طرق الخلية المرفقة قياسات السعة في ماوس الكظرية أليف الكروم خلية

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Varga, K. T., Jiang, Z., Gong, L. W. Methods for Cell-attached Capacitance Measurements in Mouse Adrenal Chromaffin Cell. J. Vis. Exp. (92), e52024, doi:10.3791/52024 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

وتوسط انتقال متشابك بواسطة إيماس من الحويصلات التي تحتوي على ناقل عصبي متشابك، ويجب أن تخضع هذه الحويصلات إعادة التدوير التقامي المحلي داخل محطة العصبية للحفاظ على الاتصالات العصبية على المدى الطويل. نظرا للدور أساسي في انتقال متشابك في الدماغ، وفهم الآليات الجزيئية التي تشكل دورة حويصلة متشابك هي الركيزة الأساسية نحو فهم أفضل في مجال الاتصالات الخلوية ككل. بين النظم نموذج خلية، وقد وفرت الخلية أليفة الكروم الكظرية بعض البصيرة الأكثر حسما في الآلية الجزيئية الكامنة وراء إعادة تدوير حويصلة متشابك. إيماس، فإن الخطوة النهائية في إطلاق الناقلات العصبيه، وقد درس كثيرا وفحصها من خلال استخدام الخلايا أليفة الكروم الكظرية 1،2. في الواقع، معظم اللاعبين الجزيئية التي تنسق تشكيل والاستهداف والالتحام والانصهار من حبيبات إفرازية تم تحديدها نظرا لتطبيق شعبةتقنيات في الخلايا أليفة الكروم ERSE 1. وعلاوة على ذلك، من خلال توفير فرصة للسماح للقرار حويصلة واحدة من الآلات البروتين المشاركة في إيماس، تبقى الخلايا أليفة الكروم نموذجا قويا لمعالجة مسائل الانصهار الحويصلة 3.

واستخدمت قياسات السعة الخلية المرفقة أولا في حل واحدة الانصهار الحويصلة خلال إيماس 3. إيماس حويصلات صغيرة مثل ~ أثبتت 60 نانومتر في القطر ليتم الكشف عنها بواسطة القياسات قبول غشاء الخلية مع تقنية المشبك التصحيح في الخلية المرفقة التكوين 4-7. ويعرف قبول كمقياس لمدى سهولة الدائرة أو الجهاز سوف تسمح لتدفق الحالية. هو معكوس مقاومة. وبالتالي، توفر قياسات قبول فهم السعة الغشاء. ويتم إنجاز هذا عن طريق دمج الغشاء الحويصلي في غشاء البلازما. هذا التأسيس يكشف عن تغيرات في سطحمنطقة 8. تسبب كل حويصلة التفجير زيادة تدريجية في السعة غشاء 9،10. بالإضافة إلى ذلك، يوفر هذا القياس القبول في تصرف الغشاء والمسام الانصهار تصرف خلال هذا الحدث exocytotic 3. كما وفرت هذه التقنية أداة فريدة من نوعها في تحديد حركية حويصلة واحدة خلال إيماس، مختبرنا وقد طبقت مؤخرا هذا المفهوم للكشف عن الإلتقام من الحويصلات واحدة 11،12.

مصلحتنا هي محددة بوساطة بالكلاذرين الإلتقام (CME)، والتي تم اعتبارها مكونا أساسيا في التدبير المنزلي العديد من الخلايا 13 و كمسار الرئيسي لحويصلة متشابك الإلتقام في المحطات العصبية 14،15. ومن المعروف CME إلى أن تكون مهمة من الناحية البيولوجية، ومع ذلك، لا تزال حركية ليست مفهومة بشكل جيد بسبب القيود التقنية في رصد الأحداث التقامي المفرد. نظرا لأوجه التشابه في آليات exocytic بين الخلايا أليفة الكروم والخلايا العصبية فمن ررausible التي قد تطبق آليات انشطار الخلايا أليفة الكروم في الأرجح إلى حويصلة متشابك الإلتقام في الخلايا العصبية. وقد استخدمت قياسات السعة الخلية المرفقة لرصد الأحداث التقامي الفردية وتحليل حركية الانشطار، والتي معظم الطرق غير قادرة على حلها. في منطقتنا التسجيلات الخلية المرفقة، وفرضه موجة جيبية عند 20 كيلو هرتز حول احتمالات عقد، ويتم فصل الانتاج الحالي في غشاء تصرف في قناة واحدة وغشاء السعة في قناة أخرى من مرحلتين قفل في مكبر للصوت 16- 18. من تغيرات في غشاء تصرف والسعة، يمكن للمرء حساب حركية الانشطار المسام، والتي تتطابق المرجح أن الرقبة غشاء أنبوبي الذي يربط حويصلة استيعاب لغشاء البلازما قبل حويصلة قرصة حالا. جماعي، هذه التقنية تتيح لنا الفرصة لدراسة الآليات التنظيمية للحويصلة الانشطار خلال التعليم الطبي المستمر.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ملاحظة: تم إجراء الإجراء بأكمله وفقا للمبادئ التوجيهية للمعاهد الوطنية للصحة، التي وافقت عليها لجنة رعاية واستخدام الحيوان من جامعة إلينوي في شيكاغو.

1. حلول والثقافة وسائل الإعلام الاستعدادات

  1. إبقاء جميع الحلول في -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى ستة أشهر. إبقاء وسائل الإعلام الثقافة في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 3 أشهر.
  2. إعداد 100 مل من وسائل الإعلام والثقافة عن طريق خلط 1 مل من محلول القلم بكتيريا و 1 مل من ITSX (الانسولين ترانسفيرين-مكملات السيلينيوم) إلى 100 مل مع DMEM.
  3. إعداد الحل انزيم عن طريق خلط 250 مل من DMEM 2.5 مل من 100 مم CaCl و 2.5 مل من 50 ملي EDTA.
  4. إعداد الحل تعطيل عن طريق خلط 225 مل من DMEM، 25 مل من FBS، 625 ملغ من الزلال، و 625 ملغ مثبط التربسين.
  5. إعداد الحل ولوك من 154 مم كلوريد الصوديوم، 5.6 ملي بوكل، 5.0 ملي HEPES، NaHCO3 3.6 ملم، 5.6 ملم الجلوكوز. ضبط درجة الحموضة إلى 7.3 مع هيدروكسيد الصوديوم.
  6. إعداد بولي د يسين (PDL) حل 50 ملغ / مل. استخدام تركيز النهائي من 1 ملغ / مل إلى coverslips معطف.
  7. إعداد حل خارج الخلية من 140 مم كلوريد الصوديوم، 5 ملي بوكل، 2 مم CaCl 1 ملم MgCl 2 و 10 ملي HEPES، هيدروكسيد الصوديوم، و 10 ملي الجلوكوز. ضبط درجة الحموضة إلى 7.3 مع هيدروكسيد الصوديوم مع الأسمولية من ~ 310 نانومول / كجم.
  8. يعد حل ماصة من 50 ملي كلوريد الصوديوم، و 100 ملي TEACl، 5 ملي بوكل، 2 مم CaCl 1 ملم MgCl 2 و 10 ملي HEPES. ضبط درجة الحموضة إلى 7.3 مع هيدروكسيد الصوديوم مع الأسمولية من ~ 290 نانومول / كجم.

2. الغدة الكظرية عزل

  1. الأوتوكلاف زوج من مقص تشريح الكبيرة والصغيرة واثنين من أزواج من ملقط. ارتداء القفازات أثناء العملية برمتها ووضع علبة تشريح في دلو الجليد.
  2. استخدام الفئران التي اتخذت في يوم 0-3. الموت ببطء الحيوانات مع الضغط دبابة CO 2 تليها قطع الرأس.
  3. الاستفادة من مجموعة أصغر من مقص لقطع أسفل الجزء الخلفي من الجرو التالية من العمود الفقري العنقية كال لالذيلية المنطقة. تأكد من قطع سطحي تحت الجلد وليس بيرس في تجويف الجسم.
  4. المقبل، قشر الجلد بعيدا عن العمود الفقري لذلك يتعرض هذا الجهاز العضلي أن يكون لها رؤية واضحة للعمود الفقري. من هنا، اجراء خفض transectional في الحبل الشوكي عنق الرحم ثم جعل اثنين تخفيضات موازية على طول جانبي العمود الفقري.
  5. مع زوج واحد من ملقط يمسك الجسم الرئيسي للحيوان، استخدام زوج آخر من ملقط لانتزاع العمود الفقري وقشر الظهر العمود الفقري حتى تتعرض الكلى.
  6. في هذه اللحظة، تصور الغدد الكظرية على قمة الكليتين. ثم ضع بعناية الغدد اثنين من كل حيوان في أنبوب مخروطي الشكل مملوءة بمحلول لوك.
    ملاحظة: في بعض الأحيان سوف الغدد التمسك ملقط. إذا كانت هذه هي الحالة، استخدم بلطف زوج آخر من ملقط للمساعدة في إزالة الغدد من ملقط والى حل للوك. يمكن أن تبقى الغدد في هذه الحالة لمدة تصل إلى 2 ساعة.
ه "> 3. الهضم الأنسجة

  1. في غضون ذلك، فقاعة الحل الانزيم مع 5٪ CO 2 + 95٪ O 2 لمدة 15 دقيقة قبل الاستخدام. ضمان أن الحل معايرتها يتحول من اللون الوردي مشرق في اللون وردي / برتقالي.
  2. إضافة غراء إلى حل انزيم فقاعات حديثا بتركيز نهائي من 20-25 وحدة / مل. احتضان كل زوج من الغدد من كل حيوان ل40-60 دقيقة عند 37 درجة مئوية في حل الانزيم مع غراء.
  3. إضافة 75٪ من الحل تعطيل لكل أنبوب، واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة أخرى. هذه الحضانة يثبط نشاط نشاط انزيم غراء.
  4. بعد حضانة 10 دقيقة مع الحل تعطيل، ونقل بلطف الغدد في أنبوب المسمى حديثا ثم يغسل الغدد 3X مع وسائل الإعلام الثقافة.

4. خلية التفكك والتصفيحات

  1. بعد الغسيل، ووضع الغدد اثنين الى 200 ميكرولتر من وسائل الإعلام الثقافة وثم يعاير بلطف صعودا والغددإلى أسفل من خلال طرف ماصة مع ماصة 200 ميكرولتر حتى لم يعد هناك قطعة كبيرة من الأنسجة في الحل.
    ملاحظة: عند المعايرة، والحفاظ على الغدد في الجزء السفلي من أنبوب مع قوة الهبوط من 200 ميكرولتر ماصة وإشراك الأنسجة بلطف وببطء. تكون معينة لاستخدام بطيئة، والسكتات الدماغية مستمرة، أبدا pipetting لسريع أو مفاجئ.
  2. إضافة إضافي سائل الإعلام والثقافة 250 ميكرولتر لتبرزي حجم الكلي للثقافة وسائل الإعلام تصل إلى 450 ميكرولتر.
  3. لوحة 60 ميكرولتر من هذا الحل التي تحتوي على كل خلية من سبعة 12 ملم coverslips المغلفة PDL مسبقا، والتي يتم وضعها في صحن الثقافة 60 × 15 مم.
  4. مرة واحدة مطلي، ضع الطبق في الحاضنة التي تم تعيينها إلى 37 درجة مئوية، وحافظت مع تدفق مستمر / توريد 5٪ CO 2 لمدة 30 دقيقة لضمان بيئة لبقاء الخلية. بعد الحضانة، إضافة بلطف 5 مل من قبل تحسنت وسائل الإعلام الثقافة في صحن الثقافة والعودة الطبق مرة أخرى في حاضنة لمدة 24 ساعة قبل خلية الملحقتسجيلات د.
    ملاحظة: عادة، الخلايا يمكن استخدامها لالتسجيلات الكهربية لمدة تصل إلى 4 أيام.

5. خلية تحديد وتشكيل ختم Gigaohm

  1. وضع 12 ملم ساترة إلى حل خارج الخلية. حيث يتم استخدام الغدد الكظرية كاملة لإعداد الخلية، مزيج الخلايا أليفة الكروم (عادة مشرقة جدا مع البني / البيج والتلوين على شكل دائري مثالي القريب (الشكل 1) في الثقافة مع الخلايا القشرية (أصغر وباهتة من الخلايا أليفة الكروم).
  2. سحب ماصات التصحيح في أربع مراحل باستخدام برمجة P-97 مجتذب. تراجع غيض ماصة في الشمع المنصهر، والتي سوف تساعد على تقليل السعة من الزجاج ومن ثم اطلاق النار البولندية طرف إلى "ضربة بعيدا" هذا الشمع من الداخل من طرف ماصة.
    ملاحظة: عندما تمتلئ حل ماصة التصحيح، ماصات التصحيح وعادة ما يكون مقاومة MΩ ~ 2.
  3. الاقتراب من ماصة التصحيح قريبة من الخلية ضمن عدة مicrons. لتحقيق تكوين الخلية المرفقة، والبحث عن أي تشوه خلية طفيف خلال نهج من ماصة التصحيح أقرب إلى الخلية. تطبيق الشفط لطيف حتى يتحقق ختم GΩ.

6. الخلية المرفقة التسجيلات السعة

  1. بمجرد كشف ختم GΩ، وجعل التسجيلات الخلية المرفقة من خلال استخدام مكبر للصوت EPC-7 زائد التصحيح، المشبك، وعلى مرحلتين التناظرية قفل في مكبر للصوت (انظر الجدول المرفق المعدات). تطبيق شركة Sinewave مع سعة 50 فولت (RMS) وتردد 20 كيلو هرتز من مكبر للصوت في قفل.
  2. تعيين عامل التصفية الناتج من مكبر للصوت قفل في 1 مللي ثانية في وقت ثابت و 24 ديسيبل. تعيين مرحلة من مكبر للصوت قفل في مثل هذا أن التغيرات السعة عابرة تنتجها البقول شفط طيف تظهر فقط في السعة التصحيح (ايم) التتبع مع ​​أي الإسقاط في تصرف التصحيح (إعادة) أثر (الشكل 2).
    ملاحظة: يرجى الاطلاع على التفاصيل لمعايرة النظام في إعادةاملؤمتر 19.
  3. تحديد التغييرات السعة نموذجية من خطوات "الهبوط" (الشكل 3).
    ملاحظة: سيتم شاهدوا A تسجيل الصلب بأنها "الدرج" نوع تشابه مع العديد من الخطوات الهبوط مما يؤدي الى استيعاب الحويصلات واحدة. تخدم عملية الترقيع بمثابة التحفيز الميكانيكي، نظرا لأن الإجراءات الحالية يمكن عادة المسجلة من معظم الخلايا.
  4. تسمية الملفات والمجلدات الفردية بما في ذلك تاريخ: شهر / يوم / سنة وكل تسجيل الخلية المرفقة والخاصة ترقيم فردي (س س) داخل هذا الملف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

وبقاء الخلية ونوعية ختم gigaohm حاسمة في تحديد نوعية التسجيلات السعة الخلية المرفقة. لذا، فمن الأهمية بمكان لشراء ثقافة خلية فعالة وكفؤة قبل التسجيلات الكهربية وخلايا قابلة للحياة نموذجية موضحة في الشكل 1. سوف الممارسة والوقت يكون مفيدا في تحقيق ختم gigaohm ذات جودة عالية. إذا كان أحد يمكن أن نرى بوضوح تشوه الخلايا عندما ماصة التصحيح يقترب الخلية كما هو موضح في الخطوة 5.3 البروتوكول، هناك فرصة أفضل في الحصول على ختم عالية الجودة. الشكل 3 يوضح تسجيل نموذجية من السعة مع غشاء أسفل متعددة الخطوات المرتبطة الإلتقام حويصلة واحدة.

الشكل 1
الرقم 1. أمثلة الخلايا أليفة الكروم الكظرية الماوس قابلة للحياة24 ساعة بعد زراعة الخلايا. السهام أشر إلى 3 خلايا أليفة الكروم قابلة للحياة. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
يتم إلغاء الرقم تعديل 2. المرحلة في التسجيلات الخلية المرفقة. مع مرحلة الإعداد الأولي، الشحوم لطيف تسبب تغيرات عابرة في كل من السعة (IM) وتصرف (إعادة) آثار، والتوقعات في رد أثر بها في المرحلة 23 ° التحول. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 3
الشكل 3. ج نموذجيةالسعة الذراع المرفقة مع تسجيل خطوات الهبوط متعددة، ويرتبط مع الإلتقام حويصلة واحدة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

قياسات السعة الخلية المرفقة تتطلب عدة خطوات حاسمة من أجل الحصول على التسجيلات ذات الجودة العالية بنجاح: 1) خلايا قابلة للحياة وصحية أعدت من الغدد الكظرية. 2) PDL طلاء لل coverslips. 3) تشكيل ختم gigaohm. 4) مستوى الضوضاء النظام؛ و 5) مرحلة التصحيح.

لجراحة الحيوان، يمكن للمرء أن التعديلات المحتملة هي جعل لضبط النهج الجراحية لتناسب والبراعة لمنع الضرر أثناء تشريح. بالإضافة إلى ذلك، ممارسة كافية على تحديد وإزالة الغدد الكظرية أمر حتمي والخلايا التي سيتم استخدامها لالتسجيلات الكهربية تأتي حصرا من النخاع من الغدة الكظرية. لانزيم الهضم، فمن الأهمية بمكان لكي تتوازن الحل بواسطة انزيم محتدما الحل مع 5٪ CO 2 + 95٪ O 2. تكون على يقين من أن أنابيب متصلة اسطوانة كافية وضيق مع أي تسرب. بالإضافة إلى ذلك، تأكد من أن نهاية طيتم وضع ن الحل بشكل صحيح خلال 15 دقيقة كامل الوقت محتدما. وهذا يمكن أن يتحقق مع وضع نهاية إبرة 20 G التي تم اضعافها في نهاية الأنبوب وذلك لتوجيه تدفق الهواء بشكل مناسب. وعلاوة على ذلك، فإن وقتا إضافيا لهذه الخطوة لن يضر طالما أن تدفق الهواء ليست قوية وذلك لتجاوز الحل في أنبوب. المعايرة الخلية هي عنصر حاسم آخر من شأنها أن تأخذ الممارسة. غالبية الخلايا يمكن أن تتلف إذا الإفراط في معاير. على العكس، إذا المعايرة ليست كافية، سيكون هناك عدد قليل جدا من الخلايا المعزولة واحدة فصلها عن الأنسجة. ليعاير بشكل فعال، واستخدام 200 ميكرولتر طرف ماصة للماصة صعودا وهبوطا 7-8x، والتأكد يتم تمرير الغدد بلطف من خلال 200 ميكرولتر ماصة كما كنت يعاير.

لPDL طلاء، يمكن للمرء دائما تمديد فترة حضانة من PDL على لل coverslips تصل إلى 3 ساعة لضمان طلاء كاف من coverslips. طلاء PDL هو أمر حاسم لأليف الكروم خلايا لنعلقلوتنمو على coverslips عن بعد الطلاء الخلية. إذا PDL طلاء غير كاف، سيتم فصل معظم الخلايا من ساترة، الأمر الذي سيجعل من الصعب تشكيل ختم gigaohm.

يمكن دائما التسجيلات الخلية المرفقة تعديلها وتحسينها، وأسلوب الترقيع هي عملية متخصصة. شفط لطيف ودقيق أمر بالغ الأهمية في تسهيل تشكيل ختم gigaohm عندما ماصة التصحيح والخلية على اتصال. والكثير من شفط تدمير خلايا الاتصال التصحيح طرف وفي الحالات القصوى، والخلايا يمكن امتص في ماصة التصحيح. هذا وسوف يتم ملاحظتها بسهولة جدا على الذبذبات عن طريق تغيير في تكوين خلية كاملة أو مقاومة ضئيلة جدا يعود الى حد كبير جدا واحد؛ الممارسة هي في غاية الأهمية للحصول على جودة عالية تشكيل ختم gigaohm.

في حين ختم عالية المقاومة أمر بالغ الأهمية لتقليل مستوى الضوضاء في التسجيلات الخلية المرفقة، خطوتين التالية هي أيضامهم لتقليل مستوى الضوضاء لحل الأحداث التقامي واحدة: (1) في حل ماصة التصحيح، ويستخدم لمنع TEACl K + قنوات بوابات الجهد؛ (2) وهي مغلفة غيض ماصة مع الشمع والشمع لزجة داخل غيض ماصة يمكن إزالتها عن طريق الحرارة تلميع.

في حين أن مرحلة التكيف مفصل في البروتوكول خطوة 6.2 أمر بالغ الأهمية لإعداد المرحلة الأولى للتسجيل، هذه الخطوة قد لا تكون مثالية. لذا، من المهم لأداء مرحلة التصحيح خلال تحليل الانشطار المسام لأحداث فردية. في غشاء المحتملة يستريح من -65 بالسيارات، تظهر تسجيلات خلية كاملة أن خلية أليفة الكروم الماوس نموذجي لديها السعة المدخلات من 5 الجبهة الوطنية والمقاومة مدخلات 500 MΩ، الذي يحسب تصرف غشاء خلايا فأر أليف الكروم و~ 0.4 PS / (FF). هذا يعني أن حدثا التقامي مع حجم السعة من 1 فرنك فرنسي سيؤدي إلى خسارة صافية قدرها تصرف غشاء ~ 0.4 PS. هذه القيمة لا يكاد يذكر مقارنة فيypical 50-100 PS تغيير تصرف غشاء المرتبطة التقامي الانشطار إغلاق المسام في تسجيلات الخلية المرفقة. ولذلك، فإننا واثقون من أن مرحلة التصحيح لدينا يسمح لنا لضبط خط الأساس للتصرف غشاء مثل أن إغلاق قبل وبعد الانشطار المسام هو على نفس المستوى. قد تؤدي هذه العملية <1٪ خطأ في تحليل البيانات لدينا.

وباختصار، فإن بروتوكول الموصوفة هنا يوضح كيف يمكن استخدام تسجيلات السعة الخلية المرفقة لمراقبة الإلتقام حويصلة واحدة باستخدام الخلايا أليفة الكروم الماوس كما في النظام النموذجي. هذا الأسلوب يسمح احد لتحليل الآليات التنظيمية للحويصلة الانشطار خلال الإلتقام.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

تعلن الكتاب أنه ليس لديهم المصالح المالية المتنافسة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Poly-D-Lysine Sigma P0899
DMEM 15066024 Keep out of UV
Dulbecco’s Modified Eagle Medium Life Technologies
Cover Glass Carolina Biological 633029 12 mm
Penicillin Streptomycin Life Technologies 15140122 100 ml
Insulin-Trans-Sel-X Life Technologies 51500056 Only thaw on ICE!
Papain Worthington 39S11614
EPC-7 plus patch amplifier HEKA
BNC-2090 data acquisition board National Instruments
Igor data acquisition software Wavemetrics
P-97 pipette puller Sutter Instruments
Microforge Scientific Instruments
Borosilicate glass capillaries Sutter Instruments B150-110-10 Outer diameter: 1.5 mm
Inner diameter: 1.10 mm
Length: 10 cm

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rettig, J., Neher, E. Emerging roles of presynaptic proteins in Ca++-triggered exocytosis. Science. 298, 781-785 (2002).
  2. Gong, L. W., et al. Phosphatidylinositol phosphate kinase type I gamma regulates dynamics of large dense-core vesicle fusion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 5204-5209 (2005).
  3. Lindau, M., Alvarez de Toledo, G. The fusion pore. Biochimica et Biophysica Acta. 1641, 167-173 (2003).
  4. Albillos, A., et al. The exocytotic event in chromaffin cells revealed by patch amperometry. Nature. 389, 509-512 (1997).
  5. Lollike, K., Borregaard, N., Lindau, M. Capacitance flickers and pseudoflickers of small granules, measured in the cell-attached configuration. Biophys J. 75, 53-59 (1998).
  6. Lollike, K., Borregaard, N., Lindau, M. The exocytotic fusion pore of small granules has a conductance similar to an ion channel. The Journal of cell biology. 129, 99-104 (1995).
  7. Dernick, G., Gong, L. W., Tabares, L., Alvarez de Toledo, G., Lindau, M. Patch amperometry: high-resolution measurements of single-vesicle fusion and release. Nat Methods. 2, 699-708 (2005).
  8. Neher, E., Marty, A. Discrete changes of cell membrane capacitance observed under conditions of enhanced secretion in bovine adrenal chromaffin cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79, 6712-6716 (1982).
  9. Gong, L. W., de Toledo, G. A., Lindau, M. Exocytotic catecholamine release is not associated with cation flux through channels in the vesicle membrane but Na+ influx through the fusion pore. Nature Cell Biology. 9, 915-922 (2007).
  10. Gong, L. W., Hafez, I., Alvarez de Toledo, G., Lindau, M. Secretory vesicles membrane area is regulated in tandem with quantal size in chromaffin cells. The Journal of Neuroscience : the Official Journal of the Society for Neuroscience. 23, 7917-7921 (2003).
  11. Yao, L. H., et al. Actin polymerization does not provide direct mechanical forces for vesicle fission during clathrin-mediated endocytosis. The Journal of Neuroscience : the Official Journal of the Society for Neuroscience. 33, 15793-15798 (2013).
  12. Yao, L. H., et al. Synaptotagmin 1 is necessary for the Ca2+ dependence of clathrin-mediated endocytosis. The Journal of Neuroscience : the Official Journal of the Society for Neuroscience. 32, 3778-3785 (2012).
  13. McMahon, H. T., Boucrot, E. Molecular mechanism and physiological functions of clathrin-mediated endocytosis. Nature reviews. Molecular Cell Biology. 12, 517-533 (2011).
  14. Murthy, V. N., De Camilli, P. Cell biology of the presynaptic terminal. Annu Rev Neurosci. 26, 701-728 (2003).
  15. Granseth, B., Odermatt, B., Royle, S. J., Lagnado, L. Clathrin-mediated endocytosis is the dominant mechanism of vesicle retrieval at hippocampal synapses. Neuron. 51, 773-786 (2006).
  16. Rosenboom, H., Lindau, M. Exo-endocytosis and closing of the fission pore during endocytosis in single pituitary nerve terminals internally perfused with high calcium concentrations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 5267-5271 (1994).
  17. MacDonald, P. E., Eliasson, L., Rorsman, P. Calcium increases endocytotic vesicle size and accelerates membrane fission in insulin-secreting INS-1 cells. Journal of Cell Science. 118, 5911-5920 (2005).
  18. Zhao, Y., Fang, Q., Straub, S. G., Lindau, M., Sharp, G. W. Hormonal inhibition of endocytosis: novel roles for noradrenaline and G protein G(z). J Physiol. 588, 3499-3509 (2010).
  19. Debus, K., Lindau, M. Resolution of patch capacitance recordings and of fusion pore conductances in small vesicles. Biophys J. 78, 2983-2997 (2000).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics