Isolierung und Verwendung von Rinder Abschnitte A. und V. mesenterica als Bioassay für Vasoaktivität im Dünndarm Testen

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Summary

Der Dünndarm wird häufig Giftstoffe, die den Blutfluss zu beeinflussen, und kann sich negativ auf die Nährstoffabsorption ausgesetzt. Mit Hilfe eines multimyograph und A. und V. mesenterica isoliert, Verbindungen oder Giftstoffe von Interesse für Vasoaktivität abgeschirmt werden.

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Klotz, J. L., Barnes, A. J. Isolating and Using Sections of Bovine Mesenteric Artery and Vein as a Bioassay to Test for Vasoactivity in the Small Intestine. J. Vis. Exp. (92), e52020, doi:10.3791/52020 (2014).

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Abstract

Säugerverdauungssysteme ständig zu Verbindungen (erwünschte und unerwünschte), die eine Wirkung auf den Blutfluss zu und von dem System auswirken können. Veränderungen im Blutfluss in den Dünndarm kann Auswirkungen auf die absorptive Funktion des Organs führen. Besonderes Interesse an der Giftstoffe aus Futtermitteln durch fermentative und Verdauungsprozesse befreit hat bei Wiederkäuern als Bereich, in dem produktive Effizienz verbessert werden könnte entwickelt. Das Video zu diesem Artikel unter beschreibt, um Verbindungen für Vasoaktivität in isolierten Querschnitte von Rindern A. und V. mesenterica mit einem multimyograph entwickelte einen in vitro-Bioassay. Sobald die Blutgefäße angebracht sind und in der Myographions ins Gleichgewicht gebracht, kann der Bioassay selbst verwendet werden: als Screening-Tool, um die Kontraktionsreaktion oder Vasoaktivität von Verbindungen von Interesse zu bewerten; bestimmen das Vorhandensein von Rezeptortypen von pharmakologisch Targeting-Rezeptoren mit spezifischen Agonistens; Bestimmung der Funktion eines Rezeptors mit der Anwesenheit von einem oder mehreren Antagonisten; oder zu bestimmen, mögliche Wechselwirkungen von Verbindungen von Interesse mit Antagonisten. Durch all diese werden Daten in Echtzeit gesammelt werden, kann Gewebe von einem einzigen Tier gesammelt, um eine große Anzahl von verschiedenen experimentellen Behandlungen (ein Vorteil in vitro) ausgesetzt werden, und stellt Gefßsystem zu beiden Seiten des kapillaren Bett eine genaue bereitzustellen Bild dessen, was könnte in der zu-und abführenden Blutversorgung unterstützen den Dünndarm passiert werden.

Introduction

Veränderungen im Blutfluss zu einem Gewebe Bett kann einen großen Einfluss auf die Organfunktion. Eine primäre Funktion des Dünndarms ist Nährstoffabsorption. Arteriellen Blutfluss in den absorbierenden Oberfläche des Darms erforderlich für die Nährstoffaufnahme und Blutfluss erhöht, um in der Nährstoffabsorption Verdauungs bewegt sich entlang der Oberfläche 1 zu unterstützen. Eine Abnahme des Blutflusses kann eine Verringerung der Nährstoffabsorption aufgrund einer Abnahme in der transepithelialen Gradient 2 verursachen. Neben Nährstoffen kann die Dünndarm auch sekundäre Metaboliten, Medikamenten oder Toxinen, die sich auf lokale Durchblutung im Mesenterium ausüben ausgesetzt werden. In dem Fall des Wiederkäuers können Verbindungen aus einer Futter freigesetzt werden (beispielsweise Nährstoffe, wie Aminosäuren, oder Toxine, wie Mutterkornalkaloide) durch fermentative Prozesse der Vorderdarm. Wenn diese Verbindungen überleben den mikrobiellen Stoffwechsel der Pansenfermentation, sind sie nun für die Absorption verfügbaroder Interaktion während sie sich durch den Magen-Darm-Trakt des Tieres.

Es gibt eine Reihe verschiedener Methoden zur Verfügung, um den Blutfluss in vivo zu messen (zum Beispiel Doppler-Ultraschall, Dauerblutflussmesser, radioaktiv markierte Mikrokügelchen und Indikator-Verdünnungsverfahren), die Bewertung der verschiedenen experimentellen Szenarien oder Behandlungen zu ermöglichen. Allerdings sind Angaben zu den mechanischen oder pharmakologischen Eigenschaften der glatten Gefäßmuskulatur zu erhalten, blieb Methoden beschränkt sich auf große Schiffe bis Mulvany und Halpern 3 einen Artikel veröffentlicht, beschreibt eine Technik, mit Draht befestigt Gefäßring Zubereitungen in einer Myographions. Seit der Entwicklung dieser Technik Modifikationen weiterhin den zugehörigen Myographions Systeme, die eine Vielzahl von verschiedenen Anwendungen für die Bewertung der röhrenförmigen Strukturen zulassen werden. Das System wurde angepasst, um feste Stäbe für die Montage größerer Schiffe 4, wo Perfusion nutzenTechniken sind nicht erwünscht.

Wegen der Unterschiede in Gefäßen aus verschiedenen anatomischen Ursprung und Auszeichnungen in den gleichen Gefäßen aus verschiedenen Tierarten, Daten aus Tiergefäß und Typ kann nicht einfach über verschiedene Gefäße oder demselben Schiff in verschiedenen Tierarten 5 extrapoliert werden. Folglich müssen getrennte Biotests entwickelt und validiert diese Aspekte jederzeit geändert werden werden. Kürzlich haben mehrere Biotests mit diesen Technologien für den Einsatz in der Rinder Vena saphena und rechten Pansen Arterie und Vene 6,7 entwickelt lateral.

Diese Bioassay wurde entwickelt, um speziell zu untersuchen, welche Auswirkungen die Mutterkornalkaloide haben am Gefäßsystem unterstützt den Dünndarm. Es wurde berichtet, dass 50-60% der zugeführten Alkaloide in abomasale Inhalte angezeigt werden, aber nur 5% sind im Kot 8 gewonnen. Strickland et al. 9 erklärte in einer Überprüfung der Mutterkornalkaloide, dass die verfügbaren Daten Suggest, dass der Dünndarm kann der wichtigste Standort für ergopeptine Absorption. Eckert et al. Prüft biopharmazeutisches 10 Aspekte der Mutterkornalkaloide und erklärte, dass, sobald sie die epitheliale Barriere zu überschreiten, Mutterkornalkaloide sind entweder durch Lymphsystem in die V. subclavia oder über mesenterica und in Portal Blut transportiert. Rhodes et al. 11 verzeichnete einen Rückgang des Blutflusses zum Zwölffingerdarm und Dickdarm in Ochsen Verzehr einer hohen endophyteninfizierten (hohe Ergotalkaloid) Ernährung. Mit der rechten Pansen Arterie und Vene-Bioassay, Foote et al. Gezeigt, dass 12 Mutterkornalkaloide sind vasoaktive in Pansengefäßsystem. Foote et al. 13 anschließend in vivo gezeigt, dass die ruminale Einwirkung Mutterkornalkaloide zu einer verringerten Pansen epithelialen Durchblutung. Diese Verringerung des Blutflusses zu der Absorptionsfläche der Pansen gleichzeitig eine Reduzierung der Nährstoff (flüchtige Fettsäure) Fluss. Angesichts der quantity der Mutterkorn-Alkaloide Weitergabe an den Dünndarm aus dem Vorderdarm; es wurde angenommen, daß eine ähnliche Wirkung auf Dünn Vaskulatur und Nährstoffabsorption auftreten würde. Dies erforderte die Entwicklung der Rinder proximalen Ileum A. und V. mesenterica Bioassay.

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Protocol

Verfahren in dieser Studie verwendeten nicht bedürfen der Zustimmung der Universität von Kentucky Animal Care und Use Committee, weil keine lebenden Tiere verwendet wurden. Vor der Entnahme einer Probe hier verwendet wird, wurden alle Tiere mit einem Bolzenschuss betäubt und ausgeblutet. Dies wurde auf einer staatlich untersuchten Schlachthaus-Anlage an der Universität von Kentucky durchgeführt. Ein offizieller Vertreter der USDA Nahrungsmittelsicherheit und Kontrolle Service beobachtet alle Aktivitäten, die mit dem lebenden Tier und die Handhabung des Schlachtkörpers behandelt.

1. Vorbereitung der Besetzung

  1. Um die Menge der Zeit zwischen Sammlungen von Gewebeproben zu Beginn eines Experiments, einzurichten Geräte zu minimieren und vor vorzubereiten Puffer zu sammeln experimentellen Gewebe (oder, wenn zusätzliches Personal zur Verfügung stehen, können diese Aufgaben gleichzeitig auftreten).
    HINWEIS: Dieser bietet nicht nur die größte Menge an Zeit, die das Gewebe lebensfähig bleibt, Experimente durchzuführen, aber einigeExperimente können für lange Zeitperioden ausgeführt werden (oder es besteht der Wunsch, mehrere Experimente in einem Tag vollständig), daher ist es gewöhnlich wünschenswert, so früh wie möglich zu beginnen.
  2. Schalten Sie den Computer verbunden, Datenübernahmen Ausrüstung, Wasser-Bad (für Puffer (s)) und Myographions Einheit (en). Legen Sie die Kalibrierungsgeräte auf der Myographions Einheit (en), und schalten Sie Myographions Wärme (voreingestellt auf 37,5 ° C) und lassen Einheiten und Kalibrierungsausrüstung erwärmen Temperaturen eingestellt.
    1. Öffnen Sie ein zuvor erstelltes Diagramm Software-Einstellungen-Datei auf dem Computer ein und starten einen Lauf (aber nicht der Datenerfassung).
  3. Aufwärmen der Ausrüstung für 10 min.
    1. Datenerfassung beginnen.
    2. Null alle Kanäle.
    3. Zu überprüfen, und führen die Kalibrierung (falls erforderlich) auf jedem Kanal (4 Kanäle pro multimyograph), um die von der jeweiligen Kraftaufnehmer mit diesem Kanal zu einem Gewicht von einem zertifizierten geliefert 2-g-Kraft verbunden gelieferte elektrische Signal zu standardisieren.
    4. Nach Kalibrierung und ein Einheiten Umwandlung abgeschlossen sind, speichern Sie alle nachfolgenden Daten als Gramm. Entsprechend ändern, basierend auf Wünsche jedes einzelnen Labor; Ausrüstung und Software ermöglichen die Verwendung von anderen Einheiten, wie Millinewton und Volt.
  4. Stellen Sie sicher, dass die Gasleitungen sind frei von Blockaden und schalten Sie Gasversorgung (95% O 2/5% CO 2) bis (e) Einheiten Myographions. Gas kontinuierlich alle Puffer (in den Kammern Myographions) während des gesamten Verfahrens.
  5. Füllen Sie alle Myographions Kammern mit 70% Ethanol und genießen für 10 min, Ethanol entfernen, und wiederholen Sie für eine zweite 10 Minuten einweichen.
    1. Nach Entfernen des Ethanols gründlich dreimal mit entionisiertem Wasser, gefolgt von drei Spülungen mit vorbereiteten Puffer (siehe Abschnitt 2 zur Herstellung Puffer), so dass die dritte Zugabe von Puffer in den Kammern.
      HINWEIS: An dieser Stelle kann das Gerät im Leerlauf in diesem Zustand, bis Puffer und Gewebe hergestellt und Personal steht bereit, um mit den experimen gehent.

2. Herstellung von Puffern

  1. Eine 1 l Krebs-Henseleit-Pufferlösung zur Verwendung bei Transport und Verarbeitung von Gewebeproben, um Endkonzentrationen von 11,1 mM D-Glucose zu erreichen; 1,2 mM MgSO4; 1,2 mM KH 2 PO 4; 4,7 mM KCl; 118.1 mM NaCl; 3,4 mM CaCl 2; 24,9 mM NaHCO 3.
    1. Mischen 9,6 g Krebs Salze in etwa 900 ml VE-Wasser auf einer Rührplatte.
    2. Mischen in 0.373 g Calciumchlorid-Dihydrat, gefolgt von 2,1 g Natriumhydrogencarbonat pro Liter Puffer gewünscht.
    3. Gaspufferlösung für 20 Minuten mit 95% O 2/5% CO 2.
    4. Nach Begasung, pH-Wert auf 7,05 (Filtration von Puffer erhöht pH-Wert; endgültige Ziel pH-Wert sollte 7,4 sein), und stellen Sie die Lautstärke auf 1 L
    5. Filter sterilisieren Puffer in einem sauberen autoklaviert 1 L Flasche und Medienspeicherpuffer bei 4 ° C bis zur Verwendung.
  2. Bereiten separaten Krebs-HEnseleit Pufferlösung zur Verwendung in Myographions Experimente wie in Schritt 2.1 zum Transport Krebs-Henseleit-Puffer mit zusätzlichen Verbindungen, die an die Kontraktilität Experimente betreffen beschrieben.
    HINWEIS: In der Regel 2 L wird für die in diesem Artikel beschriebenen Versuche genügen, aber dieses Volumen muss möglicherweise erhöht oder bezogen auf die Länge des Experiments reduziert werden, die Anzahl der Myographions Kammern und die Anzahl Puffer Ersatz (bezogen auf die Behandlung Ergänzungen).
    1. Vor der Vergasung (Schritt 2.1.3), fügen Sie 9,1 mg (pro l Puffer in Vorbereitung) von Desipramin-HCl zu puffern.
    2. Bereiten Sie eine 1,0 uM Lösung von Propranolol-HCl und 1 ml (pro Liter Puffer in Vorbereitung) dieser Lösung in der Krebs-Henseleit-Pufferlösung. Machen Sie diesen Puffer auf dem Tag der Nutzung bringen und Myographions Betriebstemperaturen (eine Temperatur, die mit 37,5 ° C Temperatur im Myographions ergibt).
      HINWEIS: Die Desipramin wird hinzugefügt, um die Wiederaufnahme-Mechanismen biogenes Amin hemmenund lassen Clearing von experimentellen Zugänge aus dem Puffer Baden der Blutgefäße schneller auftreten. Die Zugabe von Propranolol verhindert die unspezifische Bindung von Behandlungs Verbindungen an Rezeptoren-adrenergen β.

3. Sammlung und Herstellung von Gefäßsystem

  1. So bald wie möglich, entfernen Sie den Magen-Darm-Trakt von der Karkasse. Sobald das Tier nicht mehr weist jede unfreiwillige Reflex, entfernen Sie den Kopf und verstecken und heben Sie dann den Korpus vertikal. Entfernung des Magen-Darm-Eingeweide (Speiseröhre bis zum Anus) von den Schlachtkörper von zugelassenen Schlachthof Personal (<20 min von der Zeit des Betäubung) durchgeführt werden.
    HINWEIS: Wie schnell, wird in der Regel durch die Lage / Einrichtung, in der Darmtrakt ist gegen und Standardarbeitsanweisungen oder Bund beauftragt Verfahren, gefolgt von den Anlagenpersonal gesammelt beschränkt.
    1. In den meisten Einrichtungen, führen Manipulationen des Magen-Darm-Traktan einem separaten Ort von der Verarbeitung des Tierkörpers, die bestimmt ist, die Nahrungsmittelversorgung ein. Verwenden Sie eine günstige Lage in der Nähe, wo der Magen-Darm-Trakt aufgenommen und kann zur Prüfung verteilt werden.
  2. Sobald der Magen-Darm-Trakt ist ausgebreitet, identifizieren den Dünndarm, die ileozökalen fach Anschluss des Dünndarms zu Blinddarm und die Ileum-Flansch, der sich proximal der Bauhin fache (Abbildung 1A).
    1. Mit einem Skalpell oder Messer, sehr leicht einen Einschnitt in der mesenterialen Membran in der Mitte des Ileum-Flansch. Mit beiden Zeigefinger, unverblümt sezieren entfernt die Freilegung der mesenterialen Gefäßsystem (Abbildung 1B) Fett und Bindegewebe.
  3. Von diesem Flansch oder Ausbuchtung in der Darm Gekröse, sezieren mehrere Zweige (~ 2 cm in der Länge) der exponierten A. und V. mesenterica Bündel, die diesen Teil des Ileum (1C) zu unterstützen.
    1. Wenn usingen Pinzette, um Gewebe zu erfassen, achten Sie darauf, nicht direkt erfassen oder ziehen auf die Blutgefäße überhaupt beim Entfernen sie wie jede Art von Strecken kann beschädigt werden und negativ beeinflussen Gewebe Leistungs 14. Blutgefäß Entfernung geschieht am besten, indem über jedem Ende des Abschnitts zu entfernen und dann Schneiden neben oder parallel zu der jetzt isoliert Abschnitt. Für eine einfache, entfernen Sie einige der umliegenden Gewebe zusammen mit Gefäßen etwas Gewebe mit einer Pinzette fassen zu schaffen.
    2. Mit einer Pinzette, tauchen Gewebeprobe in einem Röhrchen mit eiskaltem Krebs-Henseleit-Puffer und Lagerung auf Eis, bis die Verarbeitung kann im Labor erfolgen.
  4. Platzieren Gewebeprobe auf einer Schneidfläche oder in eine Petrischale und teilweise in eiskaltem Krebs-Henseleit einzutauchen.
    1. Mit # 5 Juweliere Zangen, Noyes Iris Schere, und Lupenleuchte oder Binokular (2,5 bis 5,0-fache Vergrößerung ist ausreichend), sorgfältig sezieren entfernt die umgebende Fett und connective Gewebe und trennen die Arterie und Vene. Identifizieren des Gefäßöffnung an einem Ende des Abschnitts und sorgfältig erfassen die Blende um den Behälter mit der Zange.
    2. Machen Sie einen Schnitt mit der Schere auf das Schiff parallel, indem die Spitze der Schere unter der Faszie angehoben. Nach dem anfänglichen Schnitt, das Fett und Bindegewebe kann weiterhin aus dem Gefäß durch eine Senkung auf beiden Seiten mit einer Schere getrennt werden. Sicherzustellen, dass die Behälter auch so rein wie möglich bei gleichzeitiger Minimierung der Menge an Zeit, die Behälter zu verbringen auf der Bank.
    3. Blutgefäße zurück, um Rohre von frischen Krebs-Henseleit-Puffer und bei 4 ° C (Proben können für bis zu 24 Stunden nach der Sammlung gespeichert bleiben und immer noch gültig Kontraktilität Daten zu erzeugen).
    4. Mit einer Rasierklinge, um die Schichtbehälter in Myographions in die gewünschte Anzahl der 2-mm-Abschnitte verwendet werden (es ist hilfreich, um eine Gewebeschneidemaschine verwenden, um konsistente Querschnitte zu erhalten).
    5. Untersuchen Sie jeden Abschnitt unter einem Präparations scope (12,5-fach Vergrößerung), um sicherzustellen, dass jeder Abschnitt hat keine Auffälligkeiten, Äste, Ventile, oder oberflächliche Schäden versehentlich bei der Präparation und Reinigung getan. Ersetzen Sie die Gefäßabschnitt, wenn es irgendeine Anomalie, Zweig, Ventil oder oberflächliche Schäden.
  5. Shop akzeptabel geschnitten Gefäßabschnitte (in Krebs-Henseleit-Puffer eingetaucht) auf Eis oder bei 4 ° C bis bereit für die Montage in Myographions Kammern (meist <30 min).
  6. Montieren Sie vorsichtig das Schiff auf der Myographions, indem Sie die Stützen durch das Lumen und erhöhen die Spannung (unter Verwendung der auf der Mikropositionierer Myographions) vorsichtig, um die Gefäße über eine 2 bis 3 g Lesung nicht strecken.
  7. Nachdem alle Kammern abgedeckt sind, saugen den Puffer aus allen Kammern und füllen mit 5,0 ml Puffer und starten Sie eine 15-min-Timer, um die Gleichgewichtsperiode und das Experiment zu beginnen.

4. Experiment

  1. Ins Gleichgewicht alle Gefäßabschnitte 1,5 h, um eine stabile res zu erreichenting Spannung von 1,0 g.
    1. Ersetzen Sie den Krebs-Henseleit Inkubationspuffer alle 15 min.
    2. Während der Gleichgewichtseinstellung, ständig die Spannung auf die Blutgefäßabschnitte anpassen bis zu 2 g und lassen Sie sich zu entspannen auf ca. 0,80 g. Versuchen Sie nicht, damit Schiffe zu viel um sich zu entspannen (sie können die Halterungen rutschen). Versuchen Sie, eine stetige Ausgangsspannung, wenn das Schiff hält 1 g Spannung ohne Anpassung erfordern erreichen.
  2. Während der Gleichgewichtseinstellung, bereiten eine wässrige 1,32 M KCl-Lösung als Referenz verwendet werden.
  3. Nach der Beendigung eines zufriedenstellenden Gleichgewichts, 500 ul des 1,32 M KCl-Lösung in einer 0,12 M Lösung in 5,5 ml Lösung Baden des Gefäßes führen.
    1. Nach der Zugabe der 1,32 M KCl, nicht die Spannung manuell einstellen als die maximale Reaktion, die auf dieser Addition wird verwendet, um die Gewebelebensfähigkeit zu bewerten und um eine A verwendet, um Behandlungsdaten normalisiert werden (zB Konzentration Antwortengonist).
    2. Ersetzen Sie den Puffer in 15-Minuten-Intervallen, bis Spannung wurde auf die Baseline-Wert von 1,0 g zurück.
  4. Sobald Baseline erreicht wird, ändern Sie den Puffer und gleichzeitig beginnt eine 1 min-Timer. Tun Sie dies für alle Kammern gleichzeitig eine Staffelung der Startzeiten zu vermeiden.
    1. Mischen Sie den Standard aufgenommen werden und bereiten einen Kommentar für Kammer 1 während der 1 min Countdown.
    2. Hinzufügen der Standards in 25 ul Aliquots jeder Kammer als Experiment Diktat (somit die Behandlung unter 0,5% des Gesamtvolumens).
    3. Wenn der letzte Standard hinzugefügt wurde, starten Sie eine 9 min-Timer.
    4. Am Ende der 9 min Inkubation Standard, entfernen Sie die Behandlung mit Puffer von den Kammern und 5,0 ml frischem Puffer, und starten Sie die 2,5 min-Timer.
    5. Wiederholen Sie Schritt 4.4.4.
    6. Am Ende des zweiten 2,5 min Spülen, Saugen, die Kammern und fügen Sie frischen Puffer, und starten Sie einen 1-min-Timer, um den Beginn der SECON CountdownD Standard hinaus.
  5. Wiederholen Sie diesen Zyklus für alle Standard-Ergänzungen des Tages.
  6. Während der letzten Standardaddition und anschließende 9 min Inkubation bereiten die 1,32 M KCl Referenzverbindung für ein Ende der Laufreferenzdosis Zugabe von 500 ul.
  7. Nach der 1 min Intervall nach der letzten Behandlung hinaus, fügen Sie die KCl und starten Sie eine 9 min-Timer.
    HINWEIS: Die KCl hinaus ist die Lebensfähigkeit des Gewebes auf den Abschluss des Experiments bestätigen, und ist hilfreich, wenn die Verwaltung eine Behandlung, die nur in vernachlässigbaren Reaktion führt.
  8. Zum Abschluss des letzten 9 min Referenzverbindung Inkubation Vakuum oder entfernen Puffer aus allen Kammern. Fügen Sie keine frischen Puffer. Abschluss des Experiments.
  9. Sparen Diagramm-Datei, entfernen Blutgefäßabschnitte und fachgerecht entsorgen, und folgen Sie den sauberen up-Protokoll (vom Hersteller zur Verfügung gestellt und können spezifisch sein Labor) für Myographions Ausrüstung.

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Representative Results

Die zur Herstellung der enthaltenen Ergebnisse erzeugen Blutgefäße wurden aus 6 Holstein Ochsen (425 ± 8 kg) innerhalb von 3 Wochen-Intervall gesammelt. Ein Beispiel eines typischen mesenterica kontraktilen Reaktion auf KCl und Behandlung Zusätze Erhöhung der Konzentration ist in Abbildung 2 dargestellt. Die Größenordnung der Reaktionen einige mit der Größe des Behälters (mit der Größe des Spendertieres korreliert) zu variieren, kann aber auch durch unsachgemäße Behandlung beeinflusst werden (negativ) (Dehnung) der Gefäße bei der Sammlung und Reinigung. Daher ist es wichtig, einen wesentlichen kontraktile Reaktion in den Gefäßen Einwirkung KCl beobachten. Wenn eine vernachlässigbare Reaktion an dieser Stelle zu beachten, ist es nicht ratsam, weiter in dem Verfahren mit dem Behälter stattfindet. Wie in den 9 min Inkubationszeit in 2 zu sehen, gibt es inkrementale Erhöhungen in der Antwort, die mit steigenden Konzentrationen entsprechen. Obwohl für diese insbeson wünschenswertdere experimentellen Design, kann es nicht immer auftreten, oder nach mit anderen Behandlungen gesucht werden. Die KCl-Zugabe am Ende des Experiments, die aber nicht bei der Verarbeitung der gesammelten Daten verwendet werden, ist sehr wichtig, da sie die Lebensfähigkeit des Gewebes bestätigt am Ende der Versuchsperiode (wird wichtiger, wenn der Behälter nicht reagiert irgendeinem der Behandlungs Ergänzungen).

Die in 2 gezeigten Daten sind in Gramm Spannung aufgezeichnet. Es ist wichtig, diese Daten zu normalisieren, um ein Tier zu Tier und Schiff-zu-Schiff Variation zu minimieren. So ist neben der Verwendung als ein Indikator für die Lebensfähigkeit verwendet, wird die maximale KCl Reaktion verwendet, um alle Behandlungs Ergänzungen zu normalisieren. Dies erzeugt kontraktile Antwort-Daten als Prozentsatz der maximalen KCl. Dies ist, wie A. und V. mesenterica Antwortkurven der zunehmenden Konzentration von 5-Hydroxytryptamin (Serotonin, Figur 3) und Norepinephrin (

Die mesenterica Reaktion auf sowohl 5-Hydroxytryptamin (Abbildung 3) und Noradrenalin (Abbildung 4) begann als negative Werte. Dies ist ein Ergebnis der Korrektur der maximalen Spannung während jedes 9 min Inkubationszeit von der Ausgangsspannung vor der anfänglichen Zugabe KCl aufgezeichnet. Diese Basislinienkorrektur gewährleistet, dass geringe Unterschiede in der Spannung nicht in die Analysen einbezogen und damit die vorgestellten Daten nur eine Änderung in der Spannung zu reflektieren. Die negativen Wert ergibt sich aus dem Blutgefäß entspannen und fallen unter den vor der KCl Ausgangswerten vor der nachfolgenden Behandlung hinaus. Dies ist besonders häufig bei venösen Proben, bei denen die Ausgangskonzentrationen der Behandlung oder Agonisten zu niedrig um einen Kontraktionsreaktion verursachen. Dies war nicht der Fall für mich der senteric Arterie Reaktion entweder auf biogene Amin, das Spannung über dem Ausgangswert gehalten, bis das Schiff fing an, zu den Behandlungs Ergänzungen zu reagieren. Dieser Unterschied veranschaulicht die Unterschiede in den Behältern auf jeder Seite der Kapillare Bett und warum sie auch als Teil dieser Bioassay betrachtet.

Dieser Bioassay verwendet werden, um vasoaktive Wirkung von Verbindungen auf die Blutgefäße Nährstoffen in den Dünndarm als auch Blutgefäße, die absorbierten Nährstoffen aus dem Dünndarm zu bewerten. Daten in den 3 und 4 sind einfache Beispiele dafür, wie dies erreicht werden kann. Im Falle von 5-Hydroxytryptamin (Figur 3), es war kein Unterschied in der arteriellen oder venösen Kontraktionsreaktion. Umgekehrt wird die Kontraktionsreaktion durch die Vena mesenterica steigenden Konzentrationen von Norepinephrin war größer als die der mesenterialen Arterie.

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Abbildung 1:. Ein Beispiel Rinderdarmtrakt als Quelle der mesenterialen Blutgefäße verwendet Der rote Stern zeigt den sichtbaren Teil des ileozökalen fach in allen drei Bereichen als Bezugspunkt. (A) Die ganze Trakt mit dem roten Oval, das die Ileum-Flansch an denen die Entnahme von Gefäßsystem aufgetreten. (B) Die Exposition von mesenterialen Gefäßbett. (C) Iris Schere auf einem exponierten Zweig der mesenterica (sichtbar) und Arterie (nicht sichtbar) kurz vor der Sammlung zeigt.

Figur 2
Abbildung 2: Beispiel für eine Konzentrationsantwort eines mesenterica steigenden Konzentrationen von Noradrenalin (1 x 10 -7 bis 1× 10 -4 M). Die großen Ereignisse am Anfang und Ende der Spur sind Antworten auf 0,12 M KCl Ergänzungen. Das rote Rechteck bedeutet die Datenerfassung mit dem entsprechenden Bereich 9 min Inkubationszeit für jede Behandlung hinaus. Die 3 schlanken Spitzen, die diese folgen, sind Artefakte, die durch die Puffer Ersatz generiert und sind nicht in die Analyse einbezogen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 3
Figur 3: Die mittlere Kontraktionsreaktionen der Arteria mesenterica (MA) und Vene (MV n = 6 steuert), um zunehmende Konzentrationen an 5-Hydroxytryptamin (Serotonin)-Linien gezeigt sind, wurden unter Verwendung nicht-linearer Regressionsanalyse, um die Daten in eine sigmoidale passen erzeugt. Konzentration response Kurve, die die folgende Gleichung eingesetzt: y = unten + [(oben - unten) / (1 ​​+ 10 (logEC 50 - x))], wobei oben und unten sind der Anteil der 120 mM KCl maximale Kontraktionsreaktion auf den Hochebenen, und die EC 50 die molare Konzentration des Alkaloids, die 50% der maximalen Reaktion KCl.

Figur 4
Figur 4: Die mittlere Kontraktionsreaktionen der Arteria mesenterica (MA) und Vene (MV n = 6 steuert) zu steigenden Konzentrationen von Norepinephrin Linien gezeigt sind, wurden unter Verwendung nicht-linearer Regressionsanalyse, um die Daten in eine sigmoidale Konzentration-Antwort-Kurve, die verwendet passen erzeugt. die folgende Gleichung: y = unten + [(oben - unten) / (1 ​​+ 10 (logEC 50 - x))], wobei oben und unten sind der Anteil der 120 mM KCl maximal contractile Reaktion auf den Plateaus, und die EC 50 die molare Konzentration des Alkaloids, die 50% der maximalen Reaktion KCl.

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Discussion

Die erste Herausforderung in der Entwicklung dieses Bioassay war die Einrichtung einer Sammelstelle für wiederholbare mesenterialen Gefäßsystem. Probenstelle Konsistenz ist wichtig, da einige der Funktionen des Dünndarms Änderung während des Fortschreitens des Jejunums durch die Ileum und folglich das Mesenterium variieren in einem ähnlichen Muster. Die Ileum-Zweige der A. und V. mesenterica waren die leicht durch anatomische Landmarken identifiziert. Durch Anordnen des Blinddarms und folgende ileocecalen fache seiner Terminus auf der linken Seite des Mesenteriums, ist dieses in der Nähe der Beendigung der Schädel mesenterialen Arterie 15. Die Fläche mehr Gekröse (der so genannten Flansch) und die Verlängerung der ileozökalen fache (einzigartig in der Rind) 16 gemacht Probenahme über zahlreiche Tiere sehr wiederholbar. Eines der größeren Gefahren, die gemacht werden können, ist in dieser Phase des Bioassays. Mechanisches Strecken einen großen negativen Einfluss auf die nachfolgende Gefäß performance 14 und die Forscher feststellen, dass die Schiffe, die übermäßig manipuliert werden oder während der Entnahme und anschließende Reinigung gestreckt werden nicht an die Referenzverbindung verwendet reagieren. Das ist leider der einzige Weg, wirklich bewerten die Qualität der Gefäß Vorbereitung auf funktionaler Ebene und Behälter, die nicht an KCl reagieren, sollten nicht weiter für die Erzeugung von zuverlässigen Daten berücksichtigt werden.

Zwei andere Verfahren Validierungsschritte (nicht gezeigt), die mit dem hier vorgestellten Verfahren endgültigen führten, waren die Verwendung von anderen Chemikalien als Referenzverbindungen und Testen der Lebensfähigkeit von Blutgefäßen nach 24 Stunden Lagerung. Norepinephrin und Serotonin wurden als Referenzverbindungen ausgewertet, aber Reaktionen der A. und V. mesenterica waren zu variabel für Schiffstyp und für Tiere, damit sie erfolgreich verwendet werden. Umgekehrt ist die Zugabe von 120 mM KCl ergab eine sehr reproduzierbare Antwort auf beide Arterie und Vene Zubereitungen. Einlso, wurden Arterie und Vene Antworten Tag der Entnahme ausgewertet und neu bewertet 24 Stunden nach der Sammlung, und es gab keine Unterschiede in der Reaktion Agonist entweder durch die Arterie oder Vene. Dies war ein wichtiger Aspekt der Bioassay, da häufig eine große Anzahl von Anwendungen (oder verschiedenen Behandlungskombinationen), die angewendet werden können, aber Forscher von Platz auf der Myographions und zeitlich begrenzt. Durch die Verlängerung der Überlebensfähigkeit aus 24 h aus der Sammlung, wird die Zeit für zusätzliche Experimente stark erhöht.

Es ist wichtig für die Forscher, die Flexibilität der Behandlungsstruktur dieser Bioassay angewendet verstehen. Ein Forscher kann jede Verbindung zu dem Inkubationspuffer, die er oder sie Interesse an chronisch Aussetzen der Blutgefäße, um etwas von biologischen Relevanz zu steuern oder als Behandlung ist (im Falle von Klotz et al hinzuzufügen. 17, wurde diese mit fertig Seitenstammvenen kontinuierlich ausgesetzt ketanserin, die eine Serotonin-Rezeptor von Interesse antagonisiert). Die mesenterialen Blutgefäße könnte mit einer Verbindung von Interesse vor der Durchführung einer Kontraktionsreaktion Experiment vorbehandelt werden. Der Bioassay, wie vorgestellt, wurde entwickelt, um eine kumulative Konzentrations-Wirkungs-Experiment Blick auf Mutterkornalkaloide als Agonisten und ob vor ernährungsbedingten Exposition gegenMutterKornAlkaloide Auswirkungen auf die Gefäßreaktion 18 durchzuführen. Die repräsentativen Ergebnisse zeigen, dass dieses Verfahren eine messbare Gefäßreaktion zu erzeugen, und nur vier Konzentrationen wurden verwendet, um dies zu erreichen. Im Fall von Egert et al. 18, waren bis zu 10 verschiedenen Konzentrationen eingesetzt, um eine Antwortkurve zu konstruieren. Dieses Verfahren ist ein Weg, eine große Anzahl von verschiedenen Verbindungen oder Rezeptoren auf Blutgefäße aus einem einzigen Tier in einem kleinen Zeitfenster zu bewerten.

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Disclosures

Die Erwähnung von Handelsnamen, proprietäres Produkt, oder solche Ausrüstung stellt keine Garantie oder Gewährleistung durch die USDA und keine Zustimmung zum Ausschluss von anderen Produkten, die verfügbar sein können.

Acknowledgments

Die Autoren danken Ryan Chaplin und Dr. Gregg Rentfrow von der University of Kentucky und Fleisch Lab Abteilung Tier und Lebensmittelwissenschaften für die Bereitstellung von Möglichkeiten zur experimentellen hier verwendeten Gewebe zu sammeln.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Multi Myograph Danish Myo Technologies 610M A myograph is critical to this bioassay, but there are other platforms available for use that will suffice. 
Powerlab 8/sp ADIntruments ML785
LabChart 7 ADInstruments Version 7
Force Calibration Kit Danish Myo Technologies 100055 Specific to DMT myographs
Bottle-top Filter Nalgene 595-4520 0.22 μm pore size; 45 mm neck size
#5 Jewler’s Forceps Miltex 555008FT Any brand of forceps can be used
Noyes Iris Scissors Miltex 18-1510 Any brand of scissors can be used
Dissecting Scope Zeiss Stemi 2000-C Any brand of dissecting light microscope will suffice
Adjustable Tissue Matrice Braintree Scientific TM C12 This is not critical to the assay, but greatly reduces section to section variation in length and speeds up the slicing process greatly
Krebs-Hensleit Buffer Sigma-Aldrich K3753-10x1L It is not necessary to buy Krebs, this can be made in house
Calcium chloride dehydrate Sigma-Aldrich C7902-500G
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich S5761-500G
Desipramine-HCl Sigma-Aldrich D3900-5G
Propranolol-HCl Sigma-Aldrich P0884-1G
KCl Sigma-Aldrich P9333-500G
95% O2/5% CO2 Scott Gross UN3156

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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