanto, é geralmente assumido que a utilização de ED de 5 a 6 ED embriões irá produzir resultados equivalentes. No entanto verificou-se que na fase 27 (ED 5), a eficiência de transfecção será de cerca de 22% da população total de células, tal como indicado acima; Ainda eficiência diminuirá para 16% se estiver usando o estágio 28 embriões (ED 5.5), e para 12% na fase 29 (ED 6) 1. Outros passos críticos incluem a manutenção de condições estéreis por todo o processo; adquirir a destreza manual necessária para evitar danificar a retina durante a dissecção e eletroporação; e evitando aberturas de comprimento a partir do momento da colheita de embriões com o tempo de chapeamento celular.

Outra consideração importante para garantir a boa efficien transfecçãocas é a concentração da solução que contém o plasmídeo: a recomendada de 1,5 mg / mL é a concentração mais baixa testada que nós que não resultou numa diminuição da eficiência. Isto traduz-se numa concentração elevada quantidade de material de plasmídeo quando se considera que os copos da retina são banhadas em solução que. Utilizando o menor tamanho bem que vai acomodar o olho (tal como um tubo de microcentrífuga de tampa) pode minimizar este problema. Além disso, vários olhos pode ser electroporadas utilizando a mesma solução; não temos visto uma redução na eficiência quando electroporating até 6 xícaras de retina consecutivamente na mesma solução plasmídeo, e mais poderia ser realizado, mas não podemos atestar a diferença na eficiência depois.

Protocolos anteriormente publicados normalmente fornecida a baixa eficiência da transferência de genes para este tipo de cultura, e, portanto, eles muitas vezes que recorrem a técnicas que medem o produto de reacções enzimáticas em uma célula Lysate, a fim de aumentar a sensibilidade. Esta abordagem tem a desvantagem de não permitir a discriminação do tipo de célula e de depender de um número reduzido de células que são responsáveis ​​pelo resultado observado, o que nem sempre pode ser um reflexo do comportamento da população de células maior. Outra forma de contornar o problema da baixa eficiência é realizar a transfecção de genes in vivo, antes da enucleação dos olhos e da cultura. Esta é uma abordagem viável, mas geralmente pode ser aplicada apenas a paradigmas experimentais específicos, uma vez que ambos eletroporação plasmídeo e infecção pelo vírus RCAS (um gene vector de transdução comum no pintainho) normalmente precisam ser realizados em fases de desenvolvimento anteriores, a criação de um espaço de tempo entre a transfecção e cultura. Esta é uma consideração importante, pois durante esse tempo de latência, as células são expostas aos efeitos de ambos o microambiente extracelular, bem como factores intracelulares, que tem implicações significativas na interpretação da experimental resultados. Em contraste, o aumento substancial na eficiência da transferência de genes conseguido com a abordagem ex ovo electroporação permite o estudo da função de genes em células de modo intrínseco. Além disso, a vantagem de esta elevada taxa de transfecção pode ser aumentada quando utilizado em conjunto com a análise de alto rendimento de células automatizado 1.

Nas fases iniciais do desenvolvimento desta técnica, mantivemos a electroporação copos olho RPE-desprovido em cultura durante 24 horas para avaliar a eficiência da electroporação conseguido com diferentes condições 1. Embora nós não tentar cultura los por longo período de tempo, a experiência indica que o protocolo aqui descrito também pode ser aplicado a estudos que dependem de explantes de retina organotípicas, fornecida a longo prazo condições de cultura de explantes adequados são usados.

Finalmente, seria possível alargar a aplicabilidade do thé ex ovo abordagem eletroporação para outros modelos animais. Por exemplo, na nossa experiência de transfecção de olhos de ratinhos no dia pós-natal 1 ou 4, utilizando este protocolo produziu qualitativamente bons resultados em culturas de explantes, mas quando as culturas de células dissociadas foram tentadas a eficiência de transfecção foi da ordem de 6%, semelhante à de outras técnicas. Assim, esta poderia ser uma alternativa simples para outros protocolos para este modelo animal, mas terá de ser optimizada para o sistema em particular se forem necessárias eficiências elevadas. É de notar, como indicado acima, estágio embrionário no momento da electroporação foi fundamental para o resultado alta eficiência obtida no pintainho, de modo que este parâmetro deve ser cuidadosamente considerada quando se aplica a técnica a outros modelos.

Em conclusão, a técnica de electroporação ex ovo possível alargar a aplicabilidade dos sistemas in vitro da retina como poderosas ferramentas para complementar os estudos in vivo, n oferecendoew possibilidades para a investigação da retina.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
ECM 830 Electro Square Porator BTX/ Harvard Apparatus 45-0052
Genetrode, L-Shaped, 5 mm Gold Tip BTX/ Harvard Apparatus 45-0115 model 512 Gold tipped electrode used as anode
Polyimide Tubing Vention Medical custom made Internal Diameter: 0.5 mm/wall thickness: 0.15 - 0.2 mm. Used for insulating gold tiped electrode
2.5 mm square box filament, 4.5 mm wide Sutter Instrument Company FB245B Used to make cathode electrode
HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red Gibco - Life Technologies 14175-095
Moloney forceps Roboz RS-8254 Serrated; Slight Curve; 4.5" Length
Dumont tweezers 5/45 Roboz RS-5058 Pattern #5, 45 Degree Angle; .10 X .06mm Tip Size; 109mm Length
Bonn micro forceps, 1x2 teeth Roboz RS-5172 Tying Platform; 1x2 Teeth, 0.12 mm Teeth; 3.75" Length; 0.3 mm Tip Width

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References

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