Isolera och använda Delar av bovint Mesenteric artär och ven som Bioassay till testet för vasoaktivitet i tunntarmen

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Tunntarmen är ofta utsatt för gifter som kan påverka blodflödet och påverkar absorptionen av näringsämnen negativt. Med hjälp av en multimyograph och mesenterica artär och ven isolat, föreningar eller toxiner av intresse kan screenas för vasoaktivitet.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Klotz, J. L., Barnes, A. J. Isolating and Using Sections of Bovine Mesenteric Artery and Vein as a Bioassay to Test for Vasoactivity in the Small Intestine. J. Vis. Exp. (92), e52020, doi:10.3791/52020 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Däggdjurs gastrointestinala system utsätts ständigt för föreningar (önskade och oönskade) som kan ha en effekt på blodflödet till och från det systemet. Förändringar i blodflödet till tunntarmen kan resultera i effekter på de absorberande funktionerna hos organet. Särskilt intresse för toxiner befriats från foder via fermentativa och matsmältningsprocess har utvecklats i idisslare som ett område där produktiva effektiviteten skulle kunna förbättras. Videon i samband med denna artikel beskriver en in vitro bioanalys utvecklats för att screena föreningar för vasoaktivitet i isolerade tvärsnitt av nötkreatur mesenterica artär och ven med hjälp av en multimyograph. När blodkärlen är monterade och utjämnades i myograph kan bioassay i sig användas: som en screeningmetod för att utvärdera den kontraktila svar eller vasoaktivitet av föreningar av intresse; fastställa förekomsten av receptortyper genom att farmakologiskt inriktade receptorer med specifik agonists; bestämma rollen av en receptor med närvaron av en eller flera antagonister; eller bestämma potentiella interaktioner av föreningar av intresse med antagonister. Genom allt detta samlas uppgifter in i realtid, kan vävnad som samlats in från ett enda djur att utsättas för ett stort antal olika experimentella behandlingar (en in vitro fördel), och representerar kärl på vardera sidan av kapillärbädden att ge en korrekt bild av vad som kan hända i afferenta och efferenta blodförsörjning stöder tunntarmen.

Introduction

Förändringar i blodflödet till en vävnad säng kan ha en stor inverkan på organfunktion. En primär funktion i tunntarmen är näringsupptaget. Arteriell blodflödet till det absorptiva ytan av tarmen erfordras för absorptionen av näringsämnen och blodflödet ökar till stöd i absorptionen av näringsämnen som digesta rör sig längs ytan 1. En minskning av blodflödet kan orsaka en minskning av absorptionen av näringsämnen på grund av en minskning i transepitelial lutning 2. Förutom näringsämnen, kan tunntarmen också utsättas för sekundära metaboliter, läkemedel eller toxiner som utövar en effekt på lokaliserad blodflödet i tarmkäxet. I fallet med den idisslande djur, kan föreningarna frisättas från ett foder (t.ex. näringsämnen såsom aminosyror, eller toxiner såsom ergotalkaloider) genom fermentativa processer i tarmen. Om dessa föreningar överlever den mikrobiella metabolismen av vommen jäsning, finns nu tillgängliga för absorption deeller interaktion som de färdas genom mag-tarmkanalen hos djuret.

Det finns ett antal olika metoder tillgängliga för att mäta blodflödet in vivo (t ex Doppler-ultraljud, kvarliggande blodflödesmätare, radioaktivt märkta mikrosfärer och indikator-spädningsmetoder), som tillåter utvärdering av olika experimentella scenarier eller behandlingar. Men för att få information om de mekaniska eller farmakologiska egenskaper vaskulär glatt muskulatur, förblev metoder begränsas till stora fartyg innan Mulvany och Halpern 3 publicerade en artikel som beskriver en teknik som använder trådmonterade kärlpreparat ringen i en myograph. Eftersom utvecklingen av denna teknik, modifieringar fortsätta att göras till de tillhörande myograph system som möjliggör en mängd olika applikationer för utvärdering av rörformiga strukturer. Systemet har också anpassats för att utnyttja fasta stavar för montering större fartyg 4 där perfusiontekniker är inte önskvärt.

På grund av olikheter i fartyg från olika anatomiska ursprung och utmärkelser i samma fartyg från olika djurarter, data från fartyg och djurtypen inte lätt kan extrapoleras på olika fartyg eller samma fartyg i olika djurtyper 5. Därför måste separata biologiska testsystem utvecklas och valideras när dessa aspekter ändras. Nyligen flera biologiska testsystem har utvecklats med dessa tekniker för användning hos nötkreatur lateral vena saphena och höger ruminala artär och ven 6,7.

Denna bioanalys utvecklades för att specifikt undersöka effekterna att ergotalkaloider har på vaskulaturen stödja tunntarmen. Det rapporterades att 50-60% av matade alkaloider visas i löpmagen innehåll, men endast 5% återvinns i avföring 8. Et al. Strickland 9 uppgav i en översyn av ergotalkaloider, att tillgängliga data suggest att tunntarmen kan vara den viktigaste platsen för ergopeptine absorption. Eckert et al. 10 omdömet biofarmaceutiska aspekter av ergotalkaloider och uppgav att när de korsar epitelbarriären är ergotalkaloider transporteras antingen av lymfsystemet till vena subclavia eller via tarmkäxvenen och in portal blod. Et al. Rhodos 11 rapporterade en minskning av blodflödet till tolvfingertarmen och tjocktarmen i stutar som konsumerar en hög entofyt infekterade (hög ergotalkaloid) diet. Använda rätt ruminala artär och ven bioassay, Foote et al. 12 visade att ergotalkaloider är vasoaktiva i vommen kärl. Foote et al. 13 därefter visat in vivo att vommen exponering för ergotalkaloider resulterar i en minskad våmmen epitelial blodflöde. Denna minskning av blodflödet till absorberande yta vommen samtidigt orsakat en minskning av näringsämnen (flyktig fettsyra) flux. Med tanke på quantity av ergotalkaloider som passerar på till tunntarmen från tarmen; Det antogs att en liknande effekt på tarmens kärl och absorption av näringsämnen skulle inträffa. Detta krävde utvecklingen av nötkreatur proximala ileal mesenterica artär och ven bioassay.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Metoder som används i denna studie inte krävde godkännande från University of Kentucky Animal Care och användning kommittén, eftersom inga levande djur användes. Innan insamlingen av något prov används här, alla djuren bedövas med bultpistoler och tappades på blod. Detta genomfördes vid ett federalt inspekterade slakteri anläggning vid universitetet i Kentucky. En officiell representant för USDA Food och kontrollservice observerade alla aktiviteter som behandlas med levande djur och hantering av slaktkroppen.

1 Beredning av Instrumentation

  1. För att minimera den tid mellan samlingar av vävnadsprover till början av ett experiment, ställa in utrustning och förbereder buffertar före samla experimentell vävnad (eller om ytterligare personal finns tillgänglig, kan dessa uppgifter ske samtidigt).
    OBS: Detta ger inte bara den största tid att vävnaden fortfarande lönsamt att genomföra experiment, men vissaexperiment kan köra för långa perioder (eller det finns en önskan att slutföra flera experiment i en dag), därför är det oftast önskvärt att komma igång så tidigt som möjligt.
  2. Starta den tillhörande datorn, uppgifter förvärv utrustning, vattenbad (för buffert (s)) och myograph enhet (er). Placera kalibreringsutrustning på myograph enhet (er) och slå på myograph värme (förinställd till 37,5 ° C) och tillåta enheter och kalibreringsutrustning att värmas till förinställda temperaturer.
    1. Öppna en tidigare skapad diagram programvaruinställningar fil på datorn och starta en körning (men inte skaffa data).
  3. Värm upp utrustningen i 10 min.
    1. Börja skaffa uppgifter.
    2. Nollställa alla kanaler.
    3. Kontrollera och genomföra kalibrering (om så behövs) på varje kanal (4 kanaler per multimyograph) att standardisera den elektriska signal, som matas från de respektive kraftomvandlare associerad med denna kanal till en 2-g kraft levereras av en certifierad vikt.
    4. Efter kalibrering och enheter konvertering är klara, lagra alla efterföljande uppgifter gram. Ändra följaktligen baserad på önskemål av varje separat laboratorium; den utrustning och programvara tillåta användning av andra enheter, t.ex. millinewton och volt.
  4. Se till att gasledningarna är täppt och slå på gasförsörjning (95% O2 / 5% CO2) för att myograph (s) enheter. Kontinuerligt gas alla buffertar (i myograph kamrarna) under hela proceduren.
  5. Fyll alla myograph kammare med 70% etanol och blöt i 10 minuter, ta bort etanol, och upprepa för en andra 10 min blöta.
    1. Efter att etanol, skölj tre gånger med avjoniserat vatten, följt av tre sköljningar med beredd buffert (se avsnitt 2 för buffert preparat), som lämnar den tredje tillsats av buffert i kamrarna.
      OBS: På denna punkt utrustningen kan förbli overksam i detta tillstånd tills buffert och vävnader är beredda och personalen är redo att gå vidare med de experiment.

2 Beredning av buffertar

  1. Bered en 1 L Krebs-Henseleit buffertlösning för användning i transport och behandling av vävnadsprover för att uppnå slutkoncentrationer av 11,1 mM D-glukos; 1,2 mM MgSO 4; 1,2 mM KH 2 PO 4; 4.7 mM KCl; 118,1 mM NaCl; 3.4 mM CaCl2; 24,9 mM NaHCOa 3.
    1. Blanda 9,6 g Krebs alter till ca 900 ml avjoniserat vatten på en uppståndelse tallrik.
    2. Blanda i 0,373 g kalciumklorid dehydratisera följt av 2,1 g natriumbikarbonat per liter buffert önskas.
    3. Gas buffertlösning under 20 min med 95% O2 / 5% CO2.
    4. Efter gasning, justera pH till 7,05 (filtrering av buffert ökar pH, slutmålet pH ska vara 7,4) och justera volymen till 1 L.
    5. Filter sterilisera buffert i en ren autoklaveras 1 L medieflaska och lagra buffert vid 4 ° C tills produkten ska användas.
  2. Förbered separata Krebs-Henseleit buffertlösning för användning i myograph experiment som beskrivs i steg 2.1 för transport Krebs-Henseleit buffert med ytterligare föreningar som hör till de kontraktilitet experiment.
    OBS: Normalt 2 L räcker för experiment som beskrivs i denna artikel, men denna volym kan behöva ökas eller minskas baserat på längden av försöket, antal myograph kammare, och ersättare antal buffert (i förhållande till tillägg behandling).
    1. Före gasningssteget (steg 2.1.3), tillsätt 9,1 mg (per liter buffert förbereds) för desipramin-HCl till buffert.
    2. Bered en 1,0 uM lösning av propranolol-HCl och tillsätt 1 ml (per L av buffert förbereds) av denna lösning till Krebs-Henseleit buffertlösning. Gör denna buffert på dagen för användning och hålla myograph driftstemperaturer (en temperatur som ger en 37,5 ° C temperatur i myograph).
      OBS! Desipramin läggs till inhibera biogena aminåterupptagsmekanismeroch tillåta clearing av experimentella tillägg från bufferten badar blodkärlen att ske snabbare. Tillsatsen av propranolol förhindrar icke-specifik bindning av behandlingsföreningar till β-adrenerga receptorer.

3 Insamling och förberedelse av kärl

  1. Så snart som möjligt, ta bort mag-tarmkanalen från stommen. När djuret inte längre uppvisar någon ofrivillig reflex, ta bort huvudet och gömma sig och sedan höja stommen vertikalt. Borttagning av mag inälvorna (esofagus till anus) från slaktkroppen bör kompletteras med godkända slakteripersonal (<20 min från tidpunkten för bedövning).
    OBS: Hur snart, i allmänhet begränsas av plats / anläggning där tarmkanalen samlas från och standardrutiner eller federalt uppdrag förfaranden som de anläggningens personal.
    1. I de flesta anläggningar, genomföra manipulationer av mag-tarmkanalenpå en annan plats från bearbetning av slaktkroppen som är avsett för att komma in i livsmedelsförsörjningen. Använd en närliggande bra läge där mag-tarmkanalen kan tas och spridas ut för granskning.
  2. När mag-tarmkanalen är utspritt, identifiera tunntarmen, ileocecal faldig ansluter tunntarmen till cekum och ileal fläns som sträcker sig proximalt till den ileocekala faldig (Figur 1A).
    1. Med användning av en skalpell eller kniv, mycket lätt att göra ett snitt i mesenteriala membran i centrum av den ileala flänsen. Använda index två fingrar, rakt på sak dissekera bort fettet och bindväv exponera mesenteriala kärlsystemet (Figur 1B).
  3. Från denna fläns eller vulst i tarm tarmkäxet, dissekera ut flera grenar (~ 2 cm i längd) av de exponerade mesenteriska artär och ven knippen som stödjer denna del av ileum (figur 1C).
    1. Om usjunger pincett för att ta tag vävnad, vara noga med att inte greppa direkt eller dra i blodkärlen alls när du tar bort dem som någon sorts stretching kan skada och påverka vävnadsprestanda 14 negativt. Borttagning blodkärl bäst, genom att skära tvärs över varje ände av avsnittet som ska tas bort och sedan skära bredvid eller parallellt med nu isolerade sektionen. För att underlätta, ta bort en del av den omgivande vävnaden tillsammans med fartyg för att ge viss vävnad för att greppa med en pincett.
    2. Med en pincett, dränka vävnadsprov i ett rör innehållande iskall Krebs-Henseleit-buffert och lagras på is tills bearbetningen kan ske i laboratoriet.
  4. Placera vävnadsprov på en skärande yta eller i en petriskål och delvis dränka i iskall Krebs-Henseleit.
    1. Använda # 5 juvelerare pincett, Noyes iris sax och förstoringsglas lampa eller dissekera omfattning (2,5 till 5,0X förstoring räcker), försiktigt dissekera bort det omgivande fettet och anslutninve vävnader och separera artär och ven. Identifiera behållaröppningen vid en ände av sektionen och försiktigt tag i fascian som omger kärlet med pincett.
    2. Gör ett snitt med en sax parallellt till kärlet genom att skjuta spetsen på scissor nedanför den upphöjda fascia. Efter den initiala snittet kan fett och bindväv lösgöras ytterligare från kärlet genom att skära ner endera sidan med en sax. Se till att kärlen är så rena som möjligt och samtidigt minimera den tid fartygen tillbringar på bänken.
    3. Återgå blodkärl till rör färsk Krebs-Henseleit buffert och förvara vid 4 ° C (prov kan förbli lagras i upp till 24 timmar efter insamling och fortfarande producerar giltiga kontraktilitet data).
    4. Med hjälp av ett rakblad, som skiva fartyg användas i myograph in önskat antal 2-mm sektioner (det är bra att använda en vävnad slicer att få konsekventa tvärsnitt).
    5. Undersök varje avsnitt under en dissekera scope (12,5X förstoring) för att se till att varje avsnitt har några avvikelser, grenar, ventiler eller ytliga skador av misstag gjorda under dissekering och rengöring. Byt avsnitt fartyget om det finns något onormalt, gren, ventil, eller ytliga skador.
  5. Store godtagbara skivade fartygssektioner (nedsänkta i Krebs-Henseleit-buffert) på is eller vid 4 ° C tills redo för montering i myograph kamrarna (vanligen <30 minuter).
  6. Montera försiktigt på kärlet på myograph genom att föra in stöden genom lumen och öka spänningen (med micropositioner på myograph) var noga med att inte sträcka ut fartygen över en 2 till 3 g läsning.
  7. När alla kamrarna täcks, dammsuga buffert från alla avdelningar och fyll på med 5,0 ml buffert och börja en 15 min timer för att påbörja jämviktsperioden och experimentet.

4. Experiment

  1. Jämvikta alla fartygssektioner i 1,5 timmar för att uppnå en stabil resTing spänning av 1,0 g.
    1. Ersätt Krebs-Henseleit inkubationsbuffert vart 15 min.
    2. Under jämvikt, ständigt justera spänningen på blodkärlssektionerna på upp till 2 g och låt sedan koppla ner till ca 0,80 g. Försök att inte tillåta fartygen att koppla av för mycket (de kan halka av fästen). Försök att uppnå en stabil baslinje spänning, där fartyget innehar 1 g spänning utan att kräva justering.
  2. Under jämvikt, framställa en vattenhaltig 1,32 M lösning av KCl för att användas som en referens.
  3. Efter slutförandet av en tillfredsställande jämvikt, tillsätt 500 ìl av 1,32 M KCl-lösning för att resultera i en 0,12 M lösning i 5,5 ml lösning badar fartyget.
    1. Efter tillägg av 1,32 M KCl, inte justera spänningen manuellt som den maximala responsen från detta tillägg används för att utvärdera vävnad livskraft och kan användas för att normalisera behandlingsdata (t.ex. svar koncentrations till en agonist).
    2. Ersätt bufferten i 15-minuters intervall tills spänningen har återvänt till utgångsvärdet på 1,0 g.
  4. När baslinjen nås, ändra bufferten och samtidigt börja en 1 min timer. Gör detta för alla kamrar samtidigt för att undvika en svindlande av starttider.
    1. Vortex standarden som ska läggas och förbereda en kommentar till kammare 1 under 1 min nedräkning.
    2. Lägg standarderna i 25 | il alikvoter till varje kammare som experiment dikterar (detta håller behandling under 0,5% av den totala volymen).
    3. När den sista standarden har lagts till, starta en 9 min timer.
    4. I slutet av den 9 min standard inkubation, ta behandlingen innehållande buffert från kamrarna och tillsätt 5,0 ml av färsk buffert, och starta 2,5 min timer.
    5. Upprepa steg 4.4.4.
    6. I slutet av den andra 2,5 min sköljning, dammsuga kamrarna och lägga färsk buffert, och starta ett 1 min timer för att räkna ner påbörjandet av second standard tillägg.
  5. Fortsätt denna behandling för alla dagens standard tillägg.
  6. Under den slutliga standarden tillsats och efterföljande 9 min inkubation förbereder 1,32 M KCl referensförening för ett slut på körning referensdos tillsats av 500 pl.
  7. Efter 1 min intervall efter den slutliga behandlingen dessutom lägga KCl och starta en 9 min timer.
    OBS: KCl tillägg är att bekräfta vävnadsviabilitet vid slutet av experimentet och är bra om administrering av en behandling som resulterar i försumbar respons.
  8. Vid slutet av den sista 9 min referensförening inkubation, dammsuga eller ta bort buffert från alla kamrarna. Lägg inte till färsk buffert. Ingå experimentet.
  9. Spara diagram fil, ta bort blodkärlssektioner och avyttra ordentligt, och följer den rena upp protokollet (från tillverkaren och kan vara labb specifik) för myograph utrustning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Blodkärlen som används för att generera de inkluderade resultaten samlades in från 6 Holstein ungtjurar (425 ± 8 kg) inom en 3 veckors intervall. Ett exempel på en typisk tarmkäxvenen kontraktila svar på KCl och behandlings tillsatser ökar i koncentration presenteras i figur 2. Storleksordningen på reaktionerna kommer att variera något med storleken på kärlet (korreleras med storleken på donatordjuret), men kan också påverkas (negativt) av felaktig hantering (sträckning) av fartygen under insamling och rengöring. Därför är det viktigt att iaktta en signifikant kontraktil respons i fartyg exponering för KCl. Om en försumbar respons observeras vid denna punkt, är det inte tillrådligt att fortsätta något längre in i förfarandet med det fartyget. Såsom ses i de 9 min inkubation perioder i figur 2, finns det inkrementella ökningar i det svar som korresponderar med ökande koncentrationer. Även önskvärda för denna particular experimentell design, kanske det inte alltid förekommer eller vara eftertraktad med andra behandlingar. Den KCl tillägg vid slutet av experimentet, även om de inte används vid behandling av uppgifter som samlats in, är mycket viktigt eftersom det bekräftar livskraft vävnaden vid slutet av försöksperioden (blir viktigare om fartyget inte svarar på alla av tillsatserna behandlings).

De data som presenteras i fig 2 registreras i gram spänning. Det är viktigt att normalisera dessa data för att minimera varje djur-till-djur-och kärl-till-kärl variation. Således, förutom att användas som en indikator på lönsamheten, är den maximala KCl svar används för att normalisera alla tillägg behandlings. Detta genererar kontraktila responsdata som en procentsats av den maximala KCl. Detta är hur mesenteriska artär och ven responskurvor för ökande koncentration av 5-hydroxitryptamin (serotonin, fig 3) och norepinefrin (

Den tarmkäxvenen svar på både 5-hydroxitryptamin (Figur 3) och noradrenalin (Figur 4) började som negativa värden. Detta är ett resultat av att korrigera den maximala spänningen registreras under varje 9 min inkubationstid från baslinjen spänningen registrerats före den initiala KCl tillägg. Denna baslinje korrigering ser till att eventuella små skillnader i spänning ingår inte i analyserna och låta de data som presenteras för att reflektera endast en förändring i spänning. Den negativa värde resultat från blodkärlet avkopplande och sjunka till under pre-KCl baslinjenivåerna före fortsatt behandling tillägg. Detta är speciellt vanligt i venösa prover där de ursprungliga koncentrationerna av behandlingen eller agonist är alltför låga för att orsaka en kontraktila svaret. Detta var inte fallet för mig senteric artär svar på antingen biogen amin, som höll spänningen över baslinjen tills fartyget började svara på tillsatserna behandlings. Denna skillnad exemplifierar skillnaderna i fartyg på vardera sidan av kapillärbädden och varför de båda betraktas som en del av denna bioassay.

Denna bioassay kan användas för att utvärdera vasoaktivitet av föreningar på blodkärlen som försörjer näringsämnen till tunntarmen samt blodkärl som transporterar absorberade näringsämnen från tunntarmen. Data i fig 3 och 4 är enkla exempel på hur detta kan åstadkommas. I fallet med 5-hydroxitryptamin (figur 3), var det inte någon skillnad i den arteriella eller venösa kontraktila svaret. Omvänt det kontraktila svaret av mesenteriala venen till ökande koncentrationer av noradrenalin var större än den hos den mesenteriala artären.

gur 1 "fo: content-width =" 3 tum "src =" / filer / ftp_upload / 52020 / 52020fig1highres.jpg "width =" 300 "/>
Figur 1:. Ett exempel på bovin tarmkanalen som används som källa för mesenteriala blodkärl Den röd asterisk indikerar den synliga delen av ileocecal gånger i alla tre rutor som en referenspunkt. (A) Hela tarmkanalen med röd oval indikerar ileal flänsen där provtagning av kärl inträffade. (B) Exponering av mesenteriala kärlbädd. (C) Iris sax pekar mot en exponerad gren av tarmkäxvenen (synligt) och artär (syns inte) strax före samlingen.

Figur 2
Figur 2: Exempel på ett koncentrationssvar av en tarmkäxvenen till ökande koncentrationer av norepinefrin (1 × 10 -7 till en× 10 -4 M). De stora händelserna i början och slutet av kurvan finns svar på de 0.12 M KCl tillägg. Den röda rektangeln innebär datainsamlings region som motsvarar den 9 min inkubationstiden för varje behandlings tillägg. De 3 slanka spikar som följer här är artefakter som genereras av ersättare buffert och ingår inte i analysen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3
Figur 3: Genomsnittliga kontraktila svar från mesenterica (MA) och ven (MV, n = 6 stutar) och ökande koncentrationer av 5-hydroxitryptamin (serotonin) Linjer visas genererades med hjälp av icke-linjär regressionsanalys för att passa data till en sigmoidal. koncentration response kurva som utnyttjade följande ekvation: y = botten + [(topp - botten) / (1 ​​+ 10 (logEC 50 - x))], där topp och botten är andelen 120 mM KCl maximal kontraktila svar på platåerna, och EG-50 är den molära koncentrationen av alkaloid producera 50% av KCl maximala svaret.

Figur 4
Figur 4: Medel kontraktila svar från mesenterica (MA) och ven (MV, n = 6 stutar) till ökande koncentrationer av noradrenalin Linjer visas genererades med hjälp av icke-linjär regressionsanalys för att passa data till en sigmoidal koncentrationsresponskurva som utnyttjas. följande ekvation: y = botten + [(topp - botten) / (1 ​​+ 10 (logEC 50 - x))], där toppen och botten är den procentuella andelen av 120 mM KCl maximal contractile svar på platåer och EC50 är den molära koncentrationen av alkaloid som producerar 50% av KCI maximal respons.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den ursprungliga utmaningen i utvecklingen av denna bioassay var inrättandet av en repeterbar insamlingsplats för mesenterica kärl. Prov site konsekvens är kritisk, eftersom en del av funktionerna hos tunntarmen förändring under progressionen från jejunum genom ileum och följaktligen tarmkäxet varierar i ett liknande mönster. De ileum grenar mesenterica artär och ven var den mest lätt identifieras genom anatomiska landmärken. Genom att placera blindtarmen och efter ileocecal gånger till dess ändstation på vänster sida av krös, detta nära uppsägning av hjärn mesenterica 15. Området längre tarmkäxet (benämnd flänsen) och förlängningen av ileocecal gånger (unika för nötkreatur) 16 gjorde provtagning över många djur mycket repeterbara. Ett av de större fallgropar som kan göras är vid denna fas av bioanalys. Mekanisk sträckning har en stor negativ inverkan på efterföljande fartyg pULLGÖRANDE 14 och forskaren kommer att märka att fartyg som överdrivet är manipulerade eller sträckta vid demontering och efterföljande rengöring inte kommer att svara på referensföreningen som används. Detta är tyvärr det enda sättet att verkligen utvärdera kvaliteten av den vaskulära preparatet i en funktionell nivå och fartyg som inte svarar på KCl bör inte betraktas som ytterligare för generering av tillförlitliga uppgifter.

Två andra metod valideringssteg (ej visade), som ledde till den slutliga metod som presenteras häri var användningen av andra kemikalier som referensföreningar och testa viabiliteten av blodkärl efter 24 h lagring. Noradrenalin och serotonin utvärderades som referensföreningar, men svaren från mesenterica artär och ven var för variabel över fartygstyp och över djur för att de med framgång användas. Omvänt, tillägg av 120 mM KCl resulterade i en mycket reproducerbar respons över både artär och ven preparat. Ettlso, artär och ven svar utvärderades samlingsdagen och omvärderas 24 timmar efter insamling och det var ingen skillnad i agonistsvar antingen artären eller venen. Detta var en viktig aspekt av det biologiska testet, eftersom det ofta finns ett stort antal behandlingar (eller olika behandlingskombinationer) som kan tillämpas, men forskare är begränsade av utrymme på myograph och tid. Genom att förlänga perioden av lönsamheten ut 24 tim från samlingen, är det dags för ytterligare experiment ökat kraftigt.

Det är viktigt för forskaren att förstå den flexibilitet av behandlingsstrukturen appliceras på denna bioanalys. En forskare kan lägga till föreningen till inkubationsbufferten att han eller hon är intresserad av kroniskt exponera blodkärlen för att kontrollera något av biologisk relevans eller som en behandling (i fallet med Klotz et al. 17 gjordes detta med laterala vena vener utsätts kontinuerligt för ketanserin, vilket motverkade en serotoninreceptor av intresse). De mesenteriska blodkärl kan förbehandlas med en förening av intresse innan du genomför en kontraktila svaret experiment. Bioanalysen som presenteras, var avsedd att genomföra en kumulativ koncentrationssvarsexperiment ser ergotalkaloider som agonister och om före intaget via kosten ergotalkaloider drabbade kärl svaret 18. De representativa resultat visar att denna metod kan åstadkomma ett mätbart vaskulär respons och endast fyra koncentrationer användes för att uppnå detta. I fallet med et al. Egert 18, fanns det upp till 10 olika koncentrationer som användes för att konstruera en svarskurva. Denna metod är ett sätt att utvärdera ett stort antal olika föreningar eller receptorer på blodkärl från ett enskilt djur i ett litet fönster av tid.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Omnämnandet av handelsnamn, patentskyddad produkt eller specificerad utrustning utgör inte en garanti eller garanti av USDA och innebär inte godkännande med uteslutande av andra produkter som kan vara tillgängliga.

Acknowledgments

Författarna erkänner Ryan Chaplin och Dr Gregg Rentfrow vid University of Kentucky Meats Lab och Institutionen för husdjurens och livsmedelsvetenskap för att ge möjligheter att samla experimentella vävnader som används häri.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Multi Myograph Danish Myo Technologies 610M A myograph is critical to this bioassay, but there are other platforms available for use that will suffice. 
Powerlab 8/sp ADIntruments ML785
LabChart 7 ADInstruments Version 7
Force Calibration Kit Danish Myo Technologies 100055 Specific to DMT myographs
Bottle-top Filter Nalgene 595-4520 0.22 μm pore size; 45 mm neck size
#5 Jewler’s Forceps Miltex 555008FT Any brand of forceps can be used
Noyes Iris Scissors Miltex 18-1510 Any brand of scissors can be used
Dissecting Scope Zeiss Stemi 2000-C Any brand of dissecting light microscope will suffice
Adjustable Tissue Matrice Braintree Scientific TM C12 This is not critical to the assay, but greatly reduces section to section variation in length and speeds up the slicing process greatly
Krebs-Hensleit Buffer Sigma-Aldrich K3753-10x1L It is not necessary to buy Krebs, this can be made in house
Calcium chloride dehydrate Sigma-Aldrich C7902-500G
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich S5761-500G
Desipramine-HCl Sigma-Aldrich D3900-5G
Propranolol-HCl Sigma-Aldrich P0884-1G
KCl Sigma-Aldrich P9333-500G
95% O2/5% CO2 Scott Gross UN3156

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Matheson, P. J., Wilson, M. A., Garrison, R. N. Regulation of intestinal blood flow. The Journal of surgical research. 93, 182-196 (2000).
  2. Dobson, A. Blood flow and absorption from the rumen. Quarterly journal of experimental physiology. 69, 599-606 (1984).
  3. Mulvany, M. J., Halpern, W. Mechanical properties of vascular smooth muscle cells in situ. Nature. 260, 617-619 (1976).
  4. Nielsen-Kudsk, F., Poulsen, B., Ryom, C., Nielsen-Kudsk, J. E. A strain-gauge myograph for isometric measurements of tension in isolated small blood vessels and other muscle preparations. Journal of pharmacological. 16, 215-225 (1986).
  5. Mulvany, M. J., Aalkjaer, C. Structure and function of small arteries. Physiological reviews. 70, 921-961 (1990).
  6. Klotz, J. L., et al. Assessment of vasoconstrictive potential of D-lysergic acid using an isolated bovine lateral saphenous vein bioassay. Journal of animal science. 84, 3167-3175 (2006).
  7. Klotz, J. L., Bush, L. P., Strickland, J. R. A vascular contractility bioassay using bovine right ruminal artery and vein. Journal of animal science. 89, 1944-1951 (2011).
  8. Westendorf, M. L., et al. In vitro and in vivo ruminal and physiological responses to endophyte-infected tall fescue. Journal of dairy science. 76, 555-563 (1993).
  9. Strickland, J. R., et al. Board-invited review: St. Anthony"s Fire in livestock: causes, mechanisms, and potential solutions. Journal of animal science. 89, 1603-1626 (2011).
  10. Eckert, H., Kiechel, J. R., Rosenthaler, J., Schmidt, R., Schreier, E. Ch. 11. Ergot Alkaloids and Related Compounds. B, B. erde, HO, S. child Springer-Verlag. (1978).
  11. Rhodes, M. T., Paterson, J. A., Kerley, M. S., Garner, H. E., Laughlin, M. H. Reduced blood flow to peripheral and core body tissues in sheep and cattle induced by endophyte-infected tall fescue. Journal of animal science. 69, 2033-2043 (1991).
  12. Foote, A. P., Harmon, D. L., Strickland, J. R., Bush, L. P., Klotz, J. L. Effect of ergot alkaloids on contractility of bovine right ruminal artery and vein. Journal of animal science. 89, 2944-2949 (2011).
  13. Foote, A. P., et al. Ergot alkaloids from endophyte-infected tall fescue decrease reticuloruminal epithelial blood flow and volatile fatty acid absorption from the washed reticulorumen. Journal of animal science. 91, 5366-5378 (2013).
  14. Hocking, K. M., et al. Detrimental effects of mechanical stretch on smooth muscle function in saphenous veins. Journal of vascular surgery. 53, 454-460 (2011).
  15. Smith, D. F. Bovine intestinal surgery. Modern veterinary practice. 65, 705-710 (1984).
  16. Budras, K. D., Habel, R. E. Bovine Anatomy An Illustrated Text. first, Schlütersche GmbH and Co. KG, Verlag and Druckerei. (2003).
  17. Klotz, J. L., et al. Antagonism of lateral saphenous vein serotonin receptors from steers grazing endophyte-free, wild-type, or novel endophyte-infected tall fescue. Journal of animal science. 91, 4492-4500 (2013).
  18. Egert, A. M., Kim, D. H., Schrick, F. N., Harmon, D. L., Klotz, J. L. Dietary exposure to ergot alkaloids decreases contractility of bovine mesenteric vasculature. Journal of animal science. 92, 1768-1779 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics