زراعة خلايا الثدييات عن طريق استخدام المفرد نظام هوائي تفاعلات الاحيائية

Bioengineering
 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Obom, K. M., Cummings, P. J., Ciafardoni, J. A., Hashimura, Y., Giroux, D. Cultivation of Mammalian Cells Using a Single-use Pneumatic Bioreactor System. J. Vis. Exp. (92), e52008, doi:10.3791/52008 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

خطوط خلايا الثدييات يمكن تصنيفها إلى واحدة من ثلاث فئات على أساس الخصائص نموها: الخلايا التي تنمو في التعليق، والخلايا التي تنمو المجاميع والخلايا التي تنمو ترتكز على هذه الركيزة. على الرغم من أن مفاعل حيوي عجلة الهواء موضح في هذا الفيديو هو قادرة على النمو عن ثلاثة أنواع من الخلايا، وهذا الفيديو يظهر استخدام مفاعل حيوي لزراعة الخلايا التابعة مرسى على حاملات الدقيقة. يمكن زراعة خلايا الثدييات تعتمد مرسى لغرض إنتاج المزيد من الخلايا - حيث الخلايا نفسها هي نتاج. على سبيل المثال، يجري حاليا زراعة نخاع المستمدة الخلايا الجذعية الوسيطة العظم البشري بغرض حصاد الخلايا وحقنها داخل الأنسجة المريضة. وقد ثبت مفاعل حيوي هوائي موضح في هذا الفيديو مناسبة لإنتاج مثل هذه الخلايا الجذعية الوسيطة لهذا التطبيق (سيرا آخرون، اتصال شخصي 2013).

مرسى إقلاعوعادة ما تزرع خلايا الثدييات endent نطاق صغير في الأوعية ثقافة 2D مثل لوحات ثقافة الخلية، قوارير زراعة الخلايا، أو زجاجات الأسطوانة، حيث تلتزم سطح النمو معاملة خاصة 1. عندما يتم المطلوب المزيد من الخلايا، لوحات أو قوارير يمكن توسيعها باستخدام أكثر أو أكبر السفن. ومع ذلك، لزراعة فعالة من حيث التكلفة أكثر من كميات كبيرة من الخلايا التابعة مرسى، زيادة مساحة السطح لمرفق الخلية ويمكن تحقيق ذلك باستخدام حبات صلبة صغيرة تسمى الناقلات الصغيرة. اعتمادا على خصائص مرفق الخلية، عدة أنواع مختلفة من الناقلات الصغيرة متوفرة تجاريا، مثل ديكستران، الببتيد، أو الكولاجين المغلفة. حاملات الصغيرة لديها مساحة كبيرة لنسبة حجم توفير مساحة أكبر لنمو الخلايا. وشركات الطيران الصغيرة يمكن الحفاظ في تعليق مع الانفعالات، مما يسمح للخلايا لزراعتها إلى كثافة عالية في أنظمة مفاعل حيوي 2. حاليا، وأنواع bioreactors حيث تزرع الخلايا الملتصقة على حاملات القوارير الصغيرة تشمل الدوار والنظم خزان أثار، والتي تستخدم الضواغط المحورية للحفاظ على تعليق الخلية المغلفة شركات الصغيرة.

عدة عوامل مهمة لنجاح زراعة الخلايا بما في ذلك التوتر الأكسجين، وإجهاد القص، مصفوفة السطح، والمواد الغذائية وتركيزات المستقلب. استخدام المفاعلات الحيوية يسمح للرصد في الوقت الحقيقي من ظروف النمو والقدرة على أقل بكثير من تكاليف الإنتاج 1. هناك العديد من التصاميم مفاعل حيوي مشترك لزراعة الخلايا في المختبر بما في ذلك، أثار تعليق، سفينة الدورية جدار، أجوف الألياف، حقيبة مفاعل حيوي على منصة الروك، وأنظمة قاعدة مميعة 3. العديد من هذه الأنظمة يمثل مشكلة فريدة من نوعها لزراعة الخلايا وتوسيع نطاق -حتى، مثل التكلفة العالية والتدرجات تركيز المغذيات، والقص الهيدروديناميكية، تجميع الخلايا، وصعوبة في أخذ العينات والرصد والسيطرة على سلل نطاق المتابعة.

وتستخدم العديد من خطوط الخلايا الملتصقة في إنتاج الفيروسات، سواء في إنتاج اللقاحات الفيروسية أو لإنتاج النواقل الفيروسية لتطبيقات العلاج الجيني. في هذا الفيديو، وذلك باستخدام استخدام هوائي واحد (الهواء بعجل) نظام مفاعل حيوي، ونحن لشرح ثقافة خلايا سرطان الرئة الإنسان (A549) الخلايا على ناقلات الدقيقة لإنتاج اتش حال الورم. تصميم مفاعل حيوي يستخدم هوائي عجلة التحريض العمودي الذي هو مدعوم من قبل الطفو من الغاز sparged في الجزء السفلي من مفاعل حيوي. يحد هذا الأسلوب التحريك لطيف قوى القص الهيدروديناميكية، ولكن لا يزال يضمن المتوسطة الأمثل وخلية خلط 4. بالمقارنة مع مفاعل أثار خزان، المفاعل هوائي لديه منخفضة التوتر جدار القص حتى مع أنظمة مفاعل حيوي الهواء عجلة كبيرة الحجم (الشكل 1). على النقيض من المفاعلات الحيوية خزان أثار، يتم تشغيل المكره العمودي هذا المفاعل استخدام مرة واحدة من قبل تيار من فقاعات الغاز داخلالسفينة، والذي يسمح لطيف وموحدة خلط المتوسطة (الشكل 2).

Protocol

1. الدخول

  1. السلطة حتى مفاعل حيوي. انقر في أي مكان لفتح صفحة تسجيل الدخول. حدد اسم المستخدم وإدخال كلمة السر وانقر على "تسجيل الدخول".

2. المعايرة

  1. معايرة جهاز استشعار درجة الحموضة (2 نقطة قبل التعقيم).
  2. تفقد استشعار درجة الحموضة وتأكيد يمتلئ استشعار طرف مع حل بالكهرباء. إعداد اثنين من الأكواب مع حلول الحموضة المعايرة (بالكهرباء) الرقم الهيدروجيني 4 و 7 درجة الحموضة ولها المتاحة زجاجة غسل بالماء المقطر.
  3. قم بتوصيل كابل الرقم الهيدروجيني للاستشعار درجة الحموضة. انتقل إلى "تطبيقات" علامة على واجهة مرحبا وانقر على "معايرة". أدخل درجة الحرارة عازلة في مجال معايرة درجة الحرارة الحل.
  4. وضع جهاز استشعار درجة الحموضة في المخزن 1 (الرقم الهيدروجيني 4) وأدخل القيمة في حقل "الصفر". انتظر الرسم البياني لتحقيق الاستقرار وانقر على زر "معايرة 1". شطف استشعار درجة الحموضة بالماء المقطر.
  5. مكان حساس في المخزن 2 (درجة الحموضة 7). أدخل عازلة2 القيمة في حقل "العمر". انتظر الرسم البياني لتحقيق الاستقرار وانقر زر معايرة 2.
  6. انقر على "حفظ" ثم انقر فوق "إغلاق".
  7. معايرة الأوكسجين المذاب (DO) الاستشعار.
  8. ضمان استشعار DO تم الاستقطاب من قبل أن يكون متصلا إلى النظام لعدة ساعات. انتقل إلى "تطبيقات" علامة على واجهة أهلا وانقر معايرة. انقر على "قيام" الزر.
  9. فصل استشعار DO وأدخل 0 في الميدان "الصفر". انتظر الرسم البياني لتحقيق الاستقرار وانقر على زر "معايرة 1".
  10. إعادة الاتصال أجهزة الاستشعار DO وأدخل 100 في حقل "سبان". انتظر الرسم البياني لتحقيق الاستقرار وانقر على زر "معايرة 2".
  11. انقر على "حفظ" ثم انقر فوق "إغلاق".

3. الأوتوكلاف وتركيب مجسات والسفن الكاشف

  1. بعد المعايرة، وأجهزة الاستشعار الحراري المكان وكذلك في autocالحقائب اغتسل والأوتوكلاف لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة 121 مئوية، و 15 رطل.
  2. تعقيم الحقائب الأوتوكلاف مع 70٪ الآيزوبروبيل الكحول (IPA) ونقل الحقائب إلى مجلس الوزراء السلامة البيولوجية (BSC). إزالة التغليف الخارجي للسفينة.
  3. تطهير التعبئة والتغليف الداخلي مع 70٪ IPA ونقل السفينة إلى مجلس الوزراء السلامة البيولوجية (BSC). إزالة التغليف الداخلي وتفتيش السفينة وأنابيب للالضرر أثناء الشحن.
  4. تثبيت أجهزة استشعار درجة الحموضة وDO في اثنين من الموانئ الأمامية. تثبيت البئر الحراري إلى ميناء الظهير الايسر. فتح الغطاء الاستشعار.
  5. توجيه استشعار عبر ميناء الاستشعار. كاتب استشعار بإحكام في منفذ.
  6. نقل السفينة من BSC.
  7. يتعطل DO والكابلات استشعار درجة الحموضة خارج الأكمام السفينة وتأكد من أن لا شيء في الأكمام. حرك سفينة في كم والقدمين أولا.
  8. تناسب بعناية استشعار درجة الحرارة في البئر الحراري السفينة. تأكد من أن الجزء السفلي من السفينة تقع ضد سخانات.
  9. إزالةيحدد أنابيب من حقائبهم. مباراة الترميز اللوني على أنابيب إلى الموصلات المناظرة ومضخات على وحدة التحكم مفاعل حيوي.
  10. تثبيت خط الغاز الرئيسي عن طريق الضغط على الرابط في منفذ الغاز. تثبيت خط الغاز الصغيرة قبل التواء في اتجاه عقارب الساعة موصل بمأخذ الغاز. تثبيت أنابيب العادم مرشح:
  11. فتح الفرن التصفية. تأمين مرشح العادم على U-قناة حتى يذهب أنابيب من خلال اثنين من السنانير إلى تصفية والخروج من الفرن.
  12. تثبيت الأنابيب بواسطة كيس المكثف في حامل الأنابيب. أغلق الباب.
  13. خطوط الطريق بالإضافة A و B، كلا الخطين وسائل الإعلام، والخط الحصاد وراء استشعار DO وعلى مقاعد البدلاء بجوار وحدة التحكم مفاعل حيوي.
  14. توصيل الكابلات إلى DO ودرجة الحموضة أجهزة الاستشعار.

4. إضافة المتوسطة ومتناهية حاملات

  1. انتقل إلى "إجراءات" علامة التبويب وانقر على "مراقبة مضخات" على واجهة الكمبيوتر.
  2. تشكيل steriلو اتصال بين خط غير المستخدمة بالإضافة المتوسط ​​(1 الفرقة البرتقالية) ومصدر زجاجة / كيس المتوسط ​​عن طريق لحام الأنابيب أو استخدام التجهيزات يور.
  3. انقر شريط التمرير لتشغيل المضخة وسائل الإعلام على. انقر شريط التمرير لتحويل وسائل الإعلام ضخ قبالة بعد إضافة مبلغ المطلوب من المتوسط.
  4. وضع حبات microcarrier في كا 2+، المغنيسيوم 2+ PBS مجانا لمدة 3 ساعة على RT.
  5. تغسل حبات عدة مرات مع الكالسيوم 2+، المغنيسيوم 2+ PBS الحرة.
  6. الأوتوكلاف لمدة 15 دقيقة عند 115 درجة مئوية، و 15 رطل.
    ملاحظة: إضافة 3 جرام / لتر (وزن جاف) في هذه التجربة.
  7. ضخ في ناقلات الصغيرة التي تم رطب، وغسلها وتعقيمها في مفاعل بنفس الطريقة تم إضافة المتوسطة في الخطوة 4.1.

5. موازنة ونقطة واحد لا معايرة

  1. تعيين وحدات التحكم في السيارات وأدخل setpoints المطلوب. هنا، استخدم الانفعال تعيين نقطة (SP) = 15 دورة في الدقيقة، درجة الحرارة SP = 37.0 درجة مئوية، ودرجة الحموضة = 7.2، DO = 100٪. انتظر عarameters للتوازن.
  2. تأكيد استشعار هو المستقطب بشكل كامل. تأكيد DO القيمة الحالية قد استقرت.
  3. انتقل إلى "تطبيقات" علامة التبويب وانقر على "معايرة". انقر على "قيام"، انقر فوق "نقطة واحدة".
  4. إدخال "100" في الميدان "سبان". انقر على زر "معايرة 1"، انقر فوق "حفظ" ثم انقر على "إغلاق":

6. بدء تشغيل

  1. انتقل إلى علامة التبويب إجراءات. انقر على "دفعة". استخدام لوحة المفاتيح التي تظهر على الشاشة أو لوحة مفاتيح خارجية لإدخال اسم الدفعة 16 حرفا أو أقل.
  2. انقر على زر لوحة المفاتيح التي تظهر على الشاشة في "إخفاء". انقر على "ابدأ دفعة" تأكيد بالنقر على "ابدأ" في تراكب.

7. تلقيح مع خلايا

  1. تشكيل اتصال العقيمة بين خط غير المستخدمة بالإضافة المتوسط ​​(1 الفرقة برتقالي) وزجاجة خلية / المصدر حقيبة بواسطة اللحامأنابيب أو باستخدام التجهيزات يور.
  2. تثبيت قسم السيليكون للأنابيب في مضخة وسائل الإعلام بحيث يشير السهم نحو الأنابيب بين المضخة والسفينة.
  3. تحقق أنابيب المشبك مفتوح ومغلق تشعبت المشبك الأنابيب لها. انقر شريط التمرير لتحويل مضخة وسائل الإعلام على وانقر على "إيقاف" بعد إضافة الخلايا.
  4. انتقل إلى "تطبيقات" علامة التبويب وانقر على "مضخات السيطرة".

8. أخذ العينات

  1. بعد بتلقيح وبالتواتر المطلوب لمراقبة الثقافة، واستخلاص عينة من الثقافة على النحو التالي:
  2. انتقل إلى "إجراءات" علامة التبويب وانقر على "اتخاذ عينة". وضع أنابيب أخذ العينات في مضخة أخذ العينات والتلاعب محبس أخذ العينات وفقا للتعليمات التي تظهر على الشاشة.
  3. أداء لا يقل عن الملاحظة المجهرية اليومية وعدد خلايا على هذه العينات.
  4. عندما وصلت كثافة الخلايا المطلوب، في هذا جبورصة عمان 1.2 × 10 6 خلية / مل، تصيب الخلايا مع إضافة اللقاح الفيروس.
  5. جو معقم و مطهر إضافة إلى اللقاح حقنة 20 مل، وتوصيل حقنة لأحد منافذ بالإضافة الغيار على المفاعل. إدخال اللقاح إلى المفاعل عن طريق الضغط على المكبس حقنة.
  6. تواصل أخذ العينات وتحليل الثقافة لاتش تركيز الجسيمات داخل الخلايا.

Representative Results

في الشكل 3، وترد المعلمات لبدء المدى مفاعل حيوي. ويظهر هذا الرقم على الشاشة قبل تعيين المعلمات من درجة الحرارة والأكسجين الذائب، ودرجة الحموضة والانفعالات. حالما يتم تعيين المعلمات، ويتم رصد مستمر على المدى المعلمات ويمكن إجراء تعديلات على الحفاظ على الشروط المطلوبة. البرنامج ينتج قراءات مستمرة تسمح لسهولة تحديد المشاكل. في هذه التجربة باستخدام 2.5 لتر من DMEM تحتوي على 10٪ FBS، 250 جزء في المليون من SAFC مكافحة رغوة C، 2 مم L-الجلوتامين و 3 غرام / لتر من الناقلات الصغيرة، واستقر النظام بحيث الأكسجين في المئة هو 50٪، و درجة الحرارة 37 درجة مئوية، ودرجة الحموضة 7.2. يتم تلقيح المفاعل مع خلايا A549 بتركيز 7 × 4 10 خلية / مل (أو 10 خلية / الجزئي الناقل). أسفرت المعلمات الذي تم اختياره لهذا المدى في معظم الخلايا التمسك شركات الطيران الصغيرة في غضون 2 ساعة (الشكل 4). بعد 12 ساعة، والخلايا هي الشياطينعلامات trating من تسطيح وتنتشر على سطح حاملة الصغيرة (الشكل 5). قبل 24 ساعة وناقلات الصغيرة نسبيا حتى يكون التوزيع من الخلايا، مع عدم وجود شركات الصغيرة دون الخلايا وعدم وجود كتل كبيرة من الخلايا على الناقلات الصغيرة (الشكل 6). نسبة صغيرة من الخلايا الناقل الاستعمار A549 هي 75٪ من 24 ساعة و 90٪ بعد ذلك (الشكل 7). واستمرت الخلايا لتنمو باطراد إلى ~ من 1 مليون خلية / مل بعد 48 ساعة (الشكل 8). بعد العدوى عن طريق جرعة من اتش حال الورم (2 × 10 8 virions / مل) في 50 ساعة، زادت الكثافة إلى 1.2 مليون خلية / مل ثم بدأت في الانخفاض مع تقدم العدوى التحللي. كان هناك ~ 10،000 التضخيم أضعاف من اللقاح الفيروسي.

في التجارب السابقة، وجدنا أن مراقبة وضبط تدفق الغاز أمر بالغ الأهمية لتعظيم نمو الخلية (بيانات غير منشورة). بسرعة خلايا المتزايد يمكن أن تستنفد نظام الأكسجين مع مستوى DO انخفض إلى الصفر. بينما استمرت الخلايا في النمو، كان بمعدل أبطأ بكثير. فمن الأهمية بمكان لرصد وضبط تدفق الأكسجين لتلبية مطالب الخلايا خلال مرحلة النمو لوغاريتمي. ويمكن تحليل كل تشغيل للنمو الأمثل وذلك بمقارنة الرقم الهيدروجيني، DO، ودرجة الحرارة مع تعداد خلايا اليومية.

الشكل 1
الرقم 1. ديناميات الموائع نظام مفاعل حيوي هوائي (PBS) مقارنة مع خزان مفاعل حيوي النمام قياس قوى القص في أحجام جدار المفاعل المختلفة.

الشكل 2
الشكل 2. الهوائية الهواء عجلة مفاعل المكره.

52008 / 52008fig3highres.jpg "/>
الرقم 3. الهوائية الهواء عجلة البرمجيات الشاشة لقطة من المعلمات لبدء تشغيل مفاعل حيوي.

الرقم 4
الرقم 4. مايكرو الناقل الاستعمار مع خلايا A549 2 ساعة آخر التلقيح. (متوسط ​​قطرها الصغير الناقل ~ 180 ميكرون.) الرجاء الضغط هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 5
الرقم 5. 12 ساعة بعد الشروع في الثقافة والخلايا A549 وربط، وتسطيح، وتنتشر على شركات الطيران الصغيرة.5highres.jpg "الهدف =" _ على بياض "> اضغط هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 6
الرقم 6. مايكرو حاملات المغلفة مع الخلايا بعد 24 ساعة في الثقافة. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 7
الرقم 7. نسبة صغيرة الناقل الاستعمار من قبل خلايا A549 بعد التلقيح.

الرقم 8
الرقم 8. عدد الخلايا A549 قابلة للحياة في الثقافة قبل وإصابة آخر مع adenovirعلينا ملاحظة أن الخطوة العدوى الفيروسية وقعت في 50 ساعة.

Discussion

هذا النظام مفاعل حيوي تستخدم مرة واحدة بسيطة نسبيا للاستخدام، ويقدم تحليلات في الوقت الحقيقي لرصد وتحليل المفاعل. وتناسب بشكل جيد للغاية للثقافة خلايا الثدييات والحشرات ذات الكثافة خلية تصل إلى أكثر من 30 مليون خلية / مل. بالإضافة إلى خلايا A549 وصفت في هذا التقرير 11، لقد نمت SF-9 خلايا الحشرات في مفاعل حيوي أيضا. اختلاط اللطيف تقدمها عجلة الهواء الهوائية يقلل من تلف الخلايا. عدة خطوات حاسمة عند إعداد هذا المفاعل. الأولى، معايرة درجة الحموضة والقيام مجسات مهمة لرصد الأمثل للثقافة وإضافة الكواشف لضبط درجة الحموضة أو الأكسجين في النظام. ثانيا، يجب أن تملأ الكاشف والبذور الزجاجات والمرفقات بالتركيبة المحرز في بيئة معقمة مثل BSC. مرة واحدة يتم نقل الزجاجات كاشف للخروج من بيئة معقمة، يجب أن يتم على الاتصالات إلى خطوط تغذية مفاعل حيوي مع الحرص على تجنب التلوث الميكروبي.

استخدام نظام مفاعل حيوي هوائي واحد لديه القدرة على تلبية العديد من البحوث والتطبيقات السريرية في مجالات biotherapeutics، واللقاحات، والخلايا الجذعية، والطب الشخصي 4. بالإضافة إلى ذلك، مرونة هذا النظام يسمح للدفعة، بنك الاحتياطي الفيدرالي دفعة، الإرواء، وترنسفكأيشن التطبيقات القائمة على مفاعل حيوي 5. أخيرا، تستخدم مرة واحدة أنظمة مفاعل حيوي المتاح لديها الهياجللمحاكمة لتلبية احتياجات الإنتاج الصناعي على نطاق واسع والتمسك مبادئ توجيهية وتوصيات الهيئات التنظيمية الوطنية والدولية 6-10.

Disclosures

الكتاب D. جيرو وY. Hashimura هم موظفون من برنامج تلفزيوني للتكنولوجيا الحيوية التي تنتج الكواشف والأدوات المستخدمة في هذه المقالة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PBS 3  PBS
Single Use Assembly PBS
Human Lung Carcinoma Cells (A549) ATCC CCL-185
DMEM High Glucose Medium
Fetal Bovine Serum
Trypsin EDTA, 0.25%
Cytodex 1 Microcarriers GE 3781
Antifoam C Sigma A8011

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Freshney, R. I. Culture of Animal Cells A Manual of Basic Techniques and Specialized Applications. 6th edition, John Wiley & Sons, Inc. Hoboken, NJ. (2010).
  2. Healthcare, G. E. Microcarrier Cell Culture Principles and Methods. GE Healthcare Data File 18-1140-62. (2005).
  3. Simaria, A. S., et al. Allogeneic cell therapy bioprocess economics and optimization Single-Use cell expansion Technologies. Biotechnol and Bioeng. 111, (1), 69-83 (2014).
  4. Lee, B., Fang, D., Croughan, M., Carrondo, M., Paik, S. -H. Characterization of novel pneumatic mixing for single-use bioreactor application. BMC Proc. 5, (S8), O12 (2011).
  5. Eibl, R., Eibl, D. Disposable bioreactors in cell culture-based upstream processing. BioProcess Int. 7, (S1), 18-23 (2009).
  6. Chaubard, J. F., et al. Disposable bioreactors for viral vaccine production challenges and opportunities. Biopharm Int Supp. (2010).
  7. Croughan, M. S., Hamel, J. F., Wang, D. I. C. Hydrodynamic Effects on Animal Cells Grown in Microcarrier Cultures. Biotechnol and Bioeng. 95, (2), 295-305 (2006).
  8. DePalma, A. Single-use Equipment on Cusp of Industrialization. Genet Eng Biotechnol News. 32, (1), (2012).
  9. Baltz, R. H., Demain, A. L., Davies, J. E. Manual of Industrial Microbiology and Biotechnology. 3rd ed, ASM Press. Washington, DC. (2010).
  10. Applied Technical Bioreactors, Seminole (FL), USA. http://www.infors-ht.com/index.php/en/products/bioreactors/bench-top-bioreactors/minifors (2012).
  11. Sousa, M. F., Giroux, D., Clemente, J., Lee, B., Carrondo, M. J., Alves, P. M. Impact of Bioreactor Design on the Performance of Microcarrier Cultures. 3rd ed, Abstract. Cell Culture Engineering XIII. Scottsdale, Arizona. (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics