培养哺乳动物细胞使用一次性使用气动生物反应器系统

Bioengineering
 

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Obom, K. M., Cummings, P. J., Ciafardoni, J. A., Hashimura, Y., Giroux, D. Cultivation of Mammalian Cells Using a Single-use Pneumatic Bioreactor System. J. Vis. Exp. (92), e52008, doi:10.3791/52008 (2014).

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Abstract

Introduction

哺乳动物细胞系,可分为基于它们的生长特性三类:细胞生长于悬浮液中的细胞生长为聚集体,以及细胞生长锚定到基底。虽然空气轮生物反应器中的该视频演示是能够生长的所有三种类型的细胞,该视频将演示用的生物反应器中生长贴壁依赖性细胞的微载体。锚地依赖性哺乳动物细胞能够生长的制造多细胞的目的 - 在细胞本身的产品。例如,人骨髓间充质干细胞,目前正在栽培的收获细胞,并注射到病变组织的目的。在此视频演示的气动生物反应器已被证明适用于生产诸如间充质干细胞的这种应用(塞拉等人 ,个人通信,2013)。

安克雷奇出发endent哺乳动物细胞通常生长小规模在2D培养容器中,如细 ​​胞培养板中,细胞培养瓶或滚瓶中,在那里它们粘附在经特殊处理的生长面1。当更多的单元被需要,该板或培养瓶可通过使用更多或更大的船只进行扩展。然而,对于更符合成本效益的栽培大量贴壁依赖性细胞,增加表面积为细胞附着可以通过使用小的固体颗粒称为微载体来实现。根据细胞的附着特性,有几种不同类型的微载体可商购的,如葡聚糖,肽或胶原包衣。微载体具有大的表面积与体积之比提供了更大的表面积用于细胞生长;和微载体可以保持在悬浮液中并搅拌,从而使这些细胞进行培养,以高密度,在生物反应器系统2。 biorea目前,该类型的其中贴壁细胞生长在微载体构建函数包括旋转烧瓶中,搅拌罐系统,其使用轴向叶轮保持悬浮液中的细胞涂布的微载体。

几种因素是很重要的成功培养细胞,包括氧张力,剪切应力,表面基质,和营养物和代谢物的浓度。利用生物反应器的允许生长的条件的实时监测和潜力显著降低生产成本1。有几个共同的生物反应器设计用于体外细胞培养,包括搅拌,旋转壁容器中,中空纤维,在摇杆平台袋生物反应器和流化床系统3。许多这些系统目前唯一的问题进行细胞培养和规模-up,如成本高,营养浓度梯度,流体剪切,细胞聚集,以及难以取样,监测和控制CEL升扩大规模。

各种粘附细胞系被用于生产病毒,要么在生产病毒疫苗或用于生产病毒载体用于基因治疗的应用。在这段视频中,采用一次性使用的气动(空气轮)生物反应器系统,我们证明人类肺癌细胞(A549)细胞在微载体生产的溶瘤腺病毒的培养。的气动生物反应器设计使用由气体喷入到反应器底部的浮力驱动的垂直搅拌轮。这种温和的搅拌方法限制流体剪切力,但仍保证了最佳培养基和细胞混合4。相比于搅拌槽反应器,该气动反应器具有低的壁剪切应力,即使以高音量气轮的生物反应器系统( 图1)。而相比之下,搅拌罐生物反应器,该单次使用的反应器的垂直叶轮由气泡内的流导容器,其允许平缓而均匀的介质中的混合( 图2)。

Protocol

1,登录

  1. 上电生物反应器。点击任何地方打开登录页面。选择用户名并输入密码,然后单击“登录”。

2,校准

  1. 校准pH传感器(2点前高压灭菌)。
  2. 检查pH传感器,并确认传感器尖端填充有电解质溶液。准备两个烧杯的pH标准溶液(电解液),pH值为4和7,并有可一洗瓶子蒸馏水。
  3. pH值电缆连接到pH传感器。导航到你好界面上的“操作”选项卡,然后点击“校准”。在校准溶液温度字段中输入缓冲区的温度。
  4. 放置在缓冲区1(pH值为4)pH传感器,并在“零”字段中输入值。等待图形稳定和点击“校准1”按钮。用蒸馏水冲洗水的pH值传感器。
  5. 在缓冲液代替传感器2(pH 7)中。输入缓冲器在“范围”字段2的值。等待图形稳定,并单击校准2按钮。
  6. 点击“保存”,然后单击“关闭”。
  7. 校准溶解氧(DO)的传感器。
  8. 确保在DO传感器已被偏振,通过连接到系统的数个小时。导航到你好界面上的“操作”选项卡,然后单击校准。点击“执行”按钮。
  9. 断开溶解氧传感器,并在“零”字段中输入0。等待图形稳定和点击“校准1”按钮。
  10. 重新连接溶解氧传感器,并在“跨度”字段中输入100。等待图形稳定和点击“校准2”按钮。
  11. 点击“保存”,然后单击“关闭”。

3,高压灭菌器,并安装传感器和试剂容器

  1. 校准,地点传感器和热井autoc后澡袋和高压锅30分钟,在121℃,15磅。
  2. 高压灭菌消毒袋,用70%异丙醇(IPA)和转移袋生物安全柜(BSC)。取出容器的外包装。
  3. 消毒包装内用70%IPA和血管转移到生物安全柜(BSC)。取出内包装和检查船舶和管道损坏在运输过程中造成的。
  4. 安装pH和DO在前面的两个端口传感器。安装热井的左后卫端口。打开传感器帽。
  5. 通过传感器端口引导传感器。紧紧地拧在传感器插入端口。
  6. 转船出平衡计分卡。
  7. 挂溶解氧和pH传感器电缆血管套管之外,并检查没有什么是中袖。容器先滑入袖子,脚上。
  8. 仔细适应温度传感器放入容器热井。确保该容器的底部靠在加热器。
  9. 删除从他们的行李中管套。匹配颜色编码的油管到相应的连接器和泵的生物反应器控制单元。
  10. 通过按压连接器插入其气体出口安装在主气体管线。通过连接器顺时针扭进气口安装了微型气行。安装排气过滤器管:
  11. 打开过滤器烤箱。固定在U型通道排气过滤器,它的管子穿过两个挂钩的过滤器,并出炉。
  12. 在管架安装管道通过冷凝器袋。关门。
  13. 路线除了线A和B,两种介质线,后面的溶解氧传感器,并到板凳收获行旁边的生物反应器控制单元。
  14. 将电缆连接到DO和pH传感器。

4,增加中型和微型载体

  1. 导航到“操作”选项卡,然后单击“控制泵”电脑接口上。
  2. 形成了免缝未使用的介质除了线(1橙带)和焊接管或使用鲁尔接头介质瓶/袋源之间的勒连接。
  3. 单击滑块以开启对媒体的泵。单击滑块打开媒体介质的另外所需的款额后泵。
  4. 放置微载体珠中 Ca 2 +,Mg 2 +的游离的PBS进行3小时,在室温。
  5. 珠洗几次钙离子 ,镁离子的PBS。
  6. 高压釜中进行15分钟,在115℃,15磅。
    注:加3克/升(干重)在该实验中。
  7. 泵在微载体已水合的,洗涤和灭菌成以相同的方式在介质中加入在步骤4.1反应器中。

5,平衡和单点做校准时

  1. 将控制器自动并输入所需的设定值。在这里,用搅拌设定值(SP)=每分钟15转,温度SP = 37.0℃,pH值= 7.2,DO = 100%。等待在parameters达到平衡。
  2. 确认传感器是完全两极化。确认DO的现值已趋于稳定。
  3. 导航到“操作”选项卡,然后点击“校准”。点击“执行”,然后单击“一个点”。
  4. 在“跨越”字段中输入“100”。点击“校准1”按钮,单击“保存”,然后单击“关闭”:

6,启动运行

  1. 导航到操作选项卡。单击“批量”。使用屏幕上的键盘或外接键盘来输入一个批次名称超过16个字符。
  2. 点击屏幕键盘上的“隐藏”按钮。点击“开始批量”通过在覆盖点击“开始”进行确认。

7,接种与细胞

  1. 形成焊接一个未使用的介质除了线(1橙带)之间的无菌连接和电池瓶/袋源管或使用鲁尔接头。
  2. 在介质的泵,以便向泵和容器之间的管箭头指向安装管子的硅氧烷部分。
  3. 检查管夹处于打开状态和它的支管夹闭合。单击滑块以打开媒体水泵,点击“关闭”添加单元格后。
  4. 导航到“操作”选项卡,然后单击“控制泵”。

8采样

  1. 接种和根据需要频繁的监测培养后,吸取从以下面的方式培养的样品:
  2. 导航到“操作”选项卡,并单击“取样品”。放置在采样泵,采样管,并按照屏幕上的说明操作采样活塞。
  3. 执行至少每天显微镜观察并计数这些样品。
  4. 当细胞达到所需的密度,在本C酶1.2×10 6个细胞/ ml,感染的细胞中加入了病毒接种物。
  5. 在无菌条件下加入接种物,以20ml的注射器,并且该注射器连接到反应器上的备用加成端口之一。通过按压注射器柱塞介绍接种到反应器中。
  6. 继续采样和文化分析的腺病毒的细胞内颗粒浓度。

Representative Results

图3中,示出的参数为在生物反应器运行的开始。该图中示出了之前设定温度,溶解氧,pH和搅动的参数屏幕。一旦参数被设定,运行参数被连续地监视和调整可以维持所要求的条件。该软件会产生一个连续的读数,可轻松识别问题。在用2.5升含10%FBS,250 ppm的SAFC防泡沫的C 2毫米长谷氨酰胺和3g / L的微载体的DMEM该实验中,该系统是稳定的,以便该百分数的氧为50%,则温度是37℃,pH为7.2。该反应器在7×10 4个细胞/ ml(或10个细胞/微载体)的浓度接种A549细胞。选择用于此运行的参数导致了大多数附着于微载体中的2小时( 图4)中的细胞。后12小时,细胞是魔平坦化并在微载体表面扩散( 图5)的trating迹象。通过24小时,微载体具有相对均匀分布的细胞,用无微载体不含有细胞和细胞对微载体的没有大的团块( 图6)。微载体定植的A549细胞的百分率是75%通过24小时和此后90%( 图7)。将细胞持续48小时( 图8)后,以几何级数增长至约1百万个细胞/毫升。感染溶瘤腺病毒(2×10 8的病毒颗粒/毫升),在50小时的剂量后,密度提高到1.2万个细胞/毫升,然后开始下降,随着裂解感染进展。有病毒接种〜10,000倍放大。

在以前的实验中,我们已经发现,监控和调整气体流量,以最大限度地提高细胞的生长(未发表数据)是至关重要的。快速生长的细胞会消耗氧气系统溶解氧水平下降到零。当细胞继续增长,这是在一个非常慢的速度。关键是监视并调节氧气流量,以满足在对数生长期的细胞的需求。每次运行可实现最佳生长,通过比较pH值,溶解氧,温度和每日细胞计数分析。

图1
气动生物反应器系统(PBS)与搅拌器式生物反应器测量壁面剪切力,在不同的反应器体积比较图1流体动力学

图2
图2:气动气轮器叶轮。

52008 / 52008fig3highres.jpg“/>
图3,气动砂轮航软件的屏幕截图参数来启动生物反应器的运行。

图4
图4微载体定植A549细胞2小时后接种。(平均微载体直径〜180微米)。 请点击这里查看该图的放大版本。

图5
图5 12小时的培养开始后,在A549细胞被附着,压扁,并扩展到微载体上。5highres.jpg“目标=”_ blank将“>请点击这里查看该图的放大版本。

图6
图6。微载体24小时培养后,涂上细胞。 请点击这里查看该图的放大版本。

图7
由A549细胞图7的百分比的微载体定植后接种。

图8
可行的A549细胞在培养前的数量和交感染adenovir图8。我们注意,在病毒感染的步骤发生在50小时。

Discussion

这种一次性使用的生物反应器系统是相对简单的使用,并提供实时分析的反应器监测和分析。这是非常适合以及哺乳动物和昆虫细胞培养与细胞密度达到30多万个细胞/ ml。除了​​A549细胞这个报告11中所述,我们已经发展SF-9昆虫细胞在生物反应器为好。由气动轮设置在温和混合减少细胞损伤。建立这个反应器时,有几个步骤是至关重​​要的。 pH值的第一,适当的校准和DO传感器是用于培养的最佳监测和加入试剂以调节pH或氧在该系统的重要。第二,试剂和种子的瓶子必须填写与鲁尔装在无菌的环境中进行,例如BSC。一旦试剂瓶被移出无菌环境中,连接到所述生物反应器进料管线必须作出谨慎,以避免微生物的污染。

单次使用的气动生物反应器系统有潜力满足众多的研究和生物治疗,疫苗等领域的临床应用中,干细胞,和个性化药物4。此外,该系统的灵活性,允许分批,补料,灌注,并根据转染生物反应器的应用5。最后,单次使用的一次性生物反应器系统具有POTENTiAl基合金,以满足大规模工业生产的需要,并坚持的指导方针以及国家和国际监管机构6-10建议。

Disclosures

著者D.吉鲁和Y桥村是PBS生物产生这篇文章中所使用的试剂和仪器的员工。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PBS 3  PBS
Single Use Assembly PBS
Human Lung Carcinoma Cells (A549) ATCC CCL-185
DMEM High Glucose Medium
Fetal Bovine Serum
Trypsin EDTA, 0.25%
Cytodex 1 Microcarriers GE 3781
Antifoam C Sigma A8011

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References

  1. Freshney, R. I. Culture of Animal Cells A Manual of Basic Techniques and Specialized Applications. 6th edition, John Wiley & Sons, Inc. Hoboken, NJ. (2010).
  2. Healthcare, G. E. Microcarrier Cell Culture Principles and Methods. GE Healthcare Data File 18-1140-62. (2005).
  3. Simaria, A. S., et al. Allogeneic cell therapy bioprocess economics and optimization Single-Use cell expansion Technologies. Biotechnol and Bioeng. 111, (1), 69-83 (2014).
  4. Lee, B., Fang, D., Croughan, M., Carrondo, M., Paik, S. -H. Characterization of novel pneumatic mixing for single-use bioreactor application. BMC Proc. 5, (S8), O12 (2011).
  5. Eibl, R., Eibl, D. Disposable bioreactors in cell culture-based upstream processing. BioProcess Int. 7, (S1), 18-23 (2009).
  6. Chaubard, J. F., et al. Disposable bioreactors for viral vaccine production challenges and opportunities. Biopharm Int Supp. (2010).
  7. Croughan, M. S., Hamel, J. F., Wang, D. I. C. Hydrodynamic Effects on Animal Cells Grown in Microcarrier Cultures. Biotechnol and Bioeng. 95, (2), 295-305 (2006).
  8. DePalma, A. Single-use Equipment on Cusp of Industrialization. Genet Eng Biotechnol News. 32, (1), (2012).
  9. Baltz, R. H., Demain, A. L., Davies, J. E. Manual of Industrial Microbiology and Biotechnology. 3rd ed, ASM Press. Washington, DC. (2010).
  10. Applied Technical Bioreactors, Seminole (FL), USA. http://www.infors-ht.com/index.php/en/products/bioreactors/bench-top-bioreactors/minifors (2012).
  11. Sousa, M. F., Giroux, D., Clemente, J., Lee, B., Carrondo, M. J., Alves, P. M. Impact of Bioreactor Design on the Performance of Microcarrier Cultures. 3rd ed, Abstract. Cell Culture Engineering XIII. Scottsdale, Arizona. (2012).

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