Isolering og bruger sektioner af Bovin mesenterialarterie og Vein som et bioassay til at teste for Vasoactivity i tyndtarmen

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Tyndtarmen ofte udsat for giftstoffer, der kan påvirke blodgennemstrømningen og negativ indflydelse optagelsen af ​​næringsstoffer. Ved hjælp af en multimyograph og mesenterialarterie og vene isolater, forbindelser eller toksiner af interesse kan screenes for vasoactivity.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Klotz, J. L., Barnes, A. J. Isolating and Using Sections of Bovine Mesenteric Artery and Vein as a Bioassay to Test for Vasoactivity in the Small Intestine. J. Vis. Exp. (92), e52020, doi:10.3791/52020 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Pattedyrreplikationssystemer gastrointestinale systemer er konstant udsat for forbindelser (ønskede og uønskede), der kan have en effekt på blodgennemstrømningen til og fra dette system. Ændringer i blodtilførslen til tyndtarmen kan medføre virkninger på absorberende funktioner organet. Særlig interesse i toksiner befriet fra foder gennem fermentative og fordøjelse har udviklet sig i drøvtyggere som et område, hvor produktive effektivitet kunne forbedres. Videoen er forbundet med denne artikel beskriver en in vitro bioassay udviklet til at screene forbindelser til vasoactivity i isolerede tværsnit af kvæg mesenterialarterie og vene ved hjælp af en multimyograph. Når blodkarrene er monteret og ækvilibreret i myograph kan bioassayet selv anvendes: som et screeningsværktøj til at vurdere den kontraktile respons eller vasoactivity af forbindelser af interesse; bestemme tilstedeværelsen af ​​receptor typer af farmakologisk målrette receptorer med specifik agonists; bestemme rollen af ​​en receptor med tilstedeværelsen af ​​en eller flere antagonister; eller bestemme potentielle interaktioner af forbindelser af interesse med antagonister. Gennem hele denne, der indsamles data i realtid kan væv opsamlet fra et enkelt dyr udsættes for en lang række forskellige eksperimentelle behandlinger (et in vitro fordel), og repræsenterer vaskulatur på hver side af kapillærbane at give en præcis billede af, hvad der kunne ske i afferente og efferente blodforsyning understøtter tyndtarmen.

Introduction

Ændringer i blodgennemstrømningen til et væv seng kan have en stor indflydelse på organfunktion. En primær funktion af tyndtarmen er næringsstof absorption. Arteriel blodtilførslen til absorberende overflade af tarmen er nødvendig for optagelse af næringsstoffer og blodgennemstrømningen øges for at hjælpe til absorptionen af næringsstoffer som fordøjede bevæger sig langs overfladen 1. Et fald i blodgennemstrømningen kan forårsage en reduktion i optagelsen af næringsstoffer på grund af et fald i transepithelial gradient 2. Ud over næringsstoffer, kan tyndtarmen også blive udsat for sekundære metabolitter, narkotika eller toksiner, der udøver en virkning på lokaliseret blodgennemstrømning i mesenterium. I tilfælde af det drøvtyggende dyr, kan forbindelser blive befriet fra et foderstof (f.eks næringsstoffer, såsom aminosyrer, eller toksiner, såsom ergotalkaloider) gennem gæringsprocesser af formave. Hvis disse forbindelser overlever den mikrobielle metabolisme af ruminal fermentering, er de nu tilgængelige for absorptioneller interaktion som de bevæger sig gennem mave-tarmkanalen i dyret.

Der er en række forskellige metoder til rådighed til at måle blodgennemstrømning in vivo (f.eks Doppler ultralyd, iboende blod flowmetre, radiomærkede mikrokugler og indikator-fortynding teknikker), der tillader evaluering af forskellige eksperimentelle scenarier eller behandlinger. Men for at indhente oplysninger om de mekaniske eller farmakologiske egenskaber af vaskulær glat muskulatur, metoder fortsat begrænset til store skibe, indtil Mulvany og Halpern 3 offentliggjorde en artikel, der beskriver en teknik med anvendelse ledning monteret ring præparater vaskulære i en myograph. Da udviklingen af ​​denne teknik, fortsat gøres til de tilknyttede myograph systemer, der tillader en række forskellige applikationer til evaluering af rørformede strukturer modifikationer. Systemet er også blevet indrettet til at anvende faste stænger til montering større skibe 4 Såfremt perfusionteknikker er ikke ønsket.

På grund af uoverensstemmelser mellem fartøjer fra forskellige anatomiske oprindelser og udmærkelser i samme fartøjer fra forskellige arter af dyr, data fra fartøjet, og dyreart ikke let kan ekstrapoleres på tværs af forskellige fartøjer eller det samme fartøj i forskellige dyr typer 5. Derfor skal særskilte bioassays blive udviklet og valideret når som helst disse aspekter ændres. For nylig flere bioassays er udviklet med disse teknologier til brug i kvæg laterale saphenavene og højre vom arterie og vene 6,7.

Dette bioassay er udviklet til specifikt at undersøge de virkninger, ergotalkaloider har på vaskulaturen støtte tyndtarmen. Det blev rapporteret, at 50-60% af fodret alkaloider vises i løbemaveforskydning indhold, men kun 5% nyttiggøres i fæces 8. Strickland et al. 9 anført i en gennemgang af meldrøjealkaloider, at de foreliggende data Suggest, at tyndtarmen kan være det vigtigste sted for ergopeptine absorption. Eckert et al. 10 anmeldt biofarmaceutiske aspekter af sekalealkaloider og erklærede, at når de krydser epitelbarrieren er ergotalkaloiderne transporteres enten af lymfesystemet til nøglebensvenen eller via mesenterial venen og ind i portalen blod. Rhodes et al. 11 rapporteret et fald i blodtilførslen til duodenum og colon i stude indtager en høj endofytinficerede (høj ergotalkaloid) kost. Bruger den rigtige ruminal arterie og vene bioassay Foote et al. 12 viste, at ergotalkaloider er vasoaktive i vommen vaskulatur. Foote et al. 13. efterfølgende påvist in vivo, at ruminal eksponering for ergot alkaloider resulterer i en nedsat vommen epitel blodgennemstrømning. Dette fald i blodtilførslen til den absorberende overflade af vommen samtidig forårsagede en reduktion i næringsstof (flygtig fedtsyre) flux. Da quantity af meldrøjealkaloider passerer videre til tyndtarmen fra formave; Hypotesen var, at der vil forekomme en tilsvarende virkning på tyndtarmen karsystem og optagelse af næringsstoffer. Dette nødvendiggjorde udviklingen af ​​kvæg proximale ileum mesenteriske arterie og vene bioassay.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Procedurer, der anvendes i denne undersøgelse ikke kræver godkendelse fra University of Kentucky Animal Care og brug Udvalg fordi levende dyr blev anvendt. Forud for indsamlingen af ​​enhver prøve anvendt heri blev alle dyr bedøves med en boltpistol og tømt for blod. Dette blev udført ved en føderalt inspiceret slagteri facilitet på University of Kentucky. En officiel repræsentant for USDA Fødevaresikkerhed og Inspection Service overholdt alle aktiviteter, der behandles med det levende dyr og håndtering af slagtekroppen.

1. Fremstilling af Instrumentering

  1. For at minimere mængden af ​​tid mellem samlinger af vævsprøver til starten af ​​et eksperiment, der er nedsat udstyr og forberede buffere forud for indsamlingen af ​​eksperimentelle væv (eller hvis ekstra personale er til rådighed, kan disse opgaver forekomme samtidigt).
    BEMÆRK: Dette er ikke blot den største mængde af tid, at vævet er rentabelt at udføre eksperimenter, men nogleeksperimenter kan køre i lange perioder (eller der er et ønske om at gennemføre flere eksperimenter i en dag), er det derfor sædvanligvis ønskeligt at komme i gang så tidligt som muligt.
  2. Tænd for tilhørende computer, opkøb dataudstyr, vandbad (til buffer (e)) og myograph enhed (er). Placer kalibreringsudstyret på myograph enhed (er) og tænd myograph varme (forudindstillet til 37,5 ° C) og tillade enheder og kalibrering udstyr til at varme op til forudindstillede temperaturer.
    1. Åbn et tidligere oprettet Chart software-indstillinger fil på computeren og starte en kørsel (men ikke erhverve data).
  3. Varm op udstyret i 10 min.
    1. Begynd at erhverve data.
    2. Nulstille alle kanaler.
    3. Kontroller og udføre kalibrering (om nødvendigt) på hver kanal (4 kanaler pr multimyograph) at standardisere det elektriske signal leveres fra respektive krafttransducer forbundet med denne kanal til en 2-g kraft leveres af en certificeret vægt.
    4. Efter kalibrering og en enheder konvertering er afsluttet, gemme alle efterfølgende data som gram. Skift derfor baseret på ønsker af hvert enkelt laboratorium; udstyr og software tillader anvendelse af andre enheder, såsom milliNewtons og volt.
  4. Sørg for, at gasledningerne er fri for blokeringer og tænd gasforsyning (95% O 2/5% CO 2) til myograph (r) enheder. Kontinuerligt gas alle buffere (i myograph kamre) i løbet af hele proceduren.
  5. Udfyld alle myograph kamre med 70% ethanol og lægges i blød i 10 minutter, fjernelse af ethanol, og gentag for en anden 10 min blød.
    1. Efter fjernelse af ethanol, skylles tre gange med deioniseret vand, efterfulgt af tre skylninger med forberedt puffer (se afsnit 2 til fremstilling puffer), der forlader den tredje tilsætning af buffer i kamrene.
      BEMÆRK: På dette tidspunkt udstyret kan være inaktiv i denne tilstand indtil buffer og væv fremstilles og personalet er klar til at fortsætte med eksperimenterendet.

2. Fremstilling af buffere

  1. Forbered en 1 L Krebs-Henseleit buffer løsning til brug i transport og behandling af vævsprøver for at opnå endelige koncentrationer på 11,1 mm D-glucose; 1,2 mM MgSO4; 1,2 mM KH 2 PO 4; 4,7 mM KCI; 118,1 mM NaCI; 3.4 mM CaCl2; 24,9 mM NaHCO3.
    1. Bland 9,6 g Krebs salte i ca 900 ml deioniseret vand på en omrøringsplade.
    2. Bland 0,373 g calciumchlorid dihydrat efterfulgt af 2,1 g natriumbicarbonat pr L buffer ønskes.
    3. Gas pufferopløsning i 20 minutter med 95% O2 / 5% CO2.
    4. Efter gasning, justere pH til 7,05 (filtrering af buffer øger pH-værdien; endelige målsætning pH skal være 7,4) og justere lydstyrken til 1 L.
    5. Filtersteriliser puffer i en ren autoklaveret 1 L medier flaske og opbevares buffer ved 4 ° C, indtil den er klar til brug.
  2. Udarbejde særskilte Krebs-Henseleit bufferopløsning til brug i myograph eksperimenter som beskrevet i trin 2.1 til transport Krebs-Henseleit buffer med yderligere forbindelser, der vedrører kontraktilitet eksperimenter.
    BEMÆRK: Typisk 2 L vil være tilstrækkeligt for forsøgene beskrevet i denne artikel, men denne mængde kan være nødvendigt at øges eller reduceres baseret på længden af ​​forsøget, antal myograph kamre, og nummer buffer udskiftninger (i forhold til behandlingsmuligheder tilføjelser).
    1. Forud for gasning (trin 2.1.3), der tilsættes 9,1 mg (per L buffer forberedes) for desipramin-HCI til buffer.
    2. Forbered en 1,0 uM opløsning af propranolol-HCI, og der tilsættes 1 ml (per L buffer under udarbejdelse) af denne opløsning på Krebs-Henseleit bufferopløsning. Gør denne buffer på dagen for brug og holdes i myograph driftstemperaturer (en temperatur, der giver en 37,5 ° C temperatur i myograph).
      BEMÆRK: desipramin føjes til at hæmme de biogene amin reuptake mekanismerog tillade rydning af eksperimentelle tilføjelser fra bufferen badning blodkarrene til at ske hurtigere. Tilsætningen af ​​propranolol forhindrer den ikke-specifikke binding af behandling forbindelser, β-adrenerge receptorer.

3. Indsamling og klargøring af vaskulatur

  1. Så hurtigt som muligt, skal du fjerne mavetarmkanalen fra kroppen. Når dyret ikke længere udviser nogen ufrivillig refleks, fjern hovedet og skjule, og derefter hæve slagtekroppen lodret. Fjernelse af mave indvolde (spiserøret til endetarmen) fra kroppen skal udfyldes af godkendte slagterier personale (<20 min fra tidspunktet for bedøvelse).
    BEMÆRK: Hvor hurtigt, er generelt begrænset af placeringen / facilitet, hvor tarmkanalen bliver indsamlet fra og standardprocedurer eller føderalt mandat procedurer, der følges af faciliteten personale.
    1. I de fleste anlæg, foretage manipulationer i mavetarmkanalenpå et andet sted fra forarbejdning af slagtekroppen, som er bestemt til at komme ind i fødevareforsyningen. Brug en nærliggende hensigtsmæssigt sted, hvor mave-tarmkanalen kan tages og spredt ud til undersøgelse.
  2. Når mavetarmkanalen er spredt ud, identificere tyndtarmen ileocecal fold forbinder tyndtarmen til coecum og ileum flange, der strækker proksimalt ileocecal fold (figur 1A).
    1. Ved hjælp af en skalpel eller kniv, meget let lave et snit i mesenteriske membran i midten af ​​ileal flange. Ved hjælp af to pegefingeren, uden omsvøb dissekere væk fedt og bindevæv udsætte mesenterisk karsystem (Figur 1B).
  3. Fra denne flange eller bule i tarmsystemet mesenteriet, dissekere ud flere afdelinger (~ 2 cm i længden) af de eksponerede mesenteriske arterie og vene bundter, der understøtter denne del af ileum (figur 1C).
    1. Hvis usynge pincet til at gribe væv, sørge for at ikke forstå direkte eller trække på blodkarrene på alle, mens fjerne dem som enhver form for stretching kan skade og negativt påvirke væv ydeevne 14. Fjernelse blodkar gøres bedst ved at skære på tværs af hver ende af sektionen, der skal fjernes, og derefter skære ved siden af ​​eller parallelt med den nu isolerede afsnit. For at lette, fjerne nogle af det omgivende væv sammen med fartøjer at give nogle væv at gribe med en pincet.
    2. Med en tang, nedsænkes vævsprøve i et rør indeholdende iskold Krebs-Henseleit-buffer og opbevares på is, indtil behandlingen kan forekomme i laboratoriet.
  4. Placer vævsprøve på en skærende overflade eller i en petriskål og delvist nedsænkes i iskold Krebs-Henseleit.
    1. Brug af # 5 guldsmede pincet, Noyes iris saks, og forstørrelsesglas lampe eller dissekere anvendelsesområde (2,5 til 5,0X forstørrelse er tilstrækkeligt), forsigtigt dissekere væk omgivende fedt og connective væv og adskille arterie og vene. Identifikation af beholderen åbning ved den ene ende af sektionen og omhyggeligt forstå fascia omgiver beholderen med pincet.
    2. Lav et snit med saksen parallelt med beholderen ved at skubbe spidsen af ​​saksen under den hævede fascia. Efter den indledende indsnit kan fedt og bindevæv yderligere adskilles fra beholderen ved at skære ned på hver side med en saks. Sørg for, at skibene er så rene som muligt og samtidig minimere den tid skibene bruger på bænken.
    3. Retur blodkarrene til rør af frisk Krebs-Henseleit buffer og opbevares ved 4 ° C (prøverne kan forblive opbevares i op til 24 timer efter indsamling og stadig producere gyldige kontraktilitet data).
    4. Ved hjælp af et barberblad, at skive fartøj skal anvendes i myograph i ønskede antal 2-mm sektioner (det er nyttigt at bruge en væv pålægsmaskine at opnå konsekvente tværsnit).
    5. Undersøg hver sektion under et dissekere scoPE (12,5X forstørrelse) for at sikre, at hver sektion har ingen abnormiteter, grene, ventiler, eller overfladiske skader uforvarende gjort under dissektion og rengøring. Erstat afsnittet skibet, hvis der er noget unormalt, gren, ventil, eller overfladisk skade.
  5. Opbevar acceptable skiver sektioner fartøjer (nedsænket i Krebs-Henseleit buffer) på is eller ved 4 ° C indtil den er klar til montering i myograph kamre (normalt <30 min).
  6. Forsigtigt montere skib på myograph ved at indsætte støtterne gennem hulrummet og øge spændingen (ved hjælp af micropositioner på myograph) være omhyggelig med at ikke strække fartøjer over en 2 til 3 g læsning.
  7. Når alle kamre er omfattet, støvsuge bufferen fra alle kamre og fyld med 5,0 ml buffer, og start en 15 minutters timer til at begynde ækvilibreringsperioden og forsøget.

4. Eksperiment

  1. Ækvilibrer alle sektioner fartøj i 1,5 timer at opnå en stabil resTing spænding af 1,0 g.
    1. Udskift Krebs-Henseleit inkubationsbuffer hver 15 min.
    2. Under ækvilibrering konstant at justere spændingen på afsnittene blodkarrenes op til 2 g og får så lov til at slappe ned til cirka 0,80 g. Prøv ikke at tillade skibe at slappe for meget (de kan glide mounts). Prøv at opnå en stabil basislinje spænding, hvor et fartøj har 1 g spænding uden at kræve justering.
  2. Under ækvilibrering fremstille en vandig 1,32 M opløsning af KCl, der skal anvendes som reference.
  3. Efter afslutningen af ​​en tilfredsstillende ligevægt, tilsættes 500 pi af 1,32 M KCI-opløsning til at resultere i en 0,12 M opløsning i 5,5 ml opløsning badning fartøjet.
    1. Efter tilsætning af 1,32 M KCI, ikke justere spændingen manuelt som det maksimale respons fra denne tilsætning anvendes til at evaluere vævslevedygtighed og kan bruges til at normalisere behandlingsdata (fx koncentration svar på en engonist).
    2. Udskift buffer i 15-minutters intervaller, indtil spændingen er vendt tilbage til baseline værdi på 1,0 g.
  4. Når baseline er nået, ændre buffer og samtidig begynder en 1 min timeren. Gør dette for alle kamre samtidig for at undgå en forskydning af starttider.
    1. Vortex standard, der skal tilsættes, og forberede en kommentar til kammer 1 i 1 min nedtælling.
    2. Tilføj standarderne i 25 portioner ul til hvert kammer, da eksperiment dikterer (dette holder behandlingen under 0,5% af den samlede mængde).
    3. Når der er tilføjet den sidste standard, starter en 9 minutters timer.
    4. Ved afslutningen af ​​9 min standard inkubation fjernes behandling puffer fra kamrene, og der tilsættes 5,0 ml frisk buffer, og start 2,5 min timeren.
    5. Gentag trin 4.4.4.
    6. Ved slutningen af ​​den anden 2,5 min skyl, støvsuge kamre og tilføje frisk buffer, og start en 1 min timer til nedtælling påbegyndelsen af ​​second standard tilføjelse.
  5. Fortsæt denne cyklus for alle dagens standard tilføjelser.
  6. Under den afsluttende standard addition og efterfølgende 9 min inkubation forberede 1,32 M KCI henvisning forbindelse til en ende af køre henvisning dosis tilsætning af 500 pi.
  7. Efter 1 min interval efter den endelige behandling Desuden tilføje KCI og starte en 9 minutters timer.
    BEMÆRK: KCI tilføjelse er at bekræfte vævslevedygtighed ved afslutningen af ​​forsøget, og er nyttigt, hvis indgivelse af en behandling, der resulterer i ubetydelig reaktion.
  8. Ved afslutningen af ​​den sidste 9 min henvisning sammensatte inkubation, støvsuge eller fjerne buffer fra alle kamrene. Må ikke tilføje frisk buffer. Afslut eksperimentet.
  9. Gem figur fil, fjerne blodkar sektioner og bortskaffes korrekt, og følge oprydningen protokol (leveret af producenten og kan være lab specifik) ved myograph udstyr.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Blodkarrene bruges til at generere de inkluderede resultater blev indsamlet fra 6 holstenske stude (425 ± 8 kg) inden for en 3 ugers interval. Et eksempel på en typisk mesenteriske vene kontraktile reaktion på KCI og behandling tilføjelser stigende koncentration er vist i figur 2. Reaktionsgraden vil variere noget med størrelsen af beholderen (korreleret med størrelsen af donor dyr), men kan også blive påvirket (negativt) ved forkert håndtering (strækning) af skibene under indsamling og rengøring. Derfor er det vigtigt at observere en betydelig kontraktile reaktion i fartøjer eksponering for KCI. Hvis en ubetydelig reaktion observeres på dette punkt, er det ikke tilrådeligt at gå videre i proceduren med dette fartøj. Som det ses i 9 min inkubationsperioder i figur 2, er der trinvise stigninger i det svar, der svarer til stigende koncentrationer. Selv ønskeligt, at denne partikular eksperimentelle design, kan det ikke altid forekomme eller efterspurgt med andre behandlinger. KCl tilføjelse ved afslutningen af ​​eksperimentet, men ikke bruges i behandling af indsamlede data, er meget vigtig, da den bekræfter levedygtigheden af ​​vævet ved afslutningen af ​​forsøgsperioden (bliver mere vigtigt, hvis fartøjet ikke reagerer på enhver af behandlingen tilføjelser).

De data, der præsenteres i figur 2, registreres i gram spænding. Det er vigtigt at normalisere disse data til alle dyr-til-dyr og skib-til-skib variation minimere. Således, ud over at blive anvendt som en indikator for levedygtighed, er den maksimale KCI reaktion anvendes til at normalisere alle behandlingsgrupper tilføjelser. Dette skaber kontraktile respons data som en procentdel af den maksimale KCI. Dette er hvordan mesenteriske arterie og vene responskurver til stigende koncentration af 5-hydroxytryptamin (serotonin, figur 3) og noradrenalin (

Mesenterial vene respons på både 5-hydroxytryptamin (figur 3) og noradrenalin (figur 4) startede som negative værdier. Dette er et resultat af at korrigere den maksimale spænding registreres under hver 9 min inkubationstid ved baseline spænding registreres forud for den første KCI tilføjelse. Denne baseline korrektion sikrer, at alle små forskelle i spænding ikke er medtaget i analyserne og tillade data afspejler kun en ændring i spænding. Den negative værdi Resultaterne fra blodkar afslappende og slippe under præ-KCl basislinjeniveauer inden den efterfølgende behandling tilføjelse. Dette er især udbredt i venøse prøver, hvor den oprindelige koncentration af behandlingen eller agonist er for lave til at forårsage en kontraktile respons. Dette var ikke tilfældet for mig senteric arterie svar til enten biogene amin, som holdt spændingen over baseline, indtil fartøjet begyndte at reagerer på behandlingen tilføjelser. Denne forskel eksemplificerer forskellene i fartøjer på hver side af kapillærbane og hvorfor de blev begge betragtes som en del af dette bioassay.

Dette bioassay kan bruges til at vurdere vasoactivity af forbindelser på blodkar, der forsyner næringsstoffer til tyndtarmen samt blodkar transporterer absorberede næringsstoffer væk fra tyndtarmen. Data i figur 3 og 4 er enkle eksempler på, hvordan dette kan opnås. I tilfælde af 5-hydroxytryptamin (figur 3), var der ikke en forskel i den arterielle eller venøse kontraktile respons. Omvendt den kontraktile reaktion mesenterial vene til stigende koncentrationer af norepinephrin var større end mesenterial arterie.

gur 1 "FO: indhold-width =" 3in "src =" / filer / ftp_upload / 52020 / 52020fig1highres.jpg "width =" 300 "/>
Figur 1:. Et eksempel på kvæg tarmkanalen anvendes som kilde til mesenteriske blodkar Den røde stjerne angiver den synlige del af ileocecal fold i alle tre ruder som et referencepunkt. (A) Hele kanalen med den røde ovale angiver ileal flange, hvor udtagningen af vaskulatur indtraf. (B) udsættelse af mesenteriale vaskulær seng. (C) Iris saks peger i retning af en eksponeret gren af mesenteriske vene (synlig) og arterie (ikke synlig) lige før indsamling.

Figur 2
Figur 2: Eksempel på en koncentration svar på et mesenterial vene til stigende koncentrationer af noradrenalin (1 × 10 -7 til 1× 10 -4 M). De store begivenheder i begyndelsen og slutningen af ​​sporet er svar på de 0,12 M KCl tilføjelser. Den røde rektangel betyder dataindsamling område, der svarer til 9 minutters inkubationstid for hver behandling tilsætning. De 3 slanke pigge, der følger denne er artefakter genereret af buffer udskiftninger og er ikke medtaget i analysen. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3
Figur 3: Mean kontraktile reaktioner mesenterialarterie (MA) og vene (MV, n = 6 stude) til stigende koncentrationer af 5-hydroxytryptamin (serotonin) linjer viste blev genereret under anvendelse af ikke-lineær regressionsanalyse at tilpasse dataene til en S-formet. Koncentration R-esponse kurve, som anvendes følgende ligning: y = bund + [(top - bund) / (1 ​​+ 10 (logEC 50 - x))], hvor top og bund er den procentdel af 120 mM KCI maksimale kontraktile respons ved plateauer, og EC50 er den molære koncentration af alkaloid producerer 50% af KCl maksimal respons.

Figur 4
Figur 4: Mean kontraktile reaktioner mesenterialarterie (MA) og vene (MV, n = 6 stude) til stigende koncentrationer af noradrenalin linjer viste blev genereret under anvendelse af ikke-lineær regressionsanalyse at tilpasse dataene til en S-formet koncentrations-responskurven, som udnyttes. følgende ligning: y = bund + [(top - bund) / (1 ​​+ 10 (logEC 50 - x))], hvor top og bund er den procentdel af 120 mM KCI Maksimal contractile reaktion på plateauer og EC50 er den molære koncentration af alkaloid producerer 50% af KCl maksimal respons.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den første udfordring i udviklingen af ​​dette bioassay var etableringen af ​​en gentagelig indsamlingssted for mesenterisk kar. Prøvested konsistens er kritisk, da nogle af de funktioner i tyndtarmen ændres under progression fra jejunum gennem ileum og dermed mesenterium varierer i et lignende mønster. Ileal grene af mesenterialarterie og vene var den mest let identificeres gennem anatomiske vartegn. Ved at placere coecum og efter ileocecal fold til sin endestation på venstre side af mesenteriet, er nær afslutningen af den kraniale mesenterialarterie 15. Arealet af længere mesenterium (det såkaldte flange) og udvidelsen af ileocecal gange (unik for kreatur) 16 gjort prøvetagning på tværs af en lang række dyr meget repeterbare. En af de større faldgruber, der kan gøres, er på denne fase af bioassay. Mekanisk strækning har en stor negativ indvirkning på den efterfølgende fartøj pPFYLDELSE 14 og forskeren vil bemærke, at fartøjer, der er alt for manipulerede eller strakt under fjernelse og efterfølgende rengøring ikke vil reagere på henvisningen forbindelsen, der anvendes. Dette desværre er den eneste måde at virkelig evaluere kvaliteten af ​​det vaskulære forberedelse på funktionsniveau og fartøjer, der ikke reagerer på KCl bør ikke betragtes videre til generering af pålidelige data.

To andre metodevalidering trin (ikke vist), der førte til den sidste metode præsenteret heri var anvendelsen af ​​andre kemikalier som referenceforbindelser og teste levedygtigheden af ​​blodkar efter 24 timers opbevaring. Noradrenalin og serotonin blev vurderet som referencestoffer, men reaktion fra mesenterialarterie og vene var for variabel tværs skibstype og på tværs af dyr for dem at anvendes med succes. Omvendt tilsætning af 120 mM KCI resulterede i en meget reproducerbar reaktion på tværs af både arterie og vene præparater. EnLSO, og -vene svar blev evalueret dagen for indsamling og revurderet 24 timer efter indsamlingen, og der var ingen forskelle i agonist reaktion ved enten arterien eller venen. Dette var et vigtigt aspekt af bioassayet, da der ofte er et stort antal behandlinger (eller forskellige behandlingsmetoder kombinationer), der kan anvendes, men forskerne er begrænset af plads på myograph og tid. Ved forlængelse af levedygtighed ud 24 timer fra indsamling, er det tid til yderligere eksperimenter steget kraftigt.

Det er vigtigt for forskeren at forstå fleksibiliteten af ​​behandlingen struktur anvendt på denne bioassay. En forsker kan tilføje hvilken som helst forbindelse til inkubationsbufferen, at han eller hun er interesseret i kronisk udsætte blodkarrene til for at styre noget af biologisk relevans eller som en behandling (i tilfælde af Klotz et al. 17, blev det gjort med laterale saphenous vener kontinuerligt udsættes for ketanserin, som antagoniserede en serotoninreceptor af renter). De mesenteriske blodkar kunne forbehandles med en forbindelse af interesse, før udførelse af et kontraktilt respons eksperiment. Bioassayet, som blev præsenteret, var designet til at foretage en kumulativ koncentration respons eksperiment ser på meldrøjealkaloider som agonister, og om forudgående eksponering via kosten for ergotalkaloider påvirket vaskulære respons 18. De repræsentative resultater viser, at denne metode kan producere en målbar vaskulær respons og kun fire koncentrationer blev brugt til at opnå dette. I tilfælde af Egert et al. 18, der var op til 10 forskellige koncentrationer, der anvendes til at konstruere en responskurve. Denne metode er en måde at evaluere et stort antal forskellige forbindelser eller receptorer på blodkar fra et enkelt dyr i et lille tidsvindue.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Omtale af handelsnavn, proprietære produkt, eller bestemt udstyr udgør ikke en garanti eller garanti af USDA og indebærer ikke godkendelse til udelukkelse af andre produkter, der kan være til rådighed.

Acknowledgments

Forfatterne anerkender Ryan Chaplin og Dr. Gregg Rentfrow fra University of Kentucky Meats Lab og Institut for Husdyrbiologi og Fødevarevidenskab for at skabe mulighed for at indsamle eksperimentelle væv anvendes heri.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Multi Myograph Danish Myo Technologies 610M A myograph is critical to this bioassay, but there are other platforms available for use that will suffice. 
Powerlab 8/sp ADIntruments ML785
LabChart 7 ADInstruments Version 7
Force Calibration Kit Danish Myo Technologies 100055 Specific to DMT myographs
Bottle-top Filter Nalgene 595-4520 0.22 μm pore size; 45 mm neck size
#5 Jewler’s Forceps Miltex 555008FT Any brand of forceps can be used
Noyes Iris Scissors Miltex 18-1510 Any brand of scissors can be used
Dissecting Scope Zeiss Stemi 2000-C Any brand of dissecting light microscope will suffice
Adjustable Tissue Matrice Braintree Scientific TM C12 This is not critical to the assay, but greatly reduces section to section variation in length and speeds up the slicing process greatly
Krebs-Hensleit Buffer Sigma-Aldrich K3753-10x1L It is not necessary to buy Krebs, this can be made in house
Calcium chloride dehydrate Sigma-Aldrich C7902-500G
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich S5761-500G
Desipramine-HCl Sigma-Aldrich D3900-5G
Propranolol-HCl Sigma-Aldrich P0884-1G
KCl Sigma-Aldrich P9333-500G
95% O2/5% CO2 Scott Gross UN3156

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Matheson, P. J., Wilson, M. A., Garrison, R. N. Regulation of intestinal blood flow. The Journal of surgical research. 93, 182-196 (2000).
  2. Dobson, A. Blood flow and absorption from the rumen. Quarterly journal of experimental physiology. 69, 599-606 (1984).
  3. Mulvany, M. J., Halpern, W. Mechanical properties of vascular smooth muscle cells in situ. Nature. 260, 617-619 (1976).
  4. Nielsen-Kudsk, F., Poulsen, B., Ryom, C., Nielsen-Kudsk, J. E. A strain-gauge myograph for isometric measurements of tension in isolated small blood vessels and other muscle preparations. Journal of pharmacological. 16, 215-225 (1986).
  5. Mulvany, M. J., Aalkjaer, C. Structure and function of small arteries. Physiological reviews. 70, 921-961 (1990).
  6. Klotz, J. L., et al. Assessment of vasoconstrictive potential of D-lysergic acid using an isolated bovine lateral saphenous vein bioassay. Journal of animal science. 84, 3167-3175 (2006).
  7. Klotz, J. L., Bush, L. P., Strickland, J. R. A vascular contractility bioassay using bovine right ruminal artery and vein. Journal of animal science. 89, 1944-1951 (2011).
  8. Westendorf, M. L., et al. In vitro and in vivo ruminal and physiological responses to endophyte-infected tall fescue. Journal of dairy science. 76, 555-563 (1993).
  9. Strickland, J. R., et al. Board-invited review: St. Anthony"s Fire in livestock: causes, mechanisms, and potential solutions. Journal of animal science. 89, 1603-1626 (2011).
  10. Eckert, H., Kiechel, J. R., Rosenthaler, J., Schmidt, R., Schreier, E. Ch. 11. Ergot Alkaloids and Related Compounds. B, B. erde, HO, S. child Springer-Verlag. (1978).
  11. Rhodes, M. T., Paterson, J. A., Kerley, M. S., Garner, H. E., Laughlin, M. H. Reduced blood flow to peripheral and core body tissues in sheep and cattle induced by endophyte-infected tall fescue. Journal of animal science. 69, 2033-2043 (1991).
  12. Foote, A. P., Harmon, D. L., Strickland, J. R., Bush, L. P., Klotz, J. L. Effect of ergot alkaloids on contractility of bovine right ruminal artery and vein. Journal of animal science. 89, 2944-2949 (2011).
  13. Foote, A. P., et al. Ergot alkaloids from endophyte-infected tall fescue decrease reticuloruminal epithelial blood flow and volatile fatty acid absorption from the washed reticulorumen. Journal of animal science. 91, 5366-5378 (2013).
  14. Hocking, K. M., et al. Detrimental effects of mechanical stretch on smooth muscle function in saphenous veins. Journal of vascular surgery. 53, 454-460 (2011).
  15. Smith, D. F. Bovine intestinal surgery. Modern veterinary practice. 65, 705-710 (1984).
  16. Budras, K. D., Habel, R. E. Bovine Anatomy An Illustrated Text. first, Schlütersche GmbH and Co. KG, Verlag and Druckerei. (2003).
  17. Klotz, J. L., et al. Antagonism of lateral saphenous vein serotonin receptors from steers grazing endophyte-free, wild-type, or novel endophyte-infected tall fescue. Journal of animal science. 91, 4492-4500 (2013).
  18. Egert, A. M., Kim, D. H., Schrick, F. N., Harmon, D. L., Klotz, J. L. Dietary exposure to ergot alkaloids decreases contractility of bovine mesenteric vasculature. Journal of animal science. 92, 1768-1779 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics