השרשה של הפיברין ג'ל על עכבר ריאות לחקר אנגיוגנזה ריאות ספציפית

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Mammoto, T., Mammoto, A. Implantation of Fibrin Gel on Mouse Lung to Study Lung-specific Angiogenesis. J. Vis. Exp. (94), e52012, doi:10.3791/52012 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

התקדמות משמעותית האחרונה בטכניקות מחקר בתאי גזע וביו-הנדסה עשו התקדמות גדולה בניצול ביו-חומרים להתחדש ולתקן את הנזק ברקמות פשוטות בתחומי האורתופדים וחניכיים. עם זאת, הניסיונות לחדש את המבנה ותפקוד של איברים מורכבים יותר תלת ממדי (3D) כגון ריאות לא היה מוצלח מאוד בגלל התהליכים הביולוגיים של התחדשות איבר לא נחקרו היטב. זה הופך להיות ברור שאנגיוגנזה, היווצרותם של כלי דם חדשים, ממלאת תפקידי מפתח בהתחדשות איבר. שהוקם זה עתה vasculatures לספק לא רק חמצן, חומרי מזון ומרכיבי תא שונים הנדרשים להתחדשות איבר אלא גם לספק אותות מאלפות לרקמות המקומיות ההתחדשות. לכן, כדי להתחדש בהצלחה ריאות במבוגרים, יש צורך לשחזר את microenvironments הריאות ספציפיות שבי אנגיוגנזה התחדשות של רקמות ריאה כוננים מקומיות. למרות שיתוףnventional in vivo מבחני אנגיוגנזה, כגון השתלה תת-עורית של מטריצה ​​תאית (ECM) -rich הידרוג (למשל, ג'לים הפיברין או קולגן או Matrigel - תערובת חלבוני ECM מופרש על ידי תאי סרקומה עכבר Engelbreth-הולם-נחיל), באופן נרחב מנוצל כדי לחקור את מנגנונים כלליים של אנגיוגנזה, אנגיוגנזה ריאות ספציפיות לא מאופיין היטב כי שיטות להשתלת orthotopic של ביו-חומרים בריאות לא היו מבוססות היטב. המטרה של פרוטוקול זה היא להציג את שיטה ייחודית להשתלת ג'ל הפיברין על פני השטח הריאות של עכבר בוגר חיים, המאפשרת לסיכום המוצלח של אנגיוגנזה-נגזר ריאות המארח בתוך הג'ל. גישה זו מאפשרת לחוקרים לחקור את המנגנונים שבאמצעותם מייקרו-סביבת הריאות ספציפיות שולט אנגיוגנזה והתחדשות alveolar בשני תנאים נורמלים ופתולוגיים. מאז שחרור ביו-חומרים מושתלים ולספק אותות פיסיקליים וכימיים לl הסמוךרקמות ung, השתלה של ביו-חומרים אלה על ריאות חולות עלולה לנרמל את הרקמות חולות הסמוכות, המאפשרות לחוקרים לפתח גישות טיפוליות חדשות לסוגים שונים של מחלות ריאה.

Introduction

המטרה הכללית של פרוטוקול זה היא להציג את השיטה להשתיל ג'ל הפיברין על פני השטח הריאות של עכבר בוגר, המאפשר לחוקרים לאפיין את המנגנונים המולקולריים של כלי דם ריאה ופיתוח alveolar, ולמנף את הידע הזה כדי לפתח חומרי biomimetic מסוגל של כלי דם ריאה משחזר פיסיולוגיים והיווצרות מכתשי לטיפול במחלות ריאה שונות.

יותר מ -35 מיליון אמריקאים סובלים ממחלות ריאה כרוניות, כוללים מחלת ריאות חסימתית כרונית ופיברוזיס ריאתי. חולים אלה סימפטומים לטווח ארוך כרוניים בדרכי הנשימה כגון קוצר נשימה, לחץ בחזה, שיעול טורדני, ועייפות, שפוגעים בחיי היום היום שלהם 1-3 באופן משמעותי. למרות כמות גדולה של מאמץ לפתח טיפולים יעילים למחלות ריאה אלה, כיום אין תרופה; לכן, איכות חיים של חולים אלה היא עניה וכלכלי ועלויות אנושיות הייGH 4-7. נכון לעכשיו, השתלת ריאות היא הדרך היחידה להציל את החולים עם מחלות ריאה כרונית סופנית. עם זאת, בגלל המחסור בתורמים להשתלה, עלות גבוהה, סיבוכים חמורים, ושיעור הישרדות נמוך 8-11, השתלה היא לא גישה אופטימלית. התקדמות מהירה בטכניקות האחרונות הנדסת רקמות אפשרה לחוקרים bioengineer ריאות מושתלים על ידי אכלוס מחדש כל ריאות decellularized עם סוגים שונים של תאים או תאי גזע pluripotent מושרה (iPS) 12,13. עם זאת, ריאות bioengineered אלה הן פונקציונליות בבעלי החיים מארח רק לכמה שעות לאחר 12,14,15 השתלה. גם ניצול ביו-חומרים להתחדש מבנים ופונקציות המורכבים של ריאות היה די מוצלח. זה יכול להיות בגלל תהליכים ביולוגיים מרכזיים ששולטים בהתחדשות ריאות מבוגרים לא נחקרו היטב. בריאות, היווצרות של מערכת כלי הדם היא אחד מהאירועים המוקדמים והחשובים ביותר duriפיתוח ng והתחדשות 16-21. שהוקם זה עתה בvasculatures הריאות לא גם לספק רק חמצן, חומרי מזון ומרכיבי תא שונים הנדרשים להיווצרות איברים, אלא לספק אותות רגולציה מאלפות לתאים המקיפים 22-25. לפיכך, אנגיוגנזה משחקת תפקידי מפתח בalveolarization משובי בריאות מבוגרים 24,26,27. בנוסף, אנגיוגנזה deregulated תורמת למחלות ריאה כרוניות כגון מחלת ריאות חסימתית כרונית (COPD) 28, דיספלזיה bronchopulmonary (BPD) 21-23, ופיברוזיס ריאתי 29. לכן, כדי לפתח אסטרטגיות יעילים יותר להנדסת ריאות או טיפול במחלות ריאה כרוניות, יש צורך להבין את המנגנונים הבסיסיים של אנגיוגנזה ריאות ספציפיות.

כל איבר מציג תכונות מכאניות וכימיות ייחודיות, אשר עשוי להיות שונה בין תנאים פיסיולוגיים ופתולוגיים 30-33. microenviron איבר ספציפי אלהמפעלים לווסת התנהגויות תא האנדותל ולתזמר יצירת רשת כלי דם באופן ספציפי לאיבר 24,34-36. לכן, כדי לפתח אסטרטגיות יעילים יותר להתחדשות ריאות, המנגנון שבבסיס אנגיוגנזה ריאות ספציפיות צריך להיות מובן. בעוד מבחני אנגיוגנזה קונבנציונליים in vivo כגון השתלה תת עורית הידרוג'ל נעשו שימוש נרחב למחקר אנגיוגנזה 37-39, שיטות אלה לא לשחזר אנגיוגנזה איבר ספציפי. לאחרונה, שיטה חדשנית להשתלת Matrigel בעובש אלסטי על ריאות העכבר פותחה והוצגה בהצלחה לגייס כלי דם ותאי האפיתל ריאות לג'לים 22. גישה ייחודית זו תאפשר לחוקרים לחקור את המנגנון של אנגיוגנזה ריאות ספציפיות, כמו גם יחסי גומלין בין כלי דם ותאי ריאה שאינם כלי דם בתנאים פיסיולוגיים ופתולוגיים. מאז 1) Matrigel אינו מתאים ליישום קליני; 2) הדוארעובש lastic משמש כדי להפיל את ג'ל עשוי להשפיע על יחסי גומלין בין הידרוג ורקמת ריאה מארח ו -3) עובש אלסטי על הריאות שעלול להיות גורם פגיעה בתפקוד ריאות וכאב בזמן הנשימה, כגישה רלוונטית יותר מבחינה קלינית, מטריצת הפיברין 3D המכיל גורמי angiogenic (פקטור גדילה של אנדותל כלי דם (VEGF) / גורם גדילה פיברובלסטים בסיסי (bFGF)) כבר מושתל על ריאות העכבר ללא יציקה בתבנית הגמישה, וסכם אנגיוגנזה המופקת ריאות מארח בהצלחה. ג'ל ליפין, סיבי פולימר שנוצרו מפיברינוגן-ביקע תרומבין, ידוע למלכודת מגוון גורמי angiogenic כגון bFGF וVEGF להאיץ אנגיוגנזה in vivo 40,41. בשל יכולת ההתחדשות שלו והטבע מתכלה 42, ג'ל הפיברין נעשה שימוש נרחב בתחום הנדסת רקמות.

מאמר זה מציג רומן וגישה ייחודית להשתלת ג'ל הפיברין על פני השטח הריאות של adul חייםעכבר ולא מוכיח כי אנגיוגנזה המופקת ריאות המארח סכמה בתוך ג'לי in vivo. שיטה זו, המאפשרת לחוקרים ללמוד אנגיוגנזה ריאות ספציפיות, צפויה להוביל לפיתוח גישות טיפוליות חדשות לסוגים שונים של מחלות ריאה ולקדם באופן משמעותי את המאמצים לחדש ריאות מבוגרים בהצלחה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הערה: in vivo המחקר בבעלי החיים בוצע בהתאם קפדן עם ההמלצות במדריך לטיפול והשימוש בחי מעבדה של המכון הלאומי לבריאות. הפרוטוקול נבדק ואושר על ידי ועדת הטיפול בבעלי חיים ושימוש בבית החולים לילדים בבוסטון (במדבר פרוטוקול: 13-10-2526R, 14-02-2568R). כל התרופות המשמשות בפרוטוקול זה הן תרופות כיתה ותרופות אלה ערוכות בתנאים סטריליים.

1. הפיברין ג'ל הכנה

  1. הכן ג'ל הפיברין המכיל VEGF וbFGF.
    1. פתרונות הפשרת מניות של פיברינוגן ותרומבין המאוחסנים ב -80 ° C לטמפרטורת חדר (25 מעלות צלזיוס).
    2. להוסיף תרומבין (ריכוז סופי: 2.5 U / ml), CaCl 2 (ריכוז סופי: 45 מ"מ), VEGF (ריכוז סופי: 0-100 ng / ml) וbFGF (ריכוז סופי: 0-100 ng / ml) לפיברינוגן פתרון (ריכוז סופי: 12.5 מ"ג / מיליליטר בsodiu 0.9%מ 'פתרון כלוריד 43-45) בצינור 1.5 מיליליטר.
    3. מערבבים בעדינות על ידי pipetting.
    4. בעדינות פיפטה 200 μl של התערובת על צלחת פלסטיק סטרילי בצורה טיפה חכמה באמצעות קצה פיפטה p200.
    5. דגירה הטיפות על 37 מעלות צלזיוס במשך 30-60 דקות, עד שהם לחזק.
      הערה: ג'ל הקרושה יכול להיות כל הזמן בצלחת הפלסטיק האטום בטמפרטורת חדר (25 מעלות צלזיוס) במשך כמה שעות לפני ההשתלה (איור 1 א).
  2. חתוך את הג'ל הפיברין לקוביות מ"מ כ 3 x 3 x 3 באמצעות מספריים כירורגיות קטנים לפני ההשתלה.

2. עכבר הכנה

  1. הרדימי עכבר בוגר (8-12 שבועות) על ידי הזרקת intraperitoneal (IP) של קטמין (100 מ"ג / קילוגרם) ו xylazine (10 מ"ג / קילוגרם) ולאשר כי העכבר הוא מורדם כראוי על ידי צביטת הבוהן של העכבר.
    1. השתמש במשחת וטרינר בעיניים של העכבר כדי למנוע יובש במהלך הניסוי.
  2. פו גילוחr על הצד השמאלי של בית החזה של העכבר.
  3. לבצע אינטובציה endotracheal של העכבר.
  4. הנח את העכבר על אינטובציה לעמוד בזווית ב 70 מעלות ומחזיקים את העכבר במקום ידי משדלת החותכות העליונות שלה מעל גומייה קטנה הממוקמת בחלק העליון של הדוכן.
  5. בעדינות לחזור בו מהלשון לצד אחד באמצעות מלקחיים בוטים.
  6. דמיין את הגרון בעזרת פנס מיקרוסקופ מתכווננת סיבים אופטיים.
  7. הכנס קטטר endotracheal אלסטי (21 G) לקנה הנשימה.
  8. ודא שהעכבר הוא נושם באופן ספונטני בצורה חלקה (100-150 נשימות / דקה רגילה, אין נשימה פרדוכסלית או רדודה).
  9. מניחים את העכבר במצב שכיבה תחת מיקרוסקופ לנתיחה.
  10. מכאני לאוורר את העכבר באמצעות מכונת נשמה מכרסם (150 נשימות / דקה ו -7 מיליליטר / קילוגרם נפח של גאות ושפל).
  11. רוזן צלעות לאתר שטח צלע בין 4 th ו -5 ריב ה.
  12. יצירת שדה סטרילי מעל האזור בy נגב ביסודיות עם אלכוהול וPovidone-יוד. לכסות את שדה הניתוח כראוי עם לעטוף כירורגית סטרילית.

3. ניתוח עכבר

  1. לאחר הזרקה מקומית של bupivacaine 0.25% (200 μl) בעור, לעשות חתך בעור רוחבי (כ אורך 1 סנטימטר) על מרחב הצלע באמצעות מספריים לנתח.
  2. לאחר ההזרקה של bupivacaine 0.25% (200 μl) לתוך שריר הצלע, לעשות חתך שריר בין צלעות 4 th ו-5 באמצעות מספריים קטנים בסדר.
  3. הכנס מפשק לנתח בין הצלעות כדי להמחיש את הריאה השמאלית באופן מלא.
    1. לגרד שטח קטן (ריבוע 1 x 1 מ"מ) של הצדר הקרביים של מרכז הריאה השמאלית באמצעות מלקחיים בסדר.
    2. להפעיל לחץ עדין על האזור באמצעות מקלון צמר גפן סטרילי עד דליפות דימום והאוויר נשלטות לחלוטין.
    3. שים כמות קטנה של תערובת טריות של פיברינוגן / תרומבין (דבק הפיברין) (שלב 1.1.2. & # 20181; יב) על האזור באמצעות קצה פיפטה p200.
  4. מניח בעדינות ג'ל הפיברין אחד (שלב 1.2) באמצעות מלקחיים קטנים מעל האזור (איור 1).
    1. ודא שג'ל קבוע גם באזור במהלך תנועות נשימה של הריאות.
  5. ודא שאין לא דולף אוויר מאסיבי ולא דימום מהריאות.
  6. חתכים סגורים (שכבות שרירים ועור) עם תפר נספג, שאינו צריכים להסיר.
  7. לשאוב את חלל בית החזה באמצעות מחט 27 G ומזרק 1 מיליליטר כדי למנוע pneumothorax.
  8. לסיים אוורור מכאני.

שחזור עכבר 4.

  1. ודא שהעכבר הוא נושם באופן ספונטני בצורה חלקה (100-150 נשימות / דקה רגילה, אין נשימה פרדוכסלית או רדודה).
  2. IP להזריק 1 מיליליטר של טרום חימם 0.9% NaCl על מנת למנוע התייבשות.
  3. לאפשר עכבר כדי להתאושש על כרית מים החמה במחזור.
  4. הסר את endotracheצינור אל לאחר אישור שיש לו את העכבר נשימה יציבה.
  5. הזרק Meloxicam (5 מ"ג / קילוגרם, הזרקה תת עורית (SC), במשך 3 ימים כמשכך כאבים שלאחר ניתוח.
  6. לפקח על התנועות של העכבר בזהירות במינימום של 15 דקות במרווחים עד שהוא sternal (הצליח לגלגל על ​​הבטן שלה ולהישאר זקוף) ומודע.
  7. לאחר התאוששות, להחזיר את העכבר לכלוב חדש מבודד מעכברים ללא ניתוח.
  8. לפקח על האתר כירורגית לסימני זיהום (אדמומיות, נפיחות, הפרשות), פונקציות הביולוגיות הבסיסיות של בעלי החיים (צריכת מזון ומים, הטלת שתן, עשיית הצרכים, עלייה במשקל גוף), כמו גם סימנים קליניים של מצוקה (piloerection, תנועה מופחתת) יומי הבאים הליך כירורגי.

5. קציר הריאות

  1. 7-30 ימים לאחר ההשתלה, להרדים את העכבר באמצעות CO 2 דרך המקור של גז דחוס.
  2. עושה חתך בין הקצה של תהליך xyphoid וsternalחריץ (sternotomy חציון) וכל ריאות קציר עם ג'ל המושתל לניתוח היסטולוגית וביוכימיים על ידי חיתוך קנה הנשימה ולנתח את כל החיבורים ללב, הריאות, ואת קנה הנשימה.
  3. תקן ג'ל המושתל עם ריאות עם 4% פתרון paraformaldehyde הלילה ב 4 מעלות צלזיוס, להטביע במתחם אוקטובר, ולקחת את חלקי צעד סידוריים של 30 מיקרומטר עובי.
  4. בצע היסטולוגית (hematoxylin והכתים eosin) וניתוחי immunohistochemical (סמן אנדותל: CD31, סמן אפיתל: aquaporin (AQP) 5 ופעיל שטח חלבון (-B) SP) באמצעות מיקרוסקופ confocal 22,37,40.
  5. לקמפל ערימות של חלקים אופטיים (30 מיקרומטר עבים) כדי ליצור תמונות תלת-ממדיות של אנדותל ריאות ותאי האפיתל באמצעות תוכנת ניתוח תמונת 3D 37.
  6. לכמת אזורים צפויים של כלי דם חדש שנוצרו באמצעות תוכנת ניתוח תמונה 46.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

כדי לבחון האם היווצרות כלי דם המופק מריאת המארח סכמה בתוך ביו-החומרים מושתלים על הריאות, ג'לים הפיברין בתוספת VEGF הגדול angiogenic גורמים וbFGF (0, 10 ו -100 ng / ml כל אחד) היו מושתלים על פני השטח של ריאות עכבר חיים כ דיווח על שימוש ב-22 Matrigel. ג'לים הפיברין 47 המכילים גורמי גדילת angiogenic אלה היו מפוברקים כפי שמוצגים באיור 1 א. לאחר פתיחת בית החזה, באזור קטן של פני השטח הריאה השמאלי גרד באמצעות מלקחיים וג'ל הפיברין המפוברק הושתל על הריאות של העכבר הבוגר תוך שימוש בכמות קטנה של דבק הפיברין, שהוא ה- FDA אישר שימוש נרחב כחומר איטום אפקטיבי להפסקת הדלפות ואוויר להפחית את הדימום בניתוח ריאות 48,49 (איור 1). רוב העכברים התאוששו ללא תסמינים חמורים בדרכי הנשימה (למשל, pneumothorax, מצוקה נשימתית). שבעה ימים לאחר ההשתלה, עכברים מורדמים וריאות היו הארוויsted. ג'ל הפיברין מושתל שולב ריאות מארח 7 ימים לאחר ההשתלה (איור 1 ג '). שחזור 3D של תמונות הקרינה confocal הראה כי תאי שמקורם מארח CD31 החיובי אנדותל יצרו רשתות כלי דם בתוך ג'לי 7 ימים לאחר ההשתלה בVEGF / דרך תלוית מינון bFGF (איור 2 א, ג). אני תאי סוג (AQP5 החיובי) והסוג השני (SP-B חיובי) ריאה אפיתל גם גויסו לאורך כלי דם חדש שנוצרו בתוך ג'לי שנוספו עם ריכוזים גבוהים יותר של VEGF וbFGF (כל 100 ng / ml) (איור 2 א) . צביעת H & E של סעיפים היסטולוגית גילתה כי סוגים אחרים של תאי מארח גם היגרו ל- 7 הימים ג'ל לאחר ההשתלה (איור 2b). ממצאים אלה מצביעים על כך שרשתות כלי דם משובי המופק מריאת מארח בנויות בהצלחה בתוך ג'לי הפיברין שהם השלימו עם גורמי angiogenic ומושתל על פני השטח של mou הבוגרse ריאות.

איור 1
איור 1:. (א) ג'ל פיברין הכין לפני ההשתלה (ב) ג'ל פיברין מושתל על הצדר הקרביים המגורד של הריאה השמאלית (ראשי חץ) (ג) מושתל ג'ל הפיברין (ראשי חץ) שולב ריאות מארח 7 ימים לאחר ההשתלה.. ברים בקנה מידה של 1 מ"מ.

איור 2
איור 2: (א) micrographs הקרינה מראה היווצרות של רשתות כלי דם (חיובי CD31; ירוק) וסוג גייסתי (AQP5 חיובית; מג'נטה) או סוג II (SP-B חיובי; מג'נטה) תאי האפיתל ריאות בתוך הג'ל הפיברין בתוספת ריכוזים שונים של VEGF וbFGF (0, 10 ו -100 ng / ml כל אחד) 7 ​​ימים לאחר ההשתלה. קווים מקווקווים מציינים את הממשק בין ג'ל הפיברין מושתל ריאות ומארח. בר סולם:. 20 מיקרומטר (ב) מיקרוסקופ אור של צביעת H & E מראה חדירה של תאי מארח לתוך הג'ל הפיברין 7 ימים לאחר ההשתלה. חצים מצביעים על הממשק בין ג'ל וריאות מארח. בר סולם: 20 מיקרומטר גרף (ג) מראה אזורים צפויים של כלי דם חדש שנוצרו בג'לים הפיברין שהם השלימו עם ריכוזים שונים של VEGF וbFGF (0, 10 ו -100 ng / ml כל אחד) 7 ימים לאחר ההשתלה..

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

מאמר זה מציג שיטה חדשה להשתלה בביו-חומרים על פני השטח הריאות של חיים עכבר בוגר. עם מערכת זו, אנגיוגנזה נגזרת-ריאה המארח סכמה בהצלחה בתוך החומר. מערכת זו מאפשרת לחוקרים לחקור crosstalk בין תאי אנדותל, תאים אחרים (לדוגמא, תאי אפיתל, תאי mesenchymal, תאי מערכת חיסון) ורכיבי ECM שונים הנדרשים לאנגיוגנזה המקומית 50-53 והתחדשות alveolar 24,54. למרות שההשתלה תת עורית הידרוג'ל הקונבנציונלית in vivo כבר בשימוש נרחב למחקר אנגיוגנזה 37-39, שיטות אלה לא לשחזר אנגיוגנזה איבר ספציפי. מערכת זו, שבה הידרוג'ל מושתל ישירות על פני השטח הריאה, תאפשר לחוקרים לחקור את התפקידים של מייקרו-סביבת הריאות ספציפיות באנגיוגנזה והתחדשות alveolar בריאות עכבר בוגרות. יכול להיות מפוברק ג'לי אלה מbiomate ECM-עשיר השוניםריאל (למשל, collagens, fibrins) שניתן להשלים עם גורמים שונים כימיים (למשל גורמים, angiogenic, גורמי גדילה) 55,56, ותאים ו / או תאי iPS. בנוסף לגורמים כימיים, כוחות מכאניים גם לשלוט אנגיוגנזה 23,37. הנוקשות של שינויי ג'ל הפיברין באופן פיברינוגן ריכוז תלוי 57 ומניפולציה של ריכוז פיברינוגן עשוי להשפיע אנגיוגנזה לא רק באמצעות אותות כימיים אלא גם באמצעות רמזים פיזיים 58,59. לכן, מאפייני physicochemical של ג'לים הפיברין ייתכן שיצטרכו להיות מותאמים בקפידה לשחזר אנגיוגנזה איבר ספציפי פיזיולוגית בעתיד. ריפוי פצעים לאחר גירוד הצדר הקרביים גם מייצר קריש הפיברין אנדוגני, הכולל סוגים שונים של תאי מארח ומקדם את תהליך הריפוי והתחדשות רקמות. קריש טבעי זה עלול ליצור אינטראקציה עם ג'ל הפיברין המושתל אקסוגני, ומכאן לשלוט angioבראשית בג'ל המושתל. Fluorescently פיברינוגן שכותרתו עשוי לאפשר לחוקרים להבחין בין קריש הפיברין הטבעי וג'ל הפיברין המושתל ולחקור מנגנונים אלה. למרות זאת הוא שיטה חזקה לאפיין אנגיוגנזה בריאות עכבר בוגרות, יישום לחקר התפתחות ריאות ומחלות בעכברים בילוד היית אתגרים טכניים סביר הווה.

המטרה הסופית של מחקר זה היא לגייס כלי דם פונקציונליים לג'לים הפיברין מושתל על ריאות חולות ולהשתמש במטריצה ​​כמכשיר רפואי כדי לשחזר מבני ריאה פונקציונליים. תקשורת אפשרית בין תאי מארח וכלי הדם ומבני alveolar בתוך ג'לי, כמו גם הפונקציונליות של מבנים אלה יש לבחון בניסויים עתידיים. מאז רמות VEGF בריאות ירד בחולים עם הפרעת אישיות גבולית 60 ונפחת 61, הוספת VEGF למטריצה ​​עשויה לשפר את הגיוס של כלי דם לתוך impl המטריצהanted על ריאות החולות אלה. תכונות מכאניות שונות גם בין ריאות בריאים וחולה 23,62. לדוגמא, ביטוי של metalloproteinases המטריצה ​​ומונואמין lysyl, השולט השפלה וcrosslinking של collagens, בהתאמה, הם שינו במחלות ריאה שונות, כולל COPD ופיברוזיס ריאתי 63-67. בריאות חולות, שושלות מסוימות של אבות לאנדותל ריאות ותאי האפיתל מתרוקנים 68. לפיכך, המניפולציה גורמים אלה (גורמי angiogenic, ECMS, ECM נוקשות) או השתלת ג'לי הפיברין בתוספת תאי אב 69 צפוי להוביל להיווצרות של כלי דם פונקציונליים בתוך המטריצה ​​וההתאוששות של תפקוד ריאות במצבים פתולוגיים שונים. מאז ניתן להשלים גורמים כימיים בתוך ג'לי הפיברין לווסת אנגיוגנזה המקומית, מערכת זו יכולה גם להיות מנוצלת לחקור רמזים סביבתיים ספציפיים שעשויות לנרמל ריאות חולות במחלות ריאה כרוניות. לסיכום, מאמר זה מציג שיטה להשתלת הידרוג'ל הפיברין על פני השטח הריאות של עכבר חי, המאפשר לחוקרים לאפיין אנגיוגנזה ריאות ספציפיות in vivo. שינוי של גורמים שונים (לדוגמא, במהלך זמן, ריכוזים ושילובים של גורמי angiogenic, סוגים שונים של הידרוג'ל, מאפייני physicochemical של הידרוג'ל) במערכת זו, יחשוף את המנגנונים של אנגיוגנזה והתחדשות בריאות. כך, מערכת זו באופן משמעותי לקדם ביולוגיה של כלי דם בסיסית, הנדסת רקמות ידע מדעי, כמו גם רפואת ריאות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי קרנות מאיגוד לב אמריקאי (בבוקר), משרד הגנה האמריקאי (BC074986), ובית החולים הפקולטה פיתוח הקריירה המלגה לילדים בבוסטון (TM, בבוקר). המחברים מודים אמנדה ג'יאנג ואליזבת ג'יאנג לקבלת סיוע טכני.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fibrinogen from human placenta Sigma F4883 For fabrication of fibrin gel
Thrombin from bovine plasma Sigma T9549 For fabrication of fibrin gel
Recombinant mouse VEGF 164 R&D 493-MV For supplementation to fibrin gel
Recombinant mouse bFGF R&D 3139-FB For supplementation to fibrin gel
Rodent Intubation Stand Braintree Scientific INC RIS 100 For intubation
Fiber-Optic Light Source Fisher Scientific 12-565-35 For intubation
21 G Elastic catheter B.Braun 4251652-02 For intubation
MiniVent Ventilator Harvard Apparatus CGS-8009 For ventilation
Stemi DV4 Steromicroscope Fisher Scientific 12-070-515 For surgey
Absobable suture Ethicon PDP304 Surgical suture
Antibody against CD31 BD Biosciences 553370 Immunohistochemistry
Antibody against AQP5 Abcam AB78486 Immunohistochemistry
Antibody against SP-B Abcam AB40876 Immunohistochemistry

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Donaldson, G. C., Seemungal, T. A., Bhowmik, A., Wedzicha, J. A. Relationship between exacerbation frequency and lung function decline in chronic obstructive pulmonary disease. Thorax. 57, 847-852 (2002).
  2. Lopez-Campos, J. L., Calero, C., Quintana-Gallego, E. Symptom variability in COPD: a narrative review. Int J Chron Obstruct Pulmon Dis. 8, 231-238 (2013).
  3. Ley, B., Collard, H. R., King, T. E. Clinical course and prediction of survival in idiopathic pulmonary fibrosis. Am J Respir Crit Care Med. 183, 431-440 (2011).
  4. Ferrer, M., et al. Chronic obstructive pulmonary disease stage and health-related quality of life. The Quality of Life of Chronic Obstructive Pulmonary Disease Study Group. Ann Intern Med. 127, 1072-1079 (1997).
  5. Reardon, J. Z., Lareau, S. C., ZuWallack, R. Functional status and quality of life in chronic obstructive pulmonary disease. Am J Med. 119, 32-37 (2006).
  6. De Vries, J., Kessels, B. L., Drent, M. Quality of life of idiopathic pulmonary fibrosis patients. Eur Respir J. 17, 954-961 (2001).
  7. Sullivan, S. D., Ramsey, S. D., Lee, T. A. The economic burden of COPD. Chest. 117, 5S-9S (2000).
  8. Orens, J. B., Garrity, E. R. General overview of lung transplantation and review of organ allocation. Proc Am Thorac Soc. 6, 13-19 (2009).
  9. Benden, C. Specific aspects of children and adolescents undergoing lung transplantation. Curr Opin Organ Transplant. 17, 509-514 (2012).
  10. Lyu, D. M., Zamora, M. R. Medical complications of lung transplantation. Proc Am Thorac Soc. 6, 101-107 (2009).
  11. Trulock, E. P., et al. Registry of the International Society for Heart and Lung Transplantation: twenty-fourth official adult lung and heart-lung transplantation report-2007. J Heart Lung Transplant. 26, 782-795 (2007).
  12. Weiss, D. J. Current status of stem cells and regenerative medicine in lung biology and diseases. Stem Cells. 32, 16-25 (2013).
  13. Ghaedi, M., et al. Human iPS cell-derived alveolar epithelium repopulates lung extracellular matrix. J Clin Invest. 123, 4950-4962 (2013).
  14. Ott, H. C., et al. Regeneration and orthotopic transplantation of a bioartificial lung. Nat Med. 16, 927-933 (2010).
  15. Petersen, T. H., et al. Tissue-engineered lungs for in vivo implantation. Science. 329, 538-541 (2010).
  16. Tuyl, M., et al. Angiogenic factors stimulate tubular branching morphogenesis of sonic hedgehog-deficient lungs. Dev Biol. 303, 514-526 (2007).
  17. Galambos, C., deMello, D. E. Molecular mechanisms of pulmonary vascular development. Pediatr Dev Pathol. 10, 1-17 (2007).
  18. McGrath-Morrow, S. A., et al. Vascular endothelial growth factor receptor 2 blockade disrupts postnatal lung development. Am J Respir Cell Mol Biol. 32, 420-427 (2005).
  19. White, A. C., Lavine, K. J., Ornitz, D. M. FGF9 and SHH regulate mesenchymal Vegfa expression and development of the pulmonary capillary network. Development. 134, 3743-3752 (2007).
  20. Zhao, L., Wang, K., Ferrara, N., Vu, T. H. Vascular endothelial growth factor co-ordinates proper development of lung epithelium and vasculature. Mech Dev. 122, 877-886 (2005).
  21. Stenmark, K. R., Abman, S. H. Lung vascular development: implications for the pathogenesis of bronchopulmonary dysplasia. Annu Rev Physiol. 67, 623-661 (2005).
  22. Mammoto, T., et al. LRP5 Regulates Development of Lung Microvessels and Alveoli through the Angiopoietin-Tie2 Pathway. PLoS ONE. 7, e41596 (2012).
  23. Mammoto, T., Jiang, E., Jiang, A., Mammoto, A. ECM structure and tissue stiffness control postnatal lung development through the LRP5-Tie2 signaling system. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 49, 1009-1018 (2013).
  24. Ding, B. S., et al. Endothelial-derived angiocrine signals induce and sustain regenerative lung alveolarization. Cell. 147, 539-553 (2011).
  25. Crivellato, E. The role of angiogenic growth factors in organogenesis. Int J Dev Biol. 55, 365-375 (2011).
  26. Sakurai, M. K., et al. Vascular endothelial growth factor accelerates compensatory lung growth after unilateral pneumonectomy. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 292, 742-747 (2007).
  27. Panigrahy, D., et al. Epoxyeicosanoids promote organ and tissue regeneration. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 13528-13533 (2013).
  28. Voelkel, N. F., Douglas, I. S., Nicolls, M. Angiogenesis in chronic lung disease. Chest. 131, 874-879 (2007).
  29. Hanumegowda, C., Farkas, L., Kolb, M. Angiogenesis in pulmonary fibrosis: too much or not enough. Chest. 142, 200-207 (2012).
  30. Levental, K. R., et al. Matrix crosslinking forces tumor progression by enhancing integrin signaling. Cell. 139, 891-906 (2009).
  31. Mammoto, A., Mammoto, T., Ingber, D. E. Mechanosensitive mechanisms in transcriptional regulation. J Cell Sci. 125, 3061-3073 (2012).
  32. Westermann, D., et al. Role of left ventricular stiffness in heart failure with normal ejection fraction. Circulation. 117, 2051-2060 (2008).
  33. Merchante, N., et al. Liver stiffness predicts clinical outcome in human immunodeficiency virus/hepatitis C virus-coinfected patients with compensated liver cirrhosis. Hepatology. 56, 228-238 (2012).
  34. Ding, B. S., et al. Inductive angiocrine signals from sinusoidal endothelium are required for liver regeneration. Nature. 468, 310-315 (2010).
  35. Fidler, I. J. Angiogenic heterogeneity: regulation of neoplastic angiogenesis by the organ microenvironment. J Natl Cancer Inst. 93, 1040-1041 (2001).
  36. Folkman, J. How is blood vessel growth regulated in normal and neoplastic tissue? G.H.A. Clowes memorial Award lecture. Cancer Res. 46, 467-473 (1986).
  37. Mammoto, A., et al. A mechanosensitive transcriptional mechanism that controls angiogenesis. Nature. 457, 1103-1108 (2009).
  38. Malinda, K. M. In vivo matrigel migration and angiogenesis assay. Methods Mol Biol. 467, 287-294 (2009).
  39. Norrby, K. In vivo models of angiogenesis. J Cell Mol Med. 10, 588-612 (2006).
  40. Mammoto, T., Jiang, A., Jiang, E., Mammoto, A. Platelet rich plasma extract promotes angiogenesis through the angiopoietin1-Tie2 pathway. Microvasc Res. 89, 15-24 (2013).
  41. Mosesson, M. W. Fibrinogen and fibrin structure and functions. J Thromb Haemost. 3, 1894-1904 (2005).
  42. Bensaid, W., et al. A biodegradable fibrin scaffold for mesenchymal stem cell transplantation. Biomaterials. 24, 2497-2502 (2003).
  43. Teichert-Kuliszewska, K., et al. Biological action of angiopoietin-2 in a fibrin matrix model of angiogenesis is associated with activation of Tie2. Cardiovasc Res. 49, 659-670 (2001).
  44. Lafleur, M. A., Handsley, M. M., Knauper, V., Murphy, G., Edwards, D. R. Endothelial tubulogenesis within fibrin gels specifically requires the activity of membrane-type-matrix metalloproteinases (MT-MMPs). J Cell Sci. 115, 3427-3438 (2002).
  45. Collen, A., et al. Aberrant fibrin formation and cross-linking of fibrinogen Nieuwegein, a variant with a shortened Aalpha-chain, alters endothelial capillary tube formation. Blood. 97, 973-980 (2001).
  46. Mammoto, T., et al. Mechanochemical Control of Mesenchymal Condensation and Embryonic Tooth Organ Formation. Dev Cell. 21, 758-769 (2011).
  47. Murphy, K. C., Leach, J. K. A reproducible, high throughput method for fabricating fibrin gels. BMC Res Notes. 5, 423 (2012).
  48. Matar, A. F., Hill, J. G., Duncan, W., Orfanakis, N., Law, I. Use of biological glue to control pulmonary air leaks. Thorax. 45, 670-674 (1990).
  49. Thetter, O. Fibrin adhesive and its application in thoracic surgery. Thorac Cardiovasc Surg. 29, 290-292 (1981).
  50. Rahbarghazi, R., et al. Juxtacrine and paracrine interactions of rat marrow-derived mesenchymal stem cells, muscle-derived satellite cells, and neonatal cardiomyocytes with endothelial cells in angiogenesis dynamics. Stem Cells Dev. 22, 855-865 (2013).
  51. Nucera, S., Biziato, D., De Palma, M. The interplay between macrophages and angiogenesis in development, tissue injury and regeneration. Int J Dev Biol. 55, 495-503 (2011).
  52. Joensuu, K., et al. Interaction between marrow-derived human mesenchymal stem cells and peripheral blood mononuclear cells in endothelial cell differentiation. Scand J Surg. 100, 216-222 (2011).
  53. Takakura, N. Role of intimate interactions between endothelial cells and the surrounding accessory cells in the maturation of blood vessels. J Thromb Haemost. 9 Suppl 1, 144-150 (2011).
  54. Plantier, L., Boczkowski, J., Crestani, B. Defect of alveolar regeneration in pulmonary emphysema: role of lung fibroblasts. Int J Chron Obstruct Pulmon Dis. 2, 463-469 (2007).
  55. Belair, D. G., Murphy, W. L. Specific VEGF sequestering to biomaterials: influence of serum stability. Acta Biomater. 9, 8823-8831 (2013).
  56. Wong, C., Inman, E., Spaethe, R., Helgerson, S. Fibrin-based biomaterials to deliver human growth factors. Thromb Haemost. 89, 573-582 (2003).
  57. Stolzing, A., Colley, H., Scutt, A. Effect of age and diabetes on the response of mesenchymal progenitor cells to fibrin matrices. Int J Biomater. 2011, 378034 (2011).
  58. Vailhe, B., Ronot, X., Tracqui, P., Usson, Y., Tranqui, L. In vitro angiogenesis is modulated by the mechanical properties of fibrin gels and is related to alpha(v)beta3 integrin localization. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 33, 763-773 (1997).
  59. Kniazeva, E., Kachgal, S., Putnam, A. J. Effects of extracellular matrix density and mesenchymal stem cells on neovascularization in vivo. Tissue Eng Part A. 17, 905-914 (2011).
  60. Angio, C. T., Maniscalco, W. M. The role of vascular growth factors in hyperoxia-induced injury to the developing lung. Front Biosci. 7, 1609-1623 (2002).
  61. Kasahara, Y., et al. Inhibition of VEGF receptors causes lung cell apoptosis and emphysema. J Clin Invest. 106, 1311-1319 (2000).
  62. Owen, C. A. Roles for proteinases in the pathogenesis of chronic obstructive pulmonary disease. Int J Chron Obstruct Pulmon Dis. 3, 253-268 (2008).
  63. Demedts, I. K., et al. Elevated MMP-12 protein levels in induced sputum from patients with COPD. Thorax. 61, 196-201 (2006).
  64. Haq, I., et al. Association of MMP-2 polymorphisms with severe and very severe COPD: a case control study of MMPs-1, 9 and 12 in a European population. BMC Med Genet. 11, 7 (2010).
  65. Mercer, P. F., et al. MMP-9, TIMP-1 and inflammatory cells in sputum from COPD patients during exacerbation. Respir Res. 6, 151 (2005).
  66. Matute-Bello, G., et al. Essential role of MMP-12 in Fas-induced lung fibrosis. Am J Respir Cell Mol Biol. 37, 210-221 (2007).
  67. Sivakumar, P., Gupta, S., Sarkar, S., Sen, S. Upregulation of lysyl oxidase and MMPs during cardiac remodeling in human dilated cardiomyopathy. Mol Cell Biochem. 307, 159-167 (2008).
  68. Gomperts, B. N., Strieter, R. M. Stem cells and chronic lung disease. Annu Rev Med. 58, 285-298 (2007).
  69. Lau, A. N., Goodwin, M., Kim, C. F., Weiss, D. J. Stem cells and regenerative medicine in lung biology and diseases. Mol Ther. 20, 1116-1130 (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics